[go: up one dir, main page]

CN119365600A - 靶向颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸 - Google Patents

靶向颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN119365600A
CN119365600A CN202380047356.8A CN202380047356A CN119365600A CN 119365600 A CN119365600 A CN 119365600A CN 202380047356 A CN202380047356 A CN 202380047356A CN 119365600 A CN119365600 A CN 119365600A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antisense oligonucleotide
nucleotide sequence
contiguous nucleotide
nucleosides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202380047356.8A
Other languages
English (en)
Inventor
J·沃尔姆
L·约森
M·曼索
D·范
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN119365600A publication Critical patent/CN119365600A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/33—Alteration of splicing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了用于改变颗粒蛋白前体的剪接模式的反义寡核苷酸，以及它们在治疗神经系统疾患中的用途。所述反义寡核苷酸经修饰以更好地增加细胞中外显子1‑外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的上调或表达恢复。

Description

靶向颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸
技术领域
本发明涉及改变颗粒蛋白前体的剪接模式的反义寡核苷酸，以及它们在治疗神经系统疾患中的用途。此类反义寡核苷酸可以上调或恢复细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达。
背景技术
颗粒蛋白前体(PGRN)是一种高度保守的分泌蛋白，在多种细胞类型中表达，在CNS和外周组织中均存在。
中枢神经系统中分泌型蛋白颗粒蛋白前体的缺乏导致神经退行性疾病额颞叶痴呆(FTD)。致病性颗粒蛋白前体突变通过单倍剂量不足导致颗粒蛋白前体水平损失约50％，并且导致TDP-43蛋白在神经元内聚集。颗粒蛋白前体在大脑内的许多过程中以细胞自主性方式和非自主性方式两者发挥支持和保护作用，这些过程包括神经突起生长、突触生物学、对外源性应激源的应答、溶酶体功能、神经炎症和血管生成。
颗粒蛋白前体直接和通过转化为颗粒体蛋白来调节溶酶体功能、细胞生长、存活、修复和炎症。颗粒蛋白前体在调节CNS中与溶酶体功能相关联的小胶质细胞应答中起主要作用。导致蛋白质单倍剂量不足的颗粒蛋白前体基因的常染色体显性突变与家族性额颞叶痴呆相关，伴神经病理性额颞叶变性(FTLD)，与43kDA(TDP-43)内含物(FTLD-TDP)的TAR-DNA结合蛋白的积累相关。纯合子GRN突变与神经元蜡样质脂褐质沉积症(NCL)相关(Townley，等人，Neurology，2018年6月12日；90(24)：1127)。
最近，颗粒蛋白前体基因中的突变已确定为所有FTD(包括一些散发性病例)的约5％的原因。最近使用小鼠模型进行的研究已经阐明了颗粒蛋白前体在大脑中的表达(Petkau等人，2010)。颗粒蛋白前体在神经发育晚期表达，用成熟神经元的标志物进行定位。颗粒蛋白前体在大部分大脑区域中的神经元中表达，在丘脑、海马体和大脑皮层中的表达水平最高。小胶质细胞也表达颗粒蛋白前体，并且表达水平被小胶质细胞活化上调。在FTD中已经确定出大约70种不同的颗粒蛋白前体基因突变，并且所有突变均降低颗粒蛋白前体水平或导致颗粒蛋白前体功能丧失。
因此，迫切需要能够增加颗粒蛋白前体的表达和/或活性的治疗剂。
对于间隔聚体反义寡核苷酸，甲磺酰氨基磷酸酯修饰已被证明改善治疗指数和作用持续时间(Anderson等人，Nucleic acids research，2021)，而间隔聚体反义寡核苷酸甲磺酰氨基磷酸酯修饰也被证明能够大大降低免疫刺激和细胞毒性两者(Anderson等人，Nucleic acids research，2021)。甲磺酰氨基磷酸酯键修饰可包括甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键，其中与其他氨基磷酸酯和烷基膦酸酯键不同，负电荷保留在磷酸酯主链上。
甲磺酰氨基磷酸酯寡核苷酸也可以充当剪接转换剂。然而，之前的研究并未显示剪接转换得到改善，因为对脊髓性肌萎缩症患者来源的成纤维细胞中甲磺酰氨基磷酸酯寡核苷酸剪接转换活性的评估显示，2′-MOE甲磺酰寡核苷酸与对应的硫代磷酸酯(nusinersen)寡核苷酸之间的剪接转换功效没有显著差异(Hammond等人，Nucleic AcidTherapeutics，2021)。
发明内容
保留内含子1的5′部分的颗粒蛋白前体的剪接变体在大脑中，诸如在神经元或小胶质细胞中表达(Capell等人The Journal of Biological Chemistry，2014，289(37)，25879-25889)。该剪接变体包括内含子1的5′末端271个核苷酸，其总共3823个核苷酸。内含子1的271个核苷酸片段包括外显子2中经典下游AUG(开放阅读框)上游的两个AUG位点。来自这两个上游AUG位点的翻译不会编码颗粒蛋白前体蛋白，并且由于提前终止密码子，转录本可能会经历无义介导的mRNA衰变(NMD)。
WO2020/191212描述了可以靶向颗粒蛋白前体mRNA的特异性寡核苷酸。
先前，发明人已确定减少保留内含子1的5′部分的剪接变体会增加外显子1和外显子2剪接变体，并且进一步增加颗粒蛋白前体蛋白表达。这导致了颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸的发明。这些反义寡核苷酸能够改变颗粒蛋白前体的剪接模式，特别是反义寡核苷酸可以上调外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达，减少保留内含子1的5′部分的颗粒蛋白前体内含子1-外显子2剪接变体的产生、增加颗粒蛋白前体蛋白的表达。这些反义寡核苷酸可被描述为颗粒蛋白前体剪接的调节剂，或作为颗粒蛋白前体外显子1-外显子2的激动剂，并且可用于恢复或增强颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接变体在细胞中的表达。
发明人现在已令人惊奇地确定，可以通过在反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列内包括一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键来增加这种作用。
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为8至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的剪接调节位点互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2序列的剪接调节位点互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含一个长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本(其包含人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2序列(SEQ ID NO：1))互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
颗粒蛋白前体外显子1、内含子1和外显子2序列如下所示为SEQ ID NO：1。颗粒蛋白前体外显子1序列(以大写字母表示)对应于基因组Ensemble(www.ensemble.org)染色体17位置44,345,123；至位置44,345,334。内含子1对应于基因组Ensemble染色体17位置44,345,335至44,349,157，并且外显子2序列(以大写字母表示)对应于基因组Ensemble染色体17位置44,349,158至位置44,349,302。
人颗粒蛋白前体的mRNA前体的外显子1、内含子1和外显子2序列(SEQ ID NO：1)：
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为至少12个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体的剪接调节位点互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为12至16个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体的剪接调节位点互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为12至16个核苷酸并且包含长度为12至16个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体的剪接调节位点互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为12至18个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体的剪接调节位点互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为12至18个核苷酸并且包含长度为12至18个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体的剪接调节位点互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供了一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8个至40个核苷酸并且包含长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体的剪接调节位点互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为8至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与包含在SEQ ID NO：1内的核苷酸序列互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为8至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与包含在SEQ ID NO：1的核苷酸449至466内的核苷酸序列互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
本发明提供一种反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为8至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与SEQ ID NO：39互补、诸如完全互补，其中该连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
SEQ ID NO：39为具有以下序列的靶位点：ACCACACCATTCTTGACC
该反义寡核苷酸的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。
在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度为8至40个、12至40个、12至20个、10至20个、14至18个、12至18个或16至18个核苷酸。
连续核苷酸序列的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列具有的长度为至少12个核苷酸，诸如长度为12至16个核苷酸或12至18个核苷酸的长度。
在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度与反义寡核苷酸的长度相同。
在一些实施例中，反义寡核苷酸由连续核苷酸序列组成。
在一些实施例中，反义寡核苷酸为连续核苷酸序列。
在一些实施例中，连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1内包含的核苷酸序列完全互补。
在一些实施例中，连续核苷酸序列与SEQ ID NO：1的第449至466个核苷酸内包含的核苷酸序列完全互补。
在一些实施例中，连续核苷酸序列与SEQ ID NO：39完全互补。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或其至少8个连续核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或其至少9个连续核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或其至少10个连续核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或其至少11个连续核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或其至少12个连续核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或其至少13个连续核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或其至少14个连续核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为选自由以下项组成的组的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，或其至少15个连续核苷酸。
在一些实施例中，连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ IDNO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38。
在一些实施例中，连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。
在一些实施例中，连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：35。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为SEQ ID NO：11。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为SEQ ID NO：15。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为SEQ ID NO：16。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为SEQ ID NO：28。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为SEQ ID NO：31。
在一些实施例中，连续核苷酸序列为SEQ ID NO：35。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含1个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含3个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含4个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含5个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含6个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含7个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含8个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含9个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含10个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含11个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含12个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含13个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含14个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含15个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含16个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含17个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含多个硫代磷酸酯核苷酸间键，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的核苷酸间键经修饰。
在一些实施例中，位于连续核苷酸序列的核苷酸之间的所有核苷酸间键都是经修饰的。
在一些实施例中，反义寡核苷酸中存在的所有核苷酸间键均选自硫代磷酸酯核苷酸间键和甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含一个或多个2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32、33、34、35、36、37、38、39或40个2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷。
在一些实施例中，连续核苷酸序列的核苷为2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷。
本发明提供了一种被分离、纯化或制造的反义寡核苷酸。
在一些实施例中，反义寡核苷酸为反义寡核苷酸混聚物或全聚物或包含反义寡核苷酸混聚物或全聚物。在一些实施方案中，连续核苷酸序列为混聚物或全聚物。
本发明提供了包含根据本发明的反义寡核苷酸以及与所述反义寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分的缀合物。
本发明提供了共价连接至至少一个缀合物部分的反义寡核苷酸。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用盐。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸呈药用盐的形式。
在一些实施例中，药用盐为钠盐、钾盐或铵盐。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用钠盐。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用钾盐。
本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用铵盐。
本发明提供了药物组合物，其包含：本发明的反义寡核苷酸，或本发明的缀合物，以及药用的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或辅助剂。
本发明提供药物组合物，其包含：本发明的反义寡核苷酸，或本发明的缀合物，以及药用盐。例如，该盐可以包含金属阳离子，诸如钠盐、钾盐或铵盐。
本发明提供了根据本发明的药物组合物，其中该药物组合物包含：本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物，或本发明的药用盐，以及水性稀释剂或溶剂。
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、或本发明的药用盐的溶液，诸如磷酸盐缓冲生理盐水。适当地，本发明的溶液诸如磷酸盐缓冲盐水溶液为无菌溶液。
本发明提供了一种用于增强表达颗粒蛋白前体的细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达的方法，该方法包括向该细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。在一些实施例中，该方法为体外方法。在一些实施例中，该方法为体内方法。
在一些实施例中，该细胞为人细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供了用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患的方法，其包括向患有或易患颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。
本发明提供用于治疗或预防神经系统疾病的方法，其包括向患有或易患神经系统疾病的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物。在一个实施例中，神经系统疾病可以为TDP-43病理状况。
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸，其用作药物。
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸，其用于疗法中。
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用作药物。
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于疗法中。
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于治疗神经系统疾病。在一个实施例中，神经系统疾病可以为TDP-43病理状况。
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物，其用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。
本发明提供了本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防神经系统疾病。在一个实施例中，神经系统疾病可以为TDP-43病理状况。
本发明提供本发明的反义寡核苷酸、或本发明的缀合物、或本发明的盐、或本发明的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾患。
在一些实施例中，本发明的方法、用途或供使用的反义寡核苷酸用于治疗额颞叶痴呆(FTD)、神经病理性额颞叶变性或神经发炎。在其他实施例中，本发明的方法、用途或供使用的反义寡核苷酸用于治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病、脊髓小脑共济失调3型、肌病或慢性创伤性脑病。
在一个方面，本发明包括一种寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有以下结构：
在一个方面，本发明包括一种寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有以下结构：
在一个方面，本发明包括一种寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有以下结构：
在一个方面，本发明包括一种寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有以下结构：
在一个方面，本发明包括一种寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有以下结构：
在一个方面，本发明包括一种寡核苷酸颗粒蛋白前体激动剂，其具有以下结构：
另一方面，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物GGTCAAGAATGGTGTGGT(SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：31或SEQ ID NO：35)，其中所有核苷均为2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷，C为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键均选自硫代磷酸酯核苷间键和甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
在另一方面，本发明包括一种反义寡核苷酸，其中该寡核苷酸为寡核苷酸化合物GGTCAAGAATGGTGTGGT(SEQ ID NO：2)，其中所有核苷均为2′-0-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷，C为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键均为甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
附图说明
图1a：ddPCR数据，该数据量化了小胶质细胞相对于PBS处理的细胞在5天的剥裸后GRN mRNA中内含子1保留的5′UTR剪接变体的丰度。灰色条量化了用3μM处理后内含子1保留(Intl-Ex2)的剪接变体的丰度，且黑色条量化了用10μM处理后内含子1保留(Int1-Ex2)的剪接变体的丰度。
图1b：ddPCR数据，该数据量化了小胶质细胞相对于PBS处理的细胞在5天的剥裸后GRN mRNA中的5′UTR Exon1-Exon2剪接变体的丰度。灰色条量化了用3μM处理后剪接变体Exon1-Exon2(Ex1-Ex2)的丰度，且黑色条量化了用10μM处理后剪接变体Exon1-Exon2(Ex1-Ex2)的丰度。
定义
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合核苷也可称为核酸分子或寡聚物。
寡核苷酸通常是在实验室中通过先经固相化学合成后再加以纯化和分离而制备的。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。
本发明的寡核苷酸为人造的，并且为化学合成的，并且通常为经过纯化或分离的。
本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷，诸如2′-MOE核苷，并且可进一步包含一个或多个另外或额外经修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷。
本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷间键，诸如一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键和一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”被定义为能够通过与靶核酸杂交，特别地与靶核酸上的连续序列杂交而调节靶基因的表达的寡核苷酸。
反义寡核苷酸实质上并不是双链的，并且因此不为siRNA或shRNA。
本发明的反义寡核苷酸可以为单链的。应了解的是，本发明的单链寡核苷酸可形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要其内部或其间自互补的程度低于横跨寡核苷酸的全长的大约50％。
在某些情况下，本发明的反义寡核苷酸可被称为寡核苷酸。
在一些实施例中，本发明的单链反义寡核苷酸可以不含RNA核苷。
有利地，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2′糖修饰的核苷。此外，在本发明的一些反义寡核苷酸中，可能有利的是未修饰的核苷为DNA核苷。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指寡核苷酸的与靶核酸互补的区域，其可以为或可以包含寡核苷酸基序序列。在本文中，该术语与“连续核碱基序列”可互换使用。
在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷构成连续核苷酸序列。连续核苷酸序列是本发明的寡核苷酸中核苷酸的序列，其与靶核酸或靶序列或靶位点序列互补，并且在一些情况下完全互补。术语“靶核酸”、“靶序列”和“靶位点序列”可互换使用以指被连续核苷酸序列结合的序列。
在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO：1。
SEQ ID NO：1是人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2的序列。
在一些实施例中，靶序列为或包含SEQ ID NO：1的核苷酸449至核苷酸466。
在一些实施例中，靶序列为或包含SEQ ID NO：39。
在一些实施例中，靶序列为SEQ ID NO：39。
在一些实施例中，靶序列包含SEQ ID NO：39。
在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，并且可任选地包含其他一个或多个核苷酸，例如可用于将官能团(例如，缀合物基团)连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。
核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。应理解的是，该寡核苷酸的连续核苷酸序列不能比寡核苷酸本身更长，并且该寡核苷酸不能比连续核苷酸序列更短。
剪接调节位点
如本文所用，术语“剪接调节位点”定义为mRNA前体转录本内影响该mRNA前体剪接的位点。
在一些实施例中，剪接调节位点可调节人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2中的一者或多者的剪接。
核苷酸和核苷
核苷酸和核苷为寡核苷酸和聚核苷酸的建构块，并且为了本发明的目的，包括天然存在和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸，包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可互换称为“单元”或“单体”。
经修饰的核苷酸
如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。
本发明的反义寡核苷酸可包含含有一个或多个2'-MOE核苷的连续核苷酸序列。
本发明的反义寡核苷酸可包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列包含一个或多个另外或额外经修饰的核苷，该核苷包含经修饰的糖部分。
术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。
在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(WatsonCrick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。
可以在本发明的化合物中使用的示例性经修饰的核苷包括LNA、2′-O-MOE和吗啉代核苷类似物。
甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键
本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷间键，该核苷间键为甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键的磷酸二酯键中的一个非桥接氧原子被甲磺酰基氨基基团替换，该键与其他氨基磷酸酯和烷基膦酸酯键的不同之处在于，它在磷酸酯主链上保留负电荷，但缺乏带负电的硫原子，而硫原子为用于ASO-蛋白质相互作用的主要药效团。
在文献中，甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键也可称为甲磺酰氨基磷酸酯、甲磺酰基氨基磷酸酯或N-甲磺酰基氨基磷酸酯，其中甲磺酰为甲磺酰基的缩写，且“N-”指定甲磺酰基的位置是在氮上。本文中这些术语可以互换使用。
在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键为甲磺酰基，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％、诸如至少90％、诸如至少95％或更多的核苷间键为甲磺酰基。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含1个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含2个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含3个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含4个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含5个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含6个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含7个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含8个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含9个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含10个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含11个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含12个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含13个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含14个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含15个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含16个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含17个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
有利地，反义寡核苷酸的连续核苷酸序列中的所有核苷间键可以是甲磺酰基，或反义寡核苷酸的所有核苷间键可以是甲磺酰基键。
经修饰的核苷间键
本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列可包含一个或多个经修饰的核苷间键。对于技术人员来说显而易见的是，由于本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列必须包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键，替代性地经修饰的核苷间键将是另外的经修饰的核苷间键。
如本领域技术人员所通常理解，术语“经修饰的核苷间键”被定义为除磷酸二酯(PO)键以外，可将两个核苷共价连接在一起的键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的核苷酸间键经修饰。
在一些实施例中，位于连续核苷酸序列的核苷酸之间的所有核苷酸间键都是经修饰的。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含多个硫代磷酸酯核苷酸间键，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，反义寡核苷酸中存在的所有核苷酸间键均选自硫代磷酸酯核苷酸间键和甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
核碱基
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基也涵盖与天然存在核碱基不同但在核酸杂交期间具有功能性的经修饰的核碱基。在该上下文中，“核碱基”指的是诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤的天然存在核碱基以及非天然存在变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry增刊371.4.1。
在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶，诸如经取代的嘌呤或经取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2′-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
该核碱基部分可通过针对每个对应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括等效功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，5-甲基胞嘧啶LNA核苷可用于LNA间隔聚体。
经修饰的的寡核苷酸
本发明的反义寡核苷酸可为经修饰的寡核苷酸。
术语经修饰的寡核苷酸描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合寡核苷酸”是已经在文献中用于描述包含糖修饰的核苷和DNA核苷的寡核苷酸的术语。在一些实施例中，可能有利的是，本发明的反义寡核苷酸为嵌合寡核苷酸。
互补性
术语“互补性”描绘核苷/核苷酸的瓦特生-克里克(Watson-Crick)碱基配对能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。
应当理解，寡核苷酸可包含具有经修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，并且因此，术语互补性包括未经修饰的核碱基与修饰的核碱基之间的沃森克里克(Watson Crick)碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of ChemicalResearch第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic AcidChemistry增刊371.4.1)。
如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5'-3′和3'-5′的寡核苷酸序列比对时)互补(形成Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在此类比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称为错配。不允许在连续核苷酸序列的％互补性的计算中进行插入和删除。应当理解的是，在确定互补性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5′-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
在本发明中，术语“互补”要求反义寡核苷酸与人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本至少约80％互补，或至少约90％互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸可以与人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％互补。换句话讲，对于一些实施例，本发明的反义寡核苷酸可包括一个、二个、三个或更多个错配，其中错配为本发明的反义寡核苷酸内的不与其靶标碱基配对的核苷酸。
术语“完全互补”是指100％互补性。
本发明的反义寡核苷酸与人颗粒蛋白前体的mRNA前体互补。本发明的反义寡核苷酸有利地与人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的内含子1序列互补。人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2的序列在本文中示例为SEQ ID NO：1。本文提供的SEQ ID NO：1为参考序列，并且应当理解，靶颗粒蛋白前体核酸可以为SEQ ID NO：1的等位基因变体，诸如包含人颗粒蛋白前体核酸序列中的一个或多个多态性的等位基因变体。
同一性
如本文所用的术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。
因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以寡核苷酸的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性的百分比＝(匹配数x 100)/对齐区域(例如连续核苷酸序列)的长度。不允许在连续核苷酸序列的同一性的百分比的计算中进行插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
杂交
如本文所用的术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如反义寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间的结合亲和力为杂交的强度。它通常用解链温度(Tm)来描述，解链温度(Tm)定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm与亲和力并非严格成正比(Mergny和Lacroix，2003，Oligonucleotides 13：515-537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(Kd)通过ΔG°＝-RTln(Kd)相关，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸与该靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°体现该寡核苷酸与该靶核酸之间的强势杂交。ΔG°为与其中含水浓度为1M、pH为7并且温度为37℃的反应相关联的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交为自发性反应，而自发性反应的ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验测量，例如，通过利用如Hansen等人，1965，Chem.Comm.36-38和Holdgate等人，2005，Drug Discov.Today中所述的等温滴定量热法(ITC)方法测量。技术人员将知道，商用设备可用于ΔG°测量。ΔG°也可以通过使用如SantaLucia，1998，Proc NatlAcad Sci USA.95：1460-1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995，Biochemistry 34：11211-11216和McTigue等人，2004，Biochemistry 43：5388-5405描述的推导的热力学参数进行数值上的估计。
在一些实施例中，对于长度为10个至30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的反义寡核苷酸以低于-10kcal的估计ΔG°值与靶核酸杂交。
在一些实施例中，该杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°来测量。对于长度为8个至30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可以低于-10kcal、诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal以及诸如低于-25kcal的范围的估计ΔG°值与靶核酸杂交。在一些实施例中，寡核苷酸以-10至-60kcal、诸如-12至-40kcal、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal、诸如-18至-25kcal的估计ΔG°值与靶核酸杂交。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，当并入所述寡核苷酸中时，可增强所述寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一个修饰的核苷的解链温度增加介于+0.5℃至+12℃之间，更优选地介于+1.5℃至+10℃之间并且最优选地介于+3℃至+8℃之间。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2′取代的核苷以及锁核酸(LNA)(参见例如Freier&A1tmann，1997，Nucl.Acid Res.，25，4429-4443和Uhlmann，2000，Curr.Opinion in DrugDevelopment，3(2)，293-213)。
糖修饰
已经制成了众多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的时为了改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
这些修饰包括这样的修饰，其中对核糖环结构进行修饰，例如替代为己糖环(HNA)或双环，其通常在核糖环(LNA)上的C2与C4碳原子之间具有双基桥(biradicle bridge)的双环，或通常在C2与C3碳原子之间缺少键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO201 1/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷也包括将糖部分取代为非糖部分的核苷，例如就肽核酸(PNA)或吗啉基核酸而言。
糖修饰还包括经由将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2'-OH基团而进行的修饰。例如，可以在2′、3′、4′或5′位置引入取代基。
2′糖修饰的核苷
2′糖修饰的核苷是一种核苷，其在2′位置具有除H或-OH以外的取代基(2′取代的核苷)或包含能够在2′碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2′连接双基，诸如LNA(2′-4′双基桥连)核苷。
事实上，2′糖基取代核苷的开发已经得到了广泛的关注，并且许多2′取代核苷被发现当并入寡核苷酸中时，具有有益的特性。例如，2′修饰的糖可提供对寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。
2′取代的修饰的核苷的实例是2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann，1997，Nucl.Acid Res.，25，4429-4443和Uhlmann，2000，Curr.Opinion in Drug Development，3(2)，293-213，以及Deleavey和Damha，2012，Chemistry and Biology，19，937。下面为一些2′取代的修饰的核苷的示意图。
关于本发明，2′-取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2′桥连的核苷。
锁核酸核苷(LNA核苷)
“LNA核苷”为经2′-修饰的核苷，该核苷包含联接所述核苷的核糖糖环的C2′和C4′的双自由基(也被称为“2'-4′桥”)，该双自由基约束或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥接核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA并入寡核苷酸中用于互补RNA或DNA分子时，锁定核糖的构造与提升杂交亲和力(双链体稳定化)相关联。这可以通过测量寡核苷酸/补充双链体的融化温度来进行常规的测定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12，73-76，Seth等人，2010，J.Org.Chem.，第75(5)卷第1569-81页，及Mitsuoka等人，2009，Nucleic Acids Research，37(4)，1225-1238，以及Wan和Seth，2016，J.Medical Chemistry，59，9645-9667中。
进一步非限制性地，例示性LNA核苷公开于方案1中。
方案1：
特定LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6′-甲基-β-D-氧基LNA，诸如(S)-6′-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。
一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。
吗啉代寡核苷酸
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含吗啉代核苷或由吗啉代核苷组成(即，是吗啉代寡聚物和作为磷酸二氨基酯吗啉代寡聚物(PMO))。剪接调节吗啉代寡核苷酸已被批准用于临床-参见例如依特普森(eteplirsen)，靶向DMD中框移突变的30nt吗啉代寡核苷酸，用于治疗杜氏肌营养不良。吗啉代寡核苷酸具有附着在六元吗啉环上而不是核糖上的核碱基，诸如通过磷酸二氨基酯基团连接的亚甲基吗啉环，例如由以下4个连续的吗啉代核苷酸所说明：
在一些实施例中，本发明的吗啉代寡核苷酸的长度可以是例如20至40个吗啉代核苷酸，诸如长度为25至35个吗啉代核苷酸。
RNA酶H活性和募集
反义寡核苷酸的RNA酶H活性指的是当反义寡核苷酸与互补RNA分子在双链体中时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，其可以用于确定募集RNA酶H的能力。通常，如果当提供有互补靶核酸序列时，寡核苷酸具有初始速率(如以pmol/l/min为单位所测量的)为当使用与被测试的经修饰的寡核苷酸具有相同碱基序列，但仅仅寡核苷酸中所有单体之间含有具有硫代磷酸酯键的DNA单体，且使用由WO01/23613(特此通过引用并入)的实例91至95所提供的方法所测定的初始速率的至少5％、诸如至少10％、至少20％或多于20％，则将寡核苷酸视为能够募集RNA酶H。针对测定RHase H活性中的用途，来自瑞士卢塞恩Lubio Science GmbH的重组型RNA酶H1是可用的。
已知DNA寡核苷酸可有效募集RNA酶H，间隔聚体寡核苷酸也是如此，其包含DNA核苷区域(通常至少5个或6个连续DNA核苷)，其5′和3′侧接包含2′糖修饰的核苷(通常高亲和力2′糖修饰的核苷，诸如2-O-MOE和/或LNA)的区域。对于剪接的有效调节，前体mRNA的降解是非所需的，并且因此优选地，避免靶标的RNA酶H降解。因此，本发明的反义寡核苷酸并非RNaseH募集间隔聚体寡核苷酸。
可以通过限制寡核苷酸中连续DNA核苷酸的数量来避免RNA酶H募集，因此可以使用全聚物设计。
混聚物和全聚物
对于剪接调节，通常有利的是使用不募集RNA酶H的反义寡核苷酸。由于RNaseH活性需要DNA核苷酸的连续序列，因此反义寡核苷酸的RNaseH活性可通过设计不包含多于3个或多于4个的连续DNA核苷的区域的反义寡核苷酸来实现。这可以通过使用具有混聚物设计的反义寡核苷酸或其连续核苷区域(其包含糖修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷)以及短的DNA核苷区(诸如1个、2个或3个DNA核苷)来实现。混聚物在本文中通过“每两个”设计(其中核苷在1个LNA与1个DNA核苷之间交替，例如LDLDLDLDLDLDLDLL，具有5′端和3′端LNA核苷)和“每三个”设计(诸如LDDLDDLDDLDDLDDL，其中每三个核苷为LNA核苷)来举例说明。
全聚物为不包含DNA或RNA核苷的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列，并且可以例如仅包含2'-O-MOE核苷，诸如完全MOE硫代磷酸酯，例如MMMMMMMMMMMMMMMMMMMM，其中M＝2'-O-MOE，其被报告为用于治疗用途的有效剪接调节剂。
替代性地，混聚物可包含经修饰的核苷的混合物，诸如MLMLMLMLMLMLMLMLMLML，其中L＝LNA并且M＝2'-O-MOE核苷。有利地，混聚物和全聚物中的核苷间核苷可包括一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键和一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键，或者混聚物中的大部分核苷键可以是硫代磷酸酯核苷酸间键和甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。混聚物和全聚物可包含其他核苷间键，诸如磷酸二酯或硫代磷酸酯(作为示例)。
寡核苷酸中的区域D′或D″
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可包含寡核苷酸的连续核苷酸序列以及其他5′和/或3′核苷或由其组成，该寡核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸(诸如全聚物区域)互补。另外的5′和/或3′核苷可与或不与靶核酸互补、诸如完全互补。此类另外的5′和/或3′核苷在本文中可称为区域D′和D″。
出于将连续核苷酸序列(诸如全聚物)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D′或D″。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。替代性地，其可用于提供核酸外切酶保护或为了合成或制造。
区域D′或D″可独立包含或具有1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸，其可与靶核酸互补或不互补。邻接F或F′区域的核苷酸不为经糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或其碱基修饰的版本。D’或D″区域可用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5′和/或3′端核苷酸与磷酸二酯键连接，并且为DNA或RNA。适于用作区域D′或D″的核苷酸基生物可切割接头公开于WO2014/076195，举例来说可为磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。生物可切割接头在聚寡核苷酸构造中的用途公开于WO2015/113922，在该文献中它们用于连接单一寡核苷酸中的多重反义构造。
在一个实施例中，本发明的反义寡核苷酸除构成全聚物的连续核苷酸序列外还包含区域D′和/或D″。
在一些实施例中，位于区域D′或D″与全聚物区域之间的核苷间键为磷酸二酯键。
缀合物
本发明包括一种反义寡核苷酸，其共价连接至至少一个缀合物部分。在一些实施例中，这可以称为本发明的缀合物。
如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的反义寡核苷酸。缀合物部分可以与反义寡核苷酸共价连接，任选地经由接头(诸如区域D′或D″)基团。
寡核苷酸缀合物及其合成已经报导于Manoharan在Antisense Drug Technology，Principles，Strategies，and Applications，S.T.Crooke编辑，第16章，Marcel Dekker，Inc.，2001以及Manoharan，2002，Antisense and Nucleic Acid Drug Development，12，103的综合评论中。
在一些实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物(例如GalNAc)、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或其组合组成的组。
接头
键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段连接。缀合物部分可直接或通过连接部分(例如接头或系链)附接到反义寡核苷酸。接头可将第三区域，例如缀合物部分(区域C)，共价连接至第一区域，例如与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A)。
在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或反义寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)与缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。
区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理不稳定的接头经历化学转变(例如，裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或药剂，以及哺乳动物细胞内发现或类似于哺乳动物细胞中遇到的盐浓度。哺乳动物细胞内条件也包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性(诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)的存在。在一个实施例中，该生物可裂解接头易受S1核酸酶裂解影响。在一些实施例中，核酸酶敏感性接头包含1个至5个核苷，诸如包含至少两个连续磷酸二酯键的一个或多个DNA核苷。含有磷酸二酯的可生物裂解接头更详细地描述于WO 2014/076195中。
区域Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)与寡核苷酸(区域A或第一区域)共价连接的接头。区域Y接头可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的反义寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，接头(区域Y)为氨基烷基(诸如C2-C36氨基烷基基团)，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头(区域Y)为C6氨基烷基基团。
治疗
如本文所用，术语‘治疗’是指既存疾病(例如本文所指的疾病或疾患)的治疗或疾病的阻止(即预防)。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。
TDP-43病理
TDP-43病理是一种与TDP-43表达减少或异常相关联的疾病，其通常与细胞质TDP-43(特别是过度磷酸化和泛素化TDP-43)的增加相关联。
与TDP-43病理相关联的疾病包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病诸如脊髓小脑共济失调3、肌病或慢性创伤性脑病。
具体实施方式
发明人已经确定，用反义寡核苷酸靶向颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本可以增加颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接mRNA的表达，降低颗粒蛋白前体内含子1-外显子2剪接mRNA(保留内含子1的271核苷酸5′片段)的表达和/或改变外显子1-外显子2与内含子1-外显子2mRNA的比例。当使用包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键的反义寡核苷酸时尤其是这种情况。
本文描述的是存在于人类颗粒蛋白前体的mRNA前体上的靶位点，其可以被反义寡核苷酸靶向。还描述了与这些靶位点互补，诸如完全互补的反义寡核苷酸。
不希望受理论束缚，认为本发明的反义寡核苷酸可以通过结合到这些区域并且影响(诸如增加)外显子1-外显子2剪接变体的产生，增加颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接mRNA的表达，降低颗粒蛋白前体内含子1-外显子1剪接mRNA的表达和/或改变外显子1-外显子2与内含子1-外显子2mRNA的比率。
寡核苷酸诸如募集单链反义寡核苷酸或siRNA的RNA酶H在本领域广泛用于抑制靶标RNA，即用作其互补核酸靶标的拮抗剂。
本发明的反义寡核苷酸可被描述为调节剂，即它们改变其互补靶、颗粒蛋白前体的mRNA前体的特定剪接变体的表达，并且由此增加活性颗粒蛋白前体蛋白的产生。
减少颗粒蛋白前体内含子1-外显子2剪接变体的表达是可取的，因为在成熟的mRNA序列中包含一个内含子，诸如内含子1，会导致无义介导的mRNA衰变(NMD)。
增强颗粒蛋白前体外显子1-外显子2上在保留内含子1的5′部分的剪接变体的表达是可取的，因为外显子1-外显子2剪接变体不包括内含子1的271个核苷酸片段，在外显子2(开放阅读框)中的经典下游AUG上游有两个AUG位点。来自这两个上游AUG位点的翻译不会编码颗粒蛋白前体蛋白，并且由于提前终止密码子，转录本可能会经历无义介导的mRNA衰变(NMD)。将剪接更改为外显子1-外显子2剪接变体将导致颗粒蛋白前体蛋白的活性版本的翻译。颗粒蛋白前体是一种神经保护蛋白，并且增加其产量可用于治疗一系列神经系统疾患，诸如TDP-43病理。
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以增强外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的产生。
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸情况下的外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生，可以将外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生提高至少约10％。在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于在不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生，可以将外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生提高至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或更多。
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以减少内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生。
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生，可以将内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生减少至少约10％。在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生，可以将内含子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体mRNA的产生减少至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或更多。
颗粒蛋白前体外显子1-外显子2剪接变体的增强表达应导致颗粒蛋白前体蛋白活性版本的翻译。在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的颗粒蛋白前体蛋白的产生，可以使颗粒蛋白前体蛋白的产生增加至少约10％。在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的颗粒蛋白前体蛋白的产生，可以使颗粒蛋白前体蛋白的产生增加至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或更多。
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以改变外显子1-外显子2与内含子-外显子2颗粒蛋白前体mRNA的比率。
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mRNA的比率，可以改变外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mRNA的比率至少约10％。在其他实施例中，本发明的反义寡核苷酸相对于不存在本发明的反义寡核苷酸的情况下的外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mRNA的比率，可以改变外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mRNA的比率至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、在至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％或更多。
在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可将外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mRNA的比率改变为至少约1.2。在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可以将外显子1-外显子2与内含子1-外显子2颗粒蛋白前体mRNA的比率改变为至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9、至少约2.0或更多。
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列在长度上包含10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个连续核苷酸或由其组成。
在一些实施例中，反义寡核苷酸的整个核苷酸序列为连续核苷酸序列。
在一个实施例中，连续核苷酸序列可以是选自由以下项组成的组的序列：SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQID NO：37。本发明还设想到了这些连续核苷酸序列的片段，包括其至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个连续核苷酸的片段。
在一个实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或由其组成：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ IDNO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。
应当理解，SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ IDNQ：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：35，SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37中所示的序列可以包括在碱基配对中起所示核碱基作用的经修饰的核碱基，例如可使用5-甲基胞嘧啶来代替甲基胞嘧啶。肌苷可用作通用碱基。
在一些实施例中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为8至30个或8至40个的核苷酸或由其组成，其与选自由以下项组成的组的序列具有至少90％同一性、优选100％同一性：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36和SEQ ID NO：37。
在一些实施例中，反义寡核苷酸的长度可以为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。
应当理解，连续核碱基序列(基序序列)可经修饰以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。
将修饰的核苷(例如高亲和力修饰的核苷)掺入寡核苷酸序列中的模式通常称为寡核苷酸设计。
本发明的反义寡核苷酸经设计具有经修饰的核苷和DNA核苷。有利地，使用高亲和力修饰的核苷。
在一实施方案中，反义寡核苷酸包含至少1个经修饰的核苷，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个经修饰的核苷。
在一实施方案中，反义寡核苷酸包含1至10个经修饰的核苷，如2至9个经修饰的核苷、如3至8个经修饰的核苷、如4至7个经修饰的核苷、如6或7个经修饰的核苷。合适的修饰在“定义”部分的“经修饰的核苷”、“高亲和力修饰的核苷”、“糖修饰”、“2′糖修饰”和“锁定的核酸(LNA)”下进行了描述。
在一实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，如2’糖修饰的核苷。优选地，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个2’糖修饰的核苷，其独立地选自2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。
实例
实例1
将hiPSC衍生的小胶质细胞(iCell小胶质细胞试剂盒，01279，目录号R1131)接种(n＝1)在聚-D-赖氨酸包被的96孔板(Greiner目录号#655946)中，每孔具有20000个细胞，200μL，并且用3μM和10μM浓度的SEQ ID NO 2至38处理5天。
通过添加125μL RLT缓冲液(Qiagen)并且使用来自Qiagen的RNeasy97试剂盒和方案提取RNA。cDNA合成使用4μL输入RNA并且使用用于RT-qPCR(Bio-Rad)的IScript高级cDNA合成试剂盒进行，并且根据制造商的方案，2μL RNA用作数字液滴PCR的输入，其使用ddPCRsupermix作为探针(无dUTP)(Bio-Rad)。使用了以下引物和探针(IDT)：GRN外显子1-外显子2(FAM)：
引物1：GCTGCTGCCCAAGGACCGCGGA(SEQ ID NO：40)
引物2：GCCCTGCTGTTAAGGCCACCCA(SEQ ID NO：41)
探针/56-FAM/GGACGCAGG/ZEN/CAGACCATGTGGACCCTG/3IABkFQ/(SEQ ID NO：42)
GRN内含子1-外显子2(HEX)：
引物1：CCAAAGCAGGGACCACACCATTCTT(SEQ ID NO：43)
引物2：GCCCTGCTGTTAAGGCCACCCA(SEQ ID NO：44)
探针/5HEX/CCCAGCTCC/ZEN/ACCCCTGTCGGCAGACCATG/3IABkFQ/(SEQ ID NO：45)
GAPDH：
GAPDH(FAM、Hs.PT.39a.22214836、IDT)
GAPDH(HEX、Hs.PT.39a.22214836、IDT)
外显子1-外显子2GRN mRNA和内含子1-外显子2GRN mRNA浓度相对于管家基因GAPDH使用QuantaSoft软件(Bio-Rad)进行量化。
结果在图1a和1b中示出。与SEQ ID NO：2相比，在3μM和10μM两种剂量下，SEQ IDNO 5、6、7、9、10、11、12、14、15、16、19、20、21、22、23、24、25、27、28、30、31、34、35、36和37示出了内含子1保留(Int1-Ex2)的有效且改进的跳过以及外显子1-外显子2(Ex1-Ex2)剪接变体的可能略微增加。SEQ ID NQ：33测试了两次，且因此图1a和1b中均有重复的结果。
化合物表
HELM符号
本发明的反义寡核苷酸(化合物)以及本发明的反义寡核苷酸缀合物(缀合物)在本文中使用大分子分层编辑语言(HELM)符号进行描述。
HELM为设计用于描绘大分子的结构的符号格式。HELM符号的完整细节可见于www.pistoiaalliance.org/helm-tools/，在Zhang等人，2012，J.Chem.Inf.Model.，52，2796-2806(其最初描述了HELM符号)中以及在Milton等人，2017，J.Chem Inf.Model.，57，1233-1239(其描述HELM 2.0版本)中。
简而言之，大分子被描绘为“HELM串”，其被划分成部分。第一部分列出包含在大分子中的分子。第二部分列出大分子内分子之间的连接。一个或多个货币符号$标记HELM串的一部分的结尾。
本发明的化合物由HELM串表示，该HELM串由定义寡核苷酸的单个第一部分组成。
HELM串的第一部分中列出的每个分子均被给予识别符(例如，“RNA1”针对核酸)，并且由紧跟在识别符之后的大括号{}中的符号来定义分子的结构。用于定义本发明的化合物和缀合物的HELM串的第一部分中的大括号{}中的每个分子的结构的HELM符号如下：
[MOE](G)为2′-O-(2-甲氧基)乙基RNA鸟嘌呤核苷
[MOE](U)为2′-O-(2-甲氧基)乙基RNA尿嘧啶核苷
[MOE](A)为2′-O-(2-甲氧基)乙基RNA腺嘌呤核苷
[MOE]([5meC])为2′-O-(2-甲氧基)乙基RNA 5-甲基胞嘧啶核苷
MOE](T)为2′-O-(2-甲氧基)乙基胸腺嘧啶核苷
[sP]为硫代磷酸酯主链
[MsNP]为甲磺酰基氨基磷酸酯主链
如上所述，在本发明的上下文中，第二部分仅用于表示本发明的缀合物的HELM串中。第二部分列出在第一部分中列出的分子之间的连接。通过列出分子的识别符来定义每对连接的分子，并且然后定义它们之间的附接点(即分子之间存在共价键的点)。
HELM符号的实例
例如，SEQ ID NO：2由以下HELM串(如实例1的化合物表中所描绘)表示：
RNA1{[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE]([5meC])[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](A)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](T)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](G)[sP].[MOE](T)}$$$$V2.0
该HELM串由单个部分组成，列出SEQ ID NO 2的寡核苷酸。初始“RNA1”表示分子为核酸(寡核苷酸)。寡核苷酸的结构在RNA1之后的大括号{}中使用HELM符号来表示。“$$$$”标记该部分的结尾以及整个HELM串的结尾。“V2.0”表示使用HELM 2.0版本。
HELM注释键：
[MOE](G)为2′-O-(2-甲氧基)乙基RNA鸟嘌呤核苷
[MOE](U)为2′-O-(2-甲氧基)乙基RNA尿嘧啶核苷
[MOE](A)为2′-O-(2-甲氧基)乙基RNA腺嘌呤核苷
[MOE]([5meC])为2′-O-(2-甲氧基)乙基RNA 5-甲基胞嘧啶核苷
MOE](T)为2′-O-(2-甲氧基)乙基胸腺嘧啶核苷
[sP]为硫代磷酸酯主链
[MsNP]为甲磺酰基氨基磷酸酯主链

Claims (34)

1.一种反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为8至40个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的剪接调节位点互补，其中所述连续核苷酸序列包含一个或多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本包含所述人颗粒蛋白前体的mRNA前体转录本的外显子1、内含子1和外显子2序列(SEQ IDNO：1)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与SEQID NO：39互补。
4.根据权利要求3所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37和SEQID NO：38，或其至少8个连续核苷酸。
5.根据权利要求4所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ IDNO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ IDNO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36和SEQ ID NO：37，或其至少8个连续核苷酸。
6.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：35，或其至少8个连续核苷酸。
7.根据权利要求6所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列为SEQ ID NO：11。
8.根据权利要求6所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列为SEQ ID NO：15。
9.根据权利要求6所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列为SEQ ID NO：16。
10.根据权利要求6所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列为SEQ ID NO：28。
11.根据权利要求6所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列为SEQ ID NO：31。
12.根据权利要求6所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列为SEQ ID NO：35。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或更多个甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的核苷酸间键为经修饰的。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的反义寡核苷酸，其中位于所述连续核苷酸序列上的核苷酸之间的所有所述核苷酸间键均为经修饰的。
18.根据权利要求17所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸中存在的所有所述核苷酸间键均选自硫代磷酸酯核苷酸间键和甲磺酰基氨基磷酸酯核苷酸间键。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷。
20.根据权利要求19所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含一个或多个2'-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷。
21.根据权利要求20所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32、33、34、35、36、37、38、39或40个2'-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列的所有所述核苷均为2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷。
24.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
25.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
26.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
27.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
28.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
29.一种反义寡核苷酸，其具有以下结构：
30.一种反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸为寡核苷酸化合物GGTCAAGAATGGTGTGGT(SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：35)，其中所有核苷均为2'-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷，C为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键均选自硫代磷酸酯核苷间键和甲磺酰基氨基磷酸酯核苷间键。
31.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至30中任一项所述的反义寡核苷酸以及可药用的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或辅助剂。
32.根据权利要求1至30中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求31所述的药物组合物，其用于在神经系统疾病的治疗中使用。
33.根据权利要求1至30中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求31所述的药物组合物，其用于在颗粒蛋白前体单倍剂量不足或相关疾病的治疗中使用。
34.一种用于增强表达颗粒蛋白前体的细胞中外显子1-外显子2颗粒蛋白前体剪接变体的表达的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1至30中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求31所述的药物组合物。
CN202380047356.8A 2022-06-17 2023-06-15 靶向颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸 Pending CN119365600A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22179662 2022-06-17
EP22179662.6 2022-06-17
PCT/EP2023/066081 WO2023242324A1 (en) 2022-06-17 2023-06-15 Antisense oligonucleotides for targeting progranulin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN119365600A true CN119365600A (zh) 2025-01-24

Family

ID=82115614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202380047356.8A Pending CN119365600A (zh) 2022-06-17 2023-06-15 靶向颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN119365600A (zh)
WO (1) WO2023242324A1 (zh)

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
DE04020014T1 (de) 1997-09-12 2006-01-26 Exiqon A/S Bi-zyklische - Nukleosid,Nnukleotid und Oligonukleotid-Analoga
EP1152009B2 (en) 1999-02-12 2017-09-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
PT1178999E (pt) 1999-05-04 2007-06-26 Santaris Pharma As Análogos de l-ribo-lna
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
DK2284269T3 (en) 2002-11-18 2017-10-23 Roche Innovation Ct Copenhagen As Antisense design
DE602007009487D1 (de) 2006-01-27 2010-11-11 Isis Pharmaceutical Inc 6-modifizierte bicyclische nukleinsäureanaloga
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249349B2 (en) 2006-05-11 2012-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-Modified bicyclic nucleic acid analogs
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
ES2386492T3 (es) 2007-06-08 2012-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
WO2009006478A2 (en) 2007-07-05 2009-01-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
WO2011156202A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2 '-amino and 2 '-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
KR20150083920A (ko) 2012-11-15 2015-07-20 로슈 이노베이션 센터 코펜하겐 에이/에스 항 apob 안티센스 접합체 화합물
WO2015113922A1 (en) 2014-01-30 2015-08-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Poly oligomer compound with biocleavable conjugates
US20220154182A1 (en) 2019-03-20 2022-05-19 President And Fellows Of Harvard College Antisense oligonucleotide-based progranulin augmentation therapy in neurodegenerative diseases
EP4013767A4 (en) * 2019-08-15 2023-10-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUND-MODIFIED OLIGOMERIC COMPOUNDS AND USES THEREOF
CN116096888A (zh) * 2020-05-13 2023-05-09 豪夫迈·罗氏有限公司 靶向颗粒蛋白前体的寡核苷酸激动剂

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023242324A1 (en) 2023-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024056820A (ja) Ｓｃｎ９ａ発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
JP2023534557A (ja) Ｒｎａ結合タンパク質部位を標的とするオリゴヌクレオチド
CN112912500A (zh) 用于调节atxn2表达的寡核苷酸
JP2025501457A (ja) Ａｃｔｌ６ｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
JP2025500335A (ja) Ｕｎｃ１３ａを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
US20250051772A1 (en) Antisense Oligonucleotide for Targeting Progranulin
JP2022514648A (ja) Ｃａｒｄ９を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
JP2024546925A (ja) グルコセレブロシダーゼ発現を増加させることができるオリゴヌクレオチド
CN119365600A (zh) 靶向颗粒蛋白前体的反义寡核苷酸
JP2023526096A (ja) Ｃａｒｄ９のスプライス調節のためのオリゴヌクレオチド
JP2024524874A (ja) オリゴヌクレオチドプログラニュリンアゴニスト
CN118489009A (zh) 寡核苷酸gba激动剂
WO2023217890A1 (en) Antisense oligonucleotides targeting cfp-elk1 intergene region
JP2025501498A (ja) アンチセンスオリゴヌクレオチド
JP2022512877A (ja) Ｔｉａ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2024126654A1 (en) Antisense oligonucleotides targeting actl6b
KR20250011958A (ko) Rna 결합 단백질 부위를 표적으로 하는 개선된 올리고뉴클레오티드
TW202329983A (zh) Ｒｎａ編輯
WO2021123086A1 (en) Enhanced oligonucleotides for inhibiting scn9a expression
CN119790155A (zh) 苏糖核酸反义寡核苷酸及其方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication