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CN119285769A - 多特异性抗体及其医药用途 - Google Patents

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CN119285769A
CN119285769A CN202410923138.2A CN202410923138A CN119285769A CN 119285769 A CN119285769 A CN 119285769A CN 202410923138 A CN202410923138 A CN 202410923138A CN 119285769 A CN119285769 A CN 119285769A
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light chain
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CN202410923138.2A
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张一帆
任旻
李清
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Changzhou Hengbang Pharmaceutical Co ltd
Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Hansen Biology Co ltd
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Changzhou Hengbang Pharmaceutical Co ltd
Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Hansen Biology Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了一种多特异性抗体，包括能够特异性结合GPRC5D的第一结合结构域和能够特异性结合CD3的第二结合结构域，以及其医药用途。此外，本发明还涉及所述抗体的制备和应用。

Description

多特异性抗体及其医药用途
技术领域
本公开涉及多特异性抗体，其能够同时结合CD3和另一种肿瘤相关抗原，例如GPRC5D，结合表达GPRC5D的肿瘤细胞的同时结合并激活CD3-阳性T细胞，因此促进T细胞特异性杀伤肿瘤细胞。
背景技术
GPRC5D(G蛋白偶联受体C类5组成员D)是一种孤儿七跨膜受体，属于包括GPRC5a(RAIG1)、GPRC5b、GPRC5c和GPRC5D在内的蛋白质家族，它们彼此共享31-42％的氨基酸序列同一性。GPRC5D的内源配体及其生理功能目前尚不清楚。
GPRC5D在多发性骨髓瘤细胞中高度选择性表达，比正常浆细胞高约20倍，已被确定为多发性骨髓瘤(MMs)的有前途的免疫治疗靶点。
分化簇3(CD3)是一种在T细胞上表达的多聚体蛋白复合物，与T细胞受体复合物(TCR)结合，是T细胞活化所必需的。抗CD3抗体已被证明可将CD3聚集在T细胞上，导致T细胞活化。因此，抗CD3抗体已被提议用于参与T细胞活化的治疗目的。例如，能够结合CD3和靶抗原的双特异性抗体已被提议用于治疗用途，参与靶向T细胞对表达靶抗原的组织和细胞的免疫反应。最近批准的CD19×CD3双特异性T细胞接合器(BiTE)Blinatumomab验证了这种方法。
双特异性T细胞接合器(BiTE)是一类用于治疗癌症的新型免疫治疗分子。这些分子通过将T细胞重新靶向肿瘤细胞来增强患者对肿瘤的免疫反应。BiTE由两个单链可变片段(scFv)构成，通过柔性接头串联连接。一种scFv与T细胞特异性分子(通常是CD3)结合，而另一种scFv与肿瘤相关抗原结合。这种结构和特异性使BiTE能够将T细胞与肿瘤细胞连接起来，最终刺激T细胞活化、肿瘤杀伤和细胞因子产生。已经开发出针对多种肿瘤相关抗原的BiTE，用于各种血液肿瘤和实体瘤。
Talquetamab(US10562968B2，WO2019220368，WO2019220369，WO2023081704)和Forimtamig(WO2021018859)都是GPRC5D x CD3双特异性抗体，正在针对多发性骨髓瘤的临床试验中。两种分子均达到ORR～70％，可治疗BCMA靶向治疗预处理的患者。鉴于上述情况，虽然GPRC5D是多发性骨髓瘤(MMs)治疗的一个有前途的靶点，本领域仍然需要开发具有不同结合效力和/或结合位点或内化特性的多样化抗GPRC5D分子，开发多样化的BiTE，并扩大和/或提高治疗效用和生产适用性。
发明内容
近年来，人们对用于癌症免疫治疗的靶向CD3的BiTE越来越感兴趣。然而，与这种治疗方式的有效性和安全性相关的挑战已经出现。除了串联ScFv形式(BiTEs)之外，在现有技术水平上，还描述了许多双特异性抗体的构型和组成。多个变量会影响这些分子的体内效力，包括药代动力学、靶向抗原表位和抗原结合组分的相对亲和力。然而，尽管之前取得了所有进展，但仍然需要系统地评估其中许多参数的影响，并为癌症治疗选择最佳的双特异性结合分子。
本公开通过提供新型抗GPRC5D抗体，和结合GPRC5D和CD3的双特异性抗体来满足上述需求。
本申请发明人为实现这一目的进行了广泛的研究，并通过开发新型抗GPRC5D抗体和结合GPRC5D和CD3的工程化双特异性抗体实现了本发明。
具体而言，本发明包括以下几个方面：
本公开提供了一种特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其特征在于：a)HCDR1具有如SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:04所示的氨基酸序列；b)HCDR2具有如SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:05所示的氨基酸序列；c)HCDR3具有如SEQID NO:03或SEQ ID NO:06所示的氨基酸序列；d)LCDR1具有如SEQ ID NO:07或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；e)LCDR2具有如SEQ ID NO:08所示的氨基酸序列；f)LCDR3具有如SEQID NO:09或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其特征在于：a)HCDR1具有如SEQ ID NO:32，39所示的氨基酸序列；b)HCDR2具有如SEQ ID NO:33，35，37，40所示的氨基酸序列；c)HCDR3具有如SEQ ID NO:34，36，38，41所示的氨基酸序列；d)LCDR1具有如SEQ ID NO:42，45，47，49所示的氨基酸序列；e)LCDR2具有如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；f)LCDR3具有如SEQ ID NO:44，46，48所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，重链可变区包括分别如SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02和SEQ IDNO:03所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:09所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，重链可变区包括分别如SEQ ID NO:04、SEQID NO:05和SEQ ID NO:06所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施例中，重链可变区包括分别如SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ IDNO:34所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，重链可变区包括分别如SEQ ID NO:04、SEQID NO:35和SEQ ID NO:36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:46所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，重链可变区包括分别如SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，重链可变区包括分别如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施例中，上述抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，上述抗抗体或其抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:18所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的重链可变区，和/或，如SEQ IDNO:19所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:20所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:21所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区。
在一些实施例中，上述抗体或抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:18所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:20所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:21所示的轻链可变区。
在一些实施例中，上述抗体或抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:18所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:20所示的重链变量区，和如SEQ ID NO:21所示的轻链变区。
在一些实施例中，上述抗抗体或其抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:50所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的重链可变区，和/或，如SEQ IDNO:51所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:52所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:53所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区；或，c)如SEQ ID NO:54所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:55所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区；或，d)如SEQ ID NO:56所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:57所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区。
在一些实施例中，上述抗体或抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:50所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:51所示的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:52所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:53所示的轻链可变区；或，c)如SEQ ID NO:54所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:55所示的轻链可变区；或，d)如SEQ ID NO:56所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:57所示的轻链可变区。
在一些实施例中，上述抗体或抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:50所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:51所示的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:52所示的重链变量区，和如SEQ ID NO:53所示的轻链变区；或，c)如SEQ ID NO:54所示的重链可变区，和如SEQ IDNO:55所示的轻链可变区；或，d)如SEQ ID NO:56所示的重链变量区，和如SEQ ID NO:57所示的轻链变区。
在一些实施例中，上述抗体还包括人抗体恒定区；优选地，所述人抗体恒定区的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其变体，所述人抗体恒定区的轻链恒定区选自人κ、λ链恒定区及其变体。
在优选的实施例中，上述抗体或抗原结合片段包括SEQ ID NO:24的人重链恒定区和SEQ ID NO:25的人轻链恒定区。
在一些实施例中，上述抗体或抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:66所示的重链，和如SEQ ID NO:67所示的轻链；或，b)如SEQ ID NO:68所示的重链，和如SEQ ID NO:69所示的轻链。
在一些实施例中，上述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、二聚化结构域V(diabody)、二硫键稳定Fv(dsFv)或含CDR的肽。
另一方面，本公开提供了一种分离核酸分子，编码上述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本公开提供了一种双特异性抗体，包括特异性结合GPRC5D的第一结合域，和特异性结合第二靶蛋白的第二结合域，其中，所述第一结合域为上述的抗体或抗原结合片段。
在优选的实施例中，上述第二靶蛋白为CD3。
在一些实施例中，上述双特异性抗体的第一结合域为完整的IgG。
在一些实施例中，上述双特异性抗体的第二结合域为Fv片段，优选为单链Fv(scFv)片段，或二硫键结合的Fv片段。
在优选的实施例中，上述双特异性抗体的第一结合域为完整的IgG，第二结合域为scFv。
在一些实施例中，上述双特异性抗体的第二结合域包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别如SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17所示。
在一些实施例中，上述第二结合域的scFv包括：如SEQ ID NO:22所示的重链可变区，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性；和/或，如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。
在一些实施例中，上述第二结合域的scFv包括：如SEQ ID NO:22所示的重链可变区，以及如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区。
在优选的实施例中，上述第二结合域的scFv通过接头与所述第一结合域的完整IgG连接。
在优选的实施例中，上述第二结合域的scFv的N末端通过接头，与所述第一结合域的完整IgG的轻链C末端相连。
在一些实施例中，上述接头选自TS(GGGGS)n、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n或(GKPGS)n，n为正整数；优选地，n为1、2、3、4、5或6。
在一些实施例中，上述双特异性抗体的第一结合域包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区和轻链恒定区的序列分别如SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示。
在一些实施例中，上述双特异性抗体选自：如SEQ ID NO:28所示的重链和如SEQID NO:29所示的轻链；或，如SEQ ID NO:30所示的重链和如SEQ ID NO:31中所示的轻链。
另一方面，本公开提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码上述的双特异性抗体。
另一方面，本公开提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述的分离的核酸分子。
另一方面，本公开提供了一种分离的宿主细胞，包含上述的核酸分子，或上述的表达载体，其特征在于，所述宿主细胞选自原核细胞，或真核细胞；优选地，选自真核细胞；更优选地，选自哺乳动物细胞。
另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含上述的抗体或其抗原结合片段，或上述的双特异性抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
另一方面，本公开提供了如上述的抗体或其抗原结合片段，或如上述的双特异性抗体，或药物组合物在制备治疗或预防GPRC5D介导的疾病或病症的药物中的用途，优选地，GPRC5D介导的疾病或病症为癌症或自身免疫疾病。
在一些实施例中，上述癌症选自淋巴瘤、白血病或骨髓瘤，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎。
本发明的优点：双特异性抗体可在亚纳摩尔或个位数nM范围内，特异性结合肿瘤抗原GPRC5D，而CD3结合部分对T细胞具有中等或较低的结合亲和力，在十位数nM范围内。双特异性抗体显示出杀伤肿瘤细胞的体外效力和强大的靶向依赖介导的T细胞活化，以避免T细胞的全身激活和耗竭。此外，双特异性抗体有利于与肿瘤细胞上的GPRC5D结合，而不是循环中T细胞上的CD3，并避免CD3沉降，从而增加肿瘤中的药物暴露。双特异性抗体引起极低水平的细胞因子释放，因此将治疗窗口将增加。
附图说明
图1.T细胞结合的双特异性抗体构型，构型M“2+2IgG-scFv”的说明。抗GPRC5DFab臂、抗CD3scFv和Fc区分别显示为深灰色、白色和浅灰色矩形。
图2.来自13A1杂交瘤克隆流式细胞仪分析的代表性结合直方图。实线表示与Jurkat E6.1细胞(CD3+)的结合，虚线表示与J.RT3-T3.5细胞(CD3-)的结合。F2B作为CD3结合的阳性对照，仅使用二抗作为阴性对照。
图3.通过流式细胞术分析食蟹猴T细胞与13A1杂交瘤上清液的结合，并以直方图显示。SP34作为阳性对照，克隆27A5作为阴性对照。
图4.通过流式细胞仪分析检测抗体基因转染的CHO-S细胞上清液与CHO-S-GPRC5D+细胞的结合。
图5.抗GPRC5D重组单克隆抗体与多发性骨髓瘤细胞系H929和MM.1S的结合曲线，通过流式细胞仪分析测量，并显示指定抗体浓度下的Geomean值。与H929和MM.1S细胞的结合如(A)和(B)所示。
图6.抗GPRC5DxCD3双特异性抗体与展示人、食蟹猴或小鼠GPRC5D蛋白的VLP结合。包膜VLP对照作为阴性对照。
图7.抗GPRC5DxCD3双特异性抗体与多发性骨髓瘤细胞系H929(A)和MM.1S(B)的结合曲线，通过流式细胞仪分析测量，并显示为指定抗体浓度下的Geomean值。
图8.通过流式细胞仪分析测量的双特异性抗体与人T细胞系Jurkat E6.1的结合曲线，并显示为指定抗体浓度下的Geomean值。
图9.由抗GPRC5DxCD3双特异性抗体介导的人原代T细胞的激活。将来自单个健康供体的人PBMC与H929细胞系以10：1的E：T比例，与连续稀释的指定双特异性抗体共同孵育48小时。活化的CD4或CD8T细胞(CD25+)占CD4或CD8T细胞总数的百分比分别显示在(A)和(B)中。
图10.双特异性抗体介导的PBMC对多发性骨髓瘤细胞系H929的细胞毒性。将来自一个健康供体的人PBMC与肿瘤细胞以10：1的E：T比例，与连续稀释的双特异性抗体共培养48小时，然后通过流式细胞仪进行分析。在H929细胞上用双特异性抗体剂量-反应曲线表示肿瘤活细胞百分比。
图11.双特异性抗体诱导扩增的人T细胞杀死多种骨髓瘤细胞系。将来自单个健康供体PBMC的14天扩增T细胞与H929(E：T＝1：1)，MM.1S(E：T＝1：5)或RPMI8226(E：T＝1：1)共培养48小时，然后使用流式细胞仪测量细胞毒性。在MM.1S(A)、H929(B)、RPMI8226(C)上用双特异性抗体剂量-反应曲线表示肿瘤活细胞百分比。
图12.双特异性抗体在与H929细胞共培养时诱导PBMC释放炎性细胞因子。将新鲜PBMC与H929(E：T＝10：1)在指定浓度的不同双特异性抗体中孵育48小时。使用LegendplexTM人类必需免疫应答试剂盒检测培养上清中的炎性细胞因子水平。图示IFNγ(A)和IL-6(B)的水平。
图13.双特异性抗体在人源化H929CDX模型中的疗效。每只NSG小鼠在第0天通过皮下注射接种500万个H929细胞，然后三天后静脉注射。注射1000万个扩增的人T细胞，指定双特异性抗体为2μg/小鼠，每周两次，每组包含5只小鼠。
图14.双特异性抗体在人源化MM.1S CDX模型中的疗效。每只NSG小鼠在第0，8天通过皮下注射接种1000万个MM.1S细胞，之后静脉注射1000万个扩增的人T细胞和指定双特异性抗体，每周两次，2μg/小鼠，每组包含5只小鼠。
发明的详细说明
在本发明中，除非另有定义，本文所用的科学和技术术语具有本领域技术人员一般理解的含义。此外，本文所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学和免疫学的实验室操作是相应领域广泛应用的常规程序。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
定义
在对本发明进行下面详述之前，应当理解，本发明并不局限于本文所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些方法、方案和试剂可能有所不同。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。
对于规范的解释，将应用以下定义，在适当的情况下，单数中使用的术语也可以包括复数，反之亦然。应当理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并不旨在限制。
“双特异性抗体”是对两种不同抗原(或同一抗原的不同表位)具有结合活性的抗体。本公开的双特异性抗体对两种不同的抗原具有特异性，即GPRC5D作为第一抗原，CD3作为第二抗原。本公开的双特异性抗体包括第一结合域，称为B1，其为抗GPRC5D抗体或其抗原结合片段，第二结合域为B2，其为抗CD3抗体或其抗原结合片段。
在本发明中发现特别用途的一种同源二聚体，双特异性抗体是IgG-scFv构型，如图1所示。在该实施方案中，该构型依赖于使用scFv连接到IgG轻链上的C端，从而形成第二抗原结合域，其中IgG的Fab部分结合GPRC5D抗原，两个“额外”scFv结构域结合CD3抗原。
本文所用的术语“抗体”是指单克隆抗体或其片段。抗体由两对“轻链”(LC)和“重链”(HC)组成(这种轻链/重链对在本文中缩写为LC/HC)。这种抗体的轻链和重链是由几个结构域组成的多肽。每个重链包括一个重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区。每个轻链包括一个轻链可变域VL和一个轻链恒定域CL。可变域VH和VL可以进一步细分为超变异性区域，称为互补决定区(CDR)，穿插着更保守的区域，称为框架区域(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按以下顺序从氨基末端排列到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的“恒定结构域”不直接参与抗体与靶标的结合，但表现出各种效应功能。
术语“抗体”包括小鼠抗体、全人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和基因工程抗体(变异或突变抗体)，只要保留其特征特性即可。特别优选的是全人抗体或人源化抗体，尤其是重组全人抗体或人源化抗体。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分或片段，它们保留与抗原特异性结合的能力(例如，人GPRC5D或CD3，或其一部分)。已经表明，全长抗体的某些片段可以执行抗体的抗原结合功能。术语“抗原结合部分”中包含的结合片段的例子包括(i)Fab片段：由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段：由铰链区域的二硫键连接的两个Fab片段组成的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段；(vi)能够与抗原特异性结合的分离互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成连接子连接，使它们能够制成单个蛋白质链，其中VL和VH结构域配对形成单价分子(称为单链可变片段(scFv))。有用的连接子包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一个(通常为3到4)的整数、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。在一些实施方案中，scFv还可以包含带正电荷的scFv接头，包括(GKPGS)4。本公开的范围内还包括含VH和/或VL的抗原结合分子。在VH的情况下，分子还可以包括CH1、铰链、CH2或CH3区域中的一个或多个。这种单链抗体也旨在包含在抗体的术语“抗原结合部分”中。其他形式的单链抗体，如二聚体，也包括在内。二聚体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短，无法在同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
如本文所用，关于本文所用的双特异性抗体的术语“包含”是指双特异性抗体仅包含作为GPRC5D和CD3结合剂的那些结合剂。因此，根据公开的双特异性抗体，包括与GPRC5D特异性结合的二价抗GPRC5D抗体，以及与CD3特异性结合的二价抗体，就GPRC5D和CD3而言，仅结合GPRC5D的两个结合价，而CD3仅结合两个价，因此是四价的。如本文所用，本发明中使用的术语“肽接头”可以主要包括以下氨基酸残基：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。连接肽的长度应足以连接两个分子，使它们相对于彼此具有正确的构象，从而保持所需的活性。有用的连接剂包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如TS(GGGGS)n、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少一个(通常为3到4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性连接剂。在一些实施方案中，scFv还可以包含带正电荷的scFv接头，包括(GKPGS)4。
本文所用的“Fab片段”是指抗体片段，包括含轻链的VL结构域和恒定结构域(CL)的轻链片段，以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)。交叉Fab分子的两种不同链组成是可能的，并且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重链和轻链的可变区域交换，即交叉Fab分子包括由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。这种交叉Fab分子也称为crossFab(VLVH)。另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区交换时，交叉Fab分子包括由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。这种交叉Fab分子也称为crossFab(CLCH1)。术语“Fab片段”还包括部分或全部铰链区域，如Fab片段。本文所用的“F(ab)2片段”是指不含Fc部分的二价单特异性抗体片段。优选地，F(ab)2片段通过铰链区域中的二硫键在C末端连接，通常这样的“F(ab)2片段”是F(ab')2片段。
如本文所用，“抗体的Fc部分”是本领域技术人员所熟知的术语，并基于抗体的木瓜蛋白酶裂解来定义。本发明的抗体，其包括Fc部分，包含作为Fc部分，优选来源于人来源的Fc部分，并且优选人类恒定区域的所有其他部分。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合分子是同源二聚体。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合分子是异源三聚体(轻链与重链异二聚体结合)，其中重链异二聚体以例如Brinkmann和Kontermann，MABS 9：182-212(2017)中描述的构型。例如，在本公开的双特异性结合分子的结构中，可以使用“杵臼”、HA-TF、ZW1、CH3电荷对、EW-RVT、LUZ-Y、链交换工程结构域体(SEEDbody)、DuoBody、BEAT、Triomab/Quadroma或CrossMAb策略来促进包含免疫球蛋白Fc区的多肽的异源二聚化(例如，过度同源二聚化)。在某些实施方案中，可以使用“杵臼”方法，其中通过用具有小侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸)替换具有较大侧链的另一种氨基酸(例如，精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)来获得结构域的突出的“杵”型结构。通过将具有大侧链的氨基酸(例如精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)替换为具有较小侧链的另一种氨基酸(例如，丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸)，可以获得结构域的凹陷的“臼”型结构。在某些实施方案中，“杵臼”突变位于CH3结构域中。
如本文所用，本文所用的“可变结构域”(轻链的可变结构域(VL)、重链的可变区域(VH))表示直接参与将抗体与靶标结合的一对轻链和重链中的每一对。可变人类轻链和重链的结构域具有相同的一般结构，每个结构域包括四个框架(FR)区域，其序列广泛保守，由三个“超变区域”(或互补决定区，CDR)连接。框架区域采用β片构象，CDR可以形成连接β片结构的环。每条链中的CDR由框架区域保持在其三维结构中，并与来自另一条链的CDR一起形成目标结合位点。根据本发明的抗体重链和轻链CDR3区域在抗体的结合特异性/亲和力中起着特别重要的作用，因此提供了本发明的进一步目的。
术语“CDR”是指抗体可变结构域内的六个高变区域之一，主要有助于抗原结合。Kabat E.A.et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest，美国国立卫生研究院出版物91-3242(六种CDR最常用的定义之一)提供了这六种CDR最常用的定义。如本文所用，CDR的Kabat定义仅适用于轻链可变结构域(LCDR1、LCDR2、LCDR3或L1、L2、L3)的CDR1、CDR2和CDR3，以及重链可变结构域(HCDR1、HCDR2、HCDR3或H1、H2、H3)的CDR1、CDR2和CDR3。
用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域公知的，并且可用于鉴定本文公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可用于识别CDR边界的示例性约定，包括，例如，基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑结构的Chothia(Chothia等人，1989年)Nature 342：877-883)，基于抗体序列变异性的Kabat(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第4版，美国卫生与公众服务部，美国国立卫生研究院(1987年)、AbM(巴斯大学)、Contact(伦敦大学学院)、国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(imgt.cines.fr/万维网)，以及基于使用大量晶体结构的关联传播聚类的NorthCDR定义。本领域技术人员可以很容易地确定由每个编号系统定义的CDR。
不同系统的CDR编号的对比如下：
注1：其中一些定义(特别是对于Chothia环)因所研究的个别出版物而异；注2：任何编号方案都可用于这些CDR定义，但触点定义使用Chothia或Martin(增强型Chothia)定义除外；注3：使用Kabat编号约定编号时，Chothia HCDR1环的末端在H32和H34之间变化，具体取决于环的长度。这是因为Kabat编号方案将插入物放置在H35A和H35B。
如本文所用，本文所用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区域的抗体。人类抗体在现有技术中是众所周知的。人类抗体也可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，这些动物在免疫后能够在没有内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整的组库或选择的人类抗体。在这种种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在靶标攻击时产生人抗体。人类抗体也可以在噬菌体展示文库中产生。
如本文所用，本文所用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、制造或分离的所有人类抗体，例如从宿主细胞(例如NSO或CHO细胞)或从动物(例如小鼠)中分离出的抗体，该抗体对人类免疫球蛋白基因具有转基因，或使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区域。本发明的重组人抗体已经进行了体内体细胞超突变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列虽然来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但可能非自然存在于体内的人抗体种系库中。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括化学活性的分子表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是靶标与抗体结合的区域。
如本文所用，本文所用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。当一个核酸与另一个核酸序列处于功能关系中时，它就被“有效连接”了。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则启动子或增强子有效地与编码序列相连。
所述核酸的制备方法是本领域常规的制备方法。优选地，它包括以下步骤：通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质的核酸分子，或通过人工全长序列合成的方法获得编码上述蛋白质的核酸分子。
本领域技术人员知道，编码蛋白质氨基酸序列的碱基序列可以适当地替换、删除、改变、插入或添加，以提供多核苷酸同源物。本发明的多核苷酸的同源物可以通过替换、删除或添加编码蛋白质序列的一个或多个碱基来制备，以维持抗体的活性。
如本文所用，术语“载体”是指能够将另一核酸转运到它所连接的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，它指的是一个环状双链DNA环，其额外的DNA片段可以被连接到其中。在另一实施方案中，载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以被连接到病毒基因组中。本文公开的载体能够在它们被引入的宿主细胞中自我复制(例如，具有细菌复制起源的细菌载体和游离哺乳动物载体)，或者可以在引入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制(例如，非游离型哺乳动物载体)。
重组表达载体可以通过本领域的常规方法获得，即通过将本发明的核酸分子连接到各种表达载体，从而构建。该表达载体是本领域多种常规载体中的一种，只要它能够携带上述核酸分子即可。载体优选包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
如本文所用，本文所用的术语“转染细胞”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、植物细胞或真菌，包括酵母细胞。
根据本发明的抗体或其片段的DNA分子序列可以通过常规技术获得，例如PCR扩增或基因组文库筛选等方法。此外，编码轻链和重链的序列可以融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得相关序列，就可以使用重组方法批量获得相关序列。这通常是通过将序列克隆到载体中，用载体转化细胞，然后通过常规方法将相关序列与增殖的宿主细胞分离来实现的。
此外，可以人工合成相关序列，特别是当片段长度较短时。通常，先合成几个小片段，然后连接在一起，得到一个长序列的片段。
目前，可以通过化学合成完全获得编码本发明抗体(或其片段或其衍生物)的DNA序列。然后可以将DNA序列引入到本领域已知的各种现有DNA分子(或例如载体)和细胞中。此外，还可以通过化学合成将突变引入到本发明的蛋白质序列中。
一般而言，在适合于表达本发明的抗体的条件下，培养得到的宿主细胞。然后，利用常规的免疫球蛋白纯化步骤纯化本发明的抗体，例如，本领域技术人员所熟知的常规分离纯化手段，如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、离子交换色谱、疏水层析、分子筛层析或亲和层析。
获得的抗体可以通过常规方法进行鉴定。例如，单克隆抗体的结合特异性可以通过免疫沉淀或体外结合测定(如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来确定。例如，可以通过Scatchard分析(Munson等人，Anal.Biochem.，107：220(1980))来确定单克隆抗体的结合亲和力。
本发明的抗体可以在细胞或细胞膜上表达，或在细胞外分泌。必要时，可根据重组蛋白的物理、化学等性质，采用各种分离方法进行分离纯化。这些方法为本领域技术人员所熟知。这些方法的实例包括但不限于常规复性处理、蛋白质沉淀剂处理(如盐沉淀)、离心、渗透细胞裂解、超声处理、超离心、分子筛色谱(凝胶色谱)、吸附色谱、离子交换色谱、高效液相色谱(HPLC)和任何其他液相色谱，以及它们的组合。
如本文所用，多肽的术语“变体”例如，抗原结合片段、蛋白质或抗体是多肽，其中一个或多个氨基酸残基入、删除、添加和/或取代，与另一个多肽序列相比，并且包括融合多肽。此外，蛋白质变体包括通过蛋白质酶切割、磷酸化或其它翻译后修饰而修饰的蛋白质变体，但保持本文公开的抗体的生物活性，例如与CD3结合和特异性。该变体可以与本文公开的抗体或其抗原结合片段的序列相同，或约为99％、98％、97％、96％、95％、94％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％或80％同一性。
如本文所用，本文所用的术语“KD”(M)意指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。“KD”是指解离常数，由Kd与Ka的比值(即Kd/Ka)获得，以摩尔浓度(M)表示。鉴于本公开，可以使用本领域的方法确定抗体的KD值。例如，抗体的KD可以通过使用表面等离子体共振来测定，例如通过使用生物传感器系统，例如系统，或者通过使用生物层干涉测量技术，例如Octet RED96系统。
如本文所用，术语“亲和力”是抗体或其抗原结合片段与抗原之间的相互作用强度，它由抗原的性质决定，例如抗原的大小、形状和/或电荷，以及抗体或抗原结合片段的CDR序列。用于确定亲和力的方法在本领域是已知的，并且可以参考以下方法。
如本文所用，术语“EC50”是指浓度为50％的最大效应，即能够引起50％最大效应的浓度。
如本文所用，本文所用的术语“药物组合物”意在指含有一种或多种化合物或生理/药学上可接受的盐或其前药的混合物与本文所述的其它化学成分，例如生理/药学上可接受的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，这有利于活性成分的吸收并发挥生物活性。
如本文所用，术语“给药”和“治疗”，当应用于动物、人类、实验对象、细胞、组织、器官或生物体液时，是指与动物、人类、受试者、细胞、组织、器官或生物体液接触外源性药物、治疗、诊断试剂或组合物。例如，“给药”和“治疗”可以指治疗、药代动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括用试剂接触细胞，以及用试剂接触流体，其中流体与细胞接触。“给药”和“治疗”也指体外和离体处理，例如，通过试剂、诊断、结合组合物或由另一细胞对细胞进行处理。“治疗”适用于人类、兽医或研究对象时，是指治疗、预防或预防措施、研究和诊断应用。
具体实施方式
本发明通过以下具体实施例进一步说明。应当理解，这些实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。以下实施例中没有详细条件的实验方法一般符合常规条件，如Sambrook所描述的条件，Joseph F.Sambrook et al.“Guide to Molecular CloningLaboratory”(黄培棠等译，北京：科学出版社，2002年)，或按照制造商推荐的条件(例如，产品手册)。除非另有说明，否则百分比和部分均按重量计算。除非另有说明，否则以下示例中使用的实验材料和试剂均为市售材料和试剂。
实施例中描述的室温为本领域常规室温，一般为18-27℃。
实施例1.抗体的免疫和筛选
抗-GPRC5D抗体
使用全长人GPRC5D进行免疫和筛查。使用常规DNA免疫方法，每14天接种一次6-8周龄的RenMab GPRC5D-KO小鼠(购自百奥赛图)，进行4轮免疫接种。最后一次注射五天后，小鼠被处死。在无菌条件下分离组织并用新鲜培养基清洗。淋巴细胞从淋巴结或脾脏释放。通过平台筛选分泌GPRC5D特异性抗体的浆细胞，通过逆转录和PCR扩增测序获得抗体轻链和重链的V区序列。
抗-CD3抗体
通过使用人CD3抗原、食蟹猴CD3抗原、自然表达人CD3的人CD3DNA或Jurkat E6.1细胞(Sigma-Aldrich，目录号88042803)的组合对编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区域的转基因小鼠进行免疫接种来获得抗体。通过CD3特异性免疫测定法监测抗体免疫反应。当达到所需的免疫反应时，从每只小鼠身上收获脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞融合以保持其活力，形成杂交瘤细胞，并筛选CD3特异性。
将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0CRL-158)融合，通过电融合或PEG融合获得杂交瘤细胞。按照制造商的说明，使用ClonaCell TM HY技术(STEMCELL Technologies)进行PEG融合。原代细胞：小鼠骨髓瘤细胞比例为电融合1：1，PEG融合10：1。
通过ELISA筛选与人/食蟹猴CD3蛋白特异性结合的杂交瘤克隆
使用DuoSet ELISA辅助试剂盒(R&D System，DY008)进行ELISA。ELISA板涂有5ug/ml人CD3δε(AcroBio CDD-H52W1)和食蟹猴CD3δε(AcroBio，CDD-C52W4)过夜。用洗涤缓冲液洗涤板三次，洗掉多余的未结合蛋白质。然后将板在室温下封闭1小时。向每个重复孔中加入50ul CD3杂交瘤上清液，并孵育1小时。洗去多余的未结合抗体，并将50ul 1：1000稀释的二抗山羊抗小鼠IgG Fc-HRP(Jackson ImmunoResearch，115-035-071)再加入1小时。根据制造商的方案，在添加化学发光剂(颜色A和颜色B)之前洗涤板。450nm样品的光密度由酶标仪(PerkinElmer)测量。结果如表1所示。
表1.ELISA测定的结合活性结果
结果表明，本公开的杂交瘤克隆13A1抗体的上清液对人和食蟹猴CD3具有较高的亲和力。
Jurkat结合筛选
对人T细胞系(CD3+Jurkat细胞系克隆E6.1和CD3-克隆J.RT3-T3.5(ATCC))进行杂交瘤上清液的结合测试，使用流式细胞仪分析。使用未稀释的杂交瘤上清液进行初次染色，然后使用荧光标记的二抗(PE山羊抗小鼠IgG，BioLegend Cat#405307)。图2显示了所选流式细胞仪直方图的示例，实线表示与Jurkat E6.1细胞(CD3+)的结合，虚线表示与J.RT3-T3.5细胞(CD3-)的结合。与J.RT3-T3.5细胞相比，克隆13A1与Jurkat E6.1细胞的结合谱增强。
Cyno-T细胞(HSC-F)结合
将Jurkat结合筛选的克隆，使用流式细胞仪进一步检测与食蟹猴T细胞结合(HSC-F)。抗CD3抗体SP34被用作阳性对照(Conrad，M.L.，Davis，W.C.and Koop，B.F.(2007)，食蟹猴T细胞系(HSC-F)是从非人灵长类动物试剂资源(NHPRR)中获得的。染色的进行与上述类似，代表性结果如图3所示。
实施例2.阳性克隆的测序
抗GPRC5D克隆的测序
通过逆转录和PCR扩增测序获得抗体轻链和重链的V区序列。
表2.GPRC5D克隆的重链可变区的KABAT CDR序列
表3.GPRC5D克隆的轻链可变区的KABAT CDR序列
表4.GPRC5D克隆的重链和轻链可变区序列
抗CD3克隆的测序
从阳性杂交瘤克隆序列的过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，提取RNA，进行逆转录，然后进行VDJ区域扩增。对每个克隆扩增的cDNA文库进行二代测序。获得抗体13A1对应的重链和轻链可变区DNA序列的氨基酸序列。在可制造性评估中，将框架区进行了几次突变，各抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列和CDR序列如下表所示。VH/VL中CDR的氨基酸残基根据Kabat&Wu定义系统进行编号和注释。
表5.CD3杂交瘤克隆的重链可变区的CDR序列
表6.CD3杂交瘤克隆的轻链可变区的CDR序列
表7.CD3杂交瘤克隆的重链和轻链可变区序列
CD3ScFv工程化突变改造
该突变旨在通过将特定残基转化为种系序列来获得一组具有不同亲和力和T细胞活化活性的抗CD3抗体，以及潜在的较低免疫原性。
杂交瘤克隆13A1-1的模板选择和突变设计
表8.13A1-1轻链和重链可变区的突变
注：例如，根据Kabat编号系统，I14T表示位置14处从I到T的突变。WT表示该序列不包含氨基酸突变。
表9.13A1-1_mut36重链可变结构域的KABAT CDR序列
表10.13A1-1_mut36轻链可变结构域的KABAT CDR序列
表11.13A1-1_mut36的重链可变结构域和轻链可变结构域序列
实施例3抗GPRC5D抗体的筛选
使用ExpiCHO瞬时表达系统，表达抗GPRC5D抗体轻链和重链，并通过与过表达人GPRC5D的CHO-S细胞结合来测试上清液。来自Talquetamab(克隆：GC5B596来自US10562968B2)的亲本抗GPRC5D抗体表达为IgG1并用作阳性对照。克隆Ab04和Ab17显示出与GPRC5D+细胞的强结合(图4)，并被选中用于进一步研究。
评估ExpiCHO表达的抗体上清液对MM.1S细胞的内吞作用。用抗体和pHAb(Promega，目录号G9845)标记细胞。内化的抗体-pHAb在低pH环境中会发出荧光。通过比较孵育3或6小时后的平均荧光强度(MFI)来显示内吞作用。与阴性对照相比，克隆04和17在孵育3小时和6小时后显示内化。数据总结在表12中。
表12.抗体内吞效率
克隆 内化3h MFI 内化6h MFI
04 6206 8591
17 5018 8238
GC5B596 3793 5284
阴性对照 2951 3087
实施例4重组抗体的构建、表达和纯化
重组抗体的分子克隆：
将编码单克隆抗体或设计的双特异性抗体的VH和VL区域的cDNA序列直接合成为具有5'端框内前导序列(MGWSCIILFLVATATGVHS)的DNA片段。使用NEBuilder DNA组装克隆试剂盒(New England Biolabs)将这些DNA片段克隆到哺乳动物表达载体(骨架序列与pcDNA3.1相似)中。
这里的单特异性抗体的恒定区域是hIgG1。
表13.单克隆抗体重链恒定区和轻链恒定区序列
表14.单克隆抗体的序列
本发明中的双特异性抗体为IgG-scFv构型，如图1所示。该构型依赖于使用scFv连接到IgG轻链的C端，从而形成第二个抗原结合域，IgG的Fab部分结合GPRC5D，两个“额外”scFv结构域结合CD3。双特异性抗体的恒定区域采用具有工程突变(S228P、F234A、L235A)的hIgG4序列。
表15.双特异性抗体重链恒定区和轻链恒定区序列
表16.肽连接子的序列
抗-CD3ScFv中的连接子 (GGGGS)6
抗-GPRC5D CL与抗-CD3VH之间的连接子 TS(GGGGS)3
表17.双特异性抗体的序列
重组抗体的表达和纯化：
使用ExpiFectamine CHO转染试剂盒(ThermoFisher，A29129)将重链表达质粒和轻链质粒共转染到ExpiCHO-S细胞(ThermoFisher#A29127)中。根据制造商的说明，质粒DNA浓度达到每毫升悬浮细胞1.0ug。将转染的细胞在37℃、8％ CO2的振荡器上培养5至7天。收集培养基，并在AKTA Pure 25机器(Cytiva)上使用HiTrap MabSelect SuRe色谱柱(Cytiva，#17549112)纯化抗体。用Tris缓冲液(pH 9.0)中和洗脱的抗体，并进行PBS缓冲液置换。在AKTA Pure 25机器上使用SEC-superdex200色谱柱(Cytiva，#28989335)进一步纯化浓缩蛋白。将各峰的组分集中浓缩。最终产物通过紫外线吸收进行定量，SDS-PAGE和HPLC测定纯度。
实施例5重组抗GPRC5D单克隆抗体的基本抗原结合特性
在基于流式细胞仪的细胞结合测定中，测试了重组抗GPRC5D单克隆抗体与细胞表面GPRC5D抗原的结合亲和力。将多个骨髓瘤细胞系在冰培养基中封闭30分钟，然后与不同浓度的一抗在培养基中冰浴孵育1小时。然后用PBS洗涤细胞，并用二抗(R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性，Jackson ImmunoResearch 109-116-170)标记，在培养基中以1：200稀释，冰浴1小时。用PBS洗涤细胞，然后用流式细胞仪分析。结合曲线由Flowjo和GraphPad Prism软件生成并分析。重组抗体与H929和MM.1S的结合曲线如图5所示，KD值汇总如表18所示。使用抗GPRC5D抗体GC5B596，Talquetamab的亲本抗体(来自专利WO2019220368，参见SEQ ID NO:51,52,41,42)作为对照。HBMAB-0088和HBMAB-0097与H929和MM.1S细胞表现出强结合，亲和力高于对照抗体。
表18.重组抗GPRC5D单克隆抗体对多发性骨髓瘤细胞系的结合亲和力
实施例6T细胞衔接双特异性抗体(TCE)的抗原结合特性
对选定的GPRC5DxCD3双特异性抗体进行食蟹猴GPRC5D和小鼠GPRC5D结合测试。将展示人GPRC5D(Kactusbio Cat.No.GPR-HM05P)、食蟹猴GPRC5D(Kactusbio Cat.No.GPR-CM05P)或小鼠GPRC54D(Kactusbio Cat.No.将GPR-MM05P)的VLP在PBS中以5μg/ml的浓度在4℃下过夜，涂布到MSD板(MSD Cat.No.L15XA-3)上。包膜VLP(Kactusbio Cat.No.VLP-HM00C)平行涂覆并作为阴性对照。涂覆后，用PBS 0.05％Tween20洗涤板3次，然后在室温下用3％BSA的PBS封堵1小时。洗涤后，将板与不同浓度的双特异性抗体在室温下孵育1小时。然后根据制造商的说明，将板洗涤，并在室温下用1μg/ml磺基标签山羊抗人Fc孵育1小时，该Fc是通过向山羊抗人Fc(ImmunoResearch Cat.No.109-005-170)中加入磺基标签产生的，和MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester偶联包(MSD Cat.No.R31AA-1)。洗涤后，将MSD GOLD读取缓冲液B以150μl/孔添加到板中，并使用MESO Quickplex SQ 120MM读取器读取板。数据如图6和表19所示。M44-mut36和M53-mut36都与人、食蟹猴或小鼠GPRC5D结合，并且与VLP对照没有结合。
表19.GPRC5D x CD3TCE在展示人GPRC5D、食蟹猴GPRC5D或小鼠GPRC5D的VLP上的结合亲和力。
如实施例5所述，在基于细胞的结合测定中，对GPRC5DxCD3双特异性抗体的每个臂进行功能测试，以结合细胞表面GPRC5D或CD3。TCE与GPRC5D+多发性骨髓瘤细胞系H929和MM.1S以及人CD3+T细胞系Jurkat E6.1细胞的结合曲线如图7和图8所示，KD值总结在表20中。M44-Mut36和M53-Mut36与对照TCE Talquetamab相比，与GPRC5D阳性细胞的结合更强，并且与T细胞的结合呈阳性。
表20.GPRC5D x CD3TCE对多发性骨髓瘤细胞系H929和MM.1S以及人T细胞系Jurkat E6.1的结合亲和力
H929 MM.1S Jurkat E6.1
BsAb KD(nM) KD(nM) KD(nM)
M44-mut36 1.7 1.5 6
M53-mut36 3.8 2.9 26
Talquetamab 25.0 15.0 4
实施例7双特异性抗体对人PBMC激活的影响
测试了GPRC5DxCD3双特异性抗体激活人原代T细胞的能力。CD25表达在T细胞活化过程中被诱导，表面CD25水平可作为T细胞活化的指标。基于流式细胞仪测定法评估了靶肿瘤细胞双特异性抗体治疗后人原代T细胞上CD25的表达。用CellTrace Violet(ThermoFisher Cat.编号：C34557)预标记多发性骨髓瘤细胞系H929。将来自健康供体的人PBMC与预先标记的H929细胞以10：1的效应器与肿瘤比(E-to-T)在不同浓度的不同双特异性抗体下共培养48小时。使用1x PBS和抗CD4-BV605(BioLegend Cat#317438，克隆OKT4)、抗CD8-FITC(Invitrogen Cat#11-0088-42克隆RPA-T8)和抗CD25-APC(BioLegend Cat#302610，克隆BC96)抗体洗涤细胞，对CD4+CD25+和CD8+CD25+T细胞群进行染色。流式细胞仪数据是在BD Fortessa X20上采集的。数据通过FlowJo软件进行分析。GraphPad Prism用于绘制CD25+群体占总CD4或CD8T细胞的百分比。计算EC50值见表21。
表21.GPRC5D x CD3TCE诱导T细胞活化EC50(nM)
EC50 (pM) CD4T激活 CD8T激活
M44-mut36 5.3 2.3
M53-mut36 11 4.2
Talquetamab 40.5 39.5
在H929细胞存在的情况下，经M44-Mut36和M53-Mut36处理的PBMC中观察到，双特异性抗体对人原代CD4和CD8T细胞的强烈激活，优于对照Talquetamab。M44-mut36和M53-mut36的EC50值优于对照(图9)。
实施例8人PBMC或扩增的T细胞被双特异性抗体重定向到GPRC5D+多发性骨髓瘤细胞系的细胞毒性
在与人原代免疫细胞的共培养实验中，测试了GPRC5DxCD3双特异性抗体对GPRC5D+肿瘤细胞系的细胞毒性。
PBMC共培养细胞毒性测定：
根据制造商的说明，用5μM CellTrace Violet染料(ThermoFisher Cat#C34557)标记多发性骨髓瘤细胞系H929。根据制造商的说明，使用淋巴细胞分离培养基(CorningCat#25-072-CV)从LRS室中分离来自健康供体的人PBMC。对活PBMC和肿瘤细胞进行计数，并以10：1的E-T比混合。连续稀释双特异性抗体，起始浓度为10nM。将细胞与抗体在37℃下孵育48小时。然后，根据制造商的说明，用InvitrogenTMLIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色试剂盒(ThermoFisher Scientific Cat#L10119)对细胞进行染色，并使用BD FortessaX20流式细胞仪进行分析。
每个孔的活肿瘤细胞数被归一化，以仅在没有效应细胞的情况下的肿瘤细胞为对照孔。M44-Mut36和M53-Mut36可以有效地重定向PBMC并杀死H929肿瘤细胞(图10)，具有比Talquetamab更好的体外细胞毒性。EC50值总结如下表(表22)。
表22.GPRC5D x CD3TCE诱导H929细胞的细胞毒性的EC50值
EC50(pM)
M44-mut36 0.64
M53-mut36 1.03
Talquetamab 15.45
扩增的人T细胞共培养细胞毒性测定：
T细胞共培养细胞毒性测定的进行与上述类似，使用扩增的T细胞作为效应细胞。简而言之，使用Easysep人T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies Cat.No.17951)，根据制造商的协议，在重组IL2和DynabeadsTM人T激活剂CD3/CD28(ThermoFisher Cat#11161D)存在下，将T细胞在RPMI1640 10％ FBS、1％青霉素/链霉素培养基中扩增14天，然后在没有T细胞活化珠的情况下再培养1天。用CellTrace Violet(ThermoFisherCat.No.C34557)标记多发性骨髓瘤细胞系H929、MM.1S或RPMI8226，在不同浓度的双特异性抗体存在下，与扩增的T细胞一起在37℃的培养箱中孵育48小时。T细胞与MM.1S、H929和RPMI8226的E：T比分别为1：5、1：1和1：1。收集细胞并用Live/Dead染色剂盒(ThermoFisherCat.No.C34557)染色，用于633或635nm激发，并用流式细胞仪分析。每个孔的活肿瘤细胞数归一化为仅具有肿瘤细胞的孔。
M44-Mut36和M53-Mut36通过扩增T细胞，在表达高GPRC5D的MM.1S和H929细胞上诱导强大的杀伤活性(图11A-B)。对RPMI8226细胞的杀伤活性要弱(图11C)。EC50值汇总于表23中。
表23.GPRC5D x CD3TCE诱导多发性骨髓瘤细胞的细胞毒的EC50值
实施例9与双特异性抗体介导靶细胞结合时PBMC释放的细胞因子的定量
分析了GPRC5DxCD3双特异性抗体诱导T细胞介导的细胞因子产生的潜力。将新鲜分离的人PBMC细胞与多发性骨髓瘤细胞系H929(E至T＝10：1)在U型底部96孔板中，在37℃和5％CO2下共培养48小时。离心细胞沉淀后，将每个孔的上清液转移到V型底96孔板中。根据制造商的说明，使用LEGENDplex多重检测试剂盒(BioLegend#740930)测量PBMC中释放的细胞因子(包括IFNγ、IL6)。在iQue3(赛多利斯)上采集和分析数据。使用GraphPad Prism软件从标准曲线中插值每个样品的单个细胞因子水平。
结果显示，与有效浓度的TCE相比，双特异性抗体介导的T细胞激活释放的炎症因子(FNγ、IL-6)水平极低。如图12所示，M44-Mut36和M53-Mut36诱导的细胞因子水平与Talquetamab相当。
实施例10双特异性抗体在T细胞人源化多发性骨髓瘤CDX小鼠模型中的疗效评价。
扩增T细胞人源化H929CDX模型：
如上所述，从人PBMC中分离人T细胞，并在重组IL2和DynabeadsTM人T激活剂CD3/CD28(ThermoFisher)存在下扩增7～10天。NSG小鼠(6～8周龄)以500万个细胞/小鼠的体量植入多发性骨髓瘤细胞系H929(在PBS20％基质胶中制备)。三天后，静脉注射双特异性抗体和扩增的人T细胞。以指定剂量通过眶后静脉注射到小鼠体内。每周测量肿瘤体积三次。
在第0天，通过皮下注射6至8周龄的NOD-scid-IL2Rgnull(NSG)小鼠(杰克逊实验室)在侧腹注射5x106H929肿瘤细胞和20％基质胶。第3天，动物被随机分为5个治疗组，每组5只小鼠；每只小鼠静脉注射(眼眶后静脉)10x 106扩增的人T细胞，与双特异性抗体(2μg/小鼠)或PBS混合。小鼠每3或4天接受3剂扩增的原代T细胞，每3或4天单独接受5剂双特异性抗体或PBS溶液。每周测量体重和肿瘤体积三次。使用卡尺测量肿瘤体积，并使用以下公式计算：体积＝(长x宽x宽)/2。
M44-Mut36和M53-mut36治疗组在2ug/动物剂量(～0.1mpk)时显示出完全肿瘤消退，而Talquetamb仅部分抑制肿瘤生长(图13)。这些结果表明M44-Mut36和M53-Mut36具有较强的抗肿瘤功效。
扩增T细胞人源化MM.1S CDX模型
M44-Mut36和M53-Mut36的抗肿瘤活性也在MM.1S CDX模型中以与上述类似的方式进行评估。简而言之，在第0天将107个MM.1S细胞接种到NSG小鼠。第8天，小鼠被随机分为5组，每组5只小鼠。然后通过眶后静脉注射给荷瘤小鼠107个扩增的人T细胞和每只小鼠2μg双特异性抗体。所有小鼠每3或4天接受总共4剂扩增的T细胞和双特异性抗体。每周测量肿瘤体积三次。
M44-Mut36和M53-Mut36在体内对MM.1S表现出强大的抗肿瘤活性，而与对照组相比，Talquetamab引起的肿瘤抑制最小(图14)。这些结果表明，M44-Mut36和M53-Mut36可以有效地靶向体内多发性骨髓瘤。

Claims (25)

1.一种特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链可变区包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其特征在于：
a)HCDR1具有如SEQ ID NO:01或SEQ ID NO:04所示的氨基酸序列；
b)HCDR2具有如SEQ ID NO:02或SEQ ID NO:05所示的氨基酸序列；
c)HCDR3具有如SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:06所示的氨基酸序列；
d)LCDR1具有如SEQ ID NO:07或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
e)LCDR2具有如SEQ ID NO:08所示的氨基酸序列；
f)LCDR3具有如SEQ ID NO:09或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，
a)重链可变区包括分别如SEQ ID NO:01、SEQ ID NO:02和SEQ ID NO:03所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:09所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
或
b)重链可变区包括分别如SEQ ID NO:04、SEQ ID NO:05和SEQ ID NO:06所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括分别如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:08和SEQ ID NO:11所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
3.根据权利要求1或2所述的特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体或其抗原结合片段。
4.根据权利要求3所述的特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括：
a)如SEQ ID NO:18所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:19所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:20所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的重链可变区，和/或，SEQ ID NO:21所示，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的轻链可变区；
优选地，所述抗体或抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:18所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:20所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:21所示的轻链可变区；
更优选地，所述抗体或抗原结合片段包括：a)如SEQ ID NO:18所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:19所示的轻链可变区；或，b)如SEQ ID NO:20所示的重链变量区，和如SEQ IDNO:21所示的轻链变区。
5.根据权利要求4所述的特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体还包括人抗体恒定区；优选地，所述人抗体恒定区的重链恒定区选自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区及其变体，所述人抗体恒定区的轻链恒定区选自人κ、λ链恒定区及其变体；更优选地，所述抗体包括SEQ ID NO:24的人重链恒定区和SEQ ID NO:25的人轻链恒定区。
6.根据权利要求5所述的特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括：
a)如SEQ ID NO:66所示的重链，和如SEQ ID NO:67所示的轻链；
或，b)如SEQ ID NO:68所示的重链，和如SEQ ID NO:69所示的轻链。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的特异性结合GPRC5D的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、二聚化结构域V(diabody)、二硫键稳定Fv(dsFv)或含CDR的肽。
8.一种分离核酸分子，编码如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种双特异性抗体，包括特异性结合GPRC5D的第一结合域，和特异性结合第二靶蛋白的第二结合域，其中，所述第一结合域为权利要求1-7中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
10.根据权利要求9所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二靶蛋白为CD3。
11.根据权利要求9或10所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结合域为完整的IgG。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结合域包括重链可变区和轻链可变区，
其中，所述重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，分别如SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16和SEQ ID NO:17所示。
13.根据权利要求12所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结合域为Fv片段，优选为单链Fv(scFv)片段，或二硫键结合的Fv片段。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结合域为完整的IgG，所述第二结合域为scFv。
15.根据权利要求14所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结合域的scFv包括：如SEQ ID NO:22所示的重链可变区，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性；和/或，如SEQ ID NO:23所示的轻链可变区，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性；
优选地，所述第二结合域的scFv包括：如SEQ ID NO:22所示的重链可变区，以及如SEQID NO:23所示的轻链可变区。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结合域的scFv通过接头与所述第一结合域的完整IgG连接。
17.根据权利要求16所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第二结合域的scFv的N末端通过接头，与所述第一结合域的完整IgG的轻链C末端相连。
18.根据权利要求16或17所述的双特异性抗体，其特征在于，所述接头选自TS(GGGGS)n、(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n、(GGGS)n或(GKPGS)n，n为正整数；优选地，n为1、2、3、4、5或6。
19.根据权利要求9-18中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述第一结合域包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区和轻链恒定区的序列分别如SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27所示。
20.根据权利要求19所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体选自：
如SEQ ID NO:28所示的重链和如SEQ ID NO:29所示的轻链；
或，如SEQ ID NO:30所示的重链和如SEQ ID NO:31中所示的轻链。
21.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码如权利要求9-20中任一项所述的双特异性抗体。
22.一种表达载体，所述表达载体包含如权利要求21所述的分离的核酸分子。
23.一种分离的宿主细胞，包含如权利要求21所述的核酸分子，或如权利要求22所述的表达载体，其特征在于，所述宿主细胞选自原核细胞，或真核细胞；优选地，选自真核细胞；更优选地，选自哺乳动物细胞。
24.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求9-20中任一项所述的双特异性抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
25.如权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求9-20中任一项所述的双特异性抗体，或如权利要求24所述的药物组合物，在制备治疗或预防GPRC5D介导的疾病或病症的药物中的用途；优选地，所述GPRC5D介导的疾病或病症为癌症或自身免疫疾病；更优选的，所述癌症选自淋巴瘤、白血病或骨髓瘤，所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮，类风湿性关节炎。
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