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JP2021511818A - Ｖｉｓｔａ抗原結合性分子 - Google Patents

Ｖｉｓｔａ抗原結合性分子 Download PDF

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JP2021511818A
JP2021511818A JP2020552406A JP2020552406A JP2021511818A JP 2021511818 A JP2021511818 A JP 2021511818A JP 2020552406 A JP2020552406 A JP 2020552406A JP 2020552406 A JP2020552406 A JP 2020552406A JP 2021511818 A JP2021511818 A JP 2021511818A
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サンセノン，ヴィセンテ
グァン，シユ
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ハミングバード・バイオサイエンス・ホールディングス・プライベート・リミテッド
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Abstract

ＶＩＳＴＡ抗原結合性分子が開示される。また、ＶＩＳＴＡ抗原結合性分子をコードする核酸および発現ベクター、ＶＩＳＴＡ抗原結合性分子を含む組成物、ならびにＶＩＳＴＡ抗原結合性分子を使用する方法も開示される。【選択図】図１Ｃ

Description

本出願は、それらの内容および要素が、参照によりそれらの全体において、全ての目的のために本明細書に組み込まれる、２０１８年３月２９日に出願された、ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０５８２５８、２０１８年９月７日に出願された、ＧＢ１８１４５６２．３、２０１８年１１月５日に出願された、ＵＳ１６／１８０,９４９からの優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野に関し、より具体的には、抗体技術の分野に関する。本発明はまた、医学的な処置および予防の方法にも関する。
免疫応答の、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）媒介性抑制は、複数の充実性腫瘍およびリンパ腫において同定されている。ＭＤＳＣは、進行性結腸直腸がんにおいて上昇する（Ｔｏｏｒら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１６、７：５６０）。ＭＤＳＣはまた、乳がんにおいても観察され、ＭＤＳＣの、末梢血中の百分率は、後期乳がんを伴う患者において増大する（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．、２０１３年７月、１４０（１）：１３〜２１）。ＭＤＳＣの存在度はまた、充実性腫瘍における予後不良とも相関する（Ｃｈａｒｏｅｎｔｏｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、２０１７年１月３日、１８（１）：２４８〜２６２）。
ＭＤＳＣは、反応性酸素分子種、一酸化窒素、およびアルギナーゼの産生を含む、複数の機構を介して、Ｔ細胞に対する抑制を及ぼす。これらは、最終的に、ＤＣ、ＮＫ、およびＴ細胞の活性の抑制、ならびに腫瘍負荷の増大をもたらす（Ｕｍａｎｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）（２０１６）、４（４）：３６）。ＭＤＳＣはまた、血管新生、浸潤、増殖、および転移を促進する、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β、およびＳ１００Ａ８／Ａ９などの可溶性因子の産生を介して、腫瘍の発生および転移にも寄与する。
主に、ＭＤＳＣ上で発現される免疫チェックポイント分子である、Ｖ−ｔｙｐｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＶＩＳＴＡ）のターゲティングは、エフェクター免疫細胞機能に対するＭＤＳＣ媒介性抑制を除去するための、魅力的な治療戦略である。
ＷＯ２０１７／１３７８３０Ａ１は、例えば、段落［００２２１］において、抗ＶＩＳＴＡ抗体であるＶＳＴＢ１１２の可変領域を含むことが開示される、抗ＶＩＳＴＡ抗体であるＶＳＴＢ１７４を開示する。段落［００３６２］は、ＶＳＴＢ１２３が、ＶＳＴＢ１７４の可変領域を含むことを開示する。段落［０４１７］および図４２Ａにおける、ＷＯ２０１７／１３７８３０Ａ１の実施例２５は、ｍＩｇＧ２ａ抗体であるＶＳＴＢ１２３が、ＭＢ４９腫瘍モデルにおいて、腫瘍増殖を阻害することが可能であったことを開示する。段落［０４１８］および図４２Ａは、これに対して、ＶＳＴＢ１２４（ＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡフォーマットで提供される、同じ抗体である；段落［０４０８］を参照されたい）が、腫瘍増殖を阻害しなかったことを開示する。これらの結果に基づき、段落［０４１９］における実施例２５は、抗ＶＩＳＴＡ抗体による処置に関する有効性は、活性のＦｃを要求しうると結論づける。したがって、図４７において概略的に表された、抗ＶＩＳＴＡ抗体について提起される機構作用（段落［００５３］における、図４７に対するキャプションを参照されたい）は、ＮＫ細胞により発現されるＦｃγＲＩＩＩの、Ｆｃ媒介性エンゲージメントを伴う。
ハムスターモノクローナル抗ＶＩＳＴＡ抗体であるｍＡｂ１３Ｆ３は、Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）、７４（７）：１９３３〜４４において、Ｂ１６ＯＶＡおよびＢ１６−ＢＬ６黒色腫モデルにおける腫瘍増殖を阻害することが開示されている。１９４２頁、左〜右段にわたる段落は、ＶＩＳＴＡ ｍＡｂの免疫原性およびＦｃＲ結合活性が、最適な標的の中和およびこれに対する治療有効性を達成するための、極めて重要な制限因子でありうることについて教示する。
第１の態様では、本発明は、Ｆｃ媒介性機能に依存せずに、ＶＩＳＴＡに結合し、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗原結合性分子、任意選択で、単離抗原結合性分子を提供する。
また、ＶＩＳＴＡに結合し、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗原結合性分子、任意選択で、単離抗原結合性分子も提供され、ここで、抗原結合性分子は、Ｆｃ媒介性抗体エフェクター機能を誘導することが可能ではない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を誘導することが可能ではなく、かつ／または抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を誘導することが可能ではなく、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を誘導することが可能ではない。
また、ＶＩＳＴＡに結合し、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗原結合性分子、任意選択で、単離抗原結合性分子も提供され、ここで、抗原結合性分子は、Ｆｃγ受容体に結合せず、かつ／または抗原結合性分子は、Ｃ１ｑに結合しない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｉｇ様Ｖ型ドメイン内で、ＶＩＳＴＡに結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ（例えば、実施例８に記載される、エピトープビニング解析により決定される）への結合について、ＩＧＮ１７５Ａと競合しない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７５のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することが可能ではない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３０５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３０７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２４４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号２４５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９５または配列番号３００のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３００のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２７７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２８６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３００のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号５８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号７３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号７４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号８１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号８２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号８９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号９６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号９７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号９８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号８９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１３７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１１４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１２１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１２２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１２９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１４４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１５１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１５８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１７７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１７９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２４６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１８５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１８９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１９７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２００のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２０３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号３１０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２９４、配列番号２９７または配列番号２９９のうちの１つのアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２９４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２９７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２９９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号３０１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号３０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号３０３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２７６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２８２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２８７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
配列番号３２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号４０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号５２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号５７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号６２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号６６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号４８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号８７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号９５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１０６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１１３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１４３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１５７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１６４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号７１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号７９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１０４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１１９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１２６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１８３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１８８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１９４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１９６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１９９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１３３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１３６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１６８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１７６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ヒトＶＩＳＴＡ、ならびにマウスＶＩＳＴＡおよびカニクイザルＶＩＳＴＡのうちの１つまたは複数に結合することが可能である。
また、（ｉ）本発明に従う抗原結合性分子、および（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ以外の抗原に結合することが可能な抗原結合性分子を含む抗原結合性分子、任意選択で、単離抗原結合性分子も提供される。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、細胞表面において、ＶＩＳＴＡを発現する細胞に結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナーとの相互作用を阻害することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、エフェクター免疫細胞の増殖、および／またはこれらによるサイトカイン産生を増大させることが可能である。
また、本発明に従う抗原結合性分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供される。
また、本発明に従う、抗原結合性分子またはＣＡＲをコードする、１つの核酸または複数の核酸、任意選択で、単離核酸も提供される。
また、本発明に従う、１つの核酸または複数の核酸を含む、１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクターも提供される。
また、本発明に従う、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む細胞も提供される。
また、本発明に従う、１つの核酸もしくは複数の核酸、または１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む細胞を、抗原結合性分子またはＣＡＲの、核酸（複数可）または発現ベクター（複数可）からの発現に適する条件下で培養するステップを含む方法も提供される。
また、本発明に従う抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、または細胞を含む組成物も提供される。
一部の実施形態では、組成物は、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤をさらに含み、任意選択で、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＢＴＬＡから選択される。
また、医学的処置または予防の方法における使用のための、本発明に従う、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物も提供される。
また、がんまたは感染性疾患の処置または防止の方法における使用のための、本発明の、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物も提供される。
また、がんまたは感染性疾患の処置または防止の方法における使用のための医薬の製造における、本発明の、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物の使用も提供される。
また、がんまたは感染性疾患を処置または防止する方法であって、対象へと、治療または予防有効量の、本発明の、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物を投与するステップを含む方法も提供される。
一部の実施形態では、がんは、ＶＩＳＴＡを発現する細胞を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現する細胞の浸潤を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現するがん細胞を含むがん、血液がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、中皮腫、充実性腫瘍、肺がん、非小細胞肺癌、胃がん、胃癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、子宮がん、子宮体内膜癌、乳がん、トリプルネガティブ浸潤性乳癌、肝がん、肝細胞癌、膵がん、膵管腺癌、甲状腺がん、胸腺腫、皮膚がん、黒色腫、皮膚黒色腫、腎がん、腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、卵巣がん、卵巣癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、前立腺がん、および／または前立腺腺癌から選択される。
また、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法における使用のための、本発明の、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物も提供される。
また、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法における使用のための医薬の製造における、本発明の、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物の使用も提供される。
また、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法であって、対象へと、治療または予防有効量の、本発明の、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物を投与するステップを含む方法も提供される。
一部の実施形態では、方法は、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤の投与をさらに含み、任意選択で、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、またはＢＴＬＡから選択される。
また、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害する方法であって、ＶＩＳＴＡ発現細胞を、本発明に従う抗原結合性分子と接触させるステップを含む方法も提供される。
また、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の活性を阻害するための方法であって、ＭＤＳＣを、本発明に従う抗原結合性分子と接触させるステップを含む方法も提供される。
また、エフェクター免疫細胞の数または活性を増大させるための方法であって、ＶＩＳＴＡ発現細胞の活性を、本発明に従う抗原結合性分子により阻害するステップを含む方法も提供される。
また、ＶＩＳＴＡに結合した、本発明に従う抗原結合性分子を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体、任意選択で、単離ｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体も提供される。
また、ＶＩＳＴＡを含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、本発明に従う抗原結合性分子抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子の、ＶＩＳＴＡとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法も提供される。
また、対象を、ＶＩＳＴＡターゲティング剤による処置のために選択または層別化する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、本発明に従う抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子の、ＶＩＳＴＡとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法も提供される。
また、本発明に従う抗原結合性分子の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、診断または予後診断剤としての使用も提供される。
また、任意選択で、がんが、ＶＩＳＴＡを発現する細胞を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現する細胞の浸潤を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現するがん細胞を含むがん、血液がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、中皮腫、充実性腫瘍、肺がん、非小細胞肺癌、胃がん、胃癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、子宮がん、子宮体内膜癌、乳がん、トリプルネガティブ浸潤性乳癌、肝がん、肝細胞癌、膵がん、膵管腺癌、甲状腺がん、胸腺腫、皮膚がん、黒色腫、皮膚黒色腫、腎がん、腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、卵巣がん、卵巣癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、前立腺がん、および／または前立腺腺癌から選択される、がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法における、本発明に従う抗原結合性分子の使用も提供される。
説明
本発明は、公知の抗ＶＩＳＴＡ抗体と比較して、新規の特性および／または改善された特性を有する、新規のＶＩＳＴＡ結合性分子に関する。
本発明者らは、ＶＩＳＴＡの細胞外領域内の、特に目的となる領域に結合する抗原結合性分子を作出した。本発明のＶＩＳＴＡ結合性分子は、先行技術において開示された、ＶＩＳＴＡ結合性抗原結合性分子と比較して、所望の生物物理的特性および機能的特性の組合せを備えている。
特に、本明細書で記載されるＶＩＳＴＡ結合性分子は、Ｆｃ媒介性機能を要求しない機構を介して、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達をアンタゴナイズすることが可能であることが裏付けられている。本発明者らは、Ｆｃγ受容体および／またはＣ１ｑに結合する能力を欠くＦｃを含む、本明細書で記載されるＶＩＳＴＡ結合性分子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、抗がん治療効果をもたらすことが可能であることを裏付ける。
本発明者らは、初めて、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能（例えば、ＶＩＳＴＡ発現細胞に対するＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣ）を要求しない機構を通して、直接、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達をアンタゴナイズすることが可能であることを確立する。
本開示のＶＩＳＴＡ結合性分子は、公知の抗ＶＩＳＴＡ抗体によりターゲティングされる領域とは異なる、ＶＩＳＴＡの領域をターゲティングする。ＶＩＳＴＡの特定の領域をターゲティングする抗原結合性分子は、Ｆｃ媒介性のエフェクター機能を要求せずに、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達をアンタゴナイズすることが可能である。
したがって、本明細書で開示されるＶＩＳＴＡ結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞を枯渇させずに、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害するために有用である。ＶＩＳＴＡは、枯渇させることが所望されない細胞上で発現されるため、これは重要である。したがって、本明細書で開示されるＶＩＳＴＡ結合性分子は、所望されない副作用を最小化させながら、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。
本明細書で開示されるＶＩＳＴＡ結合性分子はまた、Ｔ細胞を、ＶＩＳＴＡ媒介性抑制から解放することが可能なであることが示されたことも有利である。具体的には、本明細書で開示されるＶＩＳＴＡ結合性分子は、Ｔ細胞の増殖、ならびに、例えば、ＶＩＳＴＡまたはＶＩＳＴＡ発現細胞の存在下で培養されたＴ細胞からの、ＩＦＮγおよびＴＮＦａの産生を増大させることが可能であることを示す。
ＶＩＳＴＡ、結合パートナー、およびＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達
Ｖ−ｔｙｐｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＶＩＳＴＡ；例えば、Ｂ７−Ｈ５、ＳＩＳＰ１、ＰＤ−１Ｈとしてもまた公知である）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列（Ｑ９Ｈ７Ｍ９−１、ｖ３）を有する、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ９Ｈ７Ｍ９により同定されるタンパク質である。ＶＩＳＴＡの構造および機能については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｌｉｎｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）、７４（７）：１９２４〜１９３２において記載されている。ＶＩＳＴＡは、免疫チェックポイントとして機能し、Ｃ１０ｏｒｆ５４遺伝子によりコードされる、約５０ｋＤａの、Ｉ型１回膜貫通タンパク質である。ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインは、ＰＤ−Ｌ１と相同である。
配列番号１の、Ｎ末端の３２アミノ酸は、シグナルペプチドを構成するので、ＶＩＳＴＡの成熟形態（すなわち、シグナルペプチドを除去するプロセシングの後における）は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１の３３〜１９４位は、細胞外ドメイン（配列番号３）を形成し、１９５〜２１５位は、膜貫通ドメイン（配列番号４）を形成し、２１６〜３１１位は、細胞質ドメイン（配列番号５）を形成する。細胞外ドメインは、Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（配列番号６に示される、配列番号１の３３〜１６８位）を含む。
本明細書では、「ＶＩＳＴＡ」とは、任意の種に由来するＶＩＳＴＡを指し、任意の種に由来する、ＶＩＳＴＡの、アイソフォーム、断片、変異体（突然変異体を含む）、または相同体を含む。
本明細書で使用される、タンパク質の「断片」、「変異体」、または「相同体」は、任意選択で、参照タンパク質（例えば、参照アイソフォーム）のアミノ酸配列に対する、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有することとして特徴付けられうる。一部の実施形態では、参照タンパク質の、断片、変異体、アイソフォーム、および相同体は、参照タンパク質により果たされる機能を果たす能力により特徴付けられうる。
「断片」とは、一般に、参照タンパク質の部分を指す。「変異体」とは、一般に、参照タンパク質のアミノ酸配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸の置換、挿入、欠失、または他の修飾を含むが、参照タンパク質のアミノ酸配列に対する、かなりの程度の配列同一性（例えば、少なくとも６０％）を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。「アイソフォーム」とは、一般に、参照タンパク質の種と同じ種により発現される、参照タンパク質の変異体を指す。「相同体」とは、一般に、参照タンパク質の種と比較して、異なる種により産生される、参照タンパク質の変異体を指す。相同体は、オーソログを含む。
「断片」は、任意の長さ（アミノ酸の数による）でありうるが、任意選択で、参照タンパク質（すなわち、断片が由来するタンパク質）の長さの、少なくとも２０％であることが可能であり、参照タンパク質の長さの、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちの１つの、最大の長さを有しうる。ＶＩＳＴＡの断片は、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００アミノ酸のうちの１つの、最小の長さを有することが可能であり、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、または３００アミノ酸のうちの１つの、最大の長さを有しうる。
一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡは、哺乳動物に由来するＶＩＳＴＡ（例えば、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、および／または齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）のＶＩＳＴＡ）である。ＶＩＳＴＡの、アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、所与の種、例えば、ヒトに由来する、未成熟または成熟のＶＩＳＴＡアイソフォームのアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有することとして特徴付けられうる。
アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、例えば、機能的特性／活性に適切なアッセイを介する解析により決定する場合、リファレンスＶＩＳＴＡの機能的特性／活性を有する、機能的なアイソフォーム、断片、変異体、または相同体でありうる。例えば、ＶＩＳＴＡのアイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、例えば、ＶＳＩＧ−３および／またはＰＳＧＬ−１との会合を呈しうる。
一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡは、配列番号１または２に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡの断片は、配列番号２、３、または６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
ＶＩＳＴＡは、タンパク質のＢ７ファミリーのメンバーであり、主に、白血球により発現され、特に、ＣＤ１４＋単球（単球由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を含む）およびＣＤ３３＋骨髄細胞により発現される。ＶＩＳＴＡはまた、ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞、樹状細胞によっても発現され、より小さな程度で、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞上でも発現される。ＶＩＳＴＡは、ＭＤＳＣ、特に、腫瘍浸潤性ＭＤＳＣ上で、高度に発現され、また、腫瘍浸潤性骨髄ＤＣ上（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）、７４（７）：１９３３〜４４）のほか、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）上および好中球上でも高度に発現される。
ＶＩＳＴＡは、Ｔ細胞上で、リガンドおよび受容体のいずれとしても、Ｔ細胞のエフェクター機能を阻害し、末梢における寛容を維持するように作用し、ＶＩＳＴＡを過剰発現させるように操作された腫瘍は、免疫によるコントロールを回避し、ＶＩＳＴＡを過剰発現させない腫瘍より、急速に増殖するという証拠がある（Ｗａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．（２０１１）、２０８（３）：５７７〜９２；Ｌｉｎｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）、７４（７）：１９２４〜１９３２）。ＶＩＳＴＡは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞上の、共阻害型受容体、またはＴ細胞に対する、共阻害型リガンドであることが示されている。ＶＩＳＴＡ−／−ＣＤ４＋ Ｔ細胞野生型ＣＤ４＋ Ｔ細胞より強い抗原特異的増殖およびサイトカイン産生を呈することが報告されていることから、ＶＩＳＴＡは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞上で、阻害型受容体として機能することが示唆される。モノクローナル抗ＶＩＳＴＡ抗体を使用して、ＶＩＳＴＡの機能を遮断することは、腫瘍微小環境における、腫瘍反応性Ｔ細胞の浸潤、増殖、およびエフェクター機能を増強することが示されている（Ｌｅ Ｍｅｒｃｉｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１４）、７４（７）：１９３３〜４４）。
ＶＩＳＴＡは、ＶＳＩＧ−３（ＩＧＳＦ１１）と相互作用することが示されている（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１７）、１９８（増刊１号）、１５４．１を参照されたい）。活性化Ｔ細胞上のＶＩＳＴＡを介する、ＶＳＩＧ−３のエンゲージメントは、Ｔ細胞の増殖を阻害し、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１ａ、およびＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣなどの、サイトカインおよびケモカインの産生を低減する。
ＶＳＩＧ−３は、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ５ＤＸ２１により同定されるタンパク質である。ヒトＩＧＳＦ１１遺伝子によりコードされるｍＲＮＡの、代替的なスプライシングは、３つの異なるアイソフォーム：アイソフォーム１（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ５ＤＸ２１−１、ｖ３；配列番号７）；１〜１７位において、配列番号７と異なる配列を含む、アイソフォーム２（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ５ＤＸ２１−２；配列番号８）；および１〜１７位において、配列番号７と異なる配列を含み、また、２１１〜２３５位において、配列番号７と異なる配列も含む、アイソフォーム３（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ５ＤＸ２１−３；配列番号９）をもたらす。
配列番号７、８、および９の、Ｎ末端の２２アミノ酸は、シグナルペプチドを構成するので、ＶＳＩＧ−３の成熟形態アイソフォーム１、２、および３（すなわち、シグナルペプチドを除去するプロセシングの後における）は、それぞれ、配列番号１０、１１、および１２に示されるアミノ酸を有する。配列番号７および８の２３〜２４１位は、ＶＳＩＧ−３の細胞外ドメインアイソフォーム１および２（配列番号１３）を形成し、配列番号９の２３〜２１６位は、ＶＳＩＧ−３の細胞外ドメインアイソフォーム３（配列番号１４）を形成する。ＶＳＩＧ−３の膜貫通ドメインは、配列番号１５に示され、細胞質ドメインは、配列番号１６に示される。細胞外ドメインは、Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（配列番号１７に示される）を含み、ＶＳＩＧ−３の細胞外ドメインアイソフォーム１および２は、加えて、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン（配列番号１８に示される）を含む。
本明細書では、「ＶＳＩＧ−３」とは、任意の種に由来するＶＳＩＧ−３を指し、任意の種に由来する、ＶＳＩＧ−３の、アイソフォーム、断片、変異体（突然変異体を含む）、または相同体を含む。
ＶＳＩＧ−３の断片は、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００アミノ酸のうちの１つの、最小の長さを有することが可能であり、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００アミノ酸のうちの１つの、最大の長さを有しうる。
一部の実施形態では、ＶＳＩＧ−３は、哺乳動物に由来するＶＳＩＧ−３（例えば、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、および／または齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）のＶＳＩＧ−３）である。ＶＳＩＧ−３の、アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、所与の種、例えば、ヒトに由来する、未成熟または成熟のＶＳＩＧ−３アイソフォームのアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有することとして特徴付けられうる。
アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、例えば、機能的特性／活性に適切なアッセイを介する解析により決定する場合、参照ＶＳＩＧ−３の機能的特性／活性を有する、機能的なアイソフォーム、断片、変異体、または相同体でありうる。例えば、ＶＳＩＧ−３のアイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、例えば、ＶＩＳＴＡとの会合を呈しうる。
一部の実施形態では、ＶＳＩＧ−３は、配列番号７〜１２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＶＳＩＧ−３の断片は、配列番号１０〜１４、１７、または１８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
ＶＩＳＴＡはまた、ＶＳＩＧ−８と相互作用することも提起されている（例えば、ＷＯ２０１６／０９０３４７Ａ１を参照されたい）。ＶＳＩＧ−８は、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０ＤＰＡ２（配列番号１９）により同定されるタンパク質である。配列番号１９の、Ｎ末端の２１アミノ酸は、シグナルペプチドを構成するので、ＶＳＩＧ−８の成熟形態（すなわち、シグナルペプチドを除去するプロセシングの後における）は、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号１９の２２〜２６３位は、ＶＳＩＧ−８の細胞外ドメイン（配列番号２１）を形成する。ＶＳＩＧ−８の膜貫通ドメインは、配列番号２２に示され、細胞質ドメインは、配列番号２３に示される。細胞外ドメインは、Ｉｇ様Ｖ型ドメイン１（配列番号２４に示される）と、Ｉｇ様Ｖ型ドメイン２（配列番号２５に示される）とを含む。
本明細書では、「ＶＳＩＧ−８」とは、任意の種に由来するＶＳＩＧ−８を指し、任意の種に由来する、ＶＳＩＧ−８の、アイソフォーム、断片、変異体（突然変異体を含む）、または相同体を含む。
ＶＳＩＧ−８の断片は、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００アミノ酸のうちの１つの、最小の長さを有することが可能であり、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００アミノ酸のうちの１つの、最大の長さを有しうる。
一部の実施形態では、ＶＳＩＧ−８は、哺乳動物に由来するＶＳＩＧ−８（例えば、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、および／または齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）のＶＳＩＧ−８）である。ＶＳＩＧ−８の、アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、所与の種、例えば、ヒトに由来する、未成熟または成熟のＶＳＩＧ−８アイソフォームのアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有することとして特徴付けられうる。
アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、例えば、機能的特性／活性に適切なアッセイを介する解析により決定する場合、参照ＶＳＩＧ−８の機能的特性／活性を有する、機能的なアイソフォーム、断片、変異体、または相同体でありうる。例えば、ＶＳＩＧ−８のアイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、例えば、ＶＩＳＴＡとの会合を呈しうる。
一部の実施形態では、ＶＳＩＧ−８は、配列番号１９または２０に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＶＳＩＧ−８の断片は、配列番号２０、２１、２４、または２５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
ＶＩＳＴＡはまた、ＰＳＧＬ−１と相互作用することも提起されている（例えば、ＷＯ２０１８／１３２４７６Ａ１を参照されたい）。ＰＳＧＬ−１アイソフォーム１は、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１４２４２−１（配列番号３２３）により同定されるタンパク質である。ＰＳＧＬ−１アイソフォーム２は、ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１４２４２−２（配列番号３２４）により同定されるタンパク質であり、配列番号３２３の１位の後に、さらなる１６アミノ酸を含む点で、ＰＳＧＬ−１アイソフォーム１と異なる。
配列番号３２３の、Ｎ末端の１７アミノ酸は、シグナルペプチドを構成するので、ＰＳＧＬ−１の成熟形態（すなわち、シグナルペプチドを除去するプロセシングの後における）は、配列番号３２５に示されるアミノ酸配列を有する。配列番号３２３の１８〜３２０位は、ＰＳＧＬ−１の細胞外ドメイン（配列番号３２６）を形成する。ＰＳＧＬ−１の膜貫通ドメインは、配列番号３２７に示され、細胞質ドメインは、配列番号３２８に示される。細胞外ドメインは、１２、１０アミノ酸のタンデムリピートを含み、リピート領域は、配列番号３２９に示される。
本明細書では、「ＰＳＧＬ−１」とは、任意の種に由来するＰＳＧＬ−１を指し、任意の種に由来する、ＰＳＧＬ−１の、アイソフォーム、断片、変異体（突然変異体を含む）、または相同体を含む。
ＰＳＧＬ−１の断片は、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００アミノ酸のうちの１つの、最小の長さを有することが可能であり、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００アミノ酸のうちの１つの、最大の長さを有しうる。
一部の実施形態では、ＰＳＧＬ−１は、哺乳動物に由来するＰＳＧＬ−１（例えば、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、および／または齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）のＰＳＧＬ−１）である。ＰＳＧＬ−１の、アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、所与の種、例えば、ヒトに由来する、未成熟または成熟のＰＳＧＬ−１アイソフォームのアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有することとして特徴付けられうる。
アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、例えば、機能的特性／活性に適切なアッセイを介する解析により決定する場合、参照ＰＳＧＬ−１の機能的特性／活性を有する、機能的なアイソフォーム、断片、変異体、または相同体でありうる。例えば、ＰＳＧＬ−１のアイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、例えば、ＶＩＳＴＡとの会合を呈しうる。
一部の実施形態では、ＰＳＧＬ−１は、配列番号３２３または３２４に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＰＳＧＬ−１の断片は、配列番号３２５、３２６、または３２９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
標的分子上の、特に目的となる領域
本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡの、特に目的となる領域をターゲティングするように、特異的にデザインされた。２ステップ法では、予測される抗原性、機能、および安全性についての解析に従い、ターゲティングされるＶＩＳＴＡ領域が選択された。次いで、標的領域に対応するペプチドを、特異的モノクローナル抗体を惹起するための免疫原として使用して、ＶＩＳＴＡの標的領域に特異的な抗体が調製され、後続するスクリーニングは、ナイーブ状態において、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗体を同定した。この手法は、抗体エピトープに対する、精緻な制御をもたらす。
本発明の抗原結合性分子は、それらが結合する、ＶＩＳＴＡの領域を参照することにより規定されうる。本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡの、特に目的となる領域に結合しうる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、アミノの酸連続配列（すなわち、アミノ酸の一次配列）からなる、ＶＩＳＴＡの直鎖状エピトープに結合しうる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、アミノ酸配列のうちの、アミノ酸の不連続配列からなる、ＶＩＳＴＡのコンフォメーションエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡの細胞外領域（例えば、配列番号３に示される領域）に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡのＩｇ様Ｖ型ドメイン（例えば、配列番号６に示される領域）に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号１の６１〜１６２位に対応する領域（配列番号３１に示される）内で、ＶＩＳＴＡに結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３２２に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２８に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２９に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３０に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７１に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７２に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７３に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７４に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７５に示される、ＶＩＳＴＡの領域に結合しない。
抗体が結合する、ペプチド／ポリペプチドの領域は、抗体−抗原複合体についてのＸ線共結晶構造解析、ペプチド走査、突然変異誘発マッピング、質量分析による水素−重水素交換解析、ファージディスプレイ、競合ＥＬＩＳＡ、およびタンパク質分解ベースの「保護」法を含む、当技術分野で周知の、多様な方法を使用して、当業者により決定されうる。このような方法については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２００７、２１（３）：１４５〜１５６において記載されている。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、本明細書で記載される抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２、４Ｍ２−Ｂ４、４Ｍ２−Ｃ９、４Ｍ２−Ｄ９、４Ｍ２−Ｄ５、４Ｍ２−Ａ８、Ｖ４Ｈ１、Ｖ４Ｈ２、Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１、２Ｍ１−Ｂ１２、２Ｍ１−Ｄ２、１Ｍ２−Ｄ２、１３Ｄ５ｐ、１３Ｄ５−１、１３Ｄ５−１３、５Ｍ１−Ａ１１または９Ｍ２−Ｃ１２のうちの１つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含む抗体が結合するＶＩＳＴＡの領域と同じＶＩＳＴＡ領域、または重複するＶＩＳＴＡの領域に結合することが可能である。
本明細書で使用される、「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結された、２つ以上のアミノ酸単量体による鎖を指す。ペプチドは、典型的に、領域内に、約２〜５０アミノ酸の長さを有する。「ポリペプチド」とは、２つ以上のペプチドによるポリマー鎖である。ポリペプチドは、典型的に、約５０アミノ酸を超える長さを有する。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、配列番号１、２、３、６、または３１のうちの１つのアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３２２のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７１のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７２のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７３のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７４のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７５のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することが可能ではない。
抗原結合性分子が、所与のペプチド／ポリペプチドに結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（例えば、ウェスタンブロット）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えば、Ｈｅａｒｔｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１２）、９０７：４１１〜４４２を参照されたい）、またはバイオレイヤー干渉法（例えば、Ｌａｄら（２０１５）、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ、２０（４）：４９８〜５０７を参照されたい）による解析を含む、当業者に周知の方法により解析されうる。
抗原結合性分子が、参照アミノ酸配列を含むペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である実施形態では、ペプチド／ポリペプチドは、参照アミノ酸配列の、一方または両方の末端において、１つまたは複数の、さらなるアミノ酸を含みうる。一部の実施形態では、ペプチド／ポリペプチドは、参照アミノ酸配列の、一方または両方の末端において、例えば、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、２０〜３０、２０〜４０、または２０〜５０の、さらなるアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡのアミノ酸配列の文脈では、参照配列の一方または両方の末端（すなわち、Ｎ末端およびＣ末端）においてもたらされる、さらなるアミノ酸（複数可）は、参照配列の末端における位置に対応する。例を目的として述べると、抗原結合性分子が、配列番号２６の配列、および配列番号２６のＣ末端における、さらなる、２つのアミノ酸を含むペプチドに結合することが可能である場合、さらなる、２つのアミノ酸は、配列番号１の９０および９１位に対応する、アルギニンおよびアスパラギンでありうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、本明細書で記載される抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２、４Ｍ２−Ｂ４、４Ｍ２−Ｃ９、４Ｍ２−Ｄ９、４Ｍ２−Ｄ５、４Ｍ２−Ａ８、Ｖ４Ｈ１、Ｖ４Ｈ２、Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１、２Ｍ１−Ｂ１２、２Ｍ１−Ｄ２、１Ｍ２−Ｄ２、１３Ｄ５ｐ、１３Ｄ５−１、１３Ｄ５−１３、５Ｍ１−Ａ１１または９Ｍ２−Ｃ１２のうちの１つのＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が結合するペプチド／ポリペプチドに結合することが可能である。
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）
骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）は、免疫抑制性表現型により特徴付けられる、骨髄系列細胞のうちの、非同種の免疫細胞群である。ＭＤＳＣの生物学については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｋｕｍａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６）、３７（３）：２０８〜２２０において総説されている。
ＭＤＳＣは、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｎｏｘ２）の発現の増大、反応性酸素分子種（ＲＯＳ）（スーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、およびペルオキシニトライト（ＰＮＴ；ＯＮＯＯ−）など）の産生の増大；アルギナーゼ１および一酸化窒素シンターゼ２（ｎｏｓ２）の発現の増大、ならびに一酸化窒素（ＮＯ）の産生の増大；ｃ／ＥＢＰβおよびＳＴＡＴ３の発現の増大；ＩＲＦ８の発現の減少；ならびにＳ１００Ａ８／９タンパク質の産生の増大など、これらの細胞を、成熟骨髄細胞（すなわち、マクロファージ、樹状細胞、および好中球）から識別する、多数の生化学的およびゲノム的特色により特徴付けられる。
２つの異なる種類のＭＤＳＣ：形態的かつ表現型的に、好中球に類似する、多型核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ−ＭＤＳＣ）と、単球により類似する、単球性ＭＤＳＣ（Ｍ−ＭＤＳＣ）とが存在する。ＭＤＳＣの、形態的かつ表現型的な特徴については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＭａｒｖｅｌおよびＧａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．、２０１５年９月１日、１２５（９）：３３５６〜３３６４において記載されている。マウスでは、ＭＤＳＣは、広く、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞として同定される。Ｇｒ−１ｈｉ細胞は、大半が、ＰＭＮ−ＭＤＳＣであり、Ｇｒ−１ｌｏ細胞は、大半が、Ｍ−ＭＤＳＣである。これらのサブセットは、Ｌｙ６ＣおよびＬｙ６Ｇマーカーに基づき、より正確に同定される場合があり、Ｍ−ＭＤＳＣは、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｈｉＬｙ６Ｇ−であり、ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｌｏＬｙ６Ｇ＋である。ヒトでは、ＭＤＳＣは、単核画分内で同定される。ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＣＤ１５＋またはＣＤ６６ｂ＋細胞であり、Ｍ−ＭＤＳＣは、ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ−／ｌｏ細胞である。Ｌｉｎ−ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ３３＋ＭＤＳＣの集団は、骨髄前駆細胞についてエンリッチされた混合細胞群を表す。
ＭＤＳＣ媒介性免疫抑制に関与する因子は、アルギナーゼ（ＡＲＧ１）、誘導性ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、およびＣＯＸ２の発現、システインの封鎖、Ｔ細胞による、ｌ−セレクチンの発現の減少、ならびにＴｒｅｇの誘導を含む。Ｍ−ＭＤＳＣと、ＰＭＮ−ＭＤＳＣとは、異なる免疫抑制の機構を利用する。Ｍ−ＭＤＳＣは、ＮＯおよびサイトカインの産生を介して、抗原特異的Ｔ細胞応答および非特異的Ｔ細胞応答のいずれも抑制し、ＰＭＮ−ＭＤＳＣより、強く免疫抑制性である。ＰＭＮ−ＭＤＳＣは、ＲＯＳの産生を介して、免疫応答を、抗原特異的に抑制する。
ＭＤＳＣは、がんおよび感染性疾患の発症および進行に、病理学的に関与する。ＭＤＳＣの、ヒト疾患における役割については、例えば、Ｋｕｍａｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１６）、３７（３）：２０８〜２２０（参照により本明細書に組み込まれる）；および参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｔｅｎら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０１１）、１１（７）：８０２〜８０７において総説されている。
ＭＤＳＣは、腫瘍組織内に豊富に存在し、複数の機構を介して、がんの発症および進行に寄与し、例えば、Ｕｍａｎｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）（２０１６）、４（４）：３６において総説されている。ＭＤＳＣは、ケモカインの発現を介して、腫瘍部位へと動員され、腫瘍微小環境内の炎症促進性因子は、ＭＤＳＣによる、免疫抑制性機能の、著明な上方調節を結果としてもたらす。ＭＤＳＣは、エフェクター免疫細胞機能（例えば、エフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞の機能）の抑制、制御性Ｔ細胞の産生／活性の促進、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦなど、増殖因子の産生、マトリックスメタロプロテイナーゼなど、ＥＣＭ修飾因子の産生を介して、腫瘍の発症、血管新生、および転移に寄与する。
ＭＤＳＣは、ＶＩＳＴＡの発現に対して特徴付けられうる。本発明の多様な態様についての実施形態では、ＭＤＳＣは、「ＶＩＳＴＡ発現ＭＤＳＣ」または「ＶＩＳＴＡ＋ ＭＤＳＣ」でありうる。ＭＤＳＣは、ＶＩＳＴＡを、細胞表面において発現させうる（すなわち、ＶＩＳＴＡは、細胞膜内または細胞膜において発現されうる）。
抗原結合性分子
本発明は、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子を提供する。
「抗原結合性分子」とは、標的抗原に結合することが可能な分子を指し、それらが、対象とする標的分子（複数可）への結合を呈する限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体および多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）、ならびに抗体断片（例えば、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ２、ダイアボディー、トリアボディー、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディー、単一ドメイン抗体（例えば、ＶｈＨ）など）を包含する。
本発明の抗原結合性分子は、標的抗原（複数可）に結合することが可能な部分を含む。一部の実施形態では、標的抗原に結合することが可能な部分は、標的抗原に特異的に結合することが可能な抗体の、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、標的抗原に結合することが可能な部分は、標的抗原に結合することが可能なアプタマー、例えば、核酸アプタマー（例えば、ＺｈｏｕおよびＲｏｓｓｉ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、２０１７、１６（３）：１８１〜２０２において総説された）を含むか、またはこれからなる。一部の実施形態では、標的抗原に結合することが可能な部分は、抗原結合性ペプチド／ポリペプチド、例えば、ペプチドアプタマー、チオレドキシン、モノボディー、アンチカリン、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、アビマー、ノッティン、フィノマー、アトリマー、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディー、ナノボディー（すなわち、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ））、アフィリン、アルマジロリピートタンパク質（ＡｒｍＲＰ）、ＯＢｏｄｙ、またはフィブロネクチン（例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｒｅｖｅｒｄａｔｔｏら、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．、２０１５、１５（１２）：１０８２〜１１０１において総説された（例えば、Ｂｏｅｒｓｍａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（２０１１）、２８６：４１２７３〜８５；およびＥｍａｎｕｅｌら、Ｍａｂ（２０１１）、３：３８〜４８もまた参照されたい））を含むか、またはこれからなる。
本発明の抗原結合性分子は、一般に、標的抗原に特異的に結合することが可能な、抗体のＶＨおよびＶＬを含む、抗原結合性ドメインを含む。本明細書では、ＶＨおよびＶＬにより形成される抗原結合性ドメインはまた、Ｆｖ領域とも称される。
抗原結合性分子は、抗原結合性ポリペプチド、または抗原結合性ポリペプチド複合体でありうるか、またはこれを含みうる。抗原結合性分子は、併せて、抗原結合性ドメインを形成する、１つを超えるポリペプチドを含みうる。ポリペプチドは、共有結合的に会合する場合もあり、非共有結合的に会合する場合もある。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドを含むより大型ポリペプチドの一部を形成する（例えば、ＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖの場合、またはＶＨ−ＣＨ１およびＶＬ−ＣＬを含むｓｃＦａｂの場合において）。
抗原結合性分子は、１つを超えるポリペプチド（例えば、２つ、３つ、４つ、６つ、または８つのポリペプチド）、例えば、２つの重鎖ポリペプチドと、２つの軽鎖ポリペプチドとを含む、ＩｇＧ様抗原結合性分子の、非共有結合的または共有結合的複合体を指す場合がある。
本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の配列を使用して、デザインおよび調製されうる。単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片など、抗体の抗原結合性領域もまた、使用されうる／もたらされうる。「抗原結合性領域」とは、所与の抗体が特異的である標的に結合することが可能な抗体の、任意の断片である。
抗体は、一般に、重鎖可変（ＶＨ）領域内の３つ：ＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、およびＨＣ−ＣＤＲ３、ならびに軽鎖可変（ＶＬ）領域内の３つ：ＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、およびＬＣ−ＣＤＲ３である、６つの相補性決定領域であるＣＤＲを含む。６つのＣＤＲは、併せて、標的抗原に結合する、抗体の部分である、抗体のパラトープを規定する。
ＶＨ領域およびＶＬ領域は、各ＣＤＲのいずれの側にも、ＣＤＲのための足場をもたらす、フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。Ｎ末端から、Ｃ末端へと、ＶＨ領域は、以下の構造：Ｎ末端−［ＨＣ−ＦＲ１］−［ＨＣ−ＣＤＲ１］−［ＨＣ−ＦＲ２］−［ＨＣ−ＣＤＲ２］−［ＨＣ−ＦＲ３］−［ＨＣ−ＣＤＲ３］−［ＨＣ−ＦＲ４］−Ｃ末端を含み、ＶＬ領域は、以下の構造：Ｎ末端−［ＬＣ−ＦＲ１］−［ＬＣ−ＣＤＲ１］−［ＬＣ−ＦＲ２］−［ＬＣ−ＣＤＲ２］−［ＬＣ−ＦＲ３］−［ＬＣ−ＣＤＲ３］−［ＬＣ−ＦＲ４］−Ｃ末端を含む。
Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）において記載された慣例、ならびにＲｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、（２００５）、３３（増刊１号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４において記載されたＶＢＡＳＥ２など、抗体のＣＤＲおよびＦＲを規定するための、いくつかの異なる慣例が存在する。本明細書で記載される抗体クローンの、ＶＨ領域およびＶＬ領域のＣＤＲおよびＦＲは、Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）、２７：５５〜７７において記載された、ＩＭＧＴ Ｖドメイン番号付け規則を使用する、ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＬｅＦｒａｎｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）、４３（データベース号）：Ｄ４１３〜２２）に従い規定された。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子のＦＲを含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子のＣＤＲおよびＦＲを含む。すなわち、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子のＶＨ領域およびＶＬ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、本明細書で記載されるＶＩＳＴＡ結合性抗体クローン（すなわち、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２、４Ｍ２−Ｂ４、４Ｍ２−Ｃ９、４Ｍ２−Ｄ９、４Ｍ２−Ｄ５、４Ｍ２−Ａ８、Ｖ４Ｈ１、Ｖ４Ｈ２、Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１、２Ｍ１−Ｂ１２、２Ｍ１−Ｄ２、１Ｍ２−Ｄ２、１３Ｄ５ｐ、１３Ｄ５−１、１３Ｄ５−１３、５Ｍ１−Ａ１１または９Ｍ２−Ｃ１２）のＶＨ／ＶＬ領域であるか、またはこれらに由来する、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（１）〜（１８）のうちの１つに従うＶＨ領域を含む。
（１）（４Ｍ２−Ｃ１２由来のコンセンサス）以下のＣＤＲ：
配列番号３０５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３０７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２）（Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（３）（Ｖ４−Ｃ１）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２７７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、またはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（４）（Ｖ４−Ｃ９）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２８６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、またはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（５）（４Ｍ２−Ｃ１２／Ｖ４Ｈ１／Ｖ４Ｈ２コンセンサス）以下のＣＤＲ：
配列番号２４４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、またはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（６）（４Ｍ２−Ｃ１２、４Ｍ２−Ｂ４、Ｖ４Ｈ２）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、またはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（７）（Ｖ４Ｈ１）以下のＣＤＲ：
配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、またはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（８）（２Ｍ１−Ｂ１２、２Ｍ１−Ｄ２）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号７３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号７４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、またはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（９）（４Ｍ２−Ｃ９、５Ｍ１−Ａ１１）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号８９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１０）（４Ｍ２−Ｄ９）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１１）（１Ｍ２−Ｄ２）以下のＣＤＲ：
配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１２１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１２２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１２）（４Ｍ２−Ｄ５）以下のＣＤＲ：
配列番号１４４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１３）（４Ｍ２−Ａ８）以下のＣＤＲ：
配列番号１５８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、またはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１４）（９Ｍ２−Ｃ１２）以下のＣＤＲ：
配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１５）（１３Ｄ５由来）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２４６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１６）（１３Ｄ５ｐ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１８５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１７）（１３Ｄ５−１）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（１８）（１３Ｄ５−１３）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２００のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（１９）〜（３５）のうちの１つに従うＶＨ領域を含む。
（１９）（Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１）以下のＦＲ：
配列番号６３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号２９２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号２９３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号２８１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２０）（Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９）以下のＦＲ：
配列番号６３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号２７９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号２８０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号２８１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、またはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２１）（４Ｍ２−Ｃ１２）以下のＦＲ：
配列番号３６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号３８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号３９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、またはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２２）（４Ｍ２−Ｂ４）以下のＦＲ：
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号３７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号３８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号３９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、またはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２３）（Ｖ４Ｈ１）以下のＦＲ：
配列番号５４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号５５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号５６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号３９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２４）（Ｖ４Ｈ２）以下のＦＲ：
配列番号６３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号６４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号６５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号３９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２５）（２Ｍ１−Ｂ１２）以下のＦＲ：
配列番号７５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号７６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号７７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２６）（４Ｍ２−Ｃ９）以下のＦＲ：
配列番号９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号９３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号９４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２７）（２Ｍ１−Ｄ２）以下のＦＲ：
配列番号１０３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号７６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号７７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２８）（４Ｍ２−Ｄ９）以下のＦＲ：
配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号１１０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号１１１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号１１２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（２９）（１Ｍ２−Ｄ２）以下のＦＲ：
配列番号１２３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号１２４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号１２５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（３０）（５Ｍ１−Ａ１１）以下のＦＲ：
配列番号１３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号９２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号９３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号１３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（３１）（４Ｍ２−Ｄ５）以下のＦＲ：
配列番号１４７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号１４８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号１４９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号１３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（３２）（４Ｍ２−Ａ８）以下のＦＲ：
配列番号１６１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号１６２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号１６３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号１３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（３３）（９Ｍ２−Ｃ１２）以下のＦＲ：
配列番号１７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号１７３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号１７４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号１７５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（３４）（１３Ｄ５ｐ、１３Ｄ５−１）以下のＦＲ：
配列番号１０３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号１８６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号１８７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（３５）（１３Ｄ５−１３）以下のＦＲ：
配列番号１０３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ１
配列番号１８６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ２
配列番号２０１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＦＲ４、
またはＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３、もしくはＨＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、上記の（１）〜（１８）のうちの１つに従うＣＤＲと、上記の（１９）〜（３５）のうちの１つに従うＦＲとを含むＶＨ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（３６）〜（５７）のうちの１つに従うＶＨ領域を含む。
（３６）（１）に従うＣＤＲと、（１９）、（２０）、（２１）、（２２）、（２３）、または（２４）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（３７）（２）に従うＣＤＲと、（１９）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（３８）（３）に従うＣＤＲと、（２０）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（３９）（４）に従うＣＤＲと、（２０）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４０）（５）に従うＣＤＲと、（２１）、（２２）、（２３）、または（２４）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４１）（６）に従うＣＤＲと、（２１）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４２）（６）に従うＣＤＲと、（２２）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４３）（６）に従うＣＤＲと、（２４）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４４）（７）に従うＣＤＲと、（２３）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４５）（８）に従うＣＤＲと、（２５）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４６）（８）に従うＣＤＲと、（２７）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４７）（９）に従うＣＤＲと、（２６）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４８）（９）に従うＣＤＲと、（３０）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（４９）（１０）に従うＣＤＲと、（２８）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（５０）（１１）に従うＣＤＲと、（２９）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（５１）（１２）に従うＣＤＲと、（３１）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（５２）（１３）に従うＣＤＲと、（３２）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（５３）（１４）に従うＣＤＲと、（３３）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（５４）（１５）に従うＣＤＲと、（３４）または（３５）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（５５）（１６）に従うＣＤＲと、（３４）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（５６）（１７）に従うＣＤＲと、（３４）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
（５７）（１８）に従うＣＤＲと、（３５）に従うＦＲとを含むＶＨ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（５８）〜（７６）のうちの１つに従うＶＨ領域を含む。
（５８）配列番号２７６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（５９）配列番号２８５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６０）配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６１）配列番号３２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６２）配列番号４８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６３）配列番号５２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６４）配列番号６２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６５）配列番号７１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６６）配列番号８７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６７）配列番号１０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６８）配列番号１０６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（６９）配列番号１１９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（７０）配列番号１３３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（７１）配列番号１４３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（７２）配列番号１５７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（７３）配列番号１６８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（７４）配列番号１８３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（７５）配列番号１９４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
（７６）配列番号１９９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（７７）〜（９６）のうちの１つに従うＶＬ領域を含む。
（７７）（４Ｍ２−Ｃ１２由来のコンセンサス）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（７８）（Ｃ２４／Ｃ２６／Ｃ２７コンセンサス）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、またはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（７９）（Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、またはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８０）（Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３００のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８１）（４Ｍ２−Ｃ１２／Ｖ４Ｈ１／Ｖ４Ｈ２コンセンサス）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号２４５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、またはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８２）（４Ｍ２−Ｃ１２、４Ｍ２−Ｂ４、Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２８）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８３）（Ｖ４Ｈ１）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号５８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８４）（Ｖ４Ｈ２）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８５）（２Ｍ１−Ｂ１２、２Ｍ１−Ｄ２）以下のＣＤＲ：
配列番号８０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号８１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号８２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８６）（４Ｍ２−Ｃ９）以下のＣＤＲ：
配列番号９６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号９７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号９８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８７）（４Ｍ２−Ｄ９）以下のＣＤＲ：
配列番号１１４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＨ領域。
（８８）（１Ｍ２−Ｄ２）以下のＣＤＲ：
配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１２９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（８９）（５Ｍ１−Ａ１１）以下のＣＤＲ：
配列番号１３７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９０）（４Ｍ２−Ｄ５）以下のＣＤＲ：
配列番号１５１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、またはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９１）（４Ｍ２−Ａ８）以下のＣＤＲ：
配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９２）（９Ｍ２−Ｃ１２）以下のＣＤＲ：
配列番号１７７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１７９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９３）（１３Ｄ５ｐ由来）以下のＣＤＲ：
配列番号２４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９４）（１３Ｄ５ｐ）以下のＣＤＲ：
配列番号１８９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、もしくはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９５）（１３Ｄ５−１）以下のＣＤＲ：
配列番号１９７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、またはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９６）（１３Ｄ５−１３）以下のＣＤＲ：
配列番号２０３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３；
またはＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、またはＬＣ−ＣＤＲ３のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（９７）〜（１２０）のうちの１つに従うＶＬ領域を含む。
（９７）（Ｖ４−Ｃ１）以下のＦＲ：
配列番号５９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号２８３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号２８４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９８）（Ｖ４−Ｃ９）以下のＦＲ：
配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号２８３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号２８４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、またはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（９９）（Ｖ４−Ｃ２４）以下のＦＲ：
配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号２８３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号２９６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、またはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１００）（Ｖ４−Ｃ２６）以下のＦＲ：
配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号２９８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号２８４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、またはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０１）（Ｖ４−Ｃ２７）以下のＦＲ：
配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号２８３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号２８４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、またはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０２）（Ｖ４−Ｃ２８）以下のＦＲ：
配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号２８３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号２９６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０３）（Ｖ４−Ｃ３０）以下のＦＲ：
配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号２８３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号２９６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、またはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０４）（Ｖ４−Ｃ３１）以下のＦＲ：
配列番号２８８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号２８３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号３０４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、またはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０５）（４Ｍ２−Ｃ１２）以下のＦＲ：
配列番号４４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、またはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つまたは複数における、１つまたは２つまたは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０６）（４Ｍ２−Ｂ４）以下のＦＲ：
配列番号５１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号４５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号４６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０７）（Ｖ４Ｈ１）以下のＦＲ：
配列番号５９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号６０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号６１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０８）（Ｖ４Ｈ２）以下のＦＲ：
配列番号６８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号６９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号７０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１０９）（２Ｍ１−Ｂ１２）以下のＦＲ：
配列番号８３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号８４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号８５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１０）（４Ｍ２−Ｃ９）以下のＦＲ：
配列番号９９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１００のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１０１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１１）（２Ｍ１−Ｄ２）以下のＦＲ：
配列番号１０５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号８４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号８５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１２）（４Ｍ２−Ｄ９）以下のＦＲ：
配列番号１１６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１１７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１１８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１３）（１Ｍ２−Ｄ２）以下のＦＲ：
配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１３１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１３２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１４）（５Ｍ１−Ａ１１）以下のＦＲ：
配列番号１４０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１５）（４Ｍ２−Ｄ５）以下のＦＲ：
配列番号１５４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１５６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１６）（４Ｍ２−Ａ８）以下のＦＲ：
配列番号１６６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１５５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１６７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１７）（９Ｍ２−Ｃ１２）以下のＦＲ：
配列番号１８０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１８１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１８２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１８）（１３Ｄ５ｐ）以下のＦＲ：
配列番号１９１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１９２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１９３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１１９）（１３Ｄ５−１）以下のＦＲ：
配列番号１９１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１９８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号１９３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
（１２０）（１３Ｄ５−１３）以下のＦＲ：
配列番号１９１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ１
配列番号１９２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ２
配列番号２０４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ３
配列番号８６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＦＲ４、
またはＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３、もしくはＬＣ−ＦＲ４のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだＶＬ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、上記の（７７）〜（９６）のうちの１つに従うＣＤＲと、上記の（９７）〜（１２０）のうちの１つに従うＦＲとを含むＶＬ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（１２１）〜（１４８）のうちの１つに従うＶＬ領域を含む。
（１２１）（７７）に従うＣＤＲと、（９７）、（９８）、（９９）、（１００）、（１０１）、（１０２）、（１０３）、（１０４）、（１０５）、（１０６）、（１０７）または（１０８）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１２２）（７８）に従うＣＤＲと、（９９）、（１００）、または（１０１）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１２３）（７９）に従うＣＤＲと、（９９）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１２４）（７９）に従うＣＤＲと、（１００）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１２５）（８０）に従うＣＤＲと、（１０１）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１２６）（８２）に従うＣＤＲと、（９７）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１２７）（８２）に従うＣＤＲと、（９８）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１２８）（８２）に従うＣＤＲと、（１０２）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１２９）（８０）に従うＣＤＲと、（１０３）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３０）（８０）に従うＣＤＲと、（１０４）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３１）（８１）に従うＣＤＲと、（１０５）、（１０６）、（１０７）、または（１０８）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３２）（８２）に従うＣＤＲと、（１０５）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３３）（８２）に従うＣＤＲと、（１０６）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３４）（８３）に従うＣＤＲと、（１０７）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３５）（８４）に従うＣＤＲと、（１０８）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３６）（８５）に従うＣＤＲと、（１０９）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３７）（８５）に従うＣＤＲと、（１１１）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３８）（８６）に従うＣＤＲと、（１１０）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１３９）（８７）に従うＣＤＲと、（１１２）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４０）（８８）に従うＣＤＲと、（１１３）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４１）（８９）に従うＣＤＲと、（１１４）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４２）（９０）に従うＣＤＲと、（１１５）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４３）（９１）に従うＣＤＲと、（１１６）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４４）（９２）に従うＣＤＲと、（１１７）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４５）（９３）に従うＣＤＲと、（１１８）、（１１９）、または（１２０）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４６）（９４）に従うＣＤＲと、（１１８）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４７）（９５）に従うＣＤＲと、（１１９）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
（１４８）（９６）に従うＣＤＲと、（１２０）に従うＦＲとを含むＶＬ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、下記の（１４９）〜（１７３）のうちの１つに従うＶＬ領域を含む。
（１４９）配列番号３１０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５０）配列番号２８２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５１）配列番号２８７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５２）配列番号２９４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５３）配列番号２９７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５４）配列番号２９９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５５）配列番号３０１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５６）配列番号３０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５７）配列番号３０３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５８）配列番号４０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１５９）配列番号５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６０）配列番号５７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６１）配列番号６６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６２）配列番号７９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６３）配列番号９５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６４）配列番号１０４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６５）配列番号１１３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６６）配列番号１２６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６７）配列番号１３６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６８）配列番号１５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１６９）配列番号１６４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１７０）配列番号１７６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１７１）配列番号１８８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１７２）配列番号１９６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
（１７３）配列番号２０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、上記の（１）〜（７６）のうちのいずれか１つに従うＶＨ領域と、上記の（７７）〜（１７３）のうちのいずれか１つに従うＶＬ領域とを含む。
１つまたは複数のアミノ酸が、別のアミノ酸で置換される、本発明に従う実施形態では、置換は、例えば、以下の表に従う、保存的置換でありうる。一部の実施形態では、中欄の同じブロック内のアミノ酸が置換される。一部の実施形態では、最も右の欄の同じ連なりのアミノ酸が置換される。
Figure 2021511818
 一部の実施形態では、置換（複数可）は、機能的に保存的でありうる。すなわち、一部の実施形態では、置換は、同等の非置換分子と比較して置換を含む抗原結合性分子の、１つまたは複数の機能的特性（例えば、標的への結合）に影響を及ぼさない場合がある（またはこれに実質的に影響を及ぼさない場合がある）。
抗体の抗原結合性領域の、ＶＨおよびＶＬ領域は、併せて、Ｆｖ領域を構成する。一部の実施形態では、本発明に従う抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合するＦｖ領域を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＦｖのＶＨおよびＶＬ領域は、リンカー領域により接合された、単一のポリペプチド、すなわち、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として提供される。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、免疫グロブリンの重鎖定常配列の、１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンの重鎖定常配列は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの重鎖定常配列であるか、またはこれらに由来する。
一部の実施形態では、免疫グロブリンの重鎖定常配列は、ヒト免疫グロブリンＧ１定常配列（ＩＧＨＧ１；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８５７−１、ｖ１；配列番号２０５）である。配列番号２０５の１〜９８位は、ＣＨ１領域（配列番号２０６）を形成する。配列番号２０５の９９〜１１０位は、ＣＨ１とＣＨ２領域との間のヒンジ領域（配列番号２０７）を形成する。配列番号２０５の１１１〜２２３位は、ＣＨ２領域（配列番号２０８）を形成する。配列番号２０５の２２４〜３３０位は、ＣＨ３領域（配列番号２０９）を形成する。
例示される抗原結合性分子は、ＣＨ３領域内に、置換である、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ（ＥＵ番号付けに従い番号付けされた位置）を含む、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１を使用して調製されうる。ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１によりコードされるＣＨ３領域のアミノ酸配列を、配列番号２１０に示す。ＣＨ３領域は、本明細書で記載される抗原結合性分子のＦｃ領域への修飾に従い、さらなる置換を施されうることが理解されるであろう。
一部の実施形態では、ＣＨ１領域は、配列番号２０６の配列、または配列番号２０６のアミノ酸配列に対する、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＣＨ１−ＣＨ２間のヒンジ領域は、配列番号２０７の配列、または配列番号２０７のアミノ酸配列に対する、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＣＨ２領域は、配列番号２０８の配列、または配列番号２０８のアミノ酸配列に対する、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、ＣＨ３領域は、配列番号２０９もしくは２１０の配列、または配列番号２０９もしくは２１０のアミノ酸配列に対する、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、免疫グロブリンの軽鎖定常配列の、１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリンの軽鎖定常配列は、ヒト免疫グロブリンカッパ定常配列（ＩＧＫＣ；Ｃκ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８３４−１、ｖ２；配列番号２１１）である。一部の実施形態では、免疫グロブリンの軽鎖定常配列は、ヒト免疫グロブリンラムダ定常配列（ＩＧＬＣ；Ｃλ）、例えば、ＩＧＬＣ１、ＩＧＬＣ２、ＩＧＬＣ３、ＩＧＬＣ６、またはＩＧＬＣ７である。一部の実施形態では、ＣＬ領域は、配列番号２１１の配列、または配列番号２１１のアミノ酸配列に対する、少なくとも６０％、好ましくは、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のうちの１つのアミノ酸配列同一性を有する配列を含むか、またはこれらからなる。
抗体の抗原結合性領域の、ＶＬおよび軽鎖定常（ＣＬ）領域、ならびにＶＨ領域および重鎖定常１（ＣＨ１）領域は、併せて、Ｆａｂ領域を構成する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）を含むＦａｂ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＶＨとＣＨ１とを含むポリペプチド（例えば、ＶＨ−ＣＨ１融合ポリペプチド）、およびＶＬとＣＬとを含むポリペプチド（例えば、ＶＬ−ＣＬ融合ポリペプチド）を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＶＨとＣＬとを含むポリペプチド（例えば、ＶＨ−ＣＬ融合ポリペプチド）、およびＶＬとＣＨとを含むポリペプチド（例えば、ＶＬ−ＣＨ１融合ポリペプチド）を含む；すなわち、一部の実施形態では、Ｆａｂ領域は、ＣｒｏｓｓＦａｂ領域である。一部の実施形態では、ＦａｂまたはＣｒｏｓｓＦａｂの、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ領域は、リンカー領域により接合された、単一のポリペプチド、すなわち、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）または単鎖ＣｒｏｓｓＦａｂ（ｓｃＣｒｏｓｓＦａｂ）として提供される。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合するＦａｂ領域を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合する全抗体を含むか、またはこれらからなる。本明細書で使用される、「全抗体」とは、免疫グロブリン（Ｉｇ）の構造と、実質的に同様の構造を有する抗体を指す。異なる種類の免疫グロブリン、およびそれらの構造については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＣａｖａｃｉｎｉ、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１０）、１２５（２０２）：Ｓ４１〜Ｓ５２において記載されている。
Ｇ型の免疫グロブリン（すなわち、ＩｇＧ）は、２つの重鎖と、２つの軽鎖とを含む、約１５０ｋＤａの糖タンパク質である。Ｎ末端から、Ｃ末端へと、重鎖は、ＶＨに続き、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含む、重鎖定常領域を含み、同様に、軽鎖は、ＶＬに続き、ＣＬを含む。重鎖に応じて、免疫グロブリンは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭと分類されうる。軽鎖は、カッパ（κ）鎖の場合もあり、ラムダ（λ）鎖の場合もある。
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合するＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭを含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに対して、少なくとも一価の結合性分子である。結合価とは、所与の抗原決定基についての、抗原結合性分子内の結合性部位の数を指す。したがって、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに対する、少なくとも１つの結合性部位を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに対する、１つを超える結合性部位、例えば、２つ、３つ、または４つの結合性部位を含む。結合性部位は、同じ場合もあり、異なる場合もある。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに対して、例えば、二価、三価、または四価である。
本発明の態様は、多特異性の抗原結合性分子に関する。「多特異性」とは、抗原結合性分子が、１つを超える標的への特異的結合をもたらすことを意味する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、二特異性の抗原結合性分子である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、少なくとも２つの、異なる抗原結合性ドメイン（すなわち、例えば、同一でないＶＨおよびＶＬを含む、少なくとも２つの抗原結合性ドメイン）を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ、および別の標的（例えば、ＶＩＳＴＡ以外の抗原）に結合するので、少なくとも二特異性である。「二特異性」という用語は、抗原結合性分子が、少なくとも２つの、別個の抗原決定基に特異的に結合することが可能であることを意味する。
本発明に従う抗原結合性分子（例えば、多特異性抗原結合性分子）は、抗原結合性分子が特異的である標的に結合することが可能な抗原結合性分子を含みうることが理解されるであろう。例えば、ＶＩＳＴＡおよびＶＩＳＴＡ以外の抗原に結合することが可能な抗原結合性分子は、（ｉ）ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子、および（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ以外の抗原に結合することが可能な抗原結合性分子を含みうる。
また、本発明に従う抗原結合性分子（例えば、多特異性抗原結合性分子）は、抗原結合性分子が特異的である標的に結合することが可能な、抗原結合性ポリペプチド、または抗原結合性ポリペプチド複合体を含みうることも理解されるであろう。例えば、本発明に従う抗原結合性分子は、例えば、（ｉ）軽鎖ポリペプチド（構造ＶＬ−ＣＬを含む）と、重鎖ポリペプチド（構造ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む）とを含む、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性ポリペプチド複合体、および（ｉｉ）軽鎖ポリペプチド（構造ＶＬ−ＣＬを含む）と、重鎖ポリペプチド（構造ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む）とを含む、ＶＩＳＴＡ以外の抗原に結合することが可能な抗原結合性ポリペプチド複合体を含みうる。
一部の実施形態では、より大型の抗原結合性分子（例えば、多特異性抗原結合性分子）の、構成要素である抗原結合性分子は、より大型の抗原結合性分子の、例えば、「抗原結合性ドメイン」または「抗原結合性領域」と称されうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子と、ＶＩＳＴＡ以外の抗原に結合することが可能な抗原結合性分子とを含む。一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡ以外の抗原は、免疫細胞の表面分子である。一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡ以外の抗原は、がん細胞抗原である。一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡ以外の抗原は、受容体分子、例えば、細胞表面受容体である。一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡ以外の抗原は、細胞シグナル伝達分子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、またはリンホカインである。一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡ以外の抗原は、増殖因子またはホルモンである。
がん細胞抗原とは、がん細胞により発現または過剰発現される抗原である。がん細胞抗原は、任意のペプチド／ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、グリカン、糖脂質、脂質、またはこれらの断片でありうる。がん細胞抗原の発現は、がんと関連しうる。がん細胞抗原は、がん細胞により、異常に発現される場合もあり（例えば、がん細胞抗原は、異常な局在化を伴って発現されうる）、がん細胞による、異常な構造を伴って発現される場合もある。がん細胞抗原は、免疫応答を誘発することが可能でありうる。一部の実施形態では、抗原は、がん細胞の細胞表面において発現される（すなわち、がん細胞抗原は、がん細胞表面抗原である）。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子が結合する、抗原の部分は、がん細胞の外部表面上に呈示される（すなわち、細胞外にある）。がん細胞抗原は、がん関連抗原でありうる。一部の実施形態では、がん細胞抗原は、その発現が、がんの発症、進行、または症状の重症度と関連する抗原である。がん関連抗原は、がんの原因または病理と関連する場合もあり、がんの帰結として、異常に発現される場合もある。一部の実施形態では、がん細胞抗原は、その発現が、がんの細胞により、例えば、同等の非がん性細胞（例えば、同じ組織／細胞型に由来する、非がん性細胞）による発現レベルと比較して、上方調節される（例えば、ＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで）抗原である。一部の実施形態では、がん関連抗原は、がん性細胞により、優先的に発現され、同等な非がん性細胞（例えば、同じ組織／細胞型に由来する、非がん性細胞）により発現されない場合がある。一部の実施形態では、がん関連抗原は、突然変異したがん遺伝子、または突然変異した腫瘍サプレッサー遺伝子の産物でありうる。一部の実施形態では、がん関連抗原は、過剰発現された細胞内タンパク質の産物の場合もあり、発がん性ウイルス、がん胎児抗原、または細胞表面糖脂質もしくは糖タンパク質により産生されたがん抗原の場合もある。
免疫細胞の表面分子は、免疫細胞の細胞表面、または細胞表面上において発現される、任意のペプチド／ポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、グリカン、糖脂質、脂質、またはこれらの断片でありうる。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子が結合する、免疫細胞の表面分子の部分は、免疫細胞の外部表面上にある（すなわち、細胞外にある）。免疫細胞の表面分子は、任意の免疫細胞の細胞表面において発現されうる。一部の実施形態では、免疫細胞は、造血細胞由来の細胞、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、樹状細胞、リンパ球、または単球でありうる。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、もしくは自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）、またはこれらの前駆細胞（例えば、胸腺細胞またはプレＢ細胞）でありうる。一部の実施形態では、免疫細胞の表面分子は、共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２７）またはこれらのリガンドでありうる。一部の実施形態では、免疫細胞の表面分子は、チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、またはＢＴＬＡ）またはこれらのリガンドでありうる。
本発明に従う、多特異性抗原結合性分子は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＢｒｉｎｋｍａｎｎおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ＭＡｂｓ（２０１７）、９（２）：１８２〜２１２において記載されたフォーマットなど、任意の適切なフォーマットで提供されうる。適切なフォーマットは、ＢｒｉｎｋｍａｎｎおよびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ＭＡｂｓ（２０１７）、９（２）：１８２〜２１２の図２に示されたフォーマット：抗体コンジュゲート、例えば、ＩｇＧ２、Ｆ（ａｂ’）２、またはＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙ；ＩｇＧまたはＩｇＧ様分子、例えば、ＩｇＧ、キメラＩｇＧ、κλ−ｂｏｄｙの共通ＨＣ；ＣＨ１／ＣＬ融合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ２−ＣＨ１／ＣＬ、ＶＨＨ２−ＣＨ１／ＣＬ；「可変ドメインだけの」二特異性抗原結合性分子、例えば、タンデムｓｃＦｖ（ｔａＦＶ）、トリプルボディー、ダイアボディー（Ｄｂ）、ｄｓＤｂ、Ｄｂ（ｋｉｈ）、ＤＡＲＴ、ｓｃＤＢ、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ、ｔａｎｄＡｂ、トリプルヘッド、タンデムｄＡｂ／ＶＨＨ、四価ｄＡｂ．ＶＨＨ；非Ｉｇ融合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ２−アルブミン、ｓｃＤｂ−アルブミン、ｔａＦｖ−アルブミン、ｔａＦｖ−毒素、ミニ抗体、ＤＮＬ−Ｆａｂ２、ＤＮＬ−Ｆａｂ２−ｓｃＦｖ、ＤＮＬ−Ｆａｂ２−ＩｇＧ−サイトカイン２、ＩｍｍＴＡＣ（ＴＣＲ−ｓｃＦｖ）；修飾Ｆｃ／ＣＨ３融合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＣＨ３電荷対）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＥＷ−ＲＶＴ）、ｓｃＦｖ−ｆｃ（ＨＡ−ＴＦ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）、ｔａＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）−Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｃ（ｋｉｈ）−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＢＥＡＴ）、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）、ＤＡＲＴ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−ＣＨ３（ｋｉｈ）、ＴｒｉＦａｂ；Ｆｃ融合体、例えば、ジダイアボディー、ｓｃＤｂ−Ｆｃ、ｔａＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ＨＣＡｂ−ＶＨＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ４−Ｉｇ、ｓｃＦｖ２−Ｆｃａｂ；ＣＨ３融合体、例えば、ダイア−ダイアボディー、ｓｃＤｂ−ＣＨ３；ＩｇＥ／ＩｇＭ ＣＨ２融合体、例えば、ｓｃＦｖ−ＥＨＤ２−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖＭＨＤ２−ｓｃＦｖ；Ｆａｂ融合タンパク質、例えば、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（バイボディー）、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ２（トリボディー）、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ＶＨＨ、直交型Ｆａｂ−Ｆａｂ；非Ｉｇ融合タンパク質、例えば、ＤＮＬ−Ｆａｂ３、ＤＮＬ−Ｆａｂ２−ｓｃＦｖ、ＤＮＬ−Ｆａｂ２−ＩｇＧ−サイトカイン２；非対称ＩｇＧまたはＩｇＧ様分子、例えば、ＩｇＧ（ｋｉｈ）、ＩｇＧ（ｋｉｈ）共通ＬＣ、ＺＷ１ ＩｇＧ共通ＬＣ、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ共通ＬＣ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ（ｋｉｈ）、ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ（ｋｉｈ）、Ｆａｂ−ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ（ｋｉｈ）、直交型Ｆａｂ ＩｇＧ（ｋｉｈ）、ＤｕｅｔＭａｂ、ＣＨ３電荷対＋ＣＨ１／ＣＬ電荷対、ヒンジ／ＣＨ３電荷対、ＳＥＥＤ−ｂｏｄｙ、デュオボディー、ｆｏｕｒ−ｉｎ−ｏｎｅ−ＣｒｏｓｓＭａｂ（ｋｉｈ）、ＬＵＺ−Ｙ共通ＬＣ；ＬＵＺ−Ｙ ｓｃＦａｂ−ＩｇＧ、ＦｃＦｃ＊；アペンデッド／Ｆｃ修飾ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ（ｋｉｈ）−Ｆｖ、ＩｇＧ ＨＡ−ＴＦ−Ｆｖ、ＩｇＧ（ｋｉｈ）ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ（ｋｉｈ）−ｓｃＦｖ２、ｓｃＦａｂ−Ｆｃ（ｋｉｈ）−ｓｃＦｖ、ｈａｌｆ ＤＶＤ−Ｉｇ、ＤＶＩ−Ｉｇ（ｆｏｕｒ−ｉｎ−ｏｎｅ）、ＣｒｏｓｓＭａｂ−Ｆａｂ；修飾Ｆｃ／ＣＨ３融合タンパク質、例えば、Ｆａｂ−Ｆｃ（ｋｉｈ）−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ｋｉｈ）、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＢＥＡＴ）、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＳＥＥＤｂｏｄｙ、ＴｒｉＦａｂ；アペンデッドＩｇＧ−ＨＣ融合体、例えば、ＩｇＧ−ＨＣ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ−ｄＡｂ、ＩｇＧ−ｔａＦＶ、ＩｇＧ−ＣｒｏｓｓＦａｂ、ＩｇＧ−直交型Ｆａｂ、ＩｇＧ−（ＣαＣβ）Ｆａｂ、ｓｃＦｖ−ＨＣ−ＩｇＧ、タンデムＦａｂ−ＩｇＧ（直交型Ｆａｂ）Ｆａｂ−ＩｇＧ（ＣαＣβ Ｆａｂ）、Ｆａｂ−ＩｇＧ（ＣＲ３）、Ｆａｂ−ヒンジ−ＩｇＧ（ＣＲ３）；アペンデッドＩｇＧ−ＬＣ融合体、例えば、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ（ＬＣ）、ｓｃＦｖ（ＬＣ）−ＩｇＧ、ｄＡｂ−ＩｇＧ；アペンデッドＩｇＧ−ＨＣ／ＬＣ融合体、例えば、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＴＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＤＶ−Ｉｇ、ｓｃＦｖ４−ＩｇＧ、Ｚｙｂｏｄｙ；Ｆｃ融合体、例えば、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ４−Ｉｇ；Ｆ（ａｂ’）２融合体、例えば、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２；ＣＨ１／ＣＬ融合タンパク質、例えば、ｓｃＦｖ２−ＣＨ１−ヒンジ／ＣＬ；修飾ＩｇＧ、例えば、ＤＡＦ（ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ−ＩｇＧ）、ＤｕｔａＭａｂ、Ｍａｂ２；および非Ｉｇ融合体、例えば、ＤＮＬ−Ｆａｂ４−ＩｇＧを含む。
当業者は、二特異性の抗原結合性分子を、デザインし、調製することが可能である。二特異性の抗原結合性分子を作製するための方法は、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＳｅｇａｌおよびＢａｓｔ、２００１、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、１４：ＩＶ：２．１３：２．１３．１〜２．１３．１６において記載される通りに、例えば、還元性ジスルフィド結合または非還元性チオエーテル結合により、抗原結合性分子または抗体断片を、化学的に架橋するステップを含む。例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（−２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、例えば、ヒンジ領域のＳＨ基を介して、Ｆａｂ断片を、化学的に架橋して、ジスルフィドにより連結された、二特異性Ｆ（ａｂ）２ヘテロ二量体を創出するのに使用されうる。
二特異性の抗原結合性分子を作製するための、他の方法は、抗体産生ハイブリドーマを、例えば、ポリエチレングリコールと融合させて、例えば、Ｄ．Ｍ．およびＢａｓｔ，Ｂ．Ｊ．、２００１、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、１４：ＩＶ：２．１３：２．１３．１〜２．１３．１６に記載された、二特異性抗体を分泌することが可能なクァドローマ細胞を作製するステップを含む。
本発明に従う、二特異性抗原結合性分子はまた、例えば、それらの両方の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、２版（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２０１２）、４０章：「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ」（ＨｏｒｎｉｇおよびＦａｅｒｂｅｒ−Ｓｃｈｗａｒｚ）；またはＦｒｅｎｃｈ、「Ｈｏｗ ｔｏ ｍａｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、２０００、４０：３３３〜３３９に記載された、抗原結合性分子のためのポリペプチドをコードする核酸構築物からの組換え発現によっても作製されうる。例えば、２つの抗原結合性断片のための軽鎖および重鎖可変ドメイン（すなわち、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性断片のための、軽鎖および重鎖可変ドメイン、ならびに別の標的タンパク質に結合することが可能な抗原結合性断片のための、軽鎖および重鎖可変ドメイン）をコードし、抗原結合性断片の間の、適切なリンカーまたは二量体化ドメインをコードする配列を含むＤＮＡ構築物は、分子クローニング法により調製されうる。その後、組換え二特異性抗体は、適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）内の、構築物の発現（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける）により産生され、次いで、発現された組換え二特異性抗体は、任意選択で、精製されうる。
Ｆｃ領域
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｆｃ領域を含む。
ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤのアイソタイプでは、Ｆｃ領域は、１つのポリペプチドに由来する、ＣＨ２およびＣＨ３領域と、別のポリペプチドに由来する、ＣＨ２およびＣＨ３領域とから構成される。２つのポリペプチドに由来する、ＣＨ２およびＣＨ３領域が、併せて、Ｆｃ領域を形成する。ＩｇＭおよびＩｇＥのアイソタイプでは、Ｆｃ領域は、３つの定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含有し、２つのポリペプチドに由来するＣＨ２〜ＣＨ４が、併せて、Ｆｃ領域を形成する。
Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体と、免疫系の他の分子との相互作用をもたらして、機能的作用をもたらす。ＩｇＧ Ｆｃ媒介性のエフェクター機能は、例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ、１９９８、１６３：５９〜７６（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）において総説されており、Ｆｃ領域と、免疫細胞により発現されるＦｃ受容体との相互作用を介する、Ｆｃに媒介される、免疫細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞、およびＴ細胞）の動員および活性化、Ｆｃ領域の、補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を介する、補体経路成分の動員、ならびに帰結としての、補体カスケードの活性化を介してもたらされる。
Ｆｃ媒介性機能は、Ｆｃ受容体への結合、抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成、細胞からの脱顆粒、サイトカインおよび／またはケモカインの産生、ならびに抗原のプロセシングおよび提示を含む。
当技術分野では、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ（２０１８）、９（１）：６３〜７３に記載された修飾など、Ｆｃ媒介性機能に影響を及ぼす、抗体のＦｃ領域への修飾が公知である。特に、抗体のエフェクター機能に影響を及ぼすことが公知である、例示的なＦｃ領域の修飾は、Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ（２０１８）、９（１）：６３〜７３の表１にまとめられている。本明細書の下記では、抗体のエフェクター活性に影響を及ぼす、Ｆｃ領域への修飾が記載される。
Ｆｃ領域／ＣＨ２／ＣＨ３が、参照の置換（複数可）「に対応する」修飾（複数可）を含むものとして記載される場合、相同なＦｃ／ＣＨ２／ＣＨ３内の、同等の置換（複数可）が想定される。例示を目的として述べると、ヒトＩｇＧ１内のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されている、ＥＵ番号付けシステムに従い番号付けされた）は、マウスＩｇガンマ２Ａ鎖Ｃ領域の１１７および１１８位における、ＬからＡへの置換に対応し、Ａ対立遺伝子は、配列番号２５６に従い番号付けされる。
Ｆｃ領域が、修飾を含むものとして記載される場合、修飾は、併せて、Ｆｃ領域を形成する、ポリペプチド鎖の一方または両方に存在しうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、修飾を含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域のうちの１つまたは複数において、修飾を含むＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ媒介性機能を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣを増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＰを増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＤＣを増大させる修飾を含む。Ｆｃ媒介性機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ）を増大させる修飾を含むＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、対応する非修飾のＦｃ領域を含む抗原結合性分子と比較した、関連するエフェクター機能のレベルの上昇を誘導する。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体への結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃγ受容体への結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つまたは複数への結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩａへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、補体タンパク質への結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑへの結合を増大させる修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗原結合性分子の六量体化を促進する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗原結合性分子の半減期を延長する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、コエンゲージメントを増大させる修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００７）、６７：８８８２〜８８９０に記載された、置換の組合せである、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌａｚａｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２００６）、１０３：４００５〜４０１０に記載された、置換の組合せである、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥまたはＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２００１）、２７６：６５９１〜６６０４に記載された、置換の組合せである、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｍｉｍｏｔｏら、ＭＡｂｓ．（２０１３）：５：２２９〜２３６に記載された、置換の組合せである、Ｌ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａに対応する、重鎖ポリペプチドのうちの１つに対する修飾と、置換の組合せである、Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅに対応する、他の重鎖ポリペプチドに対する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．（２００８）７：２５１７〜２５２７に記載された、置換の組合せである、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）、１６６（４）：２５７１〜５に記載された、置換の組合せである、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｍｏｏｒｅら、ＭＡｂｓ．（２０１０）、２（２）：１８１〜９に記載された、置換の組合せである、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎａｔｓｕｍｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００８）、６８（１０）：３８６３〜７２に記載された、置換の組合せに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｄｉｅｂｏｌｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）、３４３（６１７６）：１２６０〜３に記載された、置換の組合せである、Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）、１６９：５１７１〜５１８０に記載された、置換の組合せである、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｚａｌｅｖｓｋｙら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）、２８：１５７〜１５９に記載された、置換の組合せである、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｃｈｕら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）、４５：３９２６〜３９３３に記載された、置換の組合せである、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｓｈａｎｇら、Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１４）、２８９：１５３０９〜１５３１８に記載された、置換の組合せである、Ｎ３２５Ｓ／Ｌ３２８Ｆに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ媒介性機能を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣを低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＰを低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＤＣを低減／防止する修飾を含む。Ｆｃ媒介性機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ）を低減／防止する修飾を含むＦｃ領域を含む抗原結合性分子は、対応する非修飾のＦｃ領域を含む抗原結合性分子と比較した、関連するエフェクター機能のレベルの低減を誘導する。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体への結合を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃγ受容体への結合を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つまたは複数への結合を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩａへの結合を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、補体タンパク質への結合を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑへの結合を低減／防止する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７に対応するアミノ酸残基のグリコシル化を低減／防止する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、１つまたは複数のＦｃ媒介性機能を誘導することが可能ではない（すなわち、関連するＦｃ媒介性機能（複数可）を誘発する能力を欠く）。したがって、このようなＦｃ領域を含む抗原結合性分子はまた、関連する機能（複数可）を誘導する能力も欠く。このような抗原結合性分子は、関連する機能（複数可）が欠如すると記載されうる。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣを誘導することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＰを誘導することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＤＣを誘導することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣを誘導することが可能ではなく、かつ／またはＡＤＣＰを誘導することが可能ではなく、かつ／またはＣＤＣを誘導することが可能ではない。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体に結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃγ受容体に結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つまたは複数に結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＩａに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩａに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩＩｂに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、補体タンパク質に結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ２９７に対応するアミノ酸残基においてグリコシル化されない。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌｅａｂｍａｎら、ＭＡｂｓ．（２０１３）、５：８９６〜９０３に記載された、Ｎ２９７ＡまたはＮ２９７ＱまたはＮ２９７Ｇに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ａｌｅｇｒｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）、１４８：３４６１〜３４６８に記載された、Ｌ２３５Ｅに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｘｕら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）、２００：１６〜２６に記載された、置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５ＡまたはＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１６）、２９（１０）：４５７〜４６６に記載された、Ｐ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２０１７）、２９２（９）：３９００〜３９０８に記載された、置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｒｏｔｈｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）、２５：１２５６〜１２６４に記載された、置換の組合せに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎｅｗｍａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）、９８：１６４〜１７４に記載された、置換の組合せである、Ｓ２２８Ｐ／Ｌ２３５Ｅに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ａｎら、ＭＡｂｓ．（２００９）、１：５７２〜５７９に記載された、置換の組合せである、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｖａｆａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２０１４）、６５：１１４〜１２６に記載された、置換の組合せである、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＵＳ２０１５／００４４２３１Ａ１に記載された、置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓに対応する修飾を含む。
置換の組合せ「Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ」、および対応する置換（例えば、ヒトＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａなど）は、Ｆｃの、Ｆｃγ受容体への結合を破壊し、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰを阻害し、Ｃ１ｑへの結合もまたを低減し、これにより、ＣＤＣを低減することが公知である（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１６）、２９（１０）：４５７〜４６６）。置換である、「Ｐ３２９Ｇ」および「Ｐ３２９Ａ」は、Ｃ１ｑへの結合を低減する（そして、これにより、ＣＤＣを低減する）。「Ｎ２９７」の、「Ａ」、「Ｇ」、または「Ｑ」による置換は、グリコシル化を消失させ、これにより、Ｆｃの、Ｃ１ｑおよびＦｃγ受容体への結合を低減し、これにより、ＣＤＣおよびＡＤＣＣを低減することが公知である。Ｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２０１７）、２９２（９）：３９００〜３９０８（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）は、置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇが、マウスＩｇＧ２ａおよびヒトＩｇＧ１のいずれにおいても、補体の結合および固定、ならびにＦｃγ受容体依存的な、抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害作用を消失させたことについて報告している。
ＩｇＧ１ Ｆｃ内の置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓは、ＵＳ２０１５／００４４２３１Ａ１において、食作用、ＡＤＣＣ、およびＣＤＣの誘導を失効化させることが開示されている。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｓｉｌｖａら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（２０１５）、２９０（９）：５４６２〜５４６９に記載された、置換である、Ｓ２２８Ｐに対応する修飾を含む。ＩｇＧ４ Ｆｃ内の置換である、Ｓ２２８Ｐは、Ｆａｂアーム交換（Ｆａｂアーム交換は、所望されない場合がある）を低減する。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換である、Ｐ３２９Ｇに対応する修飾を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換である、Ｎ２９７Ｑに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ／Ｎ２９７Ｑに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、置換の組合せである、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、ＩｇＧ４における置換である、Ｓ２２８Ｐに対応する修飾を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＣＨ２およびＣＨ３領域のうちの１つまたは複数における、Ｆｃ領域の会合を促進する修飾を含むＦｃ領域を含む。抗原結合性分子の構成要素であるポリペプチドの組換え共発現、および後続する会合は、いくつかの可能な組合せをもたらす。組換え作製において、抗原結合性分子内の、所望の組合せのポリペプチドの収率を改善するために、所望の組合せの、重鎖ポリペプチドの会合を促進する、Ｆｃ領域の修飾（複数可）を導入することが有利である。修飾は、例えば、異なるポリペプチド鎖の、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域の間の疎水性および／または静電相互作用を促進しうる。適切な修飾については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｈａら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｎｏｌ（２０１６）、７：３９４において記載されている。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｈａら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｎｏｌ（２０１６）、７：３９４の表１において示される、以下のフォーマット：ＫｉＨ、ＫｉＨＳ−Ｓ、ＨＡ−ＴＦ、ＺＷ１、７．８．６０、ＤＤ−ＫＫ、ＥＷ−ＲＶＴ、ＥＷ−ＲＶＴＳ−Ｓ、ＳＥＥＤ、またはＡ１０７のうちの１つに従う、Ｆｃ領域のＣＨ３領域内に、対をなす置換を含むＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、ＵＳ７，６９５，９３６；およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ、２４８、７〜１５（２００１）に、記載された、「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ（ＫＩＨ）」または「ＫｉＨ」修飾を含む。このような実施形態では、Ｆｃ領域のうちの、ＣＨ３領域の１つは、「ノブ」修飾を含み、他のＣＨ３領域は、「ホール」修飾を含む。「ノブ」が、ポリペプチドのヘテロ二量体化を促進し（そして、ホモ二量体化を阻害し）、かつ／またはヘテロ二量体を安定化させるために、「ホール」内に配置されるように、「ノブ」修飾および「ホール」修飾は、それぞれのＣＨ３領域内に配置される。ノブは、小型鎖を有するアミノ酸を、より大型の側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）を有するアミノ酸で置換することにより構築される。ホールは、大型側鎖を有するアミノ酸を、より小型の側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）を有するアミノ酸で置換することにより創出される。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子のＦｃ領域のうちの、ＣＨ３領域の１つは、置換である、（本明細書における、Ｆｃ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の、位置／置換の番号付けは、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１において記載されている、ＥＵ番号付けシステムに従う）Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｙ４０７Ｖを含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子のＦｃ領域のうちの、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｔ３６６ＳおよびＬ３６８Ａを含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子のＦｃ領域のうちの、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｔ３６６Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｓ、およびＬ３６８Ａを含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、例えば、ＷＯ２０１４／１３１６９４Ａ１に記載された、「ＤＤ−ＫＫ」修飾を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋを含む。修飾は、ＣＨ３領域の間の静電相互作用を促進する。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｌａｂｒｉｊｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０１３）、１１０（１３）：５１４５〜５０において記載される通りに修飾され、「デュオボディー」フォーマットと称されるＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｋ４０９Ｒを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｋ４０５Ｌを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｓｔｒｏｐら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１２）、４２０（３）：２０４〜１９に記載された、「ＥＥＥ−ＲＲＲ」修飾を含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｄ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ、およびＬ３６８Ｅを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｄ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ、およびＫ４０９Ｒを含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｃｈｏｉら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２０１３）、１２（１２）：２７４８〜５９に記載された、「ＥＷ−ＲＶＴ」修飾を含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔを含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｓ３５４Ｃを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｙ３４９Ｃを含む。これらのシステイン残基の導入は、Ｆｃ領域の、２つのＣＨ３領域の間のジスルフィド架橋の形成を結果としてもたらし、ヘテロ二量体を、さらに安定化させる（Ｃａｒｔｅｒ（２００１）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８、７〜１５）。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、「ＫｉＨＳ−Ｓ」修飾を含む。一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｄａｖｉｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２０１０）、２３（４）：１９５〜２０２に記載された、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３のβ鎖セグメントと、ヒトＩｇＡ ＣＨ３のβ鎖セグメントとが交換される、「ＳＥＥＤ」修飾を含むＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｙ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆ（例えば、Ｍｏｏｒｅら、ＭＡｂｓ（２０１１）、３（６）：５４６〜５７を参照されたい）を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ（例えば、Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら、ＭＡｂｓ（２０１３）、５（５）：６４６〜５４を参照されたい）を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｋ３６０Ｄ、Ｄ３９９Ｍ、およびＹ４０７Ａを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３６６Ｖ、およびＫ４０９Ｖ（例えば、Ｌｅａｖｅｒ−Ｆａｙら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（２０１６）、２４（４）：６４１〜５１を参照されたい）を含む。
一部の実施形態では、ＣＨ３領域の１つは、置換である、Ｋ３７０ＥおよびＫ４０９Ｗを含み、Ｆｃ領域のうちの、他のＣＨ３領域は、置換である、Ｅ３５７Ｎ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔ（例えば、Ｃｈｏｉら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１５）、１０（１２）：ｅ０１４５３４９を参照されたい）を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｆｃγ受容体に結合しないＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つまたは複数に結合しないＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩＩａのうちの１つまたは複数に結合しないＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂの一方または両方に結合しないＦｃ領域を含む。
Ｆｃ領域、またはＦｃ領域を含む抗原結合性分子が、参照タンパク質（例えば、Ｆｃ受容体）に結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えば、Ｈｅａｒｔｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１２）、９０７：４１１〜４４２を参照されたい）、またはバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ；例えば、Ｌａｄら（２０１５）、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ、２０（４）：４９８〜５０７を参照されたい）など、当技術分野で周知の方法に従い解析されうる。
本明細書で使用された、参照タンパク質「に結合しない」Ｆｃ領域は、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（例えば、ウェスタンブロット）、免疫沈降、ＳＰＲ、またはＢＬＩにより決定する場合、参照タンパク質への結合を、実質的に呈さない場合がある。「〜に実質的に結合しないこと」は、所与のアッセイにおいて、互いに結合しないタンパク質について決定される、相互作用のレベルを著明に超えない、相互作用のレベルでありうる。「〜に実質的に結合しないこと」は、所与のアッセイにおいて、互いに結合しないタンパク質について決定される、相互作用のレベルの、≦５倍、例えば、≦４倍、≦３倍、≦２．５倍、≦２倍、または≦１．５倍である、相互作用のレベルでありうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃＲｎに結合するが、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩＩａのうちの１つまたは複数に結合しないＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃＲｎに結合するが、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂの一方または両方に結合しないＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＡＤＣＣを誘導しないＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＡＤＣＰを誘導しないＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＣＤＣを誘導しないＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣを誘導しないＦｃ領域を含む。
本明細書で使用される、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣを誘導しない（すなわち、これを誘導することが可能ではない）Ｆｃ領域／抗原結合性分子は、例えば、対象とする活性に適切なアッセイにおける解析により決定する場合、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣ活性を実質的に誘発しない。「ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣ活性を実質的に伴わない」とは、所与のアッセイにおいて、適切な陰性対照分子について決定されるＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣのレベルを著明に超えない、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣのレベルを指す（例えば、Ｆｃ領域を欠く抗原結合性分子、または「サイレント」Ｆｃ領域を含む抗原結合性分子（例えば、参照により本明細書の上記に組み込まれる、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１６）、２９（１０）：４５７〜４６６に記載された））。「活性を実質的に伴わない」とは、所与のアッセイにおいて、適切な陰性対照分子について決定される活性のレベルの、≦５倍、例えば、≦４倍、≦３倍、≦２．５倍、≦２倍、または≦１．５倍である、対象とする活性のレベルでありうる。
Ｆｃ領域、またはＦｃ領域を含む抗原結合性分子が、ＡＤＣＣを誘導する能力は、例えば、Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１６）、６：１９７７２（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）に記載された方法に従い、解析される場合もあり、例えば、Ｊｅｄｅｍａら、Ｂｌｏｏｄ（２００４）、１０３：２６７７〜８２（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）に記載された、５１Ｃｒ放出アッセイにより解析される場合もある。Ｆｃ領域、またはＦｃ領域を含む抗原結合性分子が、ＡＤＣＰを誘導する能力は、例えば、Ｋａｍｅｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１７）、１９８（増刊１号）１５７．１７（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）に記載された方法に従い解析されうる。Ｆｃ領域、またはＦｃ領域を含む抗原結合性分子が、ＣＤＣを誘導する能力は、例えば、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（２０１６）、２９（１０）：４５７〜４６６（参照により本明細書の上記に組み込まれた）において記載された、例えば、Ｃ１ｑ結合アッセイを使用して解析されうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２５４に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２５７に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２５９に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６０に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むＦｃ領域を含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｆｃ領域を欠く。
Ｆｃ受容体
Ｆｃ受容体とは、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合するポリペプチドである。Ｆｃ受容体の構造および機能については、例えば、それらのいずれもが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｍａｓｕｄａら、Ｉｎｆｌａｍｍ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ（２００９）、８（１）：８０〜８６およびＢｒｕｈｎｓ、Ｂｌｏｏｄ（２０１２）、１１９：５６４０〜５６４９において総説されている。
Ｆｃ受容体は、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、好塩基球、マスト細胞、およびＮＫ細胞を含む、造血細胞の表面において発現される。Ｆｃ受容体は、ＩｇＧ結合性Ｆｃγ受容体、ＩｇＥに対する高アフィニティー受容体（ＦｃεＲＩ）、ＩｇＡ受容体、ならびにＩｇＡおよびＩｇＭに対する、ポリマー性Ｉｇ受容体を含む。新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、ＩｇＧに対する、さらなるＦｃ受容体であり、上皮障壁を隔てたＩｇＧ輸送（トランスサイトーシス）、ＩｇＧの分解からの保護、および抗原提示に関与する。
ヒトは、Ｆｃγ受容体の、６つの異なるクラス（マウスオーソログを、カッコ内に示す）：ＦｃγＲＩ（ｍＦｃγＲＩ）、ＦｃγＲＩＩａ（ｍＦｃγＲＩＩＩ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ｍＦｃγＲＩＩｂ）、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ（ｍＦｃγＲＩＶ）、およびＦｃγＲＩＩＩｂを有する。
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、およびＦｃγＲＩＩＩａは、それらの細胞内ドメイン内に、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、Ｆｃによるライゲーションは、受容体を発現する細胞の活性化をもたらす。ＦｃγＲＩＩｂは、その細胞内ドメイン内に、免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含み、Ｆｃによるライゲーション時に、細胞の活性化および脱顆粒、細胞の増殖、エンドサイトーシス、ならびに食作用を、負に調節する。
本明細書では、「Ｆｃγ受容体」は、任意の種に由来することが可能であり、任意の種に由来する、アイソフォーム、断片、変異体（突然変異体を含む）、または相同体を含みうる。同様に、「ＦｃγＲＩ」、「ＦｃγＲＩＩａ」、「ＦｃγＲＩＩｂ」、「ＦｃγＲＩＩｃ」、「ＦｃγＲＩＩＩａ」、および「ＦｃγＲＩＩＩｂ」とは、それぞれ、任意の種に由来する、ＦｃγＲＩ／ＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ／ＦｃγＲＩＩｃ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＦｃγＲＩＩＩｂを指し、任意の種に由来する、アイソフォーム、断片、変異体（突然変異体を含む）、または相同体を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ／ＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ／ＦｃγＲＩＩｃ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＦｃγＲＩＩＩｂ）は、哺乳動物（例えば、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、および／または齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）に由来する。アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、所与の種、例えば、ヒトに由来する、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ／ＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ／ＦｃγＲＩＩｃ／ＦｃγＲＩＩＩａ／ＦｃγＲＩＩＩｂ）の、未成熟または成熟のアイソフォームのアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有することとして特徴付けられうる。
アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、例えば、機能的特性／活性に適切なアッセイを介する解析により決定する場合、参照Ｆｃγ受容体の機能的特性／活性を有する、機能的なアイソフォーム、断片、変異体、または相同体でありうる。例えば、ＦｃγＲＩのアイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃとの会合を呈しうる。
本明細書では、「ＦｃＲｎ受容体」は、任意の種に由来することが可能であり、任意の種に由来する、アイソフォーム、断片、変異体（突然変異体を含む）、または相同体を含みうる。
一部の実施形態では、ＦｃＲｎ受容体は、哺乳動物（例えば、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、および／または齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）に由来する。アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、所与の種、例えば、ヒトに由来する、未成熟または成熟のＦｃγ受容体アイソフォームのアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有することとして特徴付けられうる。
アイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、任意選択で、例えば、機能的特性／活性に適切なアッセイを介する解析により決定する場合、参照ＦｃＲｎの機能的特性／活性を有する、機能的なアイソフォーム、断片、変異体、または相同体でありうる。例えば、ＦｃＲｎのアイソフォーム、断片、変異体、または相同体は、例えば、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃとの会合を呈しうる。
ポリペプチド
本発明はまた、抗原結合性分子の、ポリペプチド構成要素も提供する。ポリペプチドは、単離形態で提供される場合もあり、実質的な精製形態で提供される場合もある。
本発明の抗原結合性分子は、ポリペプチドの複合体でありうるか、またはこれを含みうる。
ポリペプチドが、１つを超えるドメインまたは領域を含む、本明細書では、複数のドメイン／領域が、同じポリペプチド鎖内に存在することが好ましいことが理解されるであろう。すなわち、１つを超えるドメインまたは領域を含むポリペプチドは、ドメイン／領域を含む融合ポリペプチドである。
一部の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、本明細書で記載されるＶＨを含むか、またはこれらからなる。一部の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、本明細書で記載されるＶＬを含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、加えて、１つまたは複数の、抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、加えて、１つまたは複数の、抗体の軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＣＨ１、ＣＨ２領域、および／またはＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖定常配列の、１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＨ１領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載される、ＣＨ１−ＣＨ２間のヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＨ２領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換／アミノ酸置換の組合せ：Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ；Ｌ２３４Ｙ／Ｌ２３５Ｑ／Ｇ２３６Ｗ／Ｓ２３９Ｍ／Ｈ２６８Ｄ／Ｄ２７０Ｅ／Ｓ２９８Ａ；Ｄ２７０Ｅ／Ｋ３２６Ｄ／Ａ３３０Ｍ／Ｋ３３４Ｅ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ；Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ；Ｅ３４５Ｒ／Ｅ４３０Ｇ／Ｓ４４０Ｙ；Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ；Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ；Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ；Ｎ３２５Ｓ／Ｌ３２８Ｆ；Ｎ２９７Ａ；Ｎ２９７Ｑ；Ｎ２９７Ｇ；Ｌ２３５Ｅ；Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ；Ｐ３２９Ａ；Ｐ３２９Ｇ；Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ；Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ；およびＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓのうちのいずれか１つを含む、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換／アミノ酸置換の組合せ（例えば、参照により本明細書の上記に組み込まれた、Ｈａら、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｎｏｌ（２０１６）、７：３９４の表１に示される）：Ｔ３６６Ｗ；Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ；Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃ；Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃ；Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａ；Ｙ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆ；Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、およびＹ４０７Ｖ；Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、およびＴ３９４Ｗ；Ｋ３６０Ｄ、Ｄ３９９Ｍ、およびＹ４０７Ａ；Ｅ３４５Ｒ、Ｑ３４７Ｒ、Ｔ３６６Ｖ、およびＫ４０９Ｖ；Ｋ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ；Ｄ３９９ＫおよびＥ３５６Ｋ；Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗ；Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔ；Ｋ３６０Ｅ、Ｋ４０９Ｗ、およびＹ３４９Ｃ；Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、Ｆ４０５Ｔ、およびＳ３５４Ｃ；Ｋ３７０ＥおよびＫ４０９Ｗ；ならびにＥ３５７Ｎ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔのうちのいずれか１つを含むＣＨ３領域を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドのＣＨ２および／またはＣＨ３領域は、ポリペプチドの、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域を含む、別のポリペプチドとの会合を促進するための、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリンの軽鎖定常配列の、１つまたは複数の領域を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書で記載されるＣＬ領域を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖定常配列の、１つまたは複数の領域を欠く。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ２領域を欠く。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ３領域を欠く。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ２領域を欠き、ＣＨ３領域もまた欠く。
一部の実施形態では、本発明に従うポリペプチドは、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、以下：
（ｉ）ＶＨ
（ｉｉ）ＶＬ
（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ１
（ｉｖ）ＶＬ−ＣＬ
（ｖ）ＶＬ−ＣＨ１
（ｖｉ）ＶＨ−ＣＬ
（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３
（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３
（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３
（ｘ）ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３
のうちの１つに従う構造を含む。
本発明によりまた、本発明のポリペプチドから構成される抗原結合性分子も提供される。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、以下のポリペプチドの組合せ：
（Ａ）ＶＨ＋ＶＬ
（Ｂ）ＶＨ−ＣＨ１＋ＶＬ−ＣＬ
（Ｃ）ＶＬ−ＣＨ１＋ＶＨ−ＣＬ
（Ｄ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＬ−ＣＬ
（Ｅ）ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＬ−ＣＨ１
（Ｆ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＨ−ＣＬ
（Ｇ）ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＨ−ＣＨ１
（Ｈ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３
（Ｉ）ＶＨ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３
のうちの１つを含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、上記の（Ａ）〜（Ｉ）に示された組合せのポリペプチドのうちの、１つを超えるポリペプチドを含む。例を目的として述べると、上記の（Ｄ）を参照すると、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、構造ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む、２つのポリペプチドと、構造ＶＬ−ＣＬを含む、２つのポリペプチドとを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、以下のポリペプチドの組合せ：
（Ｊ）ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）＋ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）
（Ｋ）ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＨ１＋ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＬ
（Ｌ）ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＨ１＋ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＬ
（Ｍ）ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＬ
（Ｎ）ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＨ１
（Ｏ）ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＬ
（Ｐ）ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＨ１
（Ｑ）ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３
（Ｒ）ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３＋ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３
のうちの１つを含むが、この場合、「ＶＨ（抗ＶＩＳＴＡ）」とは、本明細書で記載される、例えば、（１）〜（７６）のうちの１つにおいて規定される、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子のＶＨを指し；「ＶＬ（抗ＶＩＳＴＡ）」とは、本明細書で記載される、例えば、（７７）〜（１７３）のうちの１つにおいて規定される、ＶＩＳＴＡに結合することが可能な抗原結合性分子のＶＬを指す。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２１２〜２４３、２４８〜２５０、２５８、２６６、または３１１〜３２１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
リンカーおよびさらなる配列
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子およびポリペプチドは、ヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＨ１領域と、ＣＨ２領域との間にもたらされる。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＬ領域と、ＣＨ２領域との間にもたらされる。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号２０７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子およびポリペプチドは、アミノ酸配列の間に、１つまたは複数のリンカー配列を含む。リンカー配列は、抗原結合性分子／ポリペプチドの、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１−ＣＨ２間のヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域のうちの１つまたは複数の、一方または両方の末端にもたらされうる。
当業者には、リンカー配列が公知であり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）、６５（１０）：１３５７〜１３６９において記載されている。一部の実施形態では、リンカー配列は、可動性リンカー配列でありうる。可動性リンカー配列は、リンカー配列により連結されたアミノ酸配列の、相対的運動を可能とする。当業者には、リンカー配列が公知であり、いくつかのリンカー配列は、Ｃｈｅｎら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ（２０１３）、６５（１０）：１３５７〜１３６９において同定されている。可動性リンカー配列は、しばしば、高比率のグリシン残基および／またはセリン残基を含む。
一部の実施形態では、リンカー配列は、少なくとも１つのグリシン残基、および／または少なくとも１つのセリン残基を含む。一部の実施形態では、リンカー配列は、グリシンおよびセリン残基からなる。一部の実施形態では、リンカー配列は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、または１〜１０アミノ酸の長さを有する。
本発明の抗原結合性分子およびポリペプチドは、加えて、さらなるアミノ酸またはアミノ酸の配列を含みうる。例えば、抗原結合性分子およびポリペプチドは、抗原結合性分子／ポリペプチドの、発現、フォールディング、トラフィッキング、プロセシング、精製、または検出を容易とするアミノ酸配列（複数可）を含みうる。例えば、抗原結合性分子／ポリペプチドは、任意選択で、抗原結合性分子／ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において、Ｈｉｓ（例えば、６×Ｈｉｓ）、Ｍｙｃ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｅ、またはビオチンタグをコードする配列を含みうる。一部の実施形態では、抗原結合性分子／ポリペプチドは、検出用部分、例えば、蛍光、発光、免疫検出用、放射性、化学、核酸、または酵素標識を含む。
本発明の抗原結合性分子およびポリペプチドは、加えて、シグナルペプチド（また、リーダー配列またはシグナル配列としても公知である）を含みうる。シグナルペプチドは通常、単一のアルファヘリックスを形成する、５〜３０の疎水性アミノ酸の配列からなる。細胞表面で分泌されるタンパク質および発現されるタンパク質は、しばしば、シグナルペプチドを含む。
シグナルペプチドは、抗原結合性分子／ポリペプチドのＮ末端に存在することが可能であり、新たに合成される抗原結合性分子／ポリペプチド内に存在しうる。シグナルペプチドは、抗原結合性分子／ポリペプチドの、効率的なトラフィッキングおよび分泌をもたらす。シグナルペプチドは、しばしば、切断により除去されるため、抗原結合性分子／ポリペプチドを発現する細胞から分泌される、成熟抗原結合性分子／ポリペプチド内に含まれない。
シグナルペプチドは、多くのタンパク質について公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、Ｅｎｓｅｍｂｌ、およびＩｎｔｅｒＰｒｏなどのデータベースに記録されており、かつ／または例えば、ＳｉｇｎａｌＰ（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、２０１１、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、８：７８５〜７８６）またはＳｉｇｎａｌ−ＢＬＡＳＴ（ＦｒａｎｋおよびＳｉｐｐｌ、２００８、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２４：２１７２〜２１７６）などのアミノ酸配列解析ツールを使用して、同定／予測されうる。
標識およびコンジュゲート
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、加えて、検出可能部分を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、検出可能部分、例えば、蛍光標識、リン光標識、発光標識、免疫検出可能標識（例えば、エピトープタグ）、放射性標識、化学、核酸、または酵素標識を含む。抗原結合性分子は、検出可能部分で、共有結合的に標識付けされる場合もあり、非共有結合的に標識付けされる場合もある。
蛍光標識は、例えば、フルオレセイン、ローダミン、アロフィコシアニン、エオシン、およびＮＤＢ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、テルビウム（Ｔｂ）、およびサマリウム（Ｓｍ）など、希土類のキレート剤、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、４−メチルウンベリフェロン、７−アミノ−４−メチルクマリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５を含む。放射性標識は、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１２６、ヨウ素１３１、ヨウ素１３３、臭素７７、テクネシウム９９ｍ、インジウム１１１、インジウム１１３ｍ、ガリウム６７、ガリウム６８、ルテニウム９５、ルテニウム９７、ルテニウム１０３、ルテニウム１０５、水銀２０７、水銀２０３、レニウム９９ｍ、レニウム１０１、レニウム１０５、スカンジウム４７、テルリウム１２１ｍ、テルリウム１２２ｍ、テルリウム１２５ｍ、ツリウム１６５、ツリウム１６７、ツリウム１６８、銅６７、フッ素１８、イットリウム９０、パラジウム１００、ビスマス２１７、およびアンチモニー２１１などの放射性同位体を含む。発光標識は、放射性発光標識、化学発光標識（例えば、アクリジニウムエステル、ルミノール、イソルミノール）、および生物発光標識を含む。免疫検出可能標識は、ハプテン、ペプチド／ポリペプチド、抗体、受容体、およびビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはジゴキシゲニンなどのリガンドを含む。核酸標識は、アプタマーを含む。酵素標識は、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼを含む。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、化学的部分へとコンジュゲートされる。化学的部分は、治療効果をもたらすための部分でありうる。抗体−薬物コンジュゲートについては、例えば、Ｐａｒｓｌｏｗら、Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ、２０１６年９月、４（３）：１４において総説されている。一部の実施形態では、化学的部分は、薬物部分（例えば、細胞傷害剤）でありうる。一部の実施形態では、薬物部分は、化学療法剤でありうる。一部の実施形態では、薬物部分は、カリケアミシン、ＤＭ１、ＤＭ４、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、ＳＮ−３８、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、Ｄ６．５、およびＰＢＤから選択される。
抗原結合性分子についての、特定の例示的な実施形態
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２１７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２１８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２１９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２２１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２２３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２２５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２２８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２２９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２３０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２３１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２３２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２３３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２３４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２３５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２３６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２３７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２３８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２３９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２４０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２４１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２４２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２４３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２４８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２４９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２５８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号２６６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、
（ｉ）配列番号３３０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド；および
（ｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％、好ましくは、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、２つのポリペプチド
を含むか、またはこれからなる。
抗原結合性分子の機能的特性
本明細書で記載される抗原結合性分子は、ある特定の機能的特性に言及することにより特徴付けられうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原結合性分子は、以下の特性：
ＶＩＳＴＡ（例えば、ヒト、マウス、および／またはカニクイザルＶＩＳＴＡ）に結合すること；
ＰＤ−Ｌ１および／またはＨＥＲ３に結合しないこと；
Ｆｃγ受容体に結合しないこと；
Ｃ１ｑに結合しないこと；
ＡＤＣＣを誘導しないこと；
ＡＤＣＰを誘導しないこと；
ＣＤＣを誘導しないこと；
ＦｃＲｎ受容体に結合すること；
ＶＩＳＴＡ発現細胞に結合すること；
ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナー（例えば、ＰＳＧＬ−１、ＶＳＩＧ−３、またはＶＳＩＧ−８）との相互作用を阻害すること；
ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害すること；
Ｆｃ媒介性機能に依存せずに、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害すること；
ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を増大させること；
ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を誘導しない／増大させないこと；
ＶＩＳＴＡ発現細胞の数／比率を低減すること；
ＶＩＳＴＡ発現細胞の数／比率を低減しないこと；
エフェクター免疫細胞の数／活性を増大させること；
免疫抑制細胞の数／活性を低減すること；
免疫抑制細胞の増殖を低減すること；
ＶＩＳＴＡ発現細胞により媒介される免疫抑制を減少させること；
抗原提示細胞による抗原提示を増大させること；
免疫細胞によるＩＬ−６の産生を増大させること；
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、および／またはＩＬ−１７の産生を増大させること；
Ｔ細胞の増殖、ＩＦＮ−γの産生、および／またはＴＮＦａの産生を増大させること；ならびに
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがんの発症および／または進行を阻害すること
のうちの１つまたは複数を所有しうる。
本明細書で記載される抗原結合性分子は、好ましくは、ＶＩＳＴＡへの特異的結合を呈する。本明細書で使用される、「特異的結合」とは、抗原に対して選択的であり、非標的抗原への非特異的結合から区別されうる結合を指す。標的分子に特異的に結合する抗原結合性分子は、好ましくは、他の非標的分子に結合する場合より、大きなアフィニティーおよび／または長い持続時間で、標的に結合する。
所与のポリペプチドが、所与の分子に特異的に結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；例えば、Ｈｅａｒｔｙら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１２）、９０７：４１１〜４４２を参照されたい）、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｌａｄら（２０１５）、Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ、２０（４）：４９８〜５０７を参照されたい）、フローサイトメトリー、または放射性標識抗原結合性アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定アッセイによる方法など、当技術分野で公知の方法に従う解析により決定されうる。このような解析によって、所与の分子への結合は、測定および定量されうる。一部の実施形態では、結合は、所与のアッセイにおいて検出される応答でありうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子の、非標的分子への結合の程度は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法により、またはＲＩＡにより測定される、抗体の、標的分子への結合の、約１０％未満である。代替的に、結合特異性は、抗原結合性分子が、抗原結合性分子の、非標的分子へのＫＤを超える、少なくとも０．１の桁数（すなわち、０．１×１０ｎ［式中、ｎは、桁数を表す整数である］）である解離定数（ＫＤ）で結合する、結合アフィニティーの点でも反映されうる。これは、任意選択で、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、または２．０のうちの１つでありうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ヒトＶＩＳＴＡ、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）（例えば、マウス（ｍｏｕｓｅ））ＶＩＳＴＡ、および／またはカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＶＩＳＴＡへの結合を呈する。すなわち、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ヒトＶＩＳＴＡ、およびマウスＶＩＳＴＡ、および／またはカニクイザルＶＩＳＴＡに対して、交差反応性である。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、非ヒト霊長動物のＶＩＳＴＡとの交差反応性をもたらす。モデル種におけるＶＩＳＴＡに対する交差反応性は、ｉｎ ｖｉｖｏの同系モデルにおける、サロゲート分子に依拠しない、有効性についての調べることを可能とする。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＰＤ−Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１）への特異的結合をもたらさない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＨＥＲ３（例えば、ヒトＨＥＲ３）への特異的結合をもたらさない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、タンパク質のＢ７ファミリーの、別のメンバーへの特異的結合をもたらさない（すなわち、これらと交差反応しない）。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＣＯＳＬＧ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＮＣＲ３ＬＧ１、ＨＨＬＡ２、および／またはＣＴＬＡ４への特異的結合をもたらさない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、ＶＴＣＮ１（Ｂ７Ｈ４）、ＮＣＲ３ＬＧ１（Ｂ７Ｈ６）、ＨＨＬＡ２（Ｂ７Ｈ７）、および／またはＣＴＬＡ４への特異的結合を呈さない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、１つまたは複数のＦｃ媒介性機能を誘導することが可能ではない（すなわち、関連するＦｃ媒介性機能（複数可）を誘発する能力を欠く）。このような抗原結合性分子は、関連する機能（複数可）が欠如すると記載されうる。
本明細書の上記で説明された通り、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣを誘導しない（すなわち、これを誘導することが可能ではない）Ｆｃ領域／抗原結合性分子は、例えば、対象とする活性に適切なアッセイにおける解析により決定する場合、ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰ／ＣＤＣ活性を実質的に誘発しない。同様に、参照タンパク質（例えば、所与のＦｃ受容体または補体タンパク質）「に結合しない」抗原結合性分子は、適切なアッセイにおいて、参照タンパク質への結合を、実質的に呈さない場合がある。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＡＤＣＣを誘導することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＡＤＣＰを誘導することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＣＤＣを誘導することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＡＤＣＣを誘導することが可能ではなく、かつ／またはＡＤＣＰを誘導することが可能ではなく、かつ／またはＣＤＣを誘導することが可能ではない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｆｃ受容体に結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｆｃγ受容体に結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つまたは複数に結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩＩＩａに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩＩａに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩＩｂに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃＲｎに結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、補体タンパク質に結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｃ１ｑに結合することが可能ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｎ２９７に対応するアミノ酸残基においてグリコシル化されない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、および／またはカニクイザルＶＩＳＴＡに結合し、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、Ｂ７Ｈ３、ＶＴＣＮ１（Ｂ７Ｈ４）、ＮＣＲ３ＬＧ１（Ｂ７Ｈ６）、ＨＨＬＡ２（Ｂ７Ｈ７）、および／またはＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１／Ｂ７Ｈ３／ＶＴＣＮ１／ＮＣＲ３ＬＧ１／ＨＨＬＡ２／ＣＴＬＡ４）に結合しない。
一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原結合性分子は、１０μＭ以下、好ましくは、≦５μＭ、≦２μＭ、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦７５ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１５ｎＭ、≦１２．５ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦５００ｐＭのうちの１つのＫＤで、ＶＩＳＴＡ（例えば、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ）に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＫＤ≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、または≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦３ｎＭ、≦２ｎＭ、または≦１ｎＭのアフィニティーで、ＶＩＳＴＡ（例えば、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ）に結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＫＤ≦５００ｐＭ、≦１００ｐＭ、≦９０ｐＭ、≦８０ｐＭ、≦７０ｐＭ、または≦６０ｐＭ、≦５０ｐＭ、≦４０ｐＭ、≦３０ｐＭ、≦２０ｐＭ、≦１０ｐＭ、≦９ｐＭ、≦８ｐＭ、≦７ｐＭ、または≦６ｐＭ、≦５ｐＭ、≦４ｐＭ、≦３ｐＭ、≦２ｐＭ、または≦１ｐＭのアフィニティーで、ＶＩＳＴＡ（例えば、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ）に結合する。
本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡの、特に目的となる領域に結合しうる。本発明に従う抗原結合性分子の抗原結合性領域は、アミノの酸連続配列（すなわち、アミノ酸の一次配列）からなる、ＶＩＳＴＡの直鎖状エピトープに結合しうる。一部の実施形態では、抗原結合性領域は、アミノ酸配列のうちの、アミノ酸の不連続配列からなる、ＶＩＳＴＡのコンフォメーションエピトープに結合しうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡの細胞外領域内で、ＶＩＳＴＡに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（例えば、配列番号６に示される領域）内で、ＶＩＳＴＡに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３１に示される領域内で、ＶＩＳＴＡに結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３２２に示されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、ペプチドまたはポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、ペプチドまたはポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、ペプチドまたはポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、ペプチドまたはポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、ペプチドまたはポリペプチドに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、ペプチドまたはポリペプチドに結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＩＧＮ１７５Ａが結合する、ＶＩＳＴＡの領域（例えば、ＷＯ２０１４／１９７８４９Ａ２に記載された）に結合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６７の配列からなるポリペプチドおよび配列番号２６８の配列からなるポリペプチドから構成される抗原結合性分子が結合する、ＶＩＳＴＡの領域に結合しない。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＩＧＮ１７５Ａ（例えば、ＷＯ２０１４／１９７８４９Ａ２に記載された）と、ＶＩＳＴＡへの結合について競合しない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６７の配列からなるポリペプチドおよび配列番号２６８の配列からなるポリペプチドから構成される抗原結合性分子と、ＶＩＳＴＡへの結合について競合しない。
所与の抗原結合性分子が、ＩＧＮ１７５Ａまたは配列番号２６７の配列からなるポリペプチドおよび配列番号２６８の配列からなるポリペプチドから構成される抗原結合性分子と、ＶＩＳＴＡへの結合について競合する能力は、例えば、Ａｂｄｉｃｈｅ ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）、３８２（２）：１０１〜１１６（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）において記載されている通り、競合ＥＬＩＳＡ、またはエピトープビニングにより解析されうる。エピトープビニングは、例えば、例えば、本出願の実施例８に記載される通り、ＢＬＩ解析により実施されうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２７５に示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合することが可能ではない。
本明細書で使用される、「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結された、２つ以上のアミノ酸単量体による鎖を指す。ペプチドは、典型的に、領域内に、約２〜５０アミノ酸の長さを有する。「ポリペプチド」とは、２つ以上のペプチドによるポリマー鎖である。ポリペプチドは、典型的に、約５０アミノ酸を超える長さを有する。
抗原結合性分子が、所与のペプチド／ポリペプチドに結合する能力は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（例えば、ウェスタンブロット）、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、およびバイオレイヤー干渉法による解析を含む、当業者に周知の方法により解析されうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２、４Ｍ２−Ｂ４、４Ｍ２−Ｃ９、４Ｍ２−Ｄ９、４Ｍ２−Ｄ５、４Ｍ２−Ａ８、Ｖ４Ｈ１、Ｖ４Ｈ２、Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１、２Ｍ１−Ｂ１２、２Ｍ１−Ｄ２、１Ｍ２−Ｄ２、１３Ｄ５ｐ、１３Ｄ５−１、１３Ｄ５−１３、５Ｍ１−Ａ１１または９Ｍ２−Ｃ１２のうちの１つのＶＨおよびＶＬ配列を含む抗体が結合するＶＩＳＴＡの領域と同じＶＩＳＴＡの領域、または重複するＶＩＳＴＡの領域に結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＩＧＮ１７５Ａが結合する、ＶＩＳＴＡの領域（例えば、ＷＯ２０１４／１９７８４９Ａ２に記載された）と異なる、ＶＩＳＴＡの領域に結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６７の配列からなるポリペプチドおよび配列番号２６８の配列からなるポリペプチドから構成される抗原結合性分子が結合する、ＶＩＳＴＡの領域と異なる、ＶＩＳＴＡの領域に結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＩＧＮ１７５Ａが結合する、ＶＩＳＴＡの領域（例えば、ＷＯ２０１４／１９７８４９Ａ２に記載された）と重複しないＶＩＳＴＡの領域に結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６７の配列からなるポリペプチドおよび配列番号２６８の配列からなるポリペプチドから構成される抗原結合性分子が結合する、ＶＩＳＴＡの領域と重複しないＶＩＳＴＡの領域に結合することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＳＴＢ１１２が接触するＶＩＳＴＡの残基（例えば、ＷＯ２０１５／０９７５３６Ａ２に記載された）と同一でない、ＶＩＳＴＡの残基との接触を介して、ＶＩＳＴＡに結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、配列番号２６９の配列からなるポリペプチドおよび配列番号２７０の配列からなるポリペプチドから構成される抗原結合性分子が接触するＶＩＳＴＡの残基と同一でない、ＶＩＳＴＡの残基との接触を介して、ＶＩＳＴＡに結合する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子のエピトープは、ＶＳＴＢ１１２のエピトープと同一ではない。一部の実施形態では、抗原結合性分子のエピトープは、配列番号２６９の配列からなるポリペプチドおよび配列番号２７０の配列からなるポリペプチドから構成される抗原結合性分子のエピトープと同一ではない。
抗体が結合する、ペプチド／ポリペプチドの領域は、抗体−抗原複合体についてのＸ線共結晶構造解析、ペプチド走査、突然変異誘発マッピング、質量分析による水素−重水素交換解析、ファージディスプレイ、競合ＥＬＩＳＡ、およびタンパク質分解ベースの「保護」法を含む、当技術分野で周知の、多様な方法を使用して、当業者により決定されうる。このような方法については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｇｅｒｓｈｏｎｉら、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、２００７、２１（３）：１４５〜１５６において記載されている。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡが、細胞表面（すなわち、細胞膜内または細胞膜）において発現される場合、抗原結合性分子（すなわち、細胞外抗原結合性分子）にアクセス可能な領域内のＶＩＳＴＡに結合する。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡを発現する細胞の細胞表面において発現されるＶＩＳＴＡに結合することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞（例えば、ＣＤ１４＋単球（単球由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）など）および／またはＣＤ３３＋骨髄細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、ならびに好中球）に結合することが可能である。
抗原結合性分子が、所与の細胞型に結合する能力は、例えば、結合しなかった抗原結合性分子を除去する洗浄ステップの後で、細胞を、抗原結合性分子抗原結合性分子と接触させ、細胞に結合した抗原結合性分子を検出することにより解析されうる。抗原結合性分子が、免疫細胞表面分子発現細胞および／またはがん細胞抗原発現細胞に結合する能力は、フローサイトメトリーおよび免疫蛍光顕微鏡法などの方法により解析されうる。
本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡのアンタゴニストでありうる。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡおよび／またはＶＩＳＴＡの結合パートナー（例えば、ＰＳＧＬ−１、ＶＳＩＧ−３、ＶＳＩＧ−８）により媒介される、機能または過程（例えば、相互作用、シグナル伝達、または他の活性）を阻害することが可能である。本明細書に、「阻害」とは、対照条件と比べた、低減、減少、または低下を指す。
本明細書で記載されるＶＩＳＴＡ結合性抗原結合性分子は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣなどのＦｃ媒介性機能を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性機能／過程を阻害することが可能である。すなわち、本明細書で記載されるＶＩＳＴＡ結合性抗原結合性分子は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣを誘発する必要を伴わずに、ＶＩＳＴＡ発現細胞の免疫抑制活性を阻害することが可能である。
特に、本明細書で記載されるＶＩＳＴＡ結合性抗原結合性分子は、Ｆｃγ受容体への結合および／またはＣ１ｑへの結合を要求しない機構を介して、ＶＩＳＴＡを阻害することが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナー（例えば、ＰＳＧＬ−１、ＶＳＩＧ−３、ＶＳＩＧ−８）との相互作用を阻害することが可能である。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡと、ＰＳＧＬ−１との相互作用を阻害することが可能である。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ−３との相互作用を阻害することが可能である。
抗原結合性分子が、２つの因子の間の相互作用を阻害する能力は、例えば、抗体／断片の存在下で、または相互作用パートナーの一方もしくは両方の、抗体／断片を伴うインキュベーションの後で、相互作用を解析することにより決定されうる。所与の抗原結合性分子が、２つの相互作用パートナーの間の相互作用を阻害することが可能であるのかどうかを決定するためのアッセイは、競合ＥＬＩＳＡアッセイおよびＳＰＲによる解析を含む。
所与の相互作用（例えば、ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナーとの相互作用）を阻害することが可能な抗原結合性分子は、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）における相互作用のレベルと比較した、抗原結合性分子の存在下（または相互作用パートナーの一方または両方の、抗原結合性分子を伴うインキュベーションの後）における、相互作用パートナー間の相互作用のレベルの低減／減少の観察により同定されうる。適切な解析は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、例えば、組換え相互作用パートナーを使用するか、または相互作用パートナーを発現する細胞を使用して実施されうる。相互作用パートナーを発現する細胞は、これを、内因的に発現させる場合もあり、細胞へと導入された核酸から発現させる場合もある。このようなアッセイの目的で、相互作用パートナーの一方もしくは両方、および／または抗原結合性分子は、相互作用のレベルを検出および／または測定することを目的とする、検出可能実体で標識付けされる場合もあり、これと共に使用される場合もある。
抗原結合性分子が、２つの結合パートナーの間の相互作用を阻害する能力はまた、このような相互作用の、下流の機能的帰結を解析することによっても決定されうる。例えば、ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナーとの相互作用の、下流の機能的帰結は、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を含みうる。例えば、抗原結合性分子が、ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナーとの相互作用を阻害する能力は、ＭＬＲアッセイにおける、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、および／またはＩＬ−１７の産生の解析により決定されうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナー（例えば、ＰＳＧＬ−１、ＶＳＩＧ−３、ＶＳＩＧ−８）との相互作用を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）における、ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナーと相互作用のレベルの、１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍、≦０．０５倍、または≦０．０１倍へと阻害することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害する。ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達は、例えば、本明細書の実施例に記載されたＭＬＲアッセイなど、エフェクター免疫細胞の数／活性についてのアッセイを使用して解析されうる。ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達の阻害は、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、および／またはＩＬ−１７の産生の増大により決定される、エフェクター免疫細胞の数および／または活性の増大の検出により同定されうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｆｃ媒介性機能を要求しないか、または伴わない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｆｃ媒介性機能に依存せずに、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。すなわち、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｆｃ領域に依存せずに、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。
抗原結合性分子が、Ｆｃ媒介性機能を要求しない／伴わない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害する能力は、例えば、機能的なＦｃ領域を欠くフォーマットで用意された抗原結合性分子が、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害する能力を解析することにより評価されうる。例えば、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達に対する効果は、「サイレント」Ｆｃ領域（例えば、ＬＡＬＡ ＰＧ置換を含む）を含む抗原結合性分子を使用して調べる場合もあり、Ｆｃ領域を欠くフォーマットで用意された抗原結合性分子（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）を使用して調べる場合もある。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＡＤＣＣを伴わない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＡＤＣＰを伴わない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＣＤＣを伴わない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、抗原結合性分子の、Ｆｃ受容体への結合を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、抗原結合性分子の、Ｆｃγ受容体への結合を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、抗原結合性分子の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つまたは複数への結合を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩＩａへの結合を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、補体タンパク質への結合を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｃ１ｑへの結合を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｎ２９７のグリコシル化を要求しない機構により、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を増大させることが可能である。ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅は、抗原結合性分子のエフェクター機能を介して増大させうる。抗原結合性分子が、Ｆｃ領域を含む実施形態では、抗原結合性分子は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）のうちの１つまたは複数を介して、ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を増大させうる。
ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を増大させることが可能な抗原結合性分子は、適切なアッセイの、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において検出される細胞殺滅のレベルと比較した、抗原結合性分子の存在下（またはＶＩＳＴＡ発現細胞の、抗原結合性分子を伴うインキュベーションの後）における、ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅のレベルの上昇の観察により同定されうる。当業者には、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、およびＡＤＣＰについてのアッセイが周知である。ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅のレベルはまた、異なる処置条件への曝露の後における、ＶＩＳＴＡ発現細胞の、生存および／または非生存の数／比率を測定することによっても決定されうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞（例えば、ＶＩＳＴＡ発現ＭＤＳＣ）の殺滅を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において観察される殺滅のレベルの、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させることが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、同等なアッセイにおいて、ＶＩＳＴＡ発現細胞（例えば、ＶＩＳＴＡ発現ＭＤＳＣ）の数を、抗原結合性分子の非存在下におけるインキュベーションの後に（または適切な対照の抗原結合性分子の存在下におけるインキュベーションの後に）検出される、ＶＩＳＴＡ発現細胞（例えば、ＶＩＳＴＡを発現させるＭＤＳＣ、ＴＡＭ、好中球）の数の、１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍、≦０．０５倍、または≦０．０１倍へと低減することが可能である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、非枯渇性抗原結合性分子である。すなわち、一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞の、実質的な枯渇を引き起こさない。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞に対する、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣを誘発しない／増大させない。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、例えば、抗原結合性分子が、Ｆｃ領域を欠く実施形態、または抗原結合性分子が、Ｆｃ媒介性抗体エフェクター機能を誘導することが可能ではないＦｃ領域を含む実施形態では、ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を誘導しない／増大させない。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞の数／比率を低減しない。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、（ｉ）ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害し、かつ、（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を誘導しない／増大させない。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、（ｉ）ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害し、かつ、（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ発現細胞の数／比率を低減しない。
ＶＩＳＴＡは、枯渇することが所望されない細胞により発現されるために、これは、特に、有利でありうる。例えば、ＶＩＳＴＡは、死滅させるか、または数／比率を低減することが所望されない免疫細胞（例えば、ある特定の種類のＴ細胞および樹状細胞）により、低レベルで発現される。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、例えば、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、陰性対照条件と比べて、エフェクター免疫細胞の数および／または活性を増大させることが可能である。説明を目的として述べると、本発明の抗原結合性分子は、エフェクター免疫細胞を、エフェクター免疫細胞の増殖および機能に対する、ＭＤＳＣ媒介性抑制から解放することが可能でありうる。一部の実施形態では、エフェクター免疫細胞は、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋ＣＴＬ）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＮＫ細胞、ＩＦＮγ産生細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、抗原経験Ｔ細胞、またはＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞でありうる。
細胞の数および比率は、例えば、細胞型の検出を可能とする抗体を使用するフローサイトメトリー解析により決定されうる。細胞分裂は、例えば、３Ｈ−チミジンの取込みについてのｉｎ ｖｉｔｒｏ解析により解析される場合もあり、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＦｕｌｃｈｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９９９）、７７（６）：５５９〜５６４において記載された、ＣＦＳＥ希釈アッセイにより解析される場合もある。エフェクター免疫細胞の活性は、このような活性の相関因子を測定することにより解析されうる。一部の実施形態では、エフェクター免疫細胞の活性は、例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、および／またはＩＬ−１７の産生の解析により決定されうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、エフェクター免疫細胞型の数を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において観察される数の、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させることが可能である。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、エフェクター免疫細胞活性の相関因子のレベルを、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において観察されるレベルの、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させることが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞により媒介される免疫抑制のレベルを減少させることが可能である。免疫抑制のレベルの変化は、例えば、Ｏｃｈｏａら、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ．、２００１年３月、２３３（３）：３９３〜３９９；ならびにＤｉｋａｌｏｖおよびＨａｒｒｉｓｏｎ、Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．、２０１４年１月１０日、２０（２）：３７２〜３８２において記載されている通り、ＶＩＳＴＡ発現細胞による、アルギナーゼ１の発現および／または反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の産生を測定する方法を使用して決定されうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、例えば、抗原提示についての適切なアッセイを使用して決定する場合、抗原提示細胞による抗原提示を増大させることが可能である。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、例えば、食作用のレベルについての適切なアッセイを使用して決定する場合、食細胞（例えば、好中球、単球、マクロファージ、マスト細胞、および／または樹状細胞）による食作用を増大させることが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、免疫細胞によるＩＬ−６の産生を増大させることが可能である。免疫細胞は、例えば、ＰＢＭＣ、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、または単球でありうる。一部の実施形態では、免疫細胞は、単球である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、例えば、ＬＰＳで刺激した後における免疫細胞による、ＩＬ−６の産生を増大させることが可能である。抗原結合性分子が、免疫細胞による、ＩＬ−６の産生を増大させる能力は、例えば、本明細書の実施例１０に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて解析されうる。このような方法は、単球（例えば、ＴＨＰ１細胞）を、ＬＰＳで刺激するステップと、刺激された細胞を、抗原結合性分子と共にインキュベートするステップとを含みうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、免疫細胞（例えば、ＬＰＳにより刺激されたＴＨＰ１細胞）による、ＩＬ−６の産生を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において観察されるレベルの、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させることが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の産生、ＩＦＮ−γの産生、および／またはＩＬ−１７の産生を増大させることが可能である。ＭＬＲアッセイは、Ｂｒｏｍｅｌｏｗら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００１年１月１日；２４７（１〜２）：１〜８（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）に記載される通りに、または本明細書の実施例に記載される通りに実施されうる。ＩＬ−２、ＩＦＮγ、および／またはＩＬ−１７の産生は、例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴなど、当業者に周知の抗体ベースの方法により解析される場合もあり、レポーターベースの方法により解析される場合もある。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＭＬＲアッセイにおける、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２の産生、ＩＦＮ−γの産生、および／またはＩＬ−１７の産生を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において観察されるレベルの、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させることが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、例えば、ＶＩＳＴＡ／ＶＩＳＴＡ発現細胞の存在下で、Ｔ細胞の増殖、ＩＦＮ−γの産生、および／またはＴＮＦａの産生を増大させることが可能である。抗原結合性分子は、例えば、本明細書の実施例に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、このような特性について評価されうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｔ細胞の増殖、ＩＦＮ−γの産生、および／またはＴＮＦａの産生（例えば、ＶＩＳＴＡ／ＶＩＳＴＡを発現する細胞の存在下における）を、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において観察されるレベルの、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させることが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）の増殖を、先行技術において開示されたＶＩＳＴＡ結合性抗体（例えば、例えば、ＷＯ２０１５／０９７５３６Ａ２において記載されたＶＳＴＢ１１２）より大きな程度へと増大させることが可能である。Ｔ細胞の増殖は、例えば、本明細書の実施例９に記載される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて評価される場合があり、アゴニスト性抗ＣＤ３抗体の存在下における培養により、Ｔ細胞増殖を刺激することを伴いうる。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、このようなアッセイにおける、Ｔ細胞の増殖を、先行技術のＶＩＳＴＡ結合性抗体（例えば、ＶＳＴＢ１１２）により誘導される増殖レベルの、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させることが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＴＨＰ１細胞による、ＩＬ−６の産生を、先行技術において開示されたＶＩＳＴＡ結合性抗体（例えば、ＷＯ２０１５／０９７５３６Ａ２において記載されたＶＳＴＢ１１２）より大きな程度へと増大させることが可能である。ＴＨＰ１細胞による、ＩＬ−６の産生は、例えば、本明細書の実施例１０に記載される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて評価される場合があり、ＴＨＰ１細胞を、ＬＰＳで刺激することを伴いうる。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、このようなアッセイにおける、ＩＬ−６の産生を、先行技術のＶＩＳＴＡ結合性抗体（例えば、ＶＳＴＢ１１２）により誘導されるレベルの、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させることが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、例えば、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、対照条件と比べて、免疫抑制細胞の数および／もしくは活性を低減し、免疫抑制細胞の増殖を阻害し、かつ／または細胞（例えば、ＣＤ４５＋細胞、例えば、腫瘍から得られたＣＤ４５＋細胞）集団内の、免疫抑制細胞の比率を低減することが可能である。
免疫抑制細胞は、例えば、ＶＩＳＴＡ発現細胞、Ａｒｇ１発現細胞、ＭＤＳＣ、顆粒球型ＭＤＳＣ（ｇ−ＭＤＳＣ）、または単球型ＭＤＳＣ（ｍ−ＭＤＳＣ）でありうる。
一部の実施形態では、数／活性／増殖／比率の低減は、抗原結合性分子の非存在下（または適切な対照抗原結合性分子の存在下）において観察される数／活性／増殖／比率の、１倍未満、例えば、≦０．９９倍、≦０．９５倍、≦０．９倍、≦０．８５倍、≦０．８倍、≦０．７５倍、≦０．７倍、≦０．６５倍、≦０．６倍、≦０．５５倍、≦０．５倍、≦０．４５倍、≦０．４倍、≦０．３５倍、≦０．３倍、≦０．２５倍、≦０．２倍、≦０．１５倍、≦０．１倍、≦０．０５倍、または≦０．０１倍への低減である。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｆｃ媒介性機能を伴わない機構により、免疫抑制細胞の数／活性／増殖／比率を低減することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｆｃ媒介性機能に依存せずに（すなわち、Ｆｃ領域に依存せずに）、免疫抑制細胞の数／活性／増殖／比率を低減することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣを伴わない機構により、免疫抑制細胞の数／活性／増殖／比率を低減することが可能である。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ発現細胞の枯渇を伴わない機構により、免疫抑制細胞の数／活性／増殖／比率を低減することが可能である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがんの発症および／または進行を阻害する。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、例えば、エフェクター免疫細胞により、がん細胞の殺滅の増大を引き起こす。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、例えば、適切な対照条件と比較した、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるがん細胞の数の低減を引き起こす。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、例えば、時間経過にわたり、腫瘍サイズ／容量を測定することにより決定される、腫瘍増殖を阻害する。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、抗原結合性分子で処置されたマウスにおける、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２３の血清レベルを増大させることが可能である。ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２３の血清レベルは、例えば、マウスから得られた血液試料に由来する血清についてのＥＬＩＳＡにより解析されうる。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子の投与は、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２３の血清レベルを、抗原結合性分子の非存在下において観察されるレベル（または適切な対照抗原結合性分子の投与後において観察されるレベル）の、１倍を超えて、例えば、≧１．０１倍、≧１．０２倍、≧１．０３倍、≧１．０４倍、≧１．０５倍、≧１．１倍、≧１．２倍、≧１．３倍、≧１．４倍、≧１．５倍、≧１．６倍、≧１．７倍、≧１．８倍、≧１．９倍、≧２倍、≧３倍、≧４倍、≧５倍、≧６倍、≧７倍、≧８倍、≧９倍、または≧１０倍へと増大させる。
本発明の抗原結合性分子は、ＣＴ２６細胞由来モデル、４Ｔ−１細胞由来モデル、ＬＬ２細胞由来モデル、Ｂ１６細胞由来モデル、またはＥＬ４細胞由来モデルなど、適切なｉｎ ｖｉｖｏモデル、例えば、細胞株由来異種移植モデルにおいて、がんの発症および／または進行を阻害する能力について解析されうる。がんは、ＶＩＳＴＡ発現細胞および／またはＭＤＳＣ（例えば、ＶＩＳＴＡを発現させるＭＤＳＣ、ＴＡＭ、好中球）が病理学的に関与するがんでありうる。ＭＤＳＣが「病理学的に関与する」がんは、ＭＤＳＣ、またはＭＤＳＣの数／比率の増大が、がんの発生、発症、もしくは進行、および／またはがんの、１つもしくは複数の症状の重症度と正に関連するがん、あるいはＭＤＳＣ、またはＭＤＳＣの数／比率の増大が、がんの発生、発症、または進行の危険性因子であるがんを含む。がんは、疾患の影響を受ける臓器／組織（例えば、疾患／状態の症状が顕在化する臓器／組織）内、または腫瘍内に、ＭＤＳＣを含みうる。
一部の実施形態では、本発明に従う抗原結合性分子の投与は、例えば、ＣＴ２６細胞、４Ｔ−１細胞、ＬＬ２細胞、Ｂ１６細胞、またはＥＬ４細胞に由来する異種移植モデルにおいて決定する場合、がんの発症／進行の阻害、がんの発生までの遅延／がんの発生の防止、腫瘍増殖の軽減／腫瘍増殖までの遅延／腫瘍増殖の防止、転移の軽減／転移までの遅延／転移の防止、がんの症状の重症度の軽減、がん細胞数の低減、腫瘍サイズ／体積の低減、および／または生存（例えば、無増悪生存期間）の延長のうちの１つまたは複数を引き起こしうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子の投与は、抗原結合性分子の投与の非存在下において（または適切な対照抗原結合性分子の投与後において）観察される腫瘍増殖の５％超、例えば、≧１０％、≧１５％、≧２０％、≧２５％、≧３０％、≧３５％、≧４０％、≧４５％、≧５０％、≧５５％、≧６０％、≧６５％、≧７０％、≧７５％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、または≧９５％を阻害することが可能である。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明はまた、本発明の抗原結合性分子またはポリペプチドを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供する。
ＣＡＲは、抗原結合およびＴ細胞活性化機能の両方をもたらす、組換え受容体である。ＣＡＲの構造および操作については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｄｏｔｔｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ（２０１４）、２５７（１）において総説されている。ＣＡＲは、細胞膜アンカー領域およびシグナル伝達領域へと連結された、抗原結合性領域を含む。任意選択のヒンジ領域は、抗原結合性領域と、細胞膜アンカー領域との分離をもたらすことが可能であり、可動性リンカーとして作用しうる。
本発明のＣＡＲは、本発明の抗原結合性分子を含むか、もしくはこれからなるか、または本発明に従うポリペプチドを含むか、もしくはこれからなる、抗原結合性領域を含む。
細胞膜アンカー領域は、ＣＡＲの、抗原結合性領域と、シグナル伝達領域との間にもたらされ、細胞外腔に抗原結合性領域を伴い、細胞内部にシグナル伝達領域を伴う、ＣＡＲの、ＣＡＲを発現する細胞の細胞膜へのアンカリングをもたらす。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ２８のうちの１つの、膜貫通領域のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれに由来するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる細胞膜アンカー領域を含む。本明細書で使用される、参照アミノ酸配列「に由来する」領域は、参照配列に対する、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性のうちの１つを有するアミノ酸配列を含む。
ＣＡＲのシグナル伝達領域は、Ｔ細胞の活性化を可能とする。ＣＡＲのシグナル伝達領域は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のリン酸化および活性化のための、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をもたらす、ＣＤ３−ζの細胞内ドメインのアミノ酸配列を含みうる。ＣＡＲでは、ＦｃγＲＩなど、他のＩＴＡＭ含有タンパク質の配列を含むシグナル伝達領域もまた利用されている（Ｈａｙｎｅｓら、２００１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６６（１）：１８２〜１８７）。ＣＡＲのシグナル伝達領域はまた、標的タンパク質への結合時における、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の活性化を容易とするように、共刺激分子のシグナル伝達領域に由来する、共刺激配列も含みうる。適切な共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２７を含む。場合によって、ＣＡＲは、異なる細胞内シグナル伝達経路の共刺激をもたらすように操作される。例えば、ＣＤ２８の共刺激と関連するシグナル伝達が、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（Ｐ１３Ｋ）経路を優先的に活性化させるのに対し、４−１ＢＢ媒介性シグナル伝達ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）アダプタータンパク質を介する。したがって、ＣＡＲのシグナル伝達領域は、場合によって、１つを超える共刺激分子のシグナル伝達領域に由来する共刺激配列を含有する。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、およびＣＤ２７のうちの１つまたは複数の細胞内ドメインのアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれに由来するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、１つまたは複数の共刺激配列を含む。
任意選択のヒンジ領域は、抗原結合性ドメインと、膜貫通ドメインとの分離をもたらすことが可能であり、可動性リンカーとして作用しうる。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１に由来しうる。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、このＩｇＧ１のヒンジ領域のアミノ酸配列を含むか、これからなるか、またはこれに由来するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるヒンジ領域を含む。
また、本発明に従うＣＡＲを含む細胞も提供される。本発明に従うＣＡＲは、ＣＡＲ発現免疫細胞、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＣＡＲ−ＮＫ細胞を作出するのに使用されうる。ＣＡＲの、免疫細胞への操作は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける培養時に実施されうる。
本発明のＣＡＲの抗原結合性領域は、例えば、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂなど、任意の適切なフォーマットでもたらされうる。
核酸およびベクター
本発明は、本発明に従う、抗原結合性分子、ポリペプチド、またはＣＡＲをコードする、１つの核酸または複数の核酸を提供する。
一部の実施形態では、核酸は、例えば、他の核酸から、精製または単離される場合もあり、天然に存在する生物学的素材から、精製または単離される場合もある。一部の実施形態では、核酸（複数可）は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むか、またはこれからなる。
本発明はまた、本発明に従う、１つの核酸または複数の核酸を含む、１つのベクターまたは複数のベクターも提供する。
ヌクレオチド配列は、ベクター、例えば、発現ベクター内に含有されうる。本明細書で使用される、「ベクター」とは、外因性核酸を、細胞へと導入するビヒクルとして使用される核酸分子である。ベクターは、細胞内で核酸を発現させるためのベクターでありうる。このようなベクターは、発現される配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含みうる。ベクターはまた、終止コドンおよび発現エンハンサーも含みうる。当技術分野で公知である、任意の、適切なベクター、プロモーター、エンハンサー、および終止コドンが、ペプチドまたはポリペプチドを、本発明に従うベクターから発現させるのに使用されうる。
「作動可能に連結された」という用語は、核酸配列の発現を、調節配列の影響下または制御下に置く（これにより、発現カセットを形成する）ように、選択された核酸配列と、調節的核酸配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）とが、共有結合的に連結された状況を含みうる。したがって、調節配列が、核酸配列の転写を実行することが可能な場合、調節配列は、選択された核酸配列に作動可能に連結されている。次いで、結果として得られる転写物（複数可）は、所望のペプチド（複数可）／ポリペプチド（複数可）へと翻訳されうる。
適切なベクターは、プラスミド、二元ベクター、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、ウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター）、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびヘルペスウイルスベクター）、トランスポゾンベースのベクター、および人工染色体（例えば、酵母人工染色体）を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、真核生物ベクター、例えば、真核細胞内のベクターからの、タンパク質の発現に必要なエレメントを含むベクターでありうる。一部の実施形態では、ベクターは、例えば、タンパク質の発現を駆動する、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＳＶ４０プロモーターを含む、哺乳動物ベクターでありうる。
本発明に従う抗原結合性分子の、構成要素であるポリペプチドは、複数の核酸のうちの、異なる核酸、または複数のベクターのうちの、異なるベクターによりコードされうる。
抗原結合性分子およびポリペプチドを含む／発現する細胞
本発明はまた、本発明に従う、抗原結合性分子、ポリペプチド、またはＣＡＲを含むか、またはこれを発現する細胞も提供する。また、本発明に従う１つの核酸、複数の核酸、１つのベクター、または複数のベクターを含むか、またはこれを発現する細胞も提供される。
細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞でありうる。哺乳動物は、霊長動物（アカゲザル、カニクイザル、非ヒト霊長動物、またはヒト）、または非ヒト哺乳動物（例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他の齧歯動物（ネズミ目内の任意の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、畜牛（ウシ、例えば、乳牛、またはウシ目内の任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目内の任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長動物）でありうる。
本発明はまた、本発明に従う核酸（複数可）またはベクター（複数可）を含む細胞を作製するための方法であって、本発明に従う１つの核酸、複数の核酸、１つのベクター、または複数のベクターを、細胞へと導入するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、本発明に従う、単離核酸（複数可）または単離ベクター（複数可）を、細胞へと導入するステップは、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、または形質導入（例えば、レトロウイルスによる形質導入）を含む。
本発明はまた、本発明に従う、抗原結合性分子、ポリペプチド、またはＣＡＲを発現する／含む細胞を作製するための方法であって、本発明に従う１つの核酸、複数の核酸、１つのベクター、または複数のベクターを、細胞へと導入するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、細胞を、細胞による、核酸（複数可）またはベクター（複数可）の発現にも適する条件下で培養するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施される。
本発明はまた、本発明に従う方法により得られるか、または得られうる細胞も提供する。
抗原結合性分子およびポリペプチドの作製
本発明に従う抗原結合性分子およびポリペプチドは、当業者に公知の、ポリペプチドを作製するための方法に従い調製されうる。
ポリペプチドは、化学合成、例えば、液相または固相合成により調製されうる。例えば、ペプチド／ポリペプチドは、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｃｈａｎｄｒｕｄｕら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１３）、１８：４３７３〜４３８８において記載された方法を使用して合成されうる。
代替的に、抗原結合性分子およびポリペプチドは、組換え発現によっても作製されうる。当技術分野では、それらのいずれもが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（４版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、２０１２；ならびにＮａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００８）、５（２）：１３５〜１４６において明示された分子生物学法など、ポリペプチドの組換え作製に適する分子生物学法が周知である。抗原結合性分子の組換え作製のための方法はまた、それらのいずれもが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｎｚｅｌら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１３）、４：２１７；ならびにＫｕｎｅｒｔおよびＲｅｉｎｈａｒｔ、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１６）、１００：３４５１〜３４６１においても記載されている。
場合によって、本発明の抗原結合性分子は、１つを超えるポリペプチド鎖から構成される。このような場合に、抗原結合性分子の作製は、抗原結合性分子を形成するのに、１つを超えるポリペプチドの転写および翻訳と、後続するポリペプチド鎖の会合とを含みうる。
本発明に従う組換え作製のために、ポリペプチドの発現に適する、任意の細胞が使用されうる。細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。一部の実施形態では、細胞は、古細菌または細菌の細胞などの原核細胞である。一部の実施形態では、細菌は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科の細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどのグラム陰性菌でありうる。一部の実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）、ＨｅＬａ、またはＣＯＳ細胞などの真核細胞である。一部の実施形態では、細胞は、一過性に、または安定的にポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞である。
場合によって、細胞は、一部の原核細胞は、真核細胞と同じフォールディングまたは翻訳後修飾を可能としないため、原核細胞ではない。加えて、真核細胞内では、極めて高度の発現レベルが可能であり、タンパク質は、適切なタグを使用する、真核細胞からの精製が容易である。タンパク質の、培地への分泌を増強する、特異的なプラスミドもまた利用されうる。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｚｅｍｅｌｌａら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ（２０１５）、１６（１７）：２４２０〜２４３１において記載されたシステムを使用する、無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）により調製されうる。
作製は、目的のポリペプチド（複数可）を発現するように修飾された、真核細胞の培養または発酵を伴いうる。培養または発酵は、栄養物、空気／酸素、および／または増殖因子の適切な供給がなされたバイオリアクター内で実施されうる。分泌されたタンパク質は、培養培地／発酵培養液を、細胞から分別し、タンパク質含有物を抽出し、個別のタンパク質を分離して、分泌されたポリペプチド（複数可）を単離することにより回収されうる。当業者には、培養、発酵、および分離法が周知であり、例えば、ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（４版；参照により、本明細書の上記に組み込まれた）において記載されている。
バイオリアクターは、細胞が培養されうる、１または複数の反応槽を含む。バイオリアクター内の培養は、反応物の、リアクターへの、持続的な流入と、培養された細胞の、リアクターからの、持続的な流出とにより、持続的に生じうる。代替的に、培養は、バッチ内で生じうる。バイオリアクターは、培養される細胞に、最適の条件がもたらされるように、ｐＨ、酸素、反応槽への流入および反応槽からの流出の流量、ならびに反応槽内の攪拌などの環境条件をモニタリングし、制御する。
抗原結合性分子／ポリペプチド（複数可）を発現する細胞の培養の後、目的のポリペプチド（複数可）は、単離されうる。当技術分野で公知の、細胞から、タンパク質を分離するための、任意の適切な方法が使用されうる。ポリペプチドを単離するために、細胞を、栄養培地から分離することが必要でありうる。目的のポリペプチド（複数可）が、細胞から分泌される場合、細胞は、分泌された目的のポリペプチド（複数可）を含有する培養培地から、遠心分離により分離されうる。目的のポリペプチド（複数可）が、細胞内に集まる場合、タンパク質の単離は、細胞を、細胞培養培地から分離する遠心分離、細胞ペレットの、溶解緩衝液による処理、および超音波処理、急速な凍結−融解、または浸透圧溶解による、細胞の破壊を含みうる。
次いで、目的のポリペプチド（複数可）を、他のタンパク質および非タンパク質成分を含有しうる、上清または培養物培地を単離することが所望されうる。タンパク質成分を、上清または培養培地から分離するための、一般的な手法は、沈殿である。可溶性が異なるタンパク質は、硫酸アンモニウムなど、異なる濃度の沈殿剤で沈殿する。例えば、低濃度の沈殿剤では、水溶性のタンパク質が抽出される。したがって、増大させる、異なる濃度の沈殿剤を添加することにより、可溶性の異なるタンパク質が、識別されうる。その後、分離されたタンパク質から、硫酸アンモニウムを除去するのに、透析が使用されうる。
当技術分野では、異なるタンパク質を識別するための、他の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズクロマトグラフィーが公知である。これらは、沈殿に対する代替法として使用される場合もあり、沈殿に後続して実施される場合もある。
目的のポリペプチド（複数可）が、培養物から単離されたら、ポリペプチド（複数可）を濃縮することが所望または必要でありうる。当技術分野では、限外濾過または凍結乾燥など、タンパク質を濃縮する、多数の方法が公知である。
組成物
本発明はまた、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸、発現ベクター、および細胞を含む組成物も提供する。
本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸、発現ベクター、および細胞は、臨床使用のための医薬組成物または医薬として製剤化される場合があり、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントを含みうる。組成物は、注射または注入を含みうる、局所、非経口、全身、腔内、静脈内、動脈内、筋内、髄腔内、眼内、結膜内、腫瘍内、皮下、皮内、髄腔内、経口、または経皮投与経路のために製剤化されうる。
適切な製剤は、滅菌媒体中または等張性媒体中の抗原結合性分子を含みうる。医薬および医薬組成物は、ゲル形態を含む、流体中で製剤化されうる。流体製剤は、ヒトまたは動物体内の、選択された領域への、注射または注入（例えば、カテーテルを介する）による投与のために製剤化されうる。
一部の実施形態では、組成物は、例えば、血管または腫瘍への、注射または注入のために製剤化される。
また、本発明に従い、本明細書で記載される、薬学的に有用な組成物を作製するための方法も提供され、このような作製法は、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、もしくは細胞を作製するステップ；本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、もしくは細胞を単離するステップ；および／または本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、もしくは細胞を、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または希釈剤と混合するステップから選択される、１つまたは複数のステップを含みうる。
例えば、本明細書で記載される、本発明のさらなる態様は、疾患／状態（例えば、がん）の処置における使用のための医薬または医薬組成物を製剤化または作製する方法であって、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、または細胞を、薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、または希釈剤と混合することにより、医薬組成物または医薬を製剤化するステップに関する。
治療適用および予防適用
本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸、発現ベクター、細胞、および組成物は、治療法および予防法において使用される。
本発明は、医学的処置または予防の方法における使用のための、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を提供する。また、疾患または状態を処置または防止するための医薬の製造における、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物の使用も提供される。また、疾患または状態を処置または防止する方法であって、対象へと、治療または予防有効量の、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を投与するステップを含む方法も提供される。
方法は、疾患／状態の発症もしくは進行の低減、疾患／状態の症状の緩和、または疾患／状態の病態の軽減に効果的でありうる。方法は、疾患／状態の進行を防止する、例えば、疾患／状態の増悪を防止するか、または疾患／状態の発症速度を遅くするのに効果的でありうる。一部の実施形態では、方法は、疾患／状態の改善、例えば、疾患／状態の症状の軽減、または疾患／状態の、重症度／活動性についての、他の一部の相関因子の低減をもたらしうる。一部の実施形態では、方法は、疾患／状態の後期（例えば、慢性期または転移）の発症を防止しうる。
本発明の物品は、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の数および／または活性の低減から、治療または予防利益を引き出す、任意の疾患／状態の処置／防止のために使用されうることが理解されるであろう。また、本発明の治療的および予防的有用性が、ＭＤＳＣおよび／または他のＶＩＳＴＡを発現する細胞、例えば、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）および好中球の数または活性の低減から利益を得る、任意の疾患／状態へと本質的に拡張されることも明らかであろう。ＶＩＳＴＡに対するアンタゴニズムは、エフェクター免疫細胞を、ＭＤＳＣおよび／または他のＶＩＳＴＡを発現する細胞による抑制から、効果的に解放する。
例えば、疾患／状態は、ＶＩＳＴＡ（例えば、ＭＤＳＣ）を発現する細胞が、病理学的に関与する疾患／状態、例えば、ＶＩＳＴＡ（例えば、ＭＤＳＣ）を発現する細胞の数／比率の増大が、疾患／状態の発生、発症、もしくは進行、および／または疾患／状態の１つもしくは複数の症状の重症度と正に関連するか、あるいはＶＩＳＴＡ（例えば、ＭＤＳＣ）を発現する細胞の数／比率の増大が、疾患／状態の、発生、発症、または進行の危険性因子である、疾患／状態でありうる。
一部の実施形態では、本発明に従い処置／防止される疾患／状態は、ＶＩＳＴＡ（例えば、ＭＤＳＣ）を発現する細胞の数／比率／活性の、例えば、疾患／状態の非存在下における、ＶＩＳＴＡ（例えば、ＭＤＳＣ）を発現する細胞の数／比率／活性と比較した増大により特徴付けられる疾患／状態である。
一部の実施形態では、対象は、例えば、末梢、もしくは疾患／状態の影響を受ける臓器／組織（例えば、疾患／状態の症状が顕在化する臓器／組織）における、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の、数／比率／活性の増大の検出に基づき、本明細書で記載される処置に選択される場合もあり、腫瘍内の、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣまたは腫瘍関連マクロファージ）の存在により、これに選択される場合もある。疾患／状態は、任意の組織または臓器または臓器系に影響を及ぼしうる。一部の実施形態では、疾患／状態は、いくつかの組織／臓器／臓器系に影響を及ぼしうる。
一部の実施形態では、対象は、対象が、末梢または臓器／組織における、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の数／比率／活性を、健常対象における、このような細胞の数／比率／活性と比べて増大させているという決定に基づき、本発明に従う治療／予防に選択される場合もあり、対象が、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）を含む腫瘍を有するという決定に基づき、これに選択される場合もある。
一部の実施形態では、処置／防止される疾患／状態は、がんである。
抗原結合性分子は、本発明の抗原結合性分子は、エフェクター免疫細胞を、ＭＤＳＣ媒介性抑制、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞による抑制から解放し、これにより、抗がん免疫応答を増強するのに有用であるため、がん一般の処置に有用であることが理解されるであろう。
がんは、任意の、望ましくない細胞増殖（または望ましくない細胞増殖により顕示される、任意の疾患）、新生物、または腫瘍でありうる。がんは、良性の場合もあり、悪性の場合もあり、原発性の場合もあり、続発性（転移性）の場合もある。新生物または腫瘍は、細胞の、任意の異常な増殖（ｇｒｏｗｔｈまたはｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）であることが可能であり、任意の組織内に位置しうる。がんは、例えば、副腎、副腎髄質、肛門、虫垂、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、盲腸、中枢神経系（脳を含むか、または除外する）、小脳、子宮頸部、結腸、十二指腸、子宮内膜、上皮細胞（例えば、腎臓上皮）、胆嚢、食道、神経膠細胞、心臓、回腸、空腸、腎臓、涙腺、喉頭、肝臓、肺、リンパ、リンパ節、リンパ芽球、顎、縦隔、腸間膜、子宮筋層、鼻咽頭、網、口腔、卵巣、膵臓、耳下腺、末梢神経系、腹膜、胸膜、前立腺、唾液腺、Ｓ字結腸、皮膚、小腸、軟部組織、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、舌、扁桃腺、気管、子宮、外陰、および／または白血球に由来する組織／細胞のがんでありうる。
処置される腫瘍は、神経系腫瘍の場合もあり、非神経系腫瘍の場合もある。神経系腫瘍、例えば、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、星状細胞腫、および希突起神経膠腫は、中枢神経系に由来する場合もあり、末梢神経系に由来する場合もある。非神経系がん／腫瘍は、他の任意の非神経組織に由来する場合があり、例は、黒色腫、中皮腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、肝がん、類表皮癌、前立腺癌、乳がん、肺がん、結腸がん、卵巣がん、膵がん、胸腺癌、ＮＳＣＬＣ、血液がん、および肉腫を含む。
ＭＤＳＣは、進行性結腸直腸がんにおいて上昇する（Ｔｏｏｒら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１６、７：５６０）。ＭＤＳＣはまた、乳がんにおいても観察され、末梢血中のＭＤＳＣの百分率は、後期乳がんを伴う患者において増大する（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．、２０１３年７月、１４０（１）：１３〜２１）。ＭＤＳＣの存在度はまた、充実性腫瘍における予後不良とも相関し（Ｃｈａｒｏｅｎｔｏｎｇら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、２０１７年１月３日、１８（１）：２４８〜２６２）、ＭＤＳＣは、肝がんモデルにおいてエンリッチされる（Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．（２０１０）、８７（４）：７１３〜２５）。前立腺癌および乳癌、黒色腫、結腸直腸がん、ならびにＬｅｗｉｓ肺癌は、ＭＤＳＣを誘引するケモカインを産生し、免疫抑制に寄与することが報告されており（Ｕｍａｎｓｋｙら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）（２０１６）、４（４）：３６）、膵がん患者におけるＭＤＳＣは、腫瘍負荷と正に相関する（Ｘｕら、Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ Ｐａｎｃｒｅａｔ Ｄｉｓ Ｉｎｔ．（２０１６）、１５（１）：９９〜１０５）。ＶＩＳＴＡはまた、卵巣がん（例えば、ＵＳ９，６３１，０１８Ｂ２を参照されたい）およびリンパ腫（例えば、ＷＯ２０１７／０２３７４９Ａ１を参照されたい）の処置のための標的であることも報告されている。
Ｂｌａｎｄｏら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（２０１９）、１１６（５）：１６９２〜１６９７は、ＶＩＳＴＡ発現骨髄細胞の、膵がんへの著明な浸潤について最近報告し、前立腺がんでは、ＣＴＬＡ４アンタゴニストによる処置後には、ＶＩＳＴＡ発現骨髄細胞の拡大が観察され、黒色腫では、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストによる処置の前後いずれにおいてもＶＩＳＴＡ発現骨髄細胞の拡大が観察されることを報告した。
一部の実施形態では、がんは、ＶＩＳＴＡを発現する細胞を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現する細胞の浸潤を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現するがん細胞を含むがん、血液がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、中皮腫、充実性腫瘍、肺がん、非小細胞肺癌、胃がん、胃癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、子宮がん、子宮体内膜癌、乳がん、トリプルネガティブ浸潤性乳癌、肝がん、肝細胞癌、膵がん、膵管腺癌、甲状腺がん、胸腺腫、皮膚がん、黒色腫、皮膚黒色腫、腎がん、腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、卵巣がん、卵巣癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、前立腺がん、および／または前立腺腺癌から選択される。
一部の実施形態では、がんは、結腸直腸がん（例えば、結腸癌、結腸腺癌）、膵がん、乳がん、肝がん、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、白血病（例えば、Ｔ細胞白血病）、リンパ腫、黒色腫、胸腺腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および／または充実性腫瘍である。
処置／防止は、がんの症状の発症／進行を遅延させる／防止すること、がんの症状の重症度を軽減すること、がんの細胞の生存期間／増殖／浸潤／転移を低減すること、がんの細胞の数を低減すること、および／または対象の生存期間を延長することのうちの１つまたは複数を目標としうる。
一部の実施形態では、処置／防止されるがんは、ＶＩＳＴＡを発現する細胞を含む。一部の実施形態では、処置／防止されるがんは、ＶＩＳＴＡを発現するがん細胞を含む。一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡを発現する細胞は、ＭＤＳＣ（例えば、ｇ−ＭＤＳＣおよび／またはｍ−ＭＤＳＣ）である。一部の実施形態では、がんは、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）を含む腫瘍を含む。一部の実施形態では、処置／防止されるがんは、ＭＤＳＣを含む腫瘍を含む。一部の実施形態では、処置／防止されるがんは、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の浸潤を含む。一部の実施形態では、処置／防止されるがんは、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の浸潤を呈する腫瘍を含む。
一部の実施形態では、処置／防止されるがんは、ＭＤＳＣを、１％を超えて、例えば、≧２％、≧５％、≧１０％、≧１５％、≧２０％、≧２５％、または≧３０％含む（例えば、腫瘍の免疫プロファイリングにより決定する場合）、ＣＤ４５＋細胞の集団を含む腫瘍を含む。
一部の実施形態では、対象は、例えば、対象から得られた試料中の、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）を含むがんの検出、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）を含む腫瘍の検出に基づき、本明細書で記載される処置に選択されうる。
一部の実施形態では、ＶＩＳＴＡ発現細胞が、病理学的に関与する疾患／状態は、感染性疾患、例えば、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫感染症である。一部の実施形態では、慢性／遷延性感染症を処置することは、例えば、このような感染症が、Ｔ細胞の機能不全またはＴ細胞の疲弊と関連する場合、特に所望されうる。Ｔ細胞の疲弊は、多くの慢性感染症（ウイルス、細菌、および寄生虫を含む）、ならびにがんにおいて生じる、Ｔ細胞の機能不全状態であることが十分に確立されている（Ｗｈｅｒｒｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２巻、６号、４９２〜４９９頁、２０１１年６月）。
処置されうる細菌感染症の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属種、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｌｏｅｒａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｅｒｗｉｎａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属種、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、抗酸菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによる感染を含む。例えば、細菌感染症は、敗血症または結核でありうる。処置されうるウイルス感染症の例は、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス、およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染を含む。処置されうる真菌の感染症の例は、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属種、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種、Ｃａｎｄｉｄａ属種、およびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ属種による感染を含む。真菌感染症は、真菌性敗血症またはヒストプラズマ症でありうる。処置されうる寄生虫感染症の例は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ属種（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、またはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ ｃｈａｂａｕｄｉ）による感染を含む。寄生虫感染症は、マラリア、リーシュマニア症、およびトキソプラズマ症などの疾患でありうる。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、Ｆｃ領域媒介性エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ）を伴わない分子機構を介して、その治療／予防効果を及ぼす。一部の実施形態では、分子機構は、抗原結合性分子の、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、およびＦｃγＲＩＩＩｂのうちの１つまたは複数）への結合を伴わない。一部の実施形態では、分子機構は、抗原結合性分子の、補体タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）への結合を伴わない。
一部の実施形態（例えば、抗原結合性分子が、Ｆｃ領域を欠く実施形態、または抗原結合性分子が、Ｆｃ媒介性抗体エフェクター機能を誘導することが可能ではないＦｃ領域を含む実施形態）では、処置は、ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を誘導しない／増大させない。一部の実施形態では、処置は、ＶＩＳＴＡ発現細胞の数／比率を低減しない。
一部の実施形態では、処置は、（ｉ）ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害し、かつ、（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ発現細胞の殺滅を誘導しない／増大させない。一部の実施形態では、処置は、（ｉ）ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害し、かつ、（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ発現細胞の数／比率を低減しない。
本発明の物品の投与は、好ましくは、「治療有効」量または「予防有効」量であり、これは、対象に対して、治療または予防利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量、および速度、ならびに投与の時間経過は、疾患／状態の性質および重症度、ならびに投与される、特定の物品に依存するであろう。処置の処方、例えば、投与量についての決定などは、一般的な従事者および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的に、処置される疾患／障害、個々の対象の状態、送達部位、投与法、および従事者に公知の他の因子を考慮に入れる。上記で言及された技法およびプロトコールの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ刊において見出されうる。
投与は、処置される状態に応じて、単独でなされる場合もあり、他の処置と同時に、または逐次的に、組み合わせてなされる場合もある。本明細書で記載される抗原結合性分子または組成物と、治療剤とは、同時に投与される場合もあり、逐次的に投与される場合もある。
一部の実施形態では、方法は、例えば、がんの処置／防止のための、さらなる治療的または予防的介入を含む。一部の実施形態では、治療的または予防的介入は、化学療法、免疫療法、放射線治療、手術、ワクチン接種、および／またはホルモン療法から選択される。一部の実施形態では、治療的または予防的介入は、白血球除去療法を含む。一部の実施形態では、治療的または予防的介入は、幹細胞移植を含む。
一部の実施形態では、抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、またはＢＴＬＡである。一部の実施形態では、抗原結合性分子は、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することが可能な薬剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、共刺激受容体は、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８６、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、またはＩＣＯＳである。
したがって、本発明は、本発明に従う物品（例えば、本発明に従う抗原結合性分子）と、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤とを含む組成物を提供する。また、本発明の物品と、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することが可能な薬剤とを含む組成物も提供される。また、本明細書で記載される疾患／状態の、医学的な処置および予防の方法における、このような組成物の使用も提供される。
また、本明細書で記載される疾患／状態を処置／防止するための方法であって、本発明に従う物品（例えば、本発明に従う抗原結合性分子）と、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤とを投与するステップを含む方法も提供される。また、本明細書で記載される疾患／状態を処置／防止するための方法であって、本発明に従う物品（例えば、本発明に従う抗原結合性分子）と、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することが可能な薬剤とを投与するステップを含む方法も提供される。
当技術分野では、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤が公知であり、例えば、免疫チェックポイント分子、またはそれらに対するリガンドに結合し、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な抗体を含む。免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な、他の薬剤は、免疫チェックポイント分子、または免疫チェックポイント分子に対するリガンドの、遺伝子／タンパク質の発現を低減すること（例えば、免疫チェックポイント分子／リガンドをコードする遺伝子（複数可）の転写を阻害すること、免疫チェックポイント分子／リガンドをコードするＲＮＡの転写後プロセシングを阻害すること、免疫チェックポイント分子／リガンドをコードするＲＮＡの安定性を低減すること、免疫チェックポイント分子／リガンドをコードするＲＮＡの分解を促進すること、免疫チェックポイント分子／リガンドの翻訳後プロセシングを阻害すること、免疫チェックポイント分子／リガンドの安定性を低減すること、または免疫チェックポイント分子／リガンドの分解を促進することを介して）が可能な薬剤、および低分子阻害剤を含む。
当技術分野では、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することが可能な薬剤が公知であり、例えば、共刺激受容体に結合し、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を誘発するか、または増大させることが可能なアゴニスト抗体を含む。共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進することが可能な、他の薬剤は、共刺激受容体、または共刺激受容体に対するリガンドの、遺伝子／タンパク質の発現を増大させる（例えば、共刺激受容体／リガンドをコードする遺伝子（複数可）の転写を促進すること、共刺激受容体／リガンドをコードするＲＮＡの転写後プロセシングを促進すること、共刺激受容体／リガンドをコードするＲＮＡの安定性を増大させること、共刺激受容体／リガンドをコードするＲＮＡの分解を阻害すること、共刺激受容体／リガンドの翻訳後プロセシングを促進すること、共刺激受容体／リガンドの安定性を増大させること、または共刺激受容体／リガンドの分解を阻害することを介して）ことが可能な薬剤、および低分子アゴニストを含む。
ＶＩＳＴＡ発現ＭＤＳＣによる免疫抑制は、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤による処置の失敗、およびこれに対する耐性の発生に関与している。Ｇａｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１７）、２３：５５１〜５５５は、最近、ＶＩＳＴＡが、イピリムマブ（すなわち、抗ＣＴＬＡ−４抗体）療法の後に、前立腺腫瘍における代償性阻害経路でありうることを示唆した。
特定の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＰＤ−１により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤と組み合わせて投与される。ＰＤ−１により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、ＰＤ−１ターゲティング剤またはＰＤ−Ｌ１ターゲティング剤でありうる。ＰＤ−１により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗体でありうる。一部の実施形態では、薬剤は、アンタゴニスト性抗ＰＤ−１抗体である。一部の実施形態では、薬剤は、アンタゴニスト性抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＣＴＬＡ−４により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤と組み合わせて投与される。ＣＴＬＡ−４により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、ＣＴＬＡ−４ターゲティング剤、またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６など、ＣＴＬＡ−４に対するリガンドに対してターゲティングされた薬剤でありうる。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８０またはＣＤ８６に結合し、ＣＴＬＡ−４媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗体でありうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＬＡＧ−３により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤と組み合わせて投与される。ＬＡＧ−３により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、ＬＡＧ−３ターゲティング剤、またはＭＨＣクラスＩＩなど、ＬＡＧ−３に対するリガンドに対してターゲティングされた薬剤でありうる。一部の実施形態では、ＬＡＧ−３により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、例えば、ＬＡＧ−３またはＭＨＣクラスＩＩに結合し、ＬＡＧ−３媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗体でありうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＴＩＭ−３により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤と組み合わせて投与される。ＴＩＭ−３により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、ＴＩＭ−３ターゲティング剤、またはガレクチン９など、ＴＩＭ−３に対するリガンドに対してターゲティングされた薬剤でありうる。一部の実施形態では、ＴＩＭ−３により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、例えば、ＴＩＭ−３またはガレクチン９に結合し、ＴＩＭ−３媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗体でありうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＴＩＧＩＴにより媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤と組み合わせて投与される。ＴＩＧＩＴにより媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、ＴＩＧＩＴターゲティング剤、またはＣＤ１１３、ＣＤ１１２、もしくはＣＤ１５５など、ＴＩＧＩＴに対するリガンドに対してターゲティングされた薬剤でありうる。一部の実施形態では、ＴＩＧＩＴにより媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、例えば、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＣＤ１１２、またはＣＤ１５５に結合し、ＴＩＧＩＴ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗体でありうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子は、ＢＴＬＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤と組み合わせて投与される。ＢＴＬＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、ＢＴＬＡターゲティング剤、またはＨＶＥＭなど、ＢＴＬＡに対するリガンドに対してターゲティングされた薬剤でありうる。一部の実施形態では、ＢＴＬＡにより媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤は、例えば、ＢＴＬＡまたはＨＶＥＭに結合し、ＢＴＬＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗体でありうる。
一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子と、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤（例えば、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１）との組合せを利用する方法は、いずれかの薬剤が、単剤療法として使用される場合に観察される効果と比較した、処置効果の改善をもたらす。一部の実施形態では、本発明の抗原結合性分子と、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤（例えば、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１）との組合せは、相乗的（すなわち、相加効果を超える）処置効果をもたらす。
一部の実施形態では、（ｉ）本発明の抗原結合性分子と、（ｉｉ）免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１）により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤とを含む組合せによる処置は、
単独で使用された、組合せの一方の構成要素について観察される処置効果と比較した、処置効果の改善；
単独で使用された、組合せの一方の構成要素について観察される処置効果と比較して、相乗的（すなわち、相加効果を超える）である処置効果；
単独で使用された、組合せの一方の構成要素による腫瘍増殖の阻害と比較した、腫瘍増殖の阻害の増大；
単独で使用された、組合せの一方の構成要素による腫瘍増殖の阻害と比較して、相乗的（すなわち、相加効果を超える）である腫瘍増殖の阻害；
単独で使用された、組合せの一方の構成要素による免疫抑制細胞の数／活性の低減と比較して大きな、免疫抑制細胞の数／活性の低減；
単独で使用された、組合せの一方の構成要素による免疫抑制細胞の数／活性の低減と比較して、相乗的（すなわち、相加効果を超える）である免疫抑制細胞の数／活性の低減；
単独で使用された、組合せの一方の構成要素による免疫抑制細胞の増殖の低減と比較して大きな、免疫抑制細胞の増殖の低減；
単独で使用された、組合せの一方の構成要素による免疫抑制細胞の増殖の低減と比較して、相乗的（すなわち、相加効果を超える）である免疫抑制細胞の増殖の低減；
単独で使用された、組合せの一方の構成要素による免疫抑制細胞の比率の低減と比較して、細胞（例えば、ＣＤ４５＋細胞、例えば、腫瘍から得られたＣＤ４５＋細胞）集団内の、大きな免疫抑制細胞の比率活性の低減；および
単独で使用された、組合せの一方の構成要素による免疫抑制細胞の比率の低減と比較して、相乗的（すなわち、相加効果を超える）である細胞（例えば、ＣＤ４５＋細胞、例えば、腫瘍から得られたＣＤ４５＋細胞）集団内の、免疫抑制細胞の比率の低減
のうちの１つまたは複数と関連しうる。
同時的投与とは、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物と、治療剤との、併せた投与、例えば、両方の薬剤を含有する医薬組成物（組合せ調製物）としての投与、または互いの直後における、任意選択で、同じ投与経路を介する、例えば、同じ動脈、静脈、または他の血管への投与を指す。逐次的投与とは、抗原結合性分子／組成物または治療剤のうちの１つの投与に後続する、所与の時間間隔の後における、他の薬剤の、別個の投与を指す。２つの薬剤が、同じ経路により投与されることは、要求されないが、一部の実施形態では、これが該当する。時間間隔は、任意の時間間隔でありうる。
化学療法および放射線療法は、それぞれ、薬物またはイオン化放射線（例えば、Ｘ線またはγ線を使用する放射線療法）によるがんの処置を指す。薬物は、化学的実体、例えば、低分子医薬の、抗生剤、ＤＮＡ挿入剤、タンパク質阻害剤（例えば、キナーゼ阻害剤）、または生物学的薬剤、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質でありうる。薬物は、医薬組成物または医薬として製剤化されうる。製剤は、１つまたは複数の薬物（例えば、１つまたは複数の活性の薬剤）を、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と併せて含みうる。
処置は、１つを超える薬物の投与を伴いうる。薬物は、処置される状態に応じて、単独で投与される場合もあり、他の処置と、同時に、または逐次的に組み合わせて投与される場合もある。例えば、化学療法は、それらのうちの１つまたは複数が、がんを処置することを意図されうる、２つ薬物の投与を伴う併用療法でありうる。
化学療法は、１つまたは複数の投与経路、例えば、非経口、静脈内注射、経口、皮下、皮内、または腫瘍内の投与経路により投与されうる。
化学療法は、処置レジメに従い投与されうる。処置レジメは、医師または医療従事者により作成されうる、化学療法投与についての、所定の時程表、計画、スキーム、またはスケジュールであることが可能であり、処置を要求する患者に適するように、微調整されうる。処置レジメは、患者へと投与される化学療法の種類；各薬物の用量または放射線の線量；投与の間の時間間隔；各処置の長さ；存在する場合、任意の休薬日の数および性質などのうちの１つまたは複数を指し示しうる。併用療法では、各薬物が、どのようにして投与されるべきであるのかを指し示す、単一の処置レジメが提示されうる。
化学療法薬は、アベマシクリブ、アビラテロン酢酸塩、アビトレキサート（メトトレキサート）、Ａｂｒａｘａｎｅ（パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ−ＰＣ、ＡＣ、アカラブルチニブ、ＡＣ−Ｔ、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（ブレンツキシマブ・ベドチン）、ＡＤＥ、Ａｄｏ−トラスツズマブ・エムタンシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アファチニブジマレイン酸塩、アフィニトール（エベロリムス）、Ａｋｙｎｚｅｏ（ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｄａｒａ（イミキモド）、アルデスロイキン、Ａｌｅｃｅｎｓａ（アレクチニブ）、アレクチニブ、アレムツズマブ、Ａｌｉｍｔａ（ペメトレキセド二ナトリウム）、Ａｌｉｑｏｐａ（コパンリシブ塩酸塩）、Ａｌｋｅｒａｎ注射剤（メルファラン塩酸塩）、Ａｌｋｅｒａｎ錠（メルファラン）、Ａｌｏｘｉ（パロノセトロン塩酸塩）、Ａｌｕｎｂｒｉｇ（ブリガチニブ）、Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ（クロランブシル）、Ａｍｂｏｃｌｏｒｉｎ（クロランブシル）、アミホスチン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、Ａｒｅｄｉａ（パミドロネート二ナトリウム）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（アナストロゾール）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（エキセメスタン）、Ａｒｒａｎｏｎ（ネララビン）、三酸化ヒ素、Ａｒｚｅｒｒａ（オファツムマブ）、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のアスパラギナーゼ、アテゾリズマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）、アベルマブ、アキシカブタゲン・シロロイセル、アキシチニブ、アザシチジン、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（アベルマブ）、ＢＥＡＣＯＰＰ、Ｂｅｃｅｎｕｍ（カルムスチン）、Ｂｅｌｅｏｄａｑ（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、Ｂｅｓｐｏｎｓａ（イノツズマブ・オゾガマイシン）、ベバシズマブ、ベキサロテン、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブおよびヨウ素Ｉ−１３１トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、Ｂｏｓｕｌｉｆ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、ブリガチニブ、ＢｕＭｅｌ、ブスルファン、Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（ブスルファン）、カバジタキセル、Ｃａｂｏｍｅｔｙｘ（カボザンチニブ−Ｓ−リンゴ酸塩）、カボザンチニブ−Ｓ−リンゴ酸塩、ＣＡＦ、Ｃａｌｑｕｅｎｃｅ（アカラブルチニブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、Ｃａｒａｃ（外用フルオロウラシル）、カルボプラチン、カルボプラチン−ＴＡＸＯＬ、カルフィルゾミブ、Ｃａｒｍｕｂｒｉｓ（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント剤、Ｃａｓｏｄｅｘ（ビカルタミド）、ＣＥＭ、Ｃｅｒｉｔｉｎｉｂ、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（ダウノルビシン塩酸塩）、Ｃｅｒｖａｒｉｘ（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、ＣＥＶ、クロランブシル、クロランブシル−ＰＲＥＤＮＩＳＯＮＥ、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラドリビン、Ｃｌａｆｅｎ（シクロホスファミド）、クロファラビン、Ｃｌｏｆａｒｅｘ（クロファラビン）、Ｃｌｏｌａｒ（クロファラビン）、ＣＭＦ、コビメチニブ、Ｃｏｍｅｔｒｉｑ（カボザンチニブ−Ｓ−リンゴ酸塩）、コパンリシブ塩酸塩、ＣＯＰＤＡＣ、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ−ＡＢＶ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（ダクチノマイシン）、Ｃｏｔｅｌｌｉｃ（コビメチニブ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、Ｃｙｆｏｓ（イホスファミド）、Ｃｙｒａｍｚａ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビンリポソーム剤、Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（シタラビン）、Ｃｙｔｏｘａｎ（シクロホスファミド）、ダラフェニブ、ダカルバジン、Ｄａｃｏｇｅｎ（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、Ｄａｒｚａｌｅｘ（ダラツムマブ）、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩およびシタラビンリポソーム剤、デシタビン、デフィブロチドナトリウム、Ｄｅｆｉｔｅｌｉｏ（デフィブロチドナトリウム）、デガレリクス、デニロイキンディフチトクス、デノスマブ、ＤｅｐｏＣｙｔ（シタラビンリポソーム剤）、デキサメタゾン、デキスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、Ｄｏｘｉｌ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム剤）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム剤、Ｄｏｘ−ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム剤）、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、デュルバルマブ、Ｅｆｕｄｅｘ（外用フルオロウラシル）、Ｅｌｉｔｅｋ（ラスブリカーゼ）、Ｅｌｌｅｎｃｅ（エピルビシン塩酸塩）、エロツズマブ、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、Ｅｍｅｎｄ（アプレピタント）、Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ（エロツズマブ）、エナシデニブメシル酸塩、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）、エリブリンメシル酸塩、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ（ビスモデジブ）、エルロチニブ塩酸塩、Ｅｒｗｉｎａｚｅ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のアスパラギナーゼ）、Ｅｔｈｙｏｌ（アミホスチン）、Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ（エトポシドリン酸塩）、エトポシド、エトポシドリン酸塩、Ｅｖａｃｅｔ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム剤）、エベロリムス、Ｅｖｉｓｔａ（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｅｖｏｍｅｌａ（メルファラン塩酸塩）、エキセメスタン、５−ＦＵ（フルオロウラシル注射）、５−ＦＵ（外用フルオロウラシル）、Ｆａｒｅｓｔｏｎ（トレミフェン）、Ｆａｒｙｄａｋ（パノビノスタット）、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（フルベストラント）、ＦＥＣ、Ｆｅｍａｒａ（レトロゾール）、フィルグラスチム、Ｆｌｕｄａｒａ（フルダラビンリン酸塩）、フルダラビンリン酸塩、Ｆｌｕｏｒｏｐｌｅｘ（外用フルオロウラシル）、フルオロウラシル注射剤、外用フルオロウラシル、フルタミド、Ｆｏｌｅｘ（メトトレキサート）、Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ（メトトレキサート）、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＩＲＩ−ベバシズマブ、ＦＯＬＦＩＲＩ−セツキシマブ、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ、Ｆｏｌｏｔｙｎ（プララトレキサート）、ＦＵ−ＬＶ、フルベストラント、Ｇａｒｄａｓｉｌ（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、Ｇａｒｄａｓｉｌ９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、Ｇａｚｙｖａ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン−シスプラチン、ゲムシタビン−オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン塩酸塩）、Ｇｉｌｏｔｒｉｆ（アファチニブジマレイン酸塩）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（イマチニブメシル酸塩）、Ｇｌｉａｄｅｌ（カルムスチンインプラント剤）、Ｇｌｉａｄｅｌウェハー剤（カルムスチンインプラント剤）、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、Ｈａｌａｖｅｎ（エリブリンメシル酸塩）、Ｈｅｍａｎｇｅｏｌ（プロプラノロール塩酸塩）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン、組換えＨＰＶ九価ワクチン、組換えＨＰＶ四価ワクチン、組換えＨｙｃａｍｔｉｎ（トポテカン塩酸塩）、Ｈｙｄｒｅａ（ヒドロキシウレア）、ヒドロキシウレア、Ｈｙｐｅｒ−ＣＶＡＤ、Ｉｂｒａｎｃｅ（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、Ｉｂｒｕｔｉｎｉｂ、ＩＣＥ、Ｉｃｌｕｓｉｇ（ポナチニブ塩酸塩）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、Ｉｄｈｉｆａ（エナシデニブメシル酸塩）、Ｉｆｅｘ（イホスファミド）、イホスファミド、Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｕｍ（イホスファミド）、ＩＬ−２（アルデスロイキン）、イマチニブメシル酸塩、Ｉｍｂｒｕｖｉｃａ（イブルチニブ）、Ｉｍｆｉｎｚｉ（デュルバルマブ）、イミキモド、Ｉｍｌｙｇｉｃ（タリモジェン・ラヘルパレプベク）、Ｉｎｌｙｔａ（アキシチニブ）、イノツズマブ・オゾガマイシン、インターフェロンアルファ−２ｂ、組換え、インターロイキン２（アルデスロイキン）、Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（組換えインターフェロンアルファ−２ｂ）、ヨウ素Ｉ−１３１トシツモマブおよびトシツモマブ、イピリムマブ、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩リポソーム剤、Ｉｓｔｏｄａｘ（ロミデプシン）、イキサベピロン、イキサゾミブクエン酸塩、Ｉｘｅｍｐｒａ（イキサベピロン）、Ｊａｋａｆｉ（ルキソリチニブリン酸塩）、ＪＥＢ、Ｊｅｖｔａｎａ（カバジタキセル）、Ｋａｄｃｙｌａ（Ａｄｏ−トラスツズマブ・エムタンシン）、Ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ（ラロキシフェン塩酸塩）、Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（パリフェルミン）、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（ペムブロリズマブ）、Ｋｉｓｑａｌｉ（リボシクリブ）、Ｋｙｍｒｉａｈ（チサゲンレクロイセル）、Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（カルフィルゾミブ）、ランレオチド酢酸塩、ラパチニブジトシル酸塩、Ｌａｒｔｒｕｖｏ（オララツマブ）、レナリドミド、レンバチニブメシル酸塩、Ｌｅｎｖｉｍａ（レンバチニブメシル酸塩）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（クロランブシル）、ロイプロリド酢酸塩、Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（クラドリビン）、Ｌｅｖｕｌａｎ（アミノレブリン酸）、Ｌｉｎｆｏｌｉｚｉｎ（クロランブシル）、ＬｉｐｏＤｏｘ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム剤）、ロムスチン、Ｌｏｎｓｕｒｆ（トリフルリジンおよびチピラシル塩酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ（ロイプロリド酢酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎデポ剤（ロイプロリド酢酸塩）、Ｌｕｐｒｏｎ小児用デポ剤（ロイプロリド酢酸塩）、Ｌｙｎｐａｒｚａ（オラパリブ）、Ｍａｒｑｉｂｏ（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム剤）、Ｍａｔｕｌａｎｅ（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲストロール酢酸塩、Ｍｅｋｉｎｉｓｔ（トラメチニブ）、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、Ｍｅｓｎｅｘ（メスナ）、Ｍｅｔｈａｚｏｌａｓｔｏｎｅ（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メチルナルトレキソン臭化物、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、Ｍｅｘａｔｅ−ＡＱ（メトトレキサート）、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、Ｍｏｚｏｂｉｌ（プレリキサフォル）、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（メクロレタミン塩酸塩）、Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（マイトマイシンＣ）、Ｍｙｌｅｒａｎ（ブスルファン）、Ｍｙｌｏｓａｒ（アザシチジン）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネシツムマブ、ネララビン、Ｎｅｏｓａｒ（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、Ｎｅｒｌｙｎｘ（ネラチニブマレイン酸塩）、ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペグフィルグラスチム）、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（フィルグラスチム）、Ｎｅｘａｖａｒ（ソラフェニブトシル酸塩）、Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（ニルタミド）、ニロチニブ、ニルタミド、Ｎｉｎｌａｒｏ（イキサゾミブクエン酸塩）、ニラパリブトシル酸塩一水和物、ニボルマブ、Ｎｏｌｖａｄｅｘ（タモキシフェンクエン酸塩）、Ｎｐｌａｔｅ（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、Ｏｄｏｍｚｏ（ソニデジブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペスクシネート、Ｏｎｃａｓｐａｒ（ペガスパルガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、Ｏｎｉｖｙｄｅ（イリノテカン塩酸塩リポソーム剤）、Ｏｎｔａｋ（デニロイキンディフチトクス）、Ｏｐｄｉｖｏ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルのアルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩およびネツピタント、パミドロネート二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、Ｐａｒａｐｌａｔ（カルボプラチン）、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ＰＣＶ、ＰＥＢ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、Ｐｅｇインターフェロンアルファ−２ｂ、ＰＥＧ





−Ｉｎｔｒｏｎ（Ｐｅｇインターフェロンアルファ−２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（シスプラチン）、Ｐｌａｔｉｎｏｌ−ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサフォル、ポマリドミド、Ｐｏｍａｌｙｓｔ（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（ネシツムマブ）、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（アルデスロイキン）、Ｐｒｏｌｉａ（デノスマブ）、Ｐｒｏｍａｃｔａ（エルトロンボパグオラミン）、プロプラノロール塩酸塩、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（シプリューセルＴ）、Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（メルカプトプリン）、Ｐｕｒｉｘａｎ（メルカプトプリン）、［未記載］、ラジウム２２３二塩化物、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ−ＣＨＯＰ、Ｒ−ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンアルファ−２ｂ、レゴラフェニブ、Ｒｅｌｉｓｔｏｒ（メチルナルトレキソン臭化物）、Ｒ−ＥＰＯＣＨ、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（レナリドミド）、Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ（メトトレキサート）、リボシクリブ、Ｒ−ＩＣＥ、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ）、ＲｉｔｕｘａｎＨｙｃｅｌａ（リツキシマブおよびヒトヒアルロニダーゼ）、リツキシマブ、リツキシマブおよびヒトヒアルロニダーゼ、ロラピタント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、Ｒｕｂｉｄｏｍｙｃｉｎ（ダウノルビシン塩酸塩）、Ｒｕｂｒａｃａ（ルカパリブカムシル酸塩）、ルカパリブカムシル酸塩、ルキソリチニブリン酸塩、Ｒｙｄａｐｔ（ミドスタウリン）、スクレロゾール胸膜内エアゾール（タルク）、シルツキシマブ、シプリューセルＴ、ソマツリンデポ剤（ランレオチド酢酸塩）、ソニデジブ、ソラフェニブトシル酸塩、Ｓｐｒｙｃｅｌ（ダサチニブ）、ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ、滅菌タルク粉末（タルク）、Ｓｔｅｒｉｔａｌｃ（タルク）、Ｓｔｉｖａｒｇａ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、Ｓｕｔｅｎｔ（スニチニブリンゴ酸塩）、Ｓｙｌａｔｒｏｎ（Ｐｅｇインターフェロンアルファ−２ｂ）、Ｓｙｌｖａｎｔ（シルツキシマブ）、Ｓｙｎｒｉｂｏ（オマセタキシンメペスクシネート）、Ｔａｂｌｏｉｄ（チオグアニン）、ＴＡＣ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（ダラフェニブ）、Ｔａｇｒｉｓｓｏ（オシメルチニブ）、タルク、タリモジェン・ラヘルパレプベク、タモキシフェンクエン酸塩、Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ（シタラビン）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ塩酸塩）、Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（ベキサロテン）、Ｔａｓｉｇｎａ（ニロチニブ）、Ｔａｘｏｌ（パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（ドセタキセル）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（アテゾリズマブ）、Ｔｅｍｏｄａｒ（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、Ｔｈａｌｏｍｉｄ（サリドマイド）、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクロイセル、Ｔｏｌａｋ（外用フルオロウラシル）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、Ｔｏｒｉｓｅｌ（テムシロリムス）、トシツモマブおよびヨウ素Ｉ−１３１トシツモマブ、Ｔｏｔｅｃｔ（デキスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、Ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ、トラメチニブ、トラスツズマブ、Ｔｒｅａｎｄａ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリフルリジンおよびチピラシル塩酸塩、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（三酸化ヒ素）、Ｔｙｋｅｒｂ（ラパチニブジトシル酸塩）、Ｕｎｉｔｕｘｉｎ（ジヌツキシマブ）、ウリジン三酢酸塩、ＶＡＣ、バルルビシン、Ｖａｌｓｔａｒ（バルルビシン）、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、Ｖａｒｕｂｉ（ロラピタント塩酸塩）、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、Ｖｅｌｂａｎ（ビンブラスチン硫酸塩）、Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ）、Ｖｅｌｓａｒ（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、Ｖｅｎｃｌｅｘｔａ（ベネトクラクス）、ベネトクラクス、Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（アベマシクリブ）、Ｖｉａｄｕｒ（ロイプロリド酢酸塩）、Ｖｉｄａｚａ（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ（ビンクリスチン硫酸塩）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム剤、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデジブ、Ｖｉｓｔｏｇａｒｄ（ウリジン三酢酸塩）、Ｖｏｒａｘａｚｅ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、Ｖｏｔｒｉｅｎｔ（パゾパニブ塩酸塩）、Ｖｙｘｅｏｓ（ダウノルビシン塩酸塩およびシタラビンリポソーム剤）、Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ（ロイコボリンカルシウム）、Ｘａｌｋｏｒｉ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、Ｘｇｅｖａ（デノスマブ）、Ｘｏｆｉｇｏ（ラジウム２２３二塩化物）、Ｘｔａｎｄｉ（エンザルタミド）、Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）、Ｙｅｓｃａｒｔａ（アキシカブタゲン・シロロイセル）、Ｙｏｎｄｅｌｉｓ（トラベクトジン）、Ｚａｌｔｒａｐ（Ｚｉｖ−アフリベルセプト）、Ｚａｒｘｉｏ（フィルグラスチム）、Ｚｅｊｕｌａ（ニラパリブトシル酸塩一水和物）、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（ベムラフェニブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（イブリツモマブチウキセタン）、Ｚｉｎｅｃａｒｄ（デキスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ−アフリベルセプト、Ｚｏｆｒａｎ（オンダンセトロン塩酸塩）、Ｚｏｌａｄｅｘ（ゴセレリン酢酸塩）、ゾレドロン酸、Ｚｏｌｉｎｚａ（ボリノスタット）、Ｚｏｍｅｔａ（ゾレドロン酸）、Ｚｙｄｅｌｉｇ（イデラリシブ）、Ｚｙｋａｄｉａ（セリチニブ）、およびＺｙｔｉｇａ（アビラテロン酢酸塩）から選択されうる。
抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物の複数回投与がなされうる。１回もしくは複数回、または各回の投与は、別の治療剤の、同時的または逐次的投与に随伴されうる。
複数回投与は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１日間、または１、２、３、４、５、もしくは６カ月間のうちの１つであるように選択されうる、所定の時間間隔により隔てられうる。例を目的として述べると、投与は、７、１４、２１、または２８日（±３、２、または１日）ごとになされうる。
検出法
本発明はまた、ＶＩＳＴＡ、またはＶＩＳＴＡ（例えば、ＭＤＳＣ）を発現する細胞を検出、位置特定、またはイメージングする方法における使用のための、本発明の物品も提供する。本明細書で記載される抗原結合性分子は、ＶＩＳＴＡに対する抗原結合性分子を伴う方法において使用されうる。このような方法は、抗原結合性分子とＶＩＳＴＡとの結合複合体の検出を伴いうる。
特に、ＶＩＳＴＡの検出は、ＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患／状態を診断／予後診断し、このような疾患／状態を発症する危険性がある対象を同定する方法において有用な場合もあり、かつ／または治療介入に対する、対象の応答を予測する方法において有用な場合もある。
このように、ＶＩＳＴＡを含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、本明細書で記載される抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子と、ＶＩＳＴＡとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法が提供される。また、ＶＩＳＴＡを発現する細胞を含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、本明細書で記載される抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子と、ＶＩＳＴＡを発現する細胞との複合体の形成を検出するステップとを含む方法も提供される。
試料は、任意の組織または体液から採取されうる。試料は、多量の血液；血液フィブリン塊および血液細胞を除去した後で得られる流体部分を含みうる、個体の血液に由来する、多量の血清；組織試料または生検；胸水；脳脊髄液（ＣＳＦ）；または前記個体から単離された細胞を含みうるか、またはこれらに由来しうる。一部の実施形態では、試料は、疾患／状態の影響を受ける、１つの組織または複数の組織（例えば、疾患の症状が顕在化するか、または疾患／状態の発症機序に関与する、１つの組織または複数の組織）から得られうるか、またはこれらに由来しうる。
当技術分野では、サンドイッチアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイを含む、適する方法フォーマットが周知である。方法は、検出可能部分、例えば、本明細書で記載される、蛍光標識、リン光標識、発光標識、免疫検出可能標識、放射性標識、化学、核酸、または酵素標識により、抗原結合性分子、または標的（複数可）、またはこれらの両方を標識付けするステップを伴いうる。当業者には、検出法が周知であり、標識化剤と対応するように選択されうる。
この種の方法は、疾患または状態、例えば、がんについての、診断的および／または予後診断的評価のための方法のベースをもたらしうる。このような方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの患者試料に対して実施される場合もあり、患者試料の加工後に実施される場合もある。試料が回収されたら、患者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法の実施に立ち会うことを要求されないため、方法は、ヒトまたは動物体内に対しては行われない方法である。一部の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて実施される。
試料中の検出は、疾患／状態（例えば、がん）、疾患／状態に対する素因の診断を目的として使用される場合もあり、疾患／状態、例えば、本明細書で記載される疾患／状態について予後診断する（予知する）ために使用される場合もある。診断または予後診断は、既存の（既に診断された）疾患／状態に関しうる。
本発明はまた、対象を、ＶＩＳＴＡターゲティング剤による処置のために選択／層別化するための方法も提供する。一部の実施形態では、対象は、例えば、対象から得られた試料中の、ＶＩＳＴＡ、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞の検出／定量に基づき、本発明に従う処置／防止のために、このような処置／防止から、利益を得る対象として選択されるか、または同定される。
このような方法は、例えば、患者試料中で、ＶＩＳＴＡおよび／またはＶＩＳＴＡ（例えば、ＭＤＳＣ）を発現する細胞を検出または定量するステップを伴いうる。方法が、対象とする因子を定量するステップを含む場合、方法は、診断的または予後診断的評価の一部として、決定された量を、標準値または参照値に対して比較するステップをさらに含みうる。他の診断／予後診断検査は、診断もしくは予後診断の精度を増強するか、または本明細書で記載される検査を使用することにより得られる結果を確認するように、本明細書で記載される診断検査／予後診断検査と共に使用されうる。
ＶＩＳＴＡレベルの増大が検出される場合、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の存在（またはこれらの数／比率の増大）が、対象から得られた試料中で検出される場合、対象は、ＭＤＳＣが病理学的に関与する疾患／状態を有するか、またはこのような疾患／状態を発症する危険性があると診断されうる。このような方法では、細胞の発現のレベルまたは数／比率「の増大」とは、例えば、健常対象から得られる、同等な試料（例えば、同じ体液、組織、臓器などから得られた、同じ種類の試料）中で検出されるレベル／数／比率など、適切な対照条件について決定されるレベル／数／比率を超えるレベル／数／比率を指す。
ＶＩＳＴＡレベルの増大が検出される場合、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の存在（またはこれらの数／比率の増大）が、対象から得られた試料中で検出される場合、対象は、同等な試料（例えば、同じ体液、組織、臓器などから得られた、同じ種類の試料）中の、ＶＩＳＴＡレベルが低レベルであるか、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の数／比率を低減していると決定された対象と比較して、予後不良であると決定されうる。
本発明の抗原結合性分子はまた、免疫療法に対する応答を予測する方法において有用でもある。「免疫療法」とは、一般に、疾患／状態を処置するのに、免疫系を役立てる治療介入を指す。免疫療法は、対象における、エフェクター免疫細胞（例えば、エフェクターＴ細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞）、ＮＫ細胞）の数／比率／活性を増大させる治療介入を含む。エフェクター免疫細胞の数／比率／活性を増大させる免疫療法は、エフェクター免疫細胞の増殖および／または生存を促進し、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害し、共刺激受容体により媒介されるシグナル伝達を促進し、抗原提示細胞による抗原提示を増強する介入などを含む。エフェクター免疫細胞の数／比率／活性を増大させる免疫療法はまた、例えば、養子細胞移入（ＡＣＴ）を介して、対象において、所望の特異性または活性を有するエフェクター免疫細胞の頻度を増大させる介入も包含する。ＡＣＴは、典型的に、免疫細胞が単離される血液試料を採取することにより、対象から免疫細胞を得ることを伴う。次いで、細胞は、典型的に、何らかの形で処理または変更され、次いで、同じまたは異なる対象へと投与される。ＡＣＴは、典型的に、ある特定の所望の特徴を伴う免疫細胞集団を、対象へと施すか、またはこの対象において、このような特徴を伴う免疫細胞の頻度を増大させることを目的とする。一部の実施形態では、ＡＣＴは、例えば、標的抗原または目的の細胞型に特異的な、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞のＡＣＴである。免疫療法はまた、対象における、免疫抑制細胞の数／比率／活性（例えば、制御性Ｔ細胞、ＭＤＳＣ）を減少させる治療介入も含む。免疫抑制細胞の数／比率／活性を減少させる免疫療法は、免疫抑制細胞に対する細胞殺滅を引き起こすか、または強化し、免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害する介入を含む。
ＶＩＳＴＡレベルの増大が検出される場合、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の存在（またはこれらの数／比率の増大）が、対象から得られた試料中で検出される場合、対象は、対象における、エフェクター免疫細胞の数／比率／活性を増大させる免疫療法に対して、同等な試料（例えば、同じ体液、組織、臓器などから得られた、同じ種類の試料）中の、ＶＩＳＴＡレベルが低レベルであるか、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の数／比率を低減していると決定された対象と比較して応答が不良であることが予測されうる。ＶＩＳＴＡレベルの増大が検出される場合、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の存在（またはこれらの数／比率の増大）が、対象から得られた試料中で検出される場合、対象は、対象における、免疫抑制細胞の数／比率／活性を低減することを目的とする免疫療法に対して、同等な試料（例えば、同じ体液、組織、臓器などから得られた、同じ種類の試料）中の、ＶＩＳＴＡレベルが低レベルであるか、またはＶＩＳＴＡを発現する細胞（例えば、ＭＤＳＣ）の数／比率を低減していると決定された対象と比較して応答が改善されることが予測されうる。
一部の実施形態では、方法は、免疫抑制細胞コンパートメント、およびエフェクター免疫細胞コンパートメントの相対的サイズ／活性を決定するステップを含む。例えば、一部の実施形態では、方法は、ＶＩＳＴＡ発現細胞（例えば、ＭＤＳＣ、ＴＡＭ、好中球）の、エフェクター免疫細胞に対する比を決定するための方法において、本明細書で記載される抗原結合性分子を利用する。比を増大させている対象は、免疫抑制細胞の数／比率／活性を低減することを目的とする免疫療法に対する応答を、比が低値であることが決定された対象と比較して改善することが予測される場合もあり、かつ／または、エフェクター免疫細胞の数／比率／活性を増大させる免疫療法に対する応答が、これと比較して不良であることが予測される場合もある。
本発明の診断および予後診断法は、疾患および／または処置の経過を通して、複数の時点において、対象から得られた試料に対して実施される場合があり、時間経過にわたり、例えば、対象へと投与された処置に応答する、疾患／状態の発症をモニタリングするのに使用されうる。方法に従う特徴付けの結果は、いつ、どのような種類の治療を、対象へと投与するのかについての臨床的決定に情報を与えるのに使用されうる。
診断法および予後診断法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの患者から得られた試料に対して実施される場合もあり、患者から得られた試料の加工後に実施される場合もある。試料が回収されたら、患者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法の実施に立ち会うことを要求されないため、方法は、ヒトまたは動物体内に対しては行われない方法である。
対象
本明細書で記載される、本発明の態様に従う対象は、任意の動物またはヒトでありうる。対象は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物でもありうるが、より好ましくは、ヒトである。対象は、雄の場合もあり、雌の場合もある。対象は、患者でありうる。対象は、処置を要求する疾患または状態（例えば、がん）を伴うと診断されている場合もあり、このような疾患／状態を有することが疑われる場合もあり、このような疾患／状態を発症する／このような疾患／状態に罹患する危険性がある場合もある。
本発明に従う実施形態では、対象は、好ましくは、ヒト対象である。一部の実施形態では、本明細書における、本発明の治療または予防法に従い処置される対象は、がんを有するか、またはがんを発症させる危険性がある対象である。本発明に従う実施形態では、対象は、このような疾患／状態の、ある特定のマーカーについての特徴付けに基づく方法に従う処置のために選択されうる。
キット
本発明の一部の態様では、本明細書で記載される部材キットが提供される。一部の実施形態では、キットは、所定数量の、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を有する、少なくとも１つの容器を有しうる。
一部の実施形態では、キットは、本明細書で記載される、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を作製するための素材を含みうる。
キットは、抗原結合性分子、ポリペプチド、ＣＡＲ、核酸（または複数の核酸）、発現ベクター（または複数の発現ベクター）、細胞、または組成物を、指定された疾患／状態を処置するための、患者への投与のための指示書と併せて提供しうる。
一部の実施形態では、キットは、所定数量の、別の治療剤（例えば、抗感染症剤または化学療法剤）を有する、少なくとも１つの容器をさらに含みうる。このような実施形態では、キットはまた、２つの医薬または医薬組成物が、特異的な疾患または状態のための組合せ処置をもたらすよう、同時に、または個別に投与されうるように、第２の医薬または医薬組成物も含みうる。治療剤はまた、腫瘍または血液への注射または注入に適するようにも製剤化されうる。
配列同一性
本明細書で使用される、「配列同一性」とは、配列の間で、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列をアライメントし、必要な場合は、ギャップを導入した後で、参照配列内のヌクレオチド／アミノ酸残基と同一な、対象配列内のヌクレオチド／アミノ酸残基のパーセントを指す。２つ以上のアミノ酸配列または核酸配列の間の配列同一性パーセントを決定することを目的とする、対での、複数の配列アライメントは、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ（Ｓｏｄｉｎｇ、Ｊ．２００５、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２１、９５１〜９６０）、Ｔ−ｃｏｆｆｅｅ（Ｎｏｔｒｅｄａｍｅら、２０００、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）、３０２、２０５〜２１７）、Ｋａｌｉｇｎ（ＬａｓｓｍａｎｎおよびＳｏｎｎｈａｍｍｅｒ、２００５、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６（２９８））、およびＭＡＦＦＴ（ＫａｔｏｈおよびＳｔａｎｄｌｅｙ、２０１３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、３０（４）、７７２〜７８０）ソフトウェアなど、市販のコンピュータソフトウェアを使用して、当業者に公知の、多様な形で達成されうる。このようなソフトウェアを使用する場合、例えば、ギャップペナルティーおよび伸長ペナルティーについての、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。
配列
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 番号付けされた項目
以下の番号付けされた項目（ｐａｒａ）は、本発明の関連で想定される、特色および特色の組合せについての言明をさらに提示する：
１．Ｆｃ媒介性機能に依存せずに、ＶＩＳＴＡに結合し、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗原結合性分子、任意選択で、単離抗原結合性分子。
２．Ｉｇ様Ｖ型ドメイン内で、ＶＩＳＴＡに結合することが可能である、項目１に記載の抗原結合性分子。
３．配列番号６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することが可能である、項目１または項目２に記載の抗原結合性分子。
４．配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドに結合することが可能である、項目１から３のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
５．ＶＩＳＴＡへの結合について、ＩＧＮ１７５Ａと競合しない、項目１から４のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
６．配列番号２７５のアミノ酸配列からなるペプチドに結合することが可能ではない、項目１から５のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
７．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３０５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３０７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
８．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３０９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
９．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１０．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３００のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１１．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２７７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１２．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２８６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１３．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１４．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号３００のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１５．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号４２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１６．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１７．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号５３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号３４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号３５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号５８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１８．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号７３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号７４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号８１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号８２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
１９．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号８９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号９６のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号９７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号９８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
２０．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号８８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号８９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１３７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１３８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１３９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
２１．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号３３のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１０７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１０８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３、
またはＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、もしくはＨＣ−ＣＤＲ３のうちの１つもしくは複数における、１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸が、別のアミノ酸で置換された、これらの変異体を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１１４のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号６７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１１５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
２２．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１２０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１２１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１２２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１２９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
２３．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１４４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１４５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１４６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１５１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
２４．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１５８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１６０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１６５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１５２のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１５３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
２５．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１７７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１７９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
２６．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２４６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２４７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
２７．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１８５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１８９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項または項目２６に記載の抗原結合性分子。
２８．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号１９７のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項または項目２６に記載の抗原結合性分子。
２９．（ｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号７２のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
配列番号１８４のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
配列番号２００のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
（ｉｉ）以下のＣＤＲ：
配列番号２０３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
配列番号１９０のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
を含む、項目１から６のいずれか一項または項目２６に記載の抗原結合性分子。
３０．配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号３１０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２９４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２９７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２９９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号３０１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号３０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号３０３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２７６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２８２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号２８５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２８７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
配列番号３２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号４０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号５２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号５７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号６２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号６６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号４８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号８７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号９５のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１０６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１１３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１４３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１５０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１５７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１６４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号７１のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号７９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１０４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１１９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１２６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１８３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１８８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１９４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１９６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１９９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号２０２のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１３３のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１３６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域；
または
配列番号１６８のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
配列番号１７６のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
３１．ヒトＶＩＳＴＡ、ならびにマウスＶＩＳＴＡおよびカニクイザルＶＩＳＴＡのうちの１つまたは複数に結合することが可能である、項目１から３０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
３２．（ｉ）項目１から３１のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、および（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ以外の抗原に結合することが可能な抗原結合性分子を含む、抗原結合性分子、任意選択で、単離抗原結合性分子。
３３．ＶＩＳＴＡを発現する細胞の、細胞表面に結合することが可能である、項目１から３２のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
３４．ＶＩＳＴＡと、ＶＩＳＴＡの結合パートナーとの相互作用を阻害することが可能である、項目１から３３のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
３５．ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能である、項目１から３４のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
３６．エフェクター免疫細胞の増殖、および／またはこれらによるサイトカイン産生を増大させることが可能である、項目１から３５のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
３７．項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
３８．項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、または項目３７に記載のＣＡＲをコードする、１つの核酸または複数の核酸、任意選択で、１つの単離核酸または複数の単離核酸。
３９．項目３８に記載の、１つの核酸または複数の核酸を含む、１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクター。
４０．項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の、１つの核酸もしくは複数の核酸、または項目３９に記載の、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む細胞。
４１．項目３８に記載の、１つの核酸もしくは複数の核酸、または項目３９に記載の、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む細胞を、抗原結合性分子またはＣＡＲの、核酸（複数可）または発現ベクター（複数可）からの発現に適する条件下で培養するステップを含む方法。
４２．項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の、１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３９に記載の、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、または項目４０に記載の細胞を含む組成物。
４３．ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤をさらに含み、任意選択で、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＢＴＬＡから選択される、項目４２に記載の組成物。
４４．医学的処置または予防の方法における使用のための、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３９に記載の１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクター、項目４０に記載の細胞、または項目４２もしくは項目４３に記載の組成物。
４５．がんまたは感染性疾患の処置または防止の方法における使用のための、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３９に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目４０に記載の細胞、または項目４２もしくは項目４３に記載の組成物。
４６．がんまたは感染症疾患の処置または防止の方法における使用のための医薬の製造における、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の、１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３９に記載の、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目４０に記載の細胞、または項目４２もしくは項目４３に記載の組成物の使用。
４７．がんまたは感染性疾患を処置または防止する方法であって、対象へと、治療または予防有効量の、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の、１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３９に記載の、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目４０に記載の細胞、または項目４２もしくは項目４３に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
４８．がんが、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、肝がん、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、白血病、リンパ腫、黒色腫、胸腺腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および充実性腫瘍から選択される、項目４５に記載の使用、項目４６に記載の使用、または項目４７に記載の方法のための、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物。
４９．骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法における使用のための、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３９に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目４０に記載の細胞、または項目４２もしくは項目４３に記載の組成物。
５０．骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法における使用のための医薬の製造における、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３９に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目４０に記載の細胞、または項目４２もしくは項目４３に記載の組成物の使用。
５１．骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法であって、対象へと、治療または予防有効量の、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、項目３７に記載のＣＡＲ、項目３８に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、項目３９に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、項目４０に記載の細胞、または項目４２もしくは項目４３に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
５２．方法が、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤の投与をさらに含み、任意選択で、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、またはＢＴＬＡから選択される、項目４５から５１のいずれか一項に記載の、使用のための抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、もしくは組成物、使用または方法。
５３．ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害する方法であって、ＶＩＳＴＡ発現細胞を、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子と接触させるステップを含む方法。
５４．骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の活性を阻害するための方法であって、ＭＤＳＣを、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子と接触させるステップを含む方法。
５５．エフェクター免疫細胞の数または活性を増大させるための方法であって、ＶＩＳＴＡ発現細胞の活性を、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子により阻害するステップを含む方法。
５６．ＶＩＳＴＡに結合した、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体、任意選択で、単離ｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体。
５７．ＶＩＳＴＡを含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子の、ＶＩＳＴＡとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法。
５８．対象を、ＶＩＳＴＡターゲティング剤による処置のために選択または層別化する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子の、ＶＩＳＴＡとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法。
５９．項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける診断または予後診断剤としての使用。
６０．任意選択で、がんが、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、肝がん、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がん、白血病、リンパ腫、黒色腫、胸腺腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、および充実性腫瘍から選択される、がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法における、項目１から３６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子の使用。
本発明は、このような組合せが、明らかに許容されないか、または明示的に回避される場合を除き、記載される態様と好ましい特徴との組合せを含む。
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される対象物を限定するものと見なすべきではない。
ここで、付属の図面を参照しながら、例を目的として、本発明の態様および実施形態が例示される。当業者には、さらなる態様および実施形態が明らかであろう。本文で言及される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書および後続の特許請求の範囲を通して、文脈によりそうでないことが要求されない限りにおいて、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「〜を含むこと」などの変化形は、言明された整数またはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を含意し、他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外は含意しないように理解される。
そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意されたい。本明細書では、範囲は、「約」１つ特定の値から、かつ／または「約」別の特定の値までの範囲として表される。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つ特定の値から、かつ／または他の特定の値までの範囲を含む。同様に、値が、先行詞である「約」の使用により、近似値として表される場合、特定の値は、別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
本明細書で、核酸配列が開示される場合、その逆相補体もまた、明示的に想定される。
本明細書で記載される方法は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて実施されうる。「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」と言う用語が、培養物中の細胞に対して実施される手順を包含することが意図されるのに対し、「ｉｎ ｖｉｖｏ」と言う用語は、無傷の多細胞生物に対する／上の手順を包含することが意図される。
ここで、付属の図を参照しながら、本発明の原理を例示する、実施形態および実験が論じられる。
フローサイトメトリーにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体による、細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、ＶＳＴＢ１１２（陽性対照；ＷＯ２０１５／０９７５３６）による、ＨＥＫ２９３細胞（ＶＩＳＴＡを発現させない）、またはＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体による、細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、４−Ｍ２−Ｄ５による、ＨＥＫ２９３細胞（ＶＩＳＴＡを発現させない）、またはＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体による、細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、９Ｍ２−Ｃ１２による、ＨＥＫ２９３細胞（ＶＩＳＴＡを発現させない）、またはＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体による、細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２（本明細書ではまた、「Ｖ４」とも称される）による、ＨＥＫ２９３細胞（ＶＩＳＴＡを発現させない）、またはＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体による、細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、９Ｍ２Ｃ１２、Ｖ４、およびクローンである、ＶＳＴＢ１１２、またはアイソタイプ対照抗体による、ＨＥＫ２９３細胞（ＶＩＳＴＡを発現させない）、またはＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。非染色の細胞を、陰性対照として解析した。 抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４による、ヒト、カニクイザル、およびマウスＶＩＳＴＡに対する結合アフィニティーについての解析の結果を示すセンサーグラムである。ヒトＶＩＳＴＡへの結合を示す。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４による、ヒト、カニクイザル、およびマウスＶＩＳＴＡに対する結合アフィニティーについての解析の結果を示すセンサーグラムである。カニクイザルＶＩＳＴＡへの結合を示す。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４による、ヒト、カニクイザル、およびマウスＶＩＳＴＡに対する結合アフィニティーについての解析の結果を示すセンサーグラムである。マウスＶＩＳＴＡへの結合を示す。Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、およびＫＤを示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体の、異なるタンパク質への結合についての解析の結果を示すグラフである。ＥＬＩＳＡにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４による、ヒト、カニクイザル、およびマウスＶＩＳＴＡ、ヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＨＥＲ３への結合を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体の、異なるタンパク質への結合についての解析の結果を示すグラフである。抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＣＴＬＡ４、および無関係な抗原への結合を示す。 ＶＩＳＴＡと、ＶＳＩＧ−３との結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、５Ｍ１−Ａ１１および９Ｍ２−Ｃ１２による、ＶＩＳＴＡと、ＶＳＩＧ−３との結合の阻害についての解析の結果を示すグラフである。 抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５ｐによる処置の、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１７Ａの産生に対する効果についての解析の結果を示すグラフおよび棒グラフである。アッセイの終了時に、細胞培養物上清中で検出された、サイトカインのレベルを示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５ｐによる処置の、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１７Ａの産生に対する効果についての解析の結果を示すグラフおよび棒グラフである。表示のサイトカインのレベルの倍数変化（「ＦＣ」）を示す。 抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、ＭＩＨ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による処置の、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１７Ａの産生に対する効果についての解析の結果を示すグラフおよび棒グラフである。アッセイの終了時に、細胞培養物上清中で検出された、サイトカインのレベルを示す。 抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、ＭＩＨ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による処置の、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１７Ａの産生に対する効果についての解析の結果を示すグラフおよび棒グラフである。表示のサイトカインのレベルの倍数変化（「ＦＣ」）を示す。 示差走査蛍光測定解析による、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４の安定性についての解析の結果を示すグラフである。 サイズ除外クロマトグラフィーによる、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４についての解析の結果を示すグラフである。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによる、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４の発現についての解析の結果を示す画像である。レーン：Ｍ１＝型番：３４５２の、ＴａＫａＲａタンパク質マーカー；Ｍ２＝型番：Ｍ００５２１の、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔタンパク質マーカー；１＝還元条件；２＝非還元条件；Ｐ＝陽性対照：マウスＩｇＧ１、カッパ（Ｓｉｇｍａ；型番：Ｍ９２６９）である。ウェスタンブロットのために使用される一次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＬＩ−ＣＯＲ；型番：９２６〜３２２１０）であった。 抗体血清についてのＥＬＩＳＡ解析による、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４の薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。 ｉｎ ｖｉｖｏの、同系細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルにおける、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４の抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。 表示のチェックポイント分子をターゲティングする、単剤療法または組合せ療法による処置後１５日目の、同系細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルにおける、腫瘍増殖の阻害を示す棒グラフである。この研究で使用された抗体は、以下の通り：抗ＶＩＳＴＡ＝クローンＶ４、抗ＰＤ−Ｌ１＝クローン１０Ｆ．９Ｇ２、抗ＴＩＧＩＴ＝クローン１Ｇ９、抗ＬＡＧ−３＝クローンＣ９Ｂ７Ｗ、および抗ＴＩＭ−３＝クローンＲＭＴ３−２３であった。 抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４単独、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、１０Ｆ．９Ｇ２単独による処置、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４および抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、１０Ｆ．９Ｇ２による組合せ処置、またはＰＢＳによる処置（陰性対照）の後における、バルク腫瘍についてのＲＮＡ−Ｓｅｑ解析により決定される、同系細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの腫瘍バルク内の、細胞１００，０００個当たりのＭＤＳＣの数、およびＣＤ８＋ Ｔ細胞：Ｔｒｅｇの比を示す棒グラフである。 ｉｎ ｖｉｖｏの、同系細胞株に由来する、Ｌｅｗｉｓ肺癌についてのマウスモデルにおける、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４の抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。 ｉｎ ｖｉｖｏの、同系細胞株に由来する、黒色腫についてのマウスモデルにおける、単剤療法としての、または抗ＰＤ−１抗体である、ＲＭＰ１−１４（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）と組み合わせた、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４の抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。 ９００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４、または陰性対照としての、等容量の溶媒（ＰＢＳ）の単回投与を行った後における、白血球の数または異なる種類を示す棒グラフである。 ９００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４、または陰性対照としての、等容量の溶媒（ＰＢＳ）の単回投与を行った後における、肝機能の相関因子の評価による、肝毒性の解析を示す棒グラフである。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）のレベルを示す。 ９００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４、または陰性対照としての、等容量の溶媒（ＰＢＳ）の単回投与を行った後における、腎機能の相関因子の評価による、腎毒性の解析を示す棒グラフである。血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（ＣＲＥＡ）のレベルを示す。 ＥＬＩＳＡにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１による、ヒト、カニクイザル、およびマウスＶＩＳＴＡ、ならびにヒトＰＤ−Ｌ１への結合についての解析の結果を示すグラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１３による、ヒトおよびマウスＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示すグラフである。 ｉｎ ｖｉｖｏの、細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルにおける、単独の、または抗ＰＤ−Ｌ１と組み合わせた、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１の抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。 ｉｎ ｖｉｖｏの、細胞株に由来する、乳癌についてのマウスモデルにおける、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１の抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。 フローサイトメトリーにより決定される、抗ＶＩＳＴＡ抗体による、細胞の染色を示すヒストグラムである。ヒストグラムは、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、４Ｍ２−Ｂ４、２Ｍ１−Ｂ１２、４Ｍ２−Ｃ９、２Ｍ１−Ｄ２、４Ｍ２−Ｄ９、１Ｍ２−Ｄ２、５Ｍ１−Ａ１１、４Ｍ２−Ｄ５、４Ｍ２−Ａ８および９Ｍ２−Ｃ１２による、ＨＥＫ２９３細胞（ＶＩＳＴＡを発現しない）、またはＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ過剰発現細胞（ＨＥＫ２９３ ＶＩＳＴＡ Ｏ／Ｅ）の染色を示す。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ１の、マウスＦｃγＲＩＶへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ１の、マウスＦｃγＲＩＩＩへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ１の、マウスＦｃγＲＩＩｂへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ１の、マウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａの、マウスＦｃγＲＩＶへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａの、マウスＦｃγＲＩＩＩへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａの、マウスＦｃγＲＩＩｂへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａの、マウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧの、マウスＦｃγＲＩＶへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧの、マウスＦｃγＲＩＩＩへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧの、マウスＦｃγＲＩＩｂへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧの、マウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＮＱの、マウスＦｃγＲＩＶへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＮＱの、マウスＦｃγＲＩＩＩへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＮＱの、マウスＦｃγＲＩＩｂへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＮＱの、マウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ１、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧ、および４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａの、マウスＦｃγＲＩＶ、マウスＦｃγＲＩＩＩ、マウスＦｃγＲＩＩｂ、およびマウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果についてについてまとめる表である。計算によるＫｏｎ値を示す。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ１、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧ、および４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａの、マウスＦｃγＲＩＶ、マウスＦｃγＲＩＩＩ、マウスＦｃγＲＩＩｂ、およびマウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果についてについてまとめる表である。計算によるＫｄｉｓ値を示す。 ４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ１、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧ、および４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａの、マウスＦｃγＲＩＶ、マウスＦｃγＲＩＩＩ、マウスＦｃγＲＩＩｂ、およびマウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果についてについてまとめる表である。計算によるＫＤ値を示す。 細胞株に由来する、Ｔ細胞リンパ腫についてのマウスモデルにおける、ｍＩｇＧ２ａおよびｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧフォーマットの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２の、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。異なる処置群についてのデータを示す。 細胞株に由来する、Ｔ細胞リンパ腫についてのマウスモデルにおける、ｍＩｇＧ２ａおよびｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧフォーマットの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２の、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。溶媒対照群および４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ処置群における、個別のマウスについて得られたデータを示す。 細胞株に由来する、Ｔ細胞リンパ腫についてのマウスモデルにおける、ｍＩｇＧ２ａおよびｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧフォーマットの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２の、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。溶媒対照群および４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧ処置群における、個別のマウスについて得られたデータを示す。 ＢＬＩによる、ヒトＶＩＳＴＡへの結合についての、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体間の競合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 ＢＬＩによる、ヒトＶＩＳＴＡへの結合についての、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体間の競合についての解析の結果を示すセンサーグラムである。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２による、ＶＩＳＴＡと、ＶＳＩＧ−３との結合の阻害についての解析の結果を示すグラフである。 ＣＦＳＥ希釈アッセイにより決定する場合の、抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇで処置されたＴ細胞に、Ｔ細胞増殖を取り戻させる能力についての解析の結果を示す棒グラフである。１：１の比の、アゴニスト性抗ＣＤ３抗体およびＶＩＳＴＡ−Ｉｇでコーティングされたウェルを使用する条件から得られた結果を示す。ＣＦＳＥ−ｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率を示す。 ＣＦＳＥ希釈アッセイにより決定する場合の、抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇで処置されたＴ細胞に、Ｔ細胞増殖を取り戻させる能力についての解析の結果を示す棒グラフである。２：１の比の、アゴニスト性抗ＣＤ３抗体およびＶＩＳＴＡ−Ｉｇでコーティングされたウェルを使用する条件から得られた結果を示す。ＣＦＳＥ−ｌｏｗ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の百分率を示す。 ＣＦＳＥ希釈アッセイにより決定する場合の、抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇで処置されたＴ細胞に、Ｔ細胞増殖を取り戻させる能力についての解析の結果を示す棒グラフである。１：１の比の、アゴニスト性抗ＣＤ３抗体およびＶＩＳＴＡ−Ｉｇでコーティングされたウェルを使用する条件から得られた結果を示す。ＣＦＳＥ−ｌｏｗ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の百分率を示す。 ＣＦＳＥ希釈アッセイにより決定する場合の、抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＶＩＳＴＡ−Ｉｇで処置されたＴ細胞に、Ｔ細胞増殖を取り戻させる能力についての解析の結果を示す棒グラフである。２：１の比の、アゴニスト性抗ＣＤ３抗体およびＶＩＳＴＡ−Ｉｇでコーティングされたウェルを使用する条件から得られた結果を示す。ＣＦＳＥ−ｌｏｗ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の百分率を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１細胞による、ＩＬ−６の産生を促進する能力についての解析の結果を示す棒グラフである。４Ｍ２−Ｃ１２を使用して得られた結果を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１細胞による、ＩＬ−６の産生を促進する能力についての解析の結果を示す棒グラフである。ＶＳＴＢ１１２を使用して得られた結果を示す。 投与の２時間前、ならびに投与の０．５時間後、６時間後、２４時間後、および９６時間後において、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２を投与されたマウスから得られた血液試料中で検出された、ＩＬ−６のレベルを示す棒グラフである。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルにおける、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置の、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。異なる処置群についてのデータを示す。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルにおける、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置の、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。溶媒対照群および４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ＋抗ＰＤ−１処置群における、個別のマウスについて得られたデータを示す。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの、ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（抗ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｃｏｍｂｏ）で処置されたマウスから得られた、２２日目における腫瘍に対する、ｇ−ＭＤＳＣである、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を示す棒グラフである。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの、ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｖ４＋ＰＤ１）で処置されたマウスから、１８日目に得られた血清中の、ＩＦＮγのレベルを示す棒グラフである。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの、ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｖ４＋ＰＤ１）で処置されたマウスから、１８日目に得られた血清中の、ＩＬ−２３のレベルを示す棒グラフである。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの、ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｖ４＋ＰＤ１）で処置されたマウスから、１８日目に得られた血清中の、ＩＬ−１０のレベルを示す棒グラフである。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの、ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｖ４＋ＰＤ１）で処置されたマウスから、１８日目に得られた血清中の、ＩＬ−４のレベルを示す棒グラフである。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの、ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｖ４＋ＰＤ１）で処置されたマウスから、１８日目に得られた血清中の、ＩＬ−５のレベルを示す棒グラフである。 細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの、ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＤＬ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｖ４＋ＰＤＬ１）で処置されたマウスから得られた、２１日目における腫瘍内の、Ａｒｇ１ ＲＮＡの発現レベルを示す棒グラフである。 細胞株に由来する、黒色腫についてのマウスモデルにおける、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置の、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。異なる処置群についてのデータを示す。 細胞株に由来する、黒色腫についてのマウスモデルにおける、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置の、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。溶媒対照群および４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ＋抗ＰＤ−１処置群における、個別のマウスについて得られたデータを示す。 ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（抗ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｃｏｍｂｏ）で処置されたマウスから得られた、細胞株に由来する、黒色腫についてのマウスモデルの、１８日目における腫瘍に対する、ｇ−ＭＤＳＣである、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を示す棒グラフである。 細胞株に由来する、Ｔ細胞白血病／リンパ腫についてのマウスモデルにおける、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（抗ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｖ４＋抗ＰＤ１）の、ｉｎ ｖｉｖｏの抗がん活性についての解析の結果を示すグラフである。 ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−１抗体（抗ＰＤ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｃｏｍｂｏ）で処置されたマウスから得られた、細胞株に由来する、Ｔ細胞白血病／リンパ腫についてのマウスモデルの、１６日目における腫瘍に対する、ｇ−ＭＤＳＣである、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を示す棒グラフである。 ＰＢＳ（溶媒）、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（Ｖ４）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（抗ＰＤＬ１）、または４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａおよび抗ＰＤ−１抗体による組合せ処置（Ｖ４＋抗ＰＤＬ１）による、細胞株に由来する、結腸癌についてのマウスモデルの処置の経過中における、マウスの体重を示すグラフである。 バイオレイヤー干渉法により決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の、ヒトＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムおよび表である。 バイオレイヤー干渉法により決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の、マウスＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムおよび表である。 バイオレイヤー干渉法により決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の、ヒトＰＤ−Ｌ１への結合についての解析の結果を示すセンサーグラムおよび表である。 ４５Ａおよび４５Ｂのセンサーグラムから計算された、反応速度および熱力学定数についてまとめる図である。 バイオレイヤー干渉法により決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の、マウスＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムおよび表である。 ４６Ａのセンサーグラムから計算された、反応速度および熱力学定数についてまとめる図である。 バイオレイヤー干渉法により決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の、ヒトＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムおよび表である。 バイオレイヤー干渉法により決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の、マウスＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示すセンサーグラムおよび表である。 ４７Ａおよび４７Ｂのセンサーグラムから計算された、反応速度および熱力学定数についてまとめる図である。 バイオレイヤー干渉法により決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の、ヒトＶＩＳＴＡおよびマウスＶＩＳＴＡならびにヒトＣＤ４７への結合についての解析の結果を示すセンサーグラムおよび表である。 ４８Ａのセンサーグラムから計算された、反応速度および熱力学定数についてまとめる図である。 ＥＬＩＳＡにより決定される、異なる抗体の、ヒトＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフおよび表である。 ＥＬＩＳＡにより決定される、異なる抗体の、マウスＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフおよび表である。 異なる抗体の、表示のタンパク質への結合についてのＥＣ５０値（ｎＭ）を示す図である。 ＥＬＩＳＡにより決定される、異なる抗体の、ヒトＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフおよび表である。 ＥＬＩＳＡにより決定される、異なる抗体の、マウスＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフおよび表である。 異なる抗体の、表示のタンパク質への結合についてのＥＣ５０値（ｎＭ）を示す図である。 ＥＬＩＳＡにより決定される、異なる抗体の、ヒトＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフおよび表である。 ＥＬＩＳＡにより決定される、異なる抗体の、マウスＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフおよび表である。 異なる抗体の、表示のタンパク質への結合についてのＥＣ５０値（ｎＭ）を示す図である。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 示差走査蛍光測定解析による、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の安定性についての解析の結果を示す溶融グラフおよび表である。被験抗体調製物およびタンパク質非含有対照（ＮＰＣ）調製物について得られた生データについての一次微分を、３連で示す。 ５２Ａ〜５２Ｉの結果についてまとめる図である。 異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体の、安全性および免疫原性についての、コンピュータによる解析の結果についてまとめる表である。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２による、ＶＩＳＴＡと、ＶＳＩＧ−３との結合の阻害についての解析の結果を示すグラフである。 抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２（Ｖ４）による、ＶＩＳＴＡと、ＰＳＧＬ−１との結合の阻害についての解析の結果を示す棒グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４への結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ２４の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４への結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ２６の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４への結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ２７の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４への結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ２８の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４への結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ３０の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４への結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ３１の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４への結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ２４の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ２６の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ２７の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ２８の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ３０の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、Ｖ４−Ｃ３１の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 ＥＬＩＳＡにより決定される、アイソタイプとマッチさせた対照抗体の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合についての解析の結果を示す濃度−応答グラフである。 異なる抗体の、表示のタンパク質への結合についてのＥＣ５０値（Ｍ）を示す図である。 フローサイトメトリーにより決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体またはアイソタイプ対照抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。抗体の、野生型の、非トランスフェクトＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞への結合を示す。１＝抗体なし（非染色）、２＝ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、３＝ＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１、４＝４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１、５＝Ｖ４−Ｃ２４ ＩｇＧ１、６＝Ｖ４−Ｃ２６ ＩｇＧ１、７＝Ｖ４−Ｃ２７ ＩｇＧ１、８＝Ｖ４−Ｃ２８ ＩｇＧ１、９＝Ｖ４−Ｃ３０ ＩｇＧ１、および１０＝Ｖ４−Ｃ３１ ＩｇＧ１である。 フローサイトメトリーにより決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体またはアイソタイプ対照抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。抗体の、ヒトＶＩＳＴＡタンパク質を過剰発現させるＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞への結合を示す。１＝抗体なし（非染色）、２＝ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、３＝ＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１、４＝４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１、５＝Ｖ４−Ｃ２４ ＩｇＧ１、６＝Ｖ４−Ｃ２６ ＩｇＧ１、７＝Ｖ４−Ｃ２７ ＩｇＧ１、８＝Ｖ４−Ｃ２８ ＩｇＧ１、９＝Ｖ４−Ｃ３０ ＩｇＧ１、および１０＝Ｖ４−Ｃ３１ ＩｇＧ１である。 フローサイトメトリーにより決定される、異なる抗ＶＩＳＴＡ抗体またはアイソタイプ対照抗体による細胞の染色を示すヒストグラムである。抗体の、マウスＶＩＳＴＡタンパク質を過剰発現させるＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞への結合を示す。１＝抗体なし（非染色）、２＝ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体、３＝ＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１、４＝４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１、５＝Ｖ４−Ｃ２４ ＩｇＧ１、６＝Ｖ４−Ｃ２６ ＩｇＧ１、７＝Ｖ４−Ｃ２７ ＩｇＧ１、８＝Ｖ４−Ｃ２８ ＩｇＧ１、９＝Ｖ４−Ｃ３０ ＩｇＧ１、および１０＝Ｖ４−Ｃ３１ ＩｇＧ１である。 抗ＶＩＳＴＡ抗体を使用する、ヒト組織についての免疫組織化学染色を示す画像である。４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａによる、ヒト正常脾臓組織の染色を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体を使用する、ヒト組織についての免疫組織化学染色を示す画像である。表示の拡大率における、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａによる、ヒト正常卵巣組織の染色を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（Ｖ４）またはＶＳＴＢ１１２が、活性化Ｔ細胞を、ＶＩＳＴＡ発現細胞による抑制を解除する能力についての解析の結果を示すヒストグラムおよび棒グラフである。５日間にわたる、ＶＩＳＴＡ発現細胞、および表示の数量の抗ＶＩＳＴＡ抗体の存在下における、Ｔ細胞増殖についてのＣＦＳＥ希釈解析の結果を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（Ｖ４）またはＶＳＴＢ１１２が、活性化Ｔ細胞を、ＶＩＳＴＡ発現細胞による抑制を解除する能力についての解析の結果を示すヒストグラムおよび棒グラフである。５日間にわたる、ＶＩＳＴＡ発現細胞、および表示の数量の抗ＶＩＳＴＡ抗体の存在下における、Ｔ細胞増殖についてのＣＦＳＥ希釈解析の結果を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（Ｖ４）またはＶＳＴＢ１１２が、活性化Ｔ細胞を、ＶＩＳＴＡ発現細胞による抑制を解除する能力についての解析の結果を示すヒストグラムおよび棒グラフである。５日後において、細胞培養物上清中で検出された、ＩＦＮγの濃度を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（Ｖ４）またはＶＳＴＢ１１２が、活性化Ｔ細胞を、ＶＩＳＴＡ発現細胞による抑制を解除する能力についての解析の結果を示すヒストグラムおよび棒グラフである。５日後において、細胞培養物上清中で検出された、ＴＮＦａの濃度を示す。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（Ｖ４）またはＶＳＴＢ１１２が、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１細胞による、サイトカインの産生を促進する能力についての解析の結果を示す棒グラフである。細胞培養物上清中で検出された、ＩＬ−６の濃度を示す。１＝非染色、２＝アイソタイプとマッチさせた対照抗体により染色された細胞、３＝２０μｇのＶ４により染色された細胞、４＝４０μｇのＶ４により染色された細胞、および５＝２０μｇのＶＳＴＢ１１２により染色された細胞である。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（Ｖ４）またはＶＳＴＢ１１２が、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１細胞による、サイトカインの産生を促進する能力についての解析の結果を示す棒グラフである。表示の数量の抗ＶＩＳＴＡ抗体の存在下で２４時間にわたり、細胞培養物上清中で検出された、ＴＮＦａの濃度を示す。１＝非染色、２＝アイソタイプとマッチさせた対照抗体により染色された細胞、３＝２０μｇのＶ４により染色された細胞、４＝４０μｇのＶ４により染色された細胞、および５＝２０μｇのＶＳＴＢ１１２により染色された細胞である。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（Ｖ４）またはＶＳＴＢ１１２が、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１細胞による、サイトカインの産生を促進する能力についての解析の結果を示す棒グラフである。ＴＨＰ１細胞が、ＶＩＳＴＡ発現細胞であることを示し、培養物中の、ＶＩＳＴＡを発現させることが決定された細胞の百分率が示される。１＝非染色、２＝アイソタイプとマッチさせた対照抗体により染色された細胞、３＝２０μｇのＶ４により染色された細胞、４＝４０μｇのＶ４により染色された細胞、および５＝２０μｇのＶＳＴＢ１１２により染色された細胞である。 抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１または４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４が、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ−１細胞による、ＩＬ−６の産生を促進する能力についての解析の結果を示す棒グラフである。細胞培養物上清中で検出された、ＩＬ−６の濃度が示される。 抗体血清についてのＥＬＩＳＡ解析による、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１および４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４の薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。１０ｍｇ／ｋｇの抗体の投与後における結果が示される。 抗体血清についてのＥＬＩＳＡ解析による、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１および４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４の薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。２５ｍｇ／ｋｇの抗体の投与後における結果が示される。 抗体血清についてのＥＬＩＳＡ解析による、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１および４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４の薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。１００ｍｇ／ｋｇの抗体の投与後における結果が示される。 抗体血清についてのＥＬＩＳＡ解析による、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１および４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４の薬物動態解析の結果を示すグラフおよび表である。２５０ｍｇ／ｋｇの抗体の投与後における結果が示される。 ５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１または等容量のＰＢＳの投与の９６時間後のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、代表的な血液学的プロファイルを示す表である。赤血球コンパートメントについての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均値赤血球容積、ＭＣＨ＝平均値赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均値赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、およびＢＵＮ＝血中尿素窒素である。 ５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１または等容量のＰＢＳの投与の９６時間後のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、代表的な血液学的プロファイルを示す表である。白血球コンパートメントについての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均値赤血球容積、ＭＣＨ＝平均値赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均値赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、およびＢＵＮ＝血中尿素窒素である。 ５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１または等容量のＰＢＳの投与の９６時間後のＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける、代表的な血液学的プロファイルを示す表である。肝機能および腎機能の相関因子についての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均値赤血球容積、ＭＣＨ＝平均値赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均値赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、およびＢＵＮ＝血中尿素窒素である。 ２５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１、２５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４、または等容量のＰＢＳの投与後におけるＳＤラットについての、代表的な血液学的プロファイルを示す表である。赤血球コンパートメントについての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均値赤血球容積、ＭＣＨ＝平均値赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均値赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウムである。 ２５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１、２５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４、または等容量のＰＢＳの投与後におけるＳＤラットについての、代表的な血液学的プロファイルを示す表である。白血球コンパートメントについての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均値赤血球容積、ＭＣＨ＝平均値赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均値赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウムである。 ２５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１、２５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４、または等容量のＰＢＳの投与後におけるＳＤラットについての、代表的な血液学的プロファイルを示す表である。肝機能、腎機能、および膵機能、ならびに電解質レベルの相関因子についての解析の結果を示す。ＲＢＣ＝赤血球、ＭＶＣ＝平均値赤血球容積、ＭＣＨ＝平均値赤血球ヘモグロビン、ＭＣＨＣ＝平均値赤血球ヘモグロビン濃度、ＷＢＣ＝白血球、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＰ＝アルカリホスファターゼ、ＣＲＥＡ＝クレアチニン、ＢＵＮ＝血中尿素窒素、ＧＬＵ＝グルカゴン、ＡＭＹ＝アミラーゼ、ＮＡ＝ナトリウム、Ｋ＝カリウム、Ｐ＝リン、およびＣＡ＝カルシウムである。
以下の実施例では、本発明者らは、ＶＩＳＴＡ分子内の、目的の特異的領域へとターゲティングされる、新規の抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンの作出、ならびにこれらの抗原結合性分子についての生物物理的および機能的特徴付け、ならびに治療的評価について記載する。
実施例１
ＶＩＳＴＡ標的のデザインおよび抗ＶＩＳＴＡ抗体ハイブリドーマの作製
本発明者らは、ＶＩＳＴＡ結合性モノクローナル抗体を惹起するために、ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３）の細胞外領域内の領域を選択した。
ＦＧループ領域は、ＶＩＳＴＡのこの領域が、ＶＩＳＴＡの阻害性機能に重要であると提起されている（Ｖｉｇｄｏｒｏｖｉｃｈら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２０１３；２１（５）：７０７〜７１７）ため、ターゲティングした。ＶＩＳＴＡの、正面を向くβシート領域もまた、ターゲティングした。
１．１ ハイブリドーマの作製
約６週齢の、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＩｎＶｉｖｏｓ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から得た。動物は、特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。
ハイブリドーマの作製のために、マウスを、抗原性ペプチド、組換え標的タンパク質、または標的タンパク質を発現する細胞の、本発明者らに所有権がある混合物で免疫化した。
融合のための脾臓を採取する前に、マウスに、抗原混合物を、連続３日間にわたり追加免役した。最終追加免役の２４時間後、全脾臓細胞を単離し、製造元の指示書（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）に従い、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹハイブリドーマクローニングキットを使用して、ＰＥＧにより、骨髄腫細胞株である、Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）と融合させた。
融合細胞は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内の、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｃ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）中で、一晩にわたり培養した。翌日、融合細胞を遠心分離し、１０ｍｌのＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｃ中に再懸濁させ、次いで、ＨＡＴ成分を含有する、９０ｍｌの、半固体メチルセルロースベースの、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ培地Ｄ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）と、静かに混合し、これにより、ハイブリドーマの選択と、クローニングとを、１つステップへと組み合わせた。
次いで、融合細胞を、９６ウェルプレートへと播種し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で増殖させた。７〜１０日後、単一のハイブリドーマクローンを単離し、抗体産生ハイブリドーマを、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、上清をスクリーニングすることにより選択した。
１．２ 抗体可変領域の増幅およびシーケンシング
製造元のプロトコールを使用する、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して、全ＲＮＡを、ハイブリドーマ細胞から抽出した。製造元の指示書に従い、ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標）、ＵＳＡ）を使用して、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。略述すると、５’−ＲＡＣＥ ＣＤＳプライマー（キット内に提供された）、および５’アダプター（ＳＭＡＲＴｅｒ ＩＩ Ａプライマー）を使用して、全長ｃＤＮＡを作出するのに、１μｇの全ＲＮＡを使用し、次いで、製造元の指示書に従い、各ｃＤＮＡへと組み込んだ。ｃＤＮＡ合成反応物は、５倍濃度のＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ緩衝液、ＤＴＴ（２０ｍＭ）、ｄＮＴＰミックス（１０ ｍＭ）、ＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／μｌ）、およびＳＭＡＲＴＳｃｒｉｂｅ逆転写酵素（１００Ｕ／μｌ）を含有した。
ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標）、ＵＳＡ）を使用して、ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）の準備ができたｃＤＮＡを増幅した。増幅反応物は、ＳｅｑＡｍｐ ＤＮＡポリメラーゼ、２倍濃度のＳｅｑ ＡＭＰ緩衝液、５’ＳＭＡＲＴｅｒ Ｒａｃｅキットで提供される、アダプター配列に相補的な、５’ユニバーサルプライマー、および、それぞれの重鎖定常領域または軽鎖定常領域のプライマーにアニーリングする、３’プライマーを含有した。５’定常領域は、Ｋｒｅｂｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９７、２０１：３５〜５５；Ｗａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０００、２３３、１６７〜１７７；またはＴｉｌｌｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００９、３５０：１８３〜１９３により、既に報告されたプライマーミックスに基づきデザインした。以下の熱プロトコール：９４℃で、１分間にわたる、前変性サイクル；９４℃で、３０秒間、５５℃で、３０秒間、および７２℃で、４５秒間にわたる、３５サイクル；７２℃で、３分間にわたる、最終伸長を使用した。
ＣｌｏｎｅＪＥＴ ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、結果として得られる、約５５０ｂｐである、ＶＨおよびＶＬのＰＣＲ産物を、ｐＪＥＴ１．２／ｂｌｕｎｔベクターへとクローニングし、高度にコンピテントのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換するのに使用した。Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、結果として得られる形質転換体から、プラスミドＤＮＡを調製し、シーケンシングした。ＤＮＡシーケンシングは、ＡＩＴｂｉｏｔｅｃｈにより行われた。ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＭＧＴ（ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ）ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＬｅＦｒａｎｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１５）、４３（データベース号）：Ｄ４１３〜２２）を使用して、これらのシーケンシングデータを解析して、個々のＣＤＲおよびフレームワーク配列を特徴付けた。ＶＨおよびＶＬの５’末端におけるシグナルペプチドは、ＳｉｇｎａｌＰ（ｖ ４．１；Ｎｉｅｌｓｅｎ；Ｋｉｈａｒａ，Ｄ（編）：「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１６１１巻）５９〜７３、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０１７）により同定した。
次いで、抗ＶＩＳＴＡモノクローナル抗体クローンを、さらなる開発および特徴付けのために選択した。
また、抗体クローンである、４Ｍ２−Ｃ１２（本明細書ではまた、「Ｖ４」とも称される）のヒト化バージョンも、抗体のＣＤＲを、ヒト抗体フレームワーク領域を含むＶＨおよびＶＬへとクローニングすることにより、標準的な方法に従い調製した。
Figure 2021511818
 実施例２
抗体の作製および精製
２．１ ＶＨおよびＶＬの、発現ベクターへのクローニング：
ヒト−マウスキメラ抗体を構築するために、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンの、重および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ｐｍＡｂＤＺ＿ＩｇＧ１＿ＣＨおよびｐｍＡｂＤＺ＿ＩｇＧ１＿ＣＬ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＵＳＡ）の真核生物発現ベクターへとサブクローニングした。
代替的に、ヒト−マウスキメラ抗体を構築するために、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンの、重および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１およびｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、ＵＳＡ）の真核生物発現ベクターへとサブクローニングした。ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１によりコードされるヒトＩｇＧ１定常領域は、ＣＨ３領域内に、ヒトＩｇＧ１定常領域（ＩＧＨＧ１；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８５７−１、ｖ１；配列番号２１０）と比べた置換である、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ（ＥＵ番号付けに従い番号付けされた位置）を含む。ｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋは、ヒトＩｇＧ１軽鎖カッパ定常領域（ＩＧＣＫ；ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１８３４−１、ｖ２）をコードする。
製造元のプロトコールに従い、ＳｅｑＡｍｐ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標）、ＵＳＡ）を使用して、可変領域を、シグナルペプチドと共に、クローニングベクターから増幅した。ＶＨまたはＶＬ内の、適切な領域と重複する、１５〜２０ｂｐに加えて、５’末端における、制限部位として、６ｂｐを有する、フォワードおよびリバースプライマーを使用した。ＤＮＡインサートおよびｐＦＵＳＥベクターを、製造元により推奨される制限酵素で消化して、フレームシフトが、導入されていないことを確認し（例えば、ＶＨには、ＥｃｏＲＩおよびＮｈｅＩであり、ＶＬには、ＡｇｅＩおよびＢｓｉＷＩである）、Ｔ４リガーゼ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して、そのそれぞれのプラスミドへとライゲーションした。ＤＮＡインサートの、ベクターに対する、３：１のモル比を、ライゲーションのために使用した。
２．２ 哺乳動物細胞内の、抗体の発現
製造元の指示書に従い、１）Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）、または２）ＨＥＫ２９３−６Ｅ一過性発現系（ＣＮＲＣ−ＮＲＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、抗体を発現させた。
１）Ｅｘｐｉ２９３一過性発現系：
細胞株の維持：
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（ＵＳＡ）から得た。細胞は、３７℃、８％ＣＯ２、振とう型プラットフォームを伴う、８０％の加湿式インキュベーター内の、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を補充した、無血清、無タンパク質の既知組成培地（Ｅｘｐｉ２９３発現培地、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）中で培養した。
トランスフェクション：
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に、その製造元のプロトコールに従い、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬キット（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を使用して、発現プラスミドをトランスフェクトした。略述すると、培養物をスピンダウンすることにより、抗生剤を除去するように、維持状態の細胞を、培地交換にかけ、細胞ペレットを、トランスフェクションの１日前に、抗生剤を伴わない新鮮培地中に再懸濁させた。トランスフェクション日に、各トランスフェクションのために、１ｍｌ当たりの生存細胞２．５×１０６個を、シェーカーフラスコ内に播種した。細胞へと添加する前に、血清低減培地である、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）中、室温で、２５分間にわたり、ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ複合体を形成した。トランスフェクションの１６〜１８時間後に、転写促進因子を、トランスフェクトされた細胞へと添加した。トランスフェクションの４日後に、等量の培地を、トランスフェクタントの上にかけ、細胞の凝集を防止した。トランスフェクタントを、４０００×ｇで、１５分間にわたる、７日目により採取し、０．２２μｍの滅菌フィルターユニットを通して濾過した。
２）ＨＥＫ２９３−６Ｅ一過性発現系
細胞株の維持：
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｃａｎａｄａから得た。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２、振とう型プラットフォームを伴う、８０％の加湿式インキュベーター内の、０．１％のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ−Ｐ１８８および４ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）および２５μｇ／ｍｌのＧ−４１８を補充した、無血清、無タンパク質、既知組成のＦｒｅｅｓｔｙｌｅ Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で培養した。
トランスフェクション：
ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に、その製造元のプロトコールに従い、ＰＥＩｐｒｏ（商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、ＵＳＡ）を使用して、発現プラスミドをトランスフェクトした。略述すると、遠心分離により、抗生剤を除去するように、維持状態の細胞を、培地交換にかけ、細胞ペレットを、トランスフェクションの１日前に、抗生剤を伴わない新鮮培地と共に再懸濁させた。トランスフェクション日に、各トランスフェクションのために、１ｍｌ当たりの生存細胞１．５〜２×１０６個を、シェーカーフラスコ内に播種した。ＤＮＡとＰＥＩｐｒｏ（商標）とを、１：１の比で混合し、細胞へと添加する前に、ＲＴで、５分間にわたり、Ｆ１７培地中で、複合体を形成させた。トランスフェクションの２４〜４８時間後に、０．５％（ｗ／ｖ）のＴｒｙｐｔｏｎｅ Ｎ１を、トランスフェクタントへとフィードした。トランスフェクタントを、４０００×ｇで、１５分間にわたる、６〜７日目により採取し、上清を、０．２２μｍの滅菌フィルターユニットを通して濾過した。
細胞に、以下の組合せのポリペプチドをコードするベクターをトランスフェクトした。
Figure 2021511818
Figure 2021511818
 ２．３ 抗体の精製
アフィニティー精製、緩衝液交換、および保管：
トランスフェクトされた細胞により、培養物上清へと分泌された抗体は、液体クロマトグラフィーシステムである、ＡＫＴＡ Ｓｔａｒｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を使用して精製した。具体的には、上清を、ＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）へと、５ｍｌ／分の結合速度でロードするのに続き、カラムを、１０カラム容量の洗浄緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で洗浄した。結合したｍＡｂを、溶出緩衝液（０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．７）により溶出させ、溶出液を、適量の中和緩衝液（１Ｍのトリス、ｐＨ９）を含有する回収チューブへと分画した。カットオフ分子量（ＭＷＣＯ）３０Ｋタンパク質濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）またはＭＷＣＯ ３，５Ｋ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳＡ）を使用して、精製されたｍＡｂを含有する、中和溶出緩衝液を、ＰＢＳへと交換した。０．２２μｍのフィルターを通すことにより、モノクローナル抗体を滅菌し、アリコート分割し、保管のために、−８０℃で凍結させた。
２．４ 抗体純度解析
サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）：
抗体純度を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）上の、ＰＢＳランニング緩衝液中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を使用する、サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により解析した。５００μｌのＰＢＳ ｐＨ７．２中に、１５０μｇの抗体を、室温、０．７５ｍｌ／分の流量で、カラムへと注入した。タンパク質を、それらの分子量に従い溶出させた。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例２．２の［１］）についての結果を、図１０に示す。
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：
抗体純度もまた、標準的な方法に従う、還元条件下および非還元条件下における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。略述すると、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用して、タンパク質を分解するのに、４％〜２０％のＴＧＸタンパク質ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を使用した。非還元条件のために、ゲルへとロードする前に、２倍濃度のＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）と混合することにより、タンパク質試料を変性させ、９５℃で、５〜１０分間にわたり煮沸した。還元条件のために、５％のβ−メルカプトエタノール（βＭＥ）または４０ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール）を含有する、２倍濃度の試料緩衝液を使用した。電気泳動は、１５０Ｖの一定電圧下、ＳＤＳランニング緩衝液（２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、１％のＳＤＳ、ｐＨ８．３）中、１時間にわたり行った。
ウェスタンブロット：
タンパク質試料（３０μｇ）を、上記で記載した通りに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロース膜へと転写した。次いで、膜をブロッキングし、４℃で、一晩にわたり、抗体による免疫ブロットにかけた。次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、３回にわたり洗浄した後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体と共に、室温で、１時間にわたりインキュベートした。結果は、化学発光による、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ基質ウェスタンブロット検出システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）によって視覚化し、オートラジオグラフィーフィルム（Ｋｏｄａｋ ＸＡＲフィルム）へと曝露した。
検出のために使用される一次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＬＩ−ＣＯＲ；型番：９２６〜３２２１０）であった。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例２．２の［１］）についての結果を、図１１に示す。Ｖ４は、高濃度で、容易に発現され、精製され、加工された。
実施例３
生物物理的特徴付け
３．１ フローサイトメトリーによる、細胞表面における抗原結合についての解析
野生型ＨＥＫ２９３細胞（高レベルのＶＩＳＴＡを発現させない）、およびヒトＶＩＳＴＡをコードするベクターをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（すなわち、ＨＥＫ ２９３ ＨＥＲ Ｏ／Ｅ細胞）を、２０μｇ／ｍｌの抗ＶＩＳＴＡ抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に、４℃で、１時間にわたりインキュベートした。ＷＯ２０１５／０９７５３６において記載された、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、ＶＳＴＢ１１２を、陽性対照として、解析に組み入れた。
細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡと、０．５％のＢＳＡとを伴うＰＢＳ）で、３回にわたり洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＦＣ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中、２〜８℃で、４０分間にわたり再懸濁させた。細胞を再度洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、フローサイトメトリー解析のために、２００μＬのＦＡＣＳフロー緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡを伴うＰＢＳ）中に再懸濁させた。収集の後、Ｆｌｏｗｌｏｇｉｃソフトウェアを使用して、全ての生データを解析した。前方および側方散乱のプロファイルを使用して、細胞にゲートをかけ、蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の値を、天然および過剰発現細胞集団について決定した。
結果を、図１Ａ〜１Ｄ、図２、および図２４に示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体は、ヒトＶＩＳＴＡに、高度の特異性で結合することが示された。
別個の実験では、１３Ｄ５ｐ（実施例２．２の［１４］）を、カニクイザルＶＩＳＴＡまたはマウスＶＩＳＴＡをコードするベクターをトランスフェクトされた細胞に結合する、その能力について解析した。１３Ｄ５ｐは、カニクイザルＶＩＳＴＡおよびマウスＶＩＳＴＡとの交差反応性を呈することが見出された。
３．２ Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システムを使用する、グローバルアフィニティー研究
Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）実験を実施した。抗５×ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）でコーティングされたバイオセンサーチップ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を使用して、Ｈｉｓタグ付けした、ヒト、カニクイザル、またはマウスＶＩＳＴＡを捕捉した（２７０ｎＭ）。全ての測定は、２５℃、１０００ｒｐｍで攪拌しながら実施した。抗原への結合についての反応速度の測定は、抗ＶＩＳＴＡ抗体を、異なる濃度（図に表示の）で、１２０秒間にわたりロードするのに続き、１２０秒間の解離時間を置き、バイオセンサーを、アッセイ緩衝液を含有するウェルへと導入することにより実施した。緩衝液効果について、センサーグラムを参照し、次いで、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４ユーザーソフトウェア（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ、ＵＳＡ）を使用して当てはめた。反応速度応答は、１部位結合モデルを使用するグローバルフィッティングにかけて、会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）、および平衡解離定数（ＫＤ）についての値を得た。ソフトウェアにより、信頼できる形で（Ｒ２＞０．９０）当てはめうる曲線だけを、解析に組み入れた。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（すなわち、実施例２．２の［１］）による結合についての解析のための、代表的なセンサーグラムを、図３Ａ〜３Ｃに示す。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４は、ヒトおよびカニクイザルＶＩＳＴＡに、ＫＤ≦１ｐＭのアフィニティーで結合し、マウスＶＩＳＴＡに、ＫＤ＝１１３ｎＭのアフィニティーで結合することが見出された。
３．３ 抗体の特異性を決定するためのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを使用して、抗体の結合特異性を決定した。抗ＶＩＳＴＡ抗体を、ヒトＶＩＳＴＡポリペプチド、それぞれの、マウスおよびカニクイザルの相同体、ならびにヒトＰＤ−Ｌ１およびヒトＨＥＲ３（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｎａ）への結合について解析した。
ＥＬＩＳＡを、標準的なプロトコールに従い行った。略述すると、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、３７℃で、２時間にわたり、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に１μｇ／ｍｌの標的タンパク質によりコーティングした。トリス緩衝液生理食塩液（ＴＢＳ）中、１０％のＢＳＡによる、室温で、１時間にわたるブロッキングの後、被験抗体を、最高濃度を３０μｇ／ｍｌとして系列希釈（１２点の系列希釈）し、プレートへと添加した。室温で、１時間にわたるインキュベーション後、プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）で、３回にわたり洗浄し、次いで、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）と共に、室温で、１時間にわたりインキュベートした。洗浄の後、プレートを、比色検出基質である、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ；Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）により、室温で、１５分間にわたり現像した。２ＭのＨ２ＳＯ４で、反応を停止させ、３０分以内に、４５０ｎｍで、ＯＤを測定した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例２．２の［１］）により得られた結果を、図４Ａに示す。クローンである、Ｖ４は、ヒト、カニクイザル、およびマウスＶＩＳＴＡに結合することが可能であることが見出されたが、ヒトＰＤ−Ｌ１またはヒトＨＥＲ３との交差反応性を呈さなかった（極めて高濃度であってもなお）。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１（実施例２．２の［１５］）により得られた結果を、図２０に示す。クローンである、１３Ｄ５−１は、ヒト、カニクイザル、およびマウスＶＩＳＴＡに結合することが可能であることが見出された。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１３（実施例２．２の［１６］）により得られた結果を、図２１に示す。クローンである、１３Ｄ５−１３は、ヒトおよびマウスＶＩＳＴＡに結合することが可能であることが見出された。
さらなる実験では、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例２．２の［１］）を、ＥＬＩＳＡにより、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、およびＣＴＬＡ４に結合する能力について解析した。結果を、図４Ｃに示す。クローンである、Ｖ４は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、またはＣＴＬＡ４のうちのいずれとも交差反応しないことが見出された。
３．４ 示差走査蛍光測定法による、熱安定性についての解析
略述すると、０．２ｍｇ／ｍＬの、３連の抗体反応ミックス、およびＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、２５μＬのＰＢＳ中で調製し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェル反応プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のウェルへと移し、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｆｉｌｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でシーリングした。ＴＡＭＲＡを、レポーターとして選択し、ＲＯＸを、受動参照として選択して、溶融曲線解析を、７５００ ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実行した。熱プロファイルは、傾斜率を１．２％として、２５℃で、２分間の初期ステップと、９９℃で、２分間の最終ステップとを含んだ。生データの一次微分を、温度の関数としてプロットして、微分溶融曲線を得た。抗体の溶融温度（Ｔｍ）は、微分曲線のピークから抽出した。
抗体クローンである、Ｖ４のＩｇＧ１フォーマット（すなわち、実施例２．２の［１］）の熱安定性に対する、示差走査蛍光測定解析について得られた生データの一次微分を、図９に示す。Ｔｍを、６７．５℃であると決定した。
実施例４
機能的特徴付け
４．１ ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ−３との相互作用
本発明者らは、ＶＳＩＧ−３が、ＶＩＳＴＡに対するリガンドとして振る舞うのかどうかについて、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用する、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）解析により調べた。略述すると、抗ヒトＦｃ捕捉バイオセンサーを使用して、１００ｎＭの濃度の、Ｆｃタグ付けＶＳＩＧ−３を捕捉し、捕捉されたＶＳＩＧ−３の、３０００ｎＭから始まり、３つの系列希釈を後続させる濃度で適用されたＶＩＳＴＡとの会合を測定し、ＰＢＳ対照と比較した。
代表的なセンサーグラムを、図５に示す。ＶＳＩＧ−３と、ＶＩＳＴＡとの会合のアフィニティーを、ＫＤ≒５．２８μＭであると計算した。
本発明者らは、次に、抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ−３との相互作用を阻害する能力について解析した。
略述すると、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、４℃で、１６時間にわたり、１倍濃度のＰＢＳ中に、１μｇ／ｍｌの、非タグ付けまたはＦｃタグ付けＶＳＩＧ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）によりコーティングした。ＴＢＳ中１％のＢＳＡによる、室温で、１時間にわたるブロッキングの後、１５μｇ／ｍｌのＶＩＳＴＡ／ヒトＨｉｓタグ付け融合タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｎａ）を、濃度を増大させる、抗ＶＩＳＴＡ抗体の存在下または非存在下で添加し、室温で、１時間にわたり、インキュベートした。その後、プレートを、ＴＢＳ−Ｔで、３回にわたり洗浄し、次いで、ＨＲＰコンジュゲート抗Ｈｉｓ二次抗体と共に、室温で、１時間にわたりインキュベートした。洗浄の後、プレートを、比色検出基質である、Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）で現像した。２ＭのＨ２ＳＯ４で、反応を停止させ、４５０ｎｍで、ＯＤを測定した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、５Ｍ１−Ａ１１および９Ｍ２−Ｃ１２（実施例２．２の［１０］および［１３］）について得られた結果を、図６に示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体は、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ−３との相互作用の、用量依存性阻害を呈した。
さらなる実験では、４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）による、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ−３との相互作用の阻害について解析した。無関係な標的抗原に特異的な抗体、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照による、ＶＩＳＴＡ：ＶＳＩＧ−３間相互作用の阻害もまた、対照条件として解析した。結果を、図３２に示す。４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１は、ＶＩＳＴＡ：ＶＳＩＧ−３間相互作用を、用量依存的に阻害することが見出された。
さらなる実験では、４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）による、ＶＩＳＴＡとＶＳＩＧ−３との相互作用の阻害を、ＶＩＳＴＡ−Ｆｃを、捕捉剤として使用するアッセイにおいて解析した。略述すると、３８４ウェルプレートのウェルを、０．５μｇ／ｍｌのＶＩＳＴＡ−Ｆｃ ３０μｌにより、室温で、１時間にわたりコーティングした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、室温で、ＴＢＳ中に１％のＢＳＡにより、１時間にわたりブロッキングした。４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体の系列希釈液を、０．３μｇ／ｍｌのＶＩＳＧ３−Ｈｉｓと併せて、プレートへと添加した。室温で、１時間にわたるインキュベーションの後、プレートを、ＰＢＳ−Ｔで、５回にわたり洗浄し、ヤギ抗ＨＩＳ−ＨＲＰと共に、室温で、１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＰＢＳ−Ｔで、５回にわたり洗浄し、Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢで現像した。２ＭのＨ２ＳＯ４で、反応を停止させ、４５０ｎｍで、ＯＤを測定した。
結果を、図５４に示す。４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１は、ＶＩＳＴＡ：ＶＳＩＧ−３間相互作用を、用量依存的に阻害することが見出された。
４．２ ＶＩＳＴＡと、ＰＳＧＬ−１との相互作用
本発明者らは、次に、ＰＳＧＬ−１が、ＶＩＳＴＡに対するリガンドとして振る舞うのかどうかについて、フローサイトメトリーベースのアッセイにおいて調べた。
略述すると、ヒトＶＩＳＴＡタンパク質を過剰発現させるように修飾された（ヒトＶＩＳＴＡをコードする構築物のトランスフェクションにより）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞１００，０００個を、ＨＢＳＳ、０．５％のＢＳＡ、および２ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ６．０を含む緩衝液中、４℃で１５分間にわたり、濃度を、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、または８０μｇ／ｍｌとする、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）またはアイソタイプとマッチさせた対照抗体と共インキュベートした。次いで、１５μｇ／ｍｌのＦｃタグ付けヒトＰＳＧＬ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、型番：３３４５−ＰＳ）または同じ量のＦｃタグ付け無関係な抗原を、細胞へと添加し、次いで、これを、４℃で、さらに４５分間にわたりインキュベートした。その後、細胞を、緩衝液で３回にわたり洗浄し、次いで、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＰＳＧＬ１抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；型番：１３０−１０４−７０６）を、１：１１の希釈倍率で添加するか、またはＡｌｅｘ４８８コンジュゲート抗Ｆｃ抗体を、１：２００の希釈倍率で添加し、細胞を、４℃で１５分間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、緩衝液で３回にわたり洗浄し、フローサイトメトリーにより解析した。
結果を、図５５に示す。４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１は、ＰＳＧＬ−１の、ＶＩＳＴＡへの結合を、用量依存的に阻害することが見出された。
４．３ ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達の阻害
本発明者らは、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５ｐが、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害しうるのかどうかについて、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用する解析により調べた。
略述すると、製造元の指示書に従い、Ｓｅｐｔａｍａｔｅキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、ＰＢＭＣを、非血縁ドナーから単離した（刺激因子およびエフェクター集団を得るために）。刺激細胞を、３７℃で２０分間にわたり、５０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）により処理し、１倍濃度のＰＢＳにより、５回にわたり洗浄した後で使用した。刺激因子集団を、ウェル１つ当たりの細胞０．５×１０５個、レスポンダー集団を、ウェル１つ当たりの細胞１．０×１０５個で、２０μｇ／ｍｌの最高濃度から濃度を増大させる、被験抗体の存在下または非存在下において播種した。５日後、上清を採取し、ＩＬ−１７、ＩＬ−２Ａ、およびＩＦＮ−γのレベルを、標準的なプロトコールに従うＥＬＩＳＡにより決定した。
結果を、図７Ａおよび７Ｂに示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体である、１３Ｄ５ｐは、ＩＬ−１７、ＩＬ−２、およびＩＦＮ−γのレベルの増大を結果としてもたらすことが見出された。図８Ａおよび８Ｂは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、ＭＩＨ５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、同じアッセイにおいて得られた結果を示す。
実施例５
ｉｎ ｖｉｖｏにおける解析
ｉｎ ｖｉｖｏ研究のために、４Ｍ２−Ｃ１２を、マウスＩｇＧ２ａフォーマットで作製した。分子は、配列番号２４８に示された配列を有する、重鎖ポリペプチドと、配列番号２５０に示された配列を有する、軽鎖ポリペプチドとのヘテロマーである。４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａは、ＣＨＯ細胞内の、重鎖ポリペプチドをコードする核酸と、軽鎖ポリペプチドをコードする核酸との共発現により作製し、その後、精製した。
Figure 2021511818
 ５．１ 薬物動態解析
約６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。
６００μｇの抗ＶＩＳＴＡ抗体を投与し、血液は、３匹のマウスから、心臓穿刺により、ベースライン（−２時間後）、０．５時間後、投与の６時間後、２４時間後、９６時間後、１６８時間後、および３３６時間後に得た。血清中の抗体を、ＥＬＩＳＡにより定量した。
薬物動態解析のためのパラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、ＡＵＣ（０〜３３６時間）、ＡＵＣ（０〜無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）は、非コンパートメントモデルから導出した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例５の［１７］）について得られた結果を、図１２に示す。この抗体クローンは、１１．７日間の半減期を有することが見出された。
５．２ ｉｎ ｖｉｖｏにおける、がんを処置する有効性についての解析
約６〜８週齢の、雌ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＩｎＶｉｖｏｓ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から購入した。動物は、特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。
研究で使用される細胞株は、ＡＴＣＣから得られる、ＬＬ２細胞（Ｌｅｗｉｓ肺癌）、４Ｔ１細胞（乳がん）、ＣＴ２６細胞（結腸癌）、Ｃｌｏｎｅ−Ｍ３細胞（黒色腫）、およびＥＬ４細胞（Ｔ細胞白血病／リンパ腫）を含んだ。Ｂ１６−ＢＬ６細胞（黒色腫）は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏａｒｒａｙから得た。細胞株は、供給元の指示書に従い維持し、ＬＬ２細胞、Ｂ１６−ＢＬ６細胞、およびＥＬ４細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ中で培養し、４Ｔ１細胞およびＣＴ２６細胞は、１０％のＦＢＳおよび１％のＰｅｎ／ＳｔｒｅｐＳｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。Ｃｌｏｎｅ−Ｍ３細胞は、２．５％のＦＢＳ、１５％のウマ血清、および１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＦ１２−Ｋ培地中で増殖させた。全ての細胞は、５％のＣＯ２インキュベーター内、３７℃で培養した。
同系腫瘍モデルは、ＬＬ２（２×１０５個）、４Ｔ１（５×１０５個）、ＣＴ２６（１×１０５〜１×１０６個）、Ｃｌｏｎｅ−Ｍ３（５×１０５個）、ＥＬ４（２×１０５個）、またはＢ１６−ＢＬ６（１×１０５個）細胞を、マウスの右脇腹へと、皮下注入することにより作出した。
植込みの３日後、抗ＶＩＳＴＡ抗体を、３日ごと、合計６回の投与にわたり、腹腔内投与した。対照群には、同じ用量間隔で、溶媒処置を施した。
腫瘍体積は、デジタル式キャリパーを使用して、毎週３回測定し、式［Ｌ×Ｗ２／２］を使用して計算した。対照アームの腫瘍が、＞１．５ｃｍの長さと測定されたら、研究の終点に到達したと考えた。
５．２．１ ＣＴ２６細胞モデル
図１３は、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例５の［１７］）の抗がん効果を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、１０Ｆ．９Ｇ２の抗がん効果と、ＣＴ２６細胞株に由来する、同系マウス結腸癌モデルにおいて比較する実験において得られた結果を示す。モデルは、ＣＴ２６細胞１００，０００個の、Ｂａｌｂ／ｃマウス（処置群１つ当たりのマウスのｎ＝８）の右脇腹への皮下注入により確立した。
Ｖ４または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、３日目から、３日ごとに、投与１回当たり３００μｇで投与した。投与１回当たり３００μｇのＶ４＋３００μｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体による組合せ処置もまた、解析に組み入れた。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４は、このモデルにおいて、高度に強力であり、腫瘍増殖を、約６０％阻害することが可能であることが見出された。
２１日目に、腫瘍を採取し、ＮｅｗｍａｎらＮａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２０１５）、１２（５）：４５３〜４５７に記載された方法に従う、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析により、Ａｒｇ１ ＲＮＡ発現について評価した。結果を、図３９に示す。４Ｍ２−Ｃ１２による処置は、２１日目の腫瘍内における、Ａｒｇ１発現の著明な低減と関連した。
別の実験では、ＣＴ２６細胞株に由来する、同系マウス結腸癌モデルは、ＣＴ２６細胞１００，０００個の、Ｂａｌｂ／ｃマウス（処置群１つ当たりのマウスのｎ＝８）の右脇腹への皮下注入により確立し、マウスを、３日目から、３日ごとに、投与１回当たり３００μｇの、アイソタイプ対照抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、１０Ｆ．９Ｇ２、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例５の［１７］）、抗ＴＩＧＩＴ抗体クローンである、１Ｇ９、抗ＬＡＧ−３抗体クローンである、Ｃ９Ｂ７Ｗ、抗ＴＩＭ−３抗体クローンである、ＲＭＴ３−２３の投与により処置するか、または３００μｇの、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローン１０Ｆ．９Ｇ２の、３００μｇずつの、他の抗体の各々との組合せ処置もまた、解析に組み入れた。
１５日目に検出された腫瘍増殖の阻害の計算結果を、図１４に示す。この実験では、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４は、免疫チェックポイント分子に対する他の任意の単剤療法より強力な、腫瘍増殖の阻害剤であることが見出され、抗ＰＤ−Ｌ１療法と組み合わせて、良好な効能を及ぼすことが見出された。
次いで、本発明者らは、ＣＴ２６腫瘍を、同じ方式で確立する、さらなる実験を実施し、マウスに、隔週で、３００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４、２００μｇの、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、１０Ｆ．９Ｇ２、３００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４＋２００μｇの、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、１０Ｆ．９Ｇ２、または対照条件としてのＰＢＳを投与した。実験の終了時に、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＮｅｗｍａｎらＮａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２０１５）、１２（５）：４５３〜４５７において記載された方法に従い、腫瘍を、ＲＮＡ−ｓｅｑにより解析して、ＭＤＳＣ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、およびＴｒｅｇの相対数を決定した。
結果を、図１５に示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（単独の、または抗ＰＤ−Ｌ１処置と組み合わせた）による処置は、ＭＤＳＣの数を低減し、ＣＤ８ Ｔ細胞：Ｔｒｅｇ比を増大させることが見出された。抗ＶＩＳＴＡ抗体による処置と関連する、腫瘍微小環境内の、遺伝子発現の変化についての解析もまた、食作用過程（例えば、アクチンフィラメントベースの運動）に関与する遺伝子の発現の上方調節、およびアルギナーゼ１の発現の下方調節（免疫抑制性でない環境を結果としてもたらす）を明らかにした。
さらなる実験では、ＣＴ２６細胞株に由来する、同系マウス結腸癌モデルを、上記で記載した通りに、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて確立し、マウスに、３日目から、３日ごとに、（ｉ）６００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１、（ｉｉ）２００μｇの、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、１０Ｆ．９Ｇ２、（ｉｉｉ）６００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１＋２００μｇの、抗ＰＤ−Ｌ１抗体クローンである、１０Ｆ．９Ｇ２、または（ｉｖ）等容量のＰＢＳ（陰性対照としての）を投与した。
結果を、図２２に示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１（単独の、または抗ＰＤ−Ｌ１処置と組み合わせた）は、このモデルにおいて、腫瘍増殖を阻害することが可能であることが見出された。
５．２．２ ＬＬ２細胞モデル
ＬＬ２モデルは、ＬＬ２細胞２００，０００個の、Ｂａｌｂ／ｃマウス（処置群１つ当たりのマウスのｎ＝８）の右脇腹への皮下注入により確立し、その後、マウスに、隔週で、６００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例５の［１７］）、または陰性対照としての、等容量の溶媒を投与した。
実験の結果を、図１６に示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４は、このモデルにおいて、高度に強力であり、腫瘍増殖を、約４４％阻害することが可能であることが見出された。
５．２．３ Ｂ１６−ＢＬ６細胞モデル
Ｂ１６−ＢＬ６モデルは、Ｂ１６−ＢＬ６細胞２００，０００個の、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（処置群１つ当たりのマウスのｎ＝８）の右脇腹への皮下注入により確立し、その後、マウスに、隔週（合計６回の投与にわたる）で、６００μｇの抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４（実施例５の［１７］）、２００μｇの抗ＰＤ−１抗体である、ＲＭＰ１−１４（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）、６００μｇの抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４＋２００μｇの抗ＰＤ−１抗体、または陰性対照としての、等容量の溶媒を投与した。
実験の結果を、図１７に示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４は、このモデルにおいて、抗ＰＤ−１抗体処置と組み合わせて、高度に強力であることが見出された。
５．２．４ ４Ｔ１細胞モデル
４Ｔ１細胞株に由来する、同系マウス乳癌モデルは、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、４Ｔ１細胞２５０，０００個の、右脇腹への皮下注入により確立した。
その後、マウスに、３日目から、３日ごとに（合計６回の投与にわたり）、３００または６００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１、アイソタイプ対照抗体、または陰性対照としての、等容量の溶媒を投与した。
実験の結果を、図２３に示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、１３Ｄ５−１は、このモデルにおいて、高度に強力であり、腫瘍増殖を、約７０％阻害することが可能であることが見出された。
５．３ 安全性についての薬理学、毒性学、および免疫毒性
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４、ならびにヒト化バージョンである、Ｖ４Ｈ１およびＶ４Ｈ２を、ＩＭＧＴ ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（Ｅｈｒｅｎｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３８、Ｄ３０１〜３０７（２０１０））およびＩＥＤＢ脱免疫化（Ｄｈａｎｄａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１８）、１５３（１）：１１８〜１３２）ツールを使用して、コンピュータにより、安全性および免疫原性について解析した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４Ｈ１およびＶ４Ｈ２は、ヒト重鎖および軽鎖に対して、ヒト化されたと考えるのに十分な（すなわち、＞８５％の）相同性を有し、潜在的な免疫原性ペプチドの数が、安全であると考えるのに十分なほど少なく、潜在的な開発可能性問題を引き起こしうる、他の特性を所有しなかった。
本発明者らまた、実施例５．２に記載される実験の経過中に、マウスを秤量し、肉眼剖検による徴候についても解析したが、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４で処置されたマウスは、ＰＢＳで処置された対照マウスとの差違を呈さなかった。図４４は、実施例５．２．１に記載された研究の経過中に得られた結果を示す。
本発明者らは、マウスに、９００μｇの、抗ＶＩＳＴＡ抗体クローンである、Ｖ４、または等容量のＰＢＳの単回投与用量を注射する実験において、血液毒性についてさらに調べた。
血液試料を得、ＨＭ５ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して、異なる種類の白血球の数について解析した。結果を、図１８に示すが、多数の異なる細胞型は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによる参照範囲内にあり、Ｖ４処置群と、ＰＢＳ処置群との間で異ならず、異なる群間で、臨床徴候、肉眼剖検、または体重の差違は検出されなかった。
マウスはまた、肝毒性および腎毒性の相関因子についても解析され、結果を、図１９に示す。検出されたレベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによる参照範囲内にあり、Ｖ４処置群と、ＰＢＳ処置群との間で異ならなかった。
５．４ 進行性充実性腫瘍の処置
ヒトにおける第一段階
標準治療による処置の後で、疾患の進行または処置の不忍容を示すが、十分な臓器機能およびＥＣＯＧ ＰＳを示す、進行性または転移性の充実性腫瘍を伴う患者を、安全性補正型「Ｍｉｎｉｍａｌ Ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔ Ｌｅｖｅｌ」（ＭＡＢＥＬ）法に従い計算された用量における、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、Ｖ４（実施例２．２の［１］）、Ｖ４Ｈ１（実施例２．２の［３］）、またはＶ４Ｈ２（実施例２．２の［４］）の静脈内注射により処置する。投与後２８日間にわたり、患者をモニタリングする。
次いで、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）に従い、患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態を決定した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体による処置は、安全かつ忍容性であることが見出される。
用量漸増：単剤療法
標準治療による処置の後で、疾患の進行または処置の不忍容を示すが、十分な臓器機能およびＥＣＯＧ ＰＳを示す、進行性または転移性の充実性腫瘍を伴う患者（ｎ＝１８〜２４）を、３＋３モデルベースの、ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒｄｏｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＥＷＯＣ）型用量漸増に従う、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、Ｖ４（実施例２．２の［１］）、Ｖ４Ｈ１（実施例２．２の［３］）、またはＶ４Ｈ２（実施例２．２の［４］）の静脈内注射により処置する。
次いで、ＣＴＣＡＥ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）に従い、患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態および処置の有効性を評価した。最大耐量（ＭＴＤ）および最大投与量（ＭＡＤ）もまた決定した。
用量漸増：組合せ療法
標準治療による処置の後で、疾患の進行または処置の不忍容を示すが、十分な臓器機能およびＥＣＯＧ ＰＳを示す、進行性または転移性の充実性腫瘍を伴う患者（ｎ＝９）を、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（３ｍｇ／ｋｇ）を伴う、３＋３モデルベースの漸増に従い、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、Ｖ４（実施例２．２の［１］）、Ｖ４Ｈ１（実施例２．２の［３］）、またはＶ４Ｈ２（実施例２．２の［４］）により処置する。
次いで、ＣＴＣＡＥ（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ）に従い、患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態および処置の有効性を評価した。
用量拡大
処置された患者を、全応答率、腫瘍マーカーの発現、循環腫瘍細胞、無増悪生存期間、全生存期間、安全性、および忍容性について解析する。
抗ＶＩＳＴＡ抗体は、安全かつ忍容性であり、がん細胞の数／比率を低減し、腫瘍細胞マーカーの発現を低減し、無増悪生存期間を延長し、かつ、全生存期間を延長することが可能であることが見出される。
５．５ リンパ腫の処置
ヒトにおける第一段階
リンパ腫（ＮＨＬおよびＨＬ）を伴う患者であって、第一選択の化学療法から利益を得なかった患者、同種幹細胞移植を施されたことがなく、リツキシマブ（ＮＨＬ）およびニボルマブまたはペムブロリズマブ（ＨＬ）に応答する可能性が高い患者を、安全性補正型「Ｍｉｎｉｍａｌ Ａｎｔｉｃｉｐａｔｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｆｆｅｃｔ Ｌｅｖｅｌ」（ＭＡＢＥＬ）法に従い計算された用量における、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、Ｖ４（実施例２．２の［１］）、Ｖ４Ｈ１（実施例２．２の［３］）、またはＶ４Ｈ２（実施例２．２の［４］）の静脈内注射により処置する。投与後２８日間にわたり、患者をモニタリングする。
次いで、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）に従い、患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態を決定した。
抗ＶＩＳＴＡ抗体による処置は、安全かつ忍容性であることが見出される。
用量漸増：単剤療法
リンパ腫（ＮＨＬおよびＨＬ）を伴う患者であって、第一選択の化学療法から利益を得なかった患者、同種幹細胞移植を施されたことがなく、リツキシマブ（ＮＨＬ）およびニボルマブまたはペムブロリズマブ（ＨＬ）に応答する可能性が高い患者を、３＋３モデルベースの、ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｖｅｒｄｏｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＥＷＯＣ）型用量漸増に従う、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、Ｖ４（実施例２．２の［１］）、Ｖ４Ｈ１（実施例２．２の［３］）、またはＶ４Ｈ２（実施例２．２の［４］）の静脈内注射により処置する。
次いで、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）に従い、患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態および処置の有効性を査定した。最大耐量（ＭＴＤ）および最大投与量（ＭＡＤ）もまた決定した。
用量漸増：組合せ療法
リンパ腫（ＮＨＬおよびＨＬ）を伴う患者であって、第一選択の化学療法から利益を得なかった患者、同種幹細胞移植を施されたことがなく、リツキシマブ（ＮＨＬ）およびニボルマブまたはペムブロリズマブ（ＨＬ）に応答する可能性が高い患者を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を伴う、３＋３モデルベースの漸増に従う、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、Ｖ４（実施例２．２の［１］）、Ｖ４Ｈ１（実施例２．２の［３］）、またはＶ４Ｈ２（実施例２．２の［４］）の静脈内注射により処置する。
次いで、Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ（ＣＴＣＡＥ）に従い、患者を評価して、処置の安全性および忍容性を決定し、分子の薬物動態および処置の有効性を査定した。
用量拡大
処置された患者を、全応答率、がん細胞マーカーの発現、循環がん細胞、無増悪生存期間、全生存期間、安全性、および忍容性について解析する。
抗ＶＩＳＴＡ抗体は、安全かつ忍容性であり、がん細胞の数／比率を低減し、腫瘍細胞マーカーの発現を低減し、無増悪生存期間を延長し、かつ、全生存期間を延長することが可能であることが見出される。
実施例６
異なるＦｃ領域を含む、ＶＩＳＴＡ結合性抗体の作製および特徴付け
６．１ 異なるＦｃ領域を含む、ＶＩＳＴＡ結合性抗体の作製および特徴付け
４Ｍ２−Ｃ１２を、マウスＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧフォーマットで作製した。分子は、配列番号２４９に示された配列を有する、重鎖ポリペプチドと、配列番号２５０に示された配列を有する、軽鎖ポリペプチドとのヘテロマーである。重鎖配列は、配列番号２５３に従い番号付けされた４および５位における、ＣＨ２領域内の、ロイシン（Ｌ）からアラニン（Ａ）への置換と、配列番号２５３に従い番号付けされた９９位における、プロリン（Ｐ）からグリシン（Ｇ）への置換とを含む。これらの置換は、文献において、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇと称され、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２０１７）、２９２（９）：３９００〜３９０８の、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃにおいて記載されている。４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧは、ＣＨＯ細胞内の、重鎖ポリペプチドをコードする核酸と、軽鎖ポリペプチドをコードする核酸との共発現により作製し、その後、精製した。
Figure 2021511818
 ４Ｍ２−Ｃ１２はまた、マウスＩｇＧ２ａ ＮＱフォーマットでも作製した。分子は、配列番号２５８に示された配列を有する、重鎖ポリペプチドと、配列番号２５０に示された配列を有する、軽鎖ポリペプチドとのヘテロマーである。重鎖配列は、配列番号２５３に従う、６７位における、ＣＨ２領域内の、アスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）への置換を含む。この置換は、文献において、Ｎ２９７Ｑと称され、例えば、Ｌｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（２０１７）、２９２（９）：３９００〜３９０８の、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃにおいて記載されている。４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ ＮＱは、ＣＨＯ細胞内の、重鎖ポリペプチドをコードする核酸と、軽鎖ポリペプチドをコードする核酸との共発現により作製し、その後、精製した。
Figure 2021511818
 ４Ｍ２−Ｃ１２を、マウスＩｇＧ１フォーマットで作製した。分子は、配列番号２６６に示された配列を有する、重鎖ポリペプチドと、配列番号２５０に示された配列を有する、軽鎖ポリペプチドとのヘテロマーである。４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ１は、ＣＨＯ細胞内の、重鎖ポリペプチドをコードする核酸と、軽鎖ポリペプチドをコードする核酸との共発現により作製し、その後、精製した。
Figure 2021511818
 ６．２ 異なるＦｃ領域を含むＶＩＳＴＡ結合性抗体の、Ｆｃ受容体への結合についての解析
異なる抗体フォーマットの４Ｍ２−Ｃ１２の、ヒト、カニクイザル、およびマウスのＶＩＳＴＡタンパク質への結合は、ＥＬＩＳＡを介して査定し、マウスＦｃγ受容体およびマウスＦｃＲｎへの結合は、Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＱＫ ３８４システムを使用する、ＢＬＩにより査定した。
ヒスチジンでタグ付けされた、ｍＦｃγＲＩＶ（５００３６−Ｍ０８Ｈ）、ｍＦｃγＲＩＩＩ（５０３２６−Ｍ０８Ｈ）、ｍＦｃγＲＩＩｂ（５００３０−Ｍ０８Ｈ）、およびｍＦｃＲｎ（ＣＴ００９−Ｈ０８Ｈ）は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから得た。抗５×ＨＩＳ（ＨＩＳ１Ｋ）バイオセンサーは、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ（１８−５１２０）から購入した。
反応速度実験のために、抗５×ＨＩＳバイオセンサーを、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、６０秒間にわたりインキュベートして、第１のベースラインを得、その後、１２０秒間にわたり、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に２００ｎＭのｍＦｃγＲＩＶ（ｈＦｃγＲＩＩＩａのオーソログ）、１６０ｎＭのｍＦｃγＲＩＩＩ（ｈＦｃγＲＩＩａのオーソログ）、７５ｎＭのｍＦｃγＲＩＩｂ（ｈＦｃγＲＩＩｂのオーソログ）、または１２０ｎＭのｍＦｃＲｎをロードした。ローディングの後、バイオセンサーを、ＰＢＳ緩衝液（Ｆｃγ受容体については、ｐＨ７．２とし、ＦｃＲｎについては、ｐＨ５．８とする）中で、６０秒間にわたりインキュベートして、第２のベースラインを得、ＰＢＳ（Ｆｃγ受容体については、ｐＨ７．２とし、ＦｃＲｎについては、ｐＨ５．８とする）中に被験抗体の、２倍ずつ６点の系列希釈液（ｍＦｃγ受容体への結合については、２０００ｎＭ〜６２．５ｎＭとし、ＦｃＲｎへの結合については、５００ｎＭ〜１５．６ｎＭとする）と共に、６０秒間にわたりインキュベートして、会合曲線を得た。最後に、バイオセンサーを、ＰＢＳ（ｍＦｃγＲについては、ｐＨ７．２とし、ｍＦｃＲｎについては、ｐＨ５．８とする）中で、１２０秒間にわたりインキュベートして、解離曲線を得た。反応速度およびアフィニティー定数は、会合および解離データの、１：１に結合モデルへのグローバルフィッティングにより計算した。
４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ１の、異なるマウスＦｃγ受容体およびマウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果を、図２５Ａ〜２５Ｄに示す。
４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａの、異なるマウスＦｃγ受容体およびマウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果を、図２６Ａ〜２６Ｄに示す。２つの個別の実験（１および２；２９Ａ〜２９Ｃを参照されたい）を実施したが、図２６Ａ〜２６Ｄは、実験２において得られた結果を示す。異なるＦｃγ受容体について検出された結合のレベルは、学術文献において報告されたレベルと同等であった。
４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧの、異なるマウスＦｃγ受容体およびマウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果を、図２７Ａ〜２７Ｄに示す。ｍＦｃγＲＩＶ、ｍＦｃγＲＩＩＩ、およびｍＦｃγＲＩＩｂへの結合のレベルは、無視できる／検出不能のレベルであり、ｍＦｃＲｎへの結合のレベルは、４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａによる、ｍＦｃＲｎへの結合のレベルと同等であった。
４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａ ＮＱの、異なるマウスＦｃγ受容体およびマウスＦｃＲｎへの結合についての解析の結果を、図２８Ａ〜２８Ｄに示す。
４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ１、４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａ、４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧおよび４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａ ＮＱについて決定された、異なるＦｃ受容体への結合についての、Ｋｏｎ、Ｋｄｉｓ、およびＫＤ値を、図２９Ａ〜２９Ｃの表にまとめる。
実施例７
異なるＦｃ領域を含む、ＶＩＳＴＡ結合性抗体についての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける解析
４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａおよび４Ｍ２−Ｃ１２−ｍＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧ（実施例６．１を参照されたい）を、ｉｎ ｖｉｖｏの、同系ＥＬ４ Ｔ細胞白血病／リンパ腫モデルにおいて、がんを処置する有効性について評価した。
ＥＬ４細胞は、１０％のウマ血清（ＦＢＳ）および１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞は、５％のＣＯ２インキュベーター内、３７℃で培養した。
約６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、ＩｎＶｉｖｏｓ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から得た。動物は、特定の無病原体条件下で飼育し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して処置した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に、ＥＬ４ Ｔ細胞白血病／リンパ腫細胞２×１０５個を接種した。腫瘍の植込み後、腫瘍が、３５０〜４００ｍｍ３のサイズに到達したら、マウスを、以下の処置群：用量を２５ｍｇ／ｋｇとする、ａ）溶媒対照（ＰＢＳ）、ｂ）４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（実施例５の［１７］）、またはｃ）４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ−ＬＡＬＡ ＰＧ（実施例６の［１８］）へと無作為化した。処置を、３日ごと、合計５回の投与にわたり、腹腔内投与した。
腫瘍体積は、デジタル式キャリパーを使用して、毎週３回測定し、式［Ｌ×Ｗ２／２］を使用して計算した。溶媒対照処置群の腫瘍が、＞１．５ｃｍの長さと測定されたら、研究の終点に到達したと考えた。
結果を、図３０Ａ〜３０Ｃに示す。研究の最終日（植込み後２３日目）までに、４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ２ａおよび４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧ処置群のいずれにおける平均値腫瘍体積も、信頼できる測定のためのサイズを下回った（＜３０ｍｍ３）。対照的に、溶媒（ＰＢＳ）処置群内のマウスにおける平均腫瘍体積は、１８日目までに、２０００ｍｍ３を超え、全ての動物を安楽死させた。
したがって、４Ｍ２−Ｃ１２は、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ａ ＬＡＬＡ ＰＧのいずれのフォーマットでも、強力な腫瘍増殖の阻害を呈することが見出された。
高度に確立されたＥＬ４腫瘍保有マウスの、抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２による処置は、単剤療法として、極めて効果的であることが見出され、腫瘍の除去を結果としてもたらした。
４Ｍ２−Ｃ１２の生物学的活性は、マウスＦｃγ受容体のエンゲージメントに依存しないことが見出されたことから、４Ｍ２−Ｃ１２が、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達の阻害を通して、その生物学的活性を及ぼすことが強く示唆される。
実施例８
抗体が結合するＶＩＳＴＡのエピトープについての解析
抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＶＩＳＴＡへの結合について、互いと競合するのかどうかを決定するように、それらを評価した。
ＶＳＴＢ１１２は、いくつかの領域内で、ＶＩＳＴＡに結合することが示唆されている。メジャーエピトープは、配列番号１の５９〜６８位および８６〜９７位（すなわち、配列番号２７１および２７２）に対応することが提起されている。マイナーエピトープは、配列番号１の７１〜８４位および１５０〜１６６位（すなわち、配列番号２７３および２７４）に対応することが提起されている（例えば、ＷＯ２０１７／１３７８３０Ａ１、例えば、段落［０３０２］を参照されたい）。ＶＳＴＢ１１２については、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／０９７５３６Ａ２において記載されている。
ＩＧＮ１７５Ａは、成熟タンパク質の、最初の３２アミノ酸内で（すなわち、配列番号１の３３〜６４位（すなわち、配列番号２７５）内で）、ＶＩＳＴＡに結合すると考えられる。ＩＧＮ１７５Ａについては、例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／１９７８４９Ａ２において記載されている。
Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用するＢＬＩにより、エピトープビニング実験を実施した。略述すると、ＰＢＳ中のヒトＶＩＳＴＡ−Ｈｉｓ組換えタンパク質（４．７μｇ／ｍｌ）を、５分間にわたり、抗５×ＨＩＳセンサー（ＨＩＳ１Ｋ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）へと固定化した。ＰＢＳ中のベースラインのシグナルを３０秒間にわたり測定してから、ＰＢＳ中の４００ｎＭの飽和抗体を、１０分間にわたり、１０００ｒｐｍの攪拌速度でロードし、ＰＢＳを使用して、１２０秒間にわたる解離ステップにかけた。その後、バイオセンサーを、ＰＢＳ中に３００ｎＭの競合抗体により、５分間にわたり、１０００ｒｐｍの攪拌速度で処理するのに続き、ＰＢＳを使用して、１２０秒間にわたる解離ステップにかけた。
実験では、以下の抗原結合性分子：
・ＩｇＧ１フォーマットにおける、４Ｍ２−Ｃ１２（Ｖ４）（実施例２．２の［１］）
・ＩｇＧ１フォーマットにおける、４Ｍ２−Ｃ１２の、ヒト化／アフィニティー成熟型変異体（Ｖ４−Ｃ１）（実施例１３の［２１］）
・ＩＧＮ１７５Ａ ＩｇＧ１（ＩＧＮ１７５Ａ ＨＣ（配列番号２６７）＋ＩＧＮ１７５Ａ ＬＣ（配列番号２６８）を含む）
・ＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１（ＶＳＴＢ１１２ ＨＣ（配列番号２６９）＋ＶＳＴＢ１１２ ＬＣ（配列番号２７０）を含む）
について解析した。
以下の抗原／飽和抗体／競合抗体の組合せについて調べた：
Figure 2021511818
 結果を、図３１Ａおよび３１Ｂに示す。
Ｖ４およびＶ４−Ｃ１ ＩｇＧ１は、ＶＩＳＴＡへの結合について、ＩＧＮ１７５Ａと競合しないことが見出された。ＶＳＴＢ１１２は、ＶＩＳＴＡへの結合について、Ｖ４、Ｖ４−Ｃ１、およびＩＧＮ１７５Ａと、部分的に競合することが見出された。競合抗体の添加時における、応答（ｎｍ単位）の変化を、下記に示す。
Figure 2021511818
 結果は、４Ｍ２−Ｃ１２とＩＧＮ１７５Ａとが、ＶＩＳＴＡの、局所的に遠く離れている領域に結合し、ＶＳＴＢ１１２が、４Ｍ２−Ｃ１２およびＩＧＮ１７５Ａに対して近位の領域内で、ＶＩＳＴＡに結合することを指し示す。
Ｖ１−Ｃ１とＩＧＮ１７５Ａとが、ＶＩＳＴＡへの結合について競合しないという事実は、ＶＳＴＢ１１２が、ＶＩＳＴＡへの結合について、ＩＧＮ１７５Ａと競合するという観察と併せて、４Ｍ２−Ｃ１２のＣＤＲを含む抗体が、ＩＧＮ１７５Ａが結合する、ＶＩＳＴＡのエピトープと同一ではなく、ＶＳＴＢ１１２が結合する、ＶＩＳＴＡのエピトープともまた同一でない、ＶＩＳＴＡのエピトープに結合することを指し示す。
ＶＩＳＴＡについての配列、４Ｍ２−Ｃ１２を惹起するのに使用される免疫原、種交差反応性データの解析から、本発明者らは、４Ｍ２−Ｃ１２およびその派生体は、配列番号３２２に示される配列（配列番号１の７６〜８１位に対応する）に結合すると結論づけた。
実施例９
ＶＩＳＴＡ結合性抗体が、Ｔ細胞の増殖を、ＶＩＳＴＡ媒介性阻害からレスキューする能力についての解析
抗ＶＩＳＴＡ抗体が、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達の阻害作用からレスキューする能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて解析した。
略述すると、９６ウェルプレートを、濃度比を、１：１（２．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３：２．５μｇ／ｍｌのＶＩＳＴＡ／対照Ｉｇ）、または２：１（２．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３：１．２５μｇ／ｍｌのＶＩＳＴＡ／対照Ｉｇ）とする、抗ＣＤ３およびＶＩＳＴＡ−Ｉｇまたは対照Ｉｇでコーティングした。無関係な抗原Ｉｇを、対照条件として使用した。プレートを、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。
ＰＢＭＣは、新たに回収された血液試料から精製し、ｈｕｍａｎ Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、Ｔ細胞について、さらにエンリッチした。次いで、エンリッチされたＴ細胞集団を、ＣＦＳＥで標識付けした。
ウェルを、ＰＢＳで、３回にわたり洗浄し、ＣＦＳＥで標識付けされたＴ細胞１００，０００個を、最終濃度を２０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌとする、４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）の存在下で、もしくは最終濃度を２０μｇ／ｍｌとする、ＶＳＴＢ１１２の存在下で、または添加される抗体の非存在下で、各ウェルの、１０％のＦＢＳを補充した、完全ＲＰＭＩ １６４０培地へと添加した。
５日後、細胞を採取し、蛍光コンジュゲート抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体で標識付けし、Ｍａｃｓｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０を使用するフローサイトメトリーにより解析した。
実験の結果を、図３３Ａ〜３３Ｄに示す。４Ｍ２−Ｃ１２は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれもが増殖する能力を回復させることが見出された。
重要なことに、４Ｍ２−Ｃ１２は、Ｔ細胞の増殖の回復において、ＶＳＴＢ１１２より効果的であることが見出された。
実施例１０
ＶＩＳＴＡ結合性抗体が、ＬＰＳに応答する、ＴＨＰ１細胞による、ＩＬ−６の産生を促進する能力についての解析
ＶＩＳＴＡ結合性抗体が、ＬＰＳ刺激に応答する、ＴＨＰ１細胞による、ＩＬ−６の産生を促進する能力を、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて解析した。
略述すると、未分化ＴＨＰ１細胞を、９６ウェルプレート内の、ＦＢＳまたはｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを伴わないＲＰＭＩ培地中に、２連で（ウェル１つ当たりの細胞１００，０００個）播種した。その後、細胞を、２０００μｇ／ｍｌ〜７．８μｇ／ｍｌの範囲の、異なる濃度の４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）、または１０００μｇ／ｍｌ〜７．８μｇ／ｍｌの範囲の、異なる濃度のＶＳＴＢ１１２の存在下で、ＬＰＳ（最終濃度を１００μｇ／ｍｌとする）およびＭｎＣｌ２（１００μＭ）により処理した。３日後、細胞培養物上清を回収し、ＩＬ−６ Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＩＬ−６のレベルを決定するために、ＥＬＩＳＡにより解析した。
結果を、図３４Ａおよび３４Ｂに示す。４Ｍ２−Ｃ１２は、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ１細胞によるＩＬ−６の産生を、ＶＳＴＢ１１２より大幅に促進することが見出された。
実施例１１
ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＶＩＳＴＡ結合性抗体が、ＩＬ−６の産生を促進する能力についての解析
４Ｍ２−Ｃ１２による処置に応答する、ＩＬ−６の産生を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて調べた。
略述すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）に、単一の６００μｇの、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（実施例５の［１７］）の単回投与の用量を投与し、血液試料を、マウスから、投与の２時間前、ならびに投与の０．５時間後、６時間後、２４時間後、９６時間後、１６８時間後、および３３６時間後に採取した。
Ｍｏｕｓｅ ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ａｂｃａｍ；ａｂ１００７１２）を使用して、血清を、ＩＬ−６含有物について解析した。
結果を、図３５に示す。ＩＬ−６は、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａを投与した０．５時間後に、血清中で検出した。
実施例１２
単独の、または抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた、ＶＩＳＴＡ結合性抗体についての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける解析
１２．１ ＣＴ２６細胞モデル
Ｔ細胞白血病／リンパ腫の同系モデルは、ＣＴ２６細胞１×１０５個を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの右脇腹へと、皮下注入することにより作出した。
マウス（処置群１つ当たり７匹）に、
・６００μｇの４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ２ａ（実施例５の［１７］）
・２００μｇの抗ＰＤ−１抗体（クローンである、ＲＭＰ１−１４（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ））
・６００μｇの４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ２ａ＋２００μｇの抗ＰＤ−１抗体
・ＰＢＳだけ
を、３日ごと、合計７回の投与にわたり、腹腔内投与した。
腫瘍体積は、デジタル式キャリパーを使用して、毎週３回測定し、式［Ｌ×Ｗ２／２］を使用して計算した。対照アームの腫瘍が、＞１．５ｃｍの長さと測定されたら、研究の終点に到達したと考えた。
結果を、図３６Ａおよび３６Ｂに示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２および抗ＰＤ−１による組合せ療法は、いずれかの薬剤が、単剤療法として使用される場合より大きな程度で、腫瘍増殖を阻害した。
腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞についての免疫プロファイリングを企図した。略述すると、実験の２２日目に、腫瘍を採取し、単一の細胞懸濁液へと加工し、免疫細胞表面タンパク質（ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ、およびＬｙ６Ｃ）に特異的な抗体で染色した。
試料を、フローサイトメトリーにより解析し、以下の、異なる免疫細胞表面タンパク質についての、それらの染色に基づき、以下の免疫細胞サブセット：
・ＣＤ４細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ４＋；
・ＣＤ８ Ｔ細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ８＋；
・Ｔｒｅｇ細胞：ＣＤ４５＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋；
・顆粒球型ＭＤＳＣ（ｇ−ＭＤＳＣ）：ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃｌｏ／−
・単球型ＭＤＳＣ（ｍ−ＭＤＳＣ）：ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃｈｉ／＋
へと分類した。
表示の表現型を有する、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を、下記にまとめる：
Figure 2021511818
 ｇ−ＭＤＳＣであった腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を、図３７に示す。４Ｍ２−Ｃ１２（単独の、または抗ＰＤ−１と組み合わせた）による処置は、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の中の、ｇ−ＭＤＳＣの比率を、著明に低減した。
血液は、１８日目に、マウスから得、血清を、ＭＡＣＳＰｌｅｘ ｃｙｔｏｋｉｎｅ １０ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する解析により、異なる多様なサイトカインのレベルについて解析した。
結果を、図３８Ａ〜３８Ｅに示す。
１２．２ Ｂ１６−ＢＬ６細胞モデル
図４０Ａおよび４０Ｂは、上記の実施例５．２．３で記載された研究（結果は、図１７に示される）の、１８日間への拡張の結果を示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２および抗ＰＤ−１による組合せ療法は、いずれかの薬剤が、単剤療法として使用される場合より大きな程度で、腫瘍増殖を阻害した。
腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞についての免疫プロファイリングを企図した。略述すると、実験の１８日目に、腫瘍を採取し、単一の細胞懸濁液へと加工し、免疫細胞表面に特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析し、上記の実施例１２．１に記載した通りに、細胞を、免疫細胞サブセットへと分類した。
表示の表現型を有する、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を、下記にまとめる：
Figure 2021511818
 ｇ−ＭＤＳＣであった腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を、図４１に示す。
１２．３ ＥＬ４細胞モデル
Ｔ細胞白血病／リンパ腫の同系モデルは、ＥＬ４細胞２×１０５個を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹へと、皮下注入することにより確立した。
マウス（処置群１つ当たり７匹）に、
・６００μｇの４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ２ａ（実施例５の［１７］）
・２００μｇの抗ＰＤ−１抗体（クローンである、ＲＭＰ１−１４（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ））
・６００μｇの４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ２ａ＋２００μｇの抗ＰＤ−１抗体
・ＰＢＳだけ
を、３日ごと、合計５回の投与にわたり、腹腔内投与した。
腫瘍体積は、デジタル式キャリパーを使用して、毎週３回測定し、式［Ｌ×Ｗ２／２］を使用して計算した。対照アームの腫瘍が、＞１．５ｃｍの長さと測定されたら、研究の終点に到達したと考えた。
結果を、図４２に示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２および抗ＰＤ−１による組合せ療法は、いずれかの薬剤が、単剤療法として使用される場合より大きな程度で、腫瘍増殖を阻害した。
腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞についての免疫プロファイリングを企図した。略述すると、実験の１６日目に、腫瘍を採取し、単一の細胞懸濁液へと加工し、免疫細胞表面に特異的な抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析し、上記の実施例１２．１に記載した通りに、細胞を、免疫細胞サブセットへと分類した。
表示の表現型を有する、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を、下記にまとめる：
Figure 2021511818
 ｇ−ＭＤＳＣであった腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の百分率を、図４３に示す。４Ｍ２−Ｃ１２（単独の、または抗ＰＤ−１と組み合わせた）による処置は、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の中の、ｇ−ＭＤＳＣの比率を、著明に低減した。
１２．４ 結論
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１によるシグナル伝達の阻害が、ＣＴ２６、Ｂ１６−ＢＬ６、およびＥＬ４モデルにおいて、腫瘍浸潤性ＣＤ４５＋細胞の中の、ｇ−ＭＤＳＣの比率を増大させるのに対し、４Ｍ２−Ｃ１２による処置は、ｇ−ＭＤＳＣの拡大を抑制する。
実施例１３
ＶＩＳＴＡ結合性抗体についての、さらなる特徴付け
さらなるＶＩＳＴＡ結合性抗原結合性分子を作製した。
Figure 2021511818
 Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１を、ＩＭＧＴ ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ（Ｅｈｒｅｎｍａｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３８、Ｄ３０１〜３０７（２０１０））およびＩＥＤＢ脱免疫化（Ｄｈａｎｄａら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１８）、１５３（１）：１１８〜１３２）ツールを使用して、コンピュータにより、安全性および免疫原性について解析した。
Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１は、ヒト重鎖およびヒト軽鎖に対して、ヒト化されたと考えるのに十分な（すなわち、＞８５％の）相同性を有し、潜在的な免疫原性ペプチドの数が、安全であると考えるのに十分なほど少なく（図５３を参照されたい）、潜在的な開発可能性問題を引き起こしうる、他の特性を所有しなかった。
１３．１ ＢＬＩによる、結合アフィニティーの解析
Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１（すなわち、［２１］〜［２８］）の、ヒトおよびマウスのＶＩＳＴＡタンパク質ならびにヒトＰＤ−Ｌ１への結合を、Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＱＫ ３８４システムを使用する、ＢＬＩにより査定した。
略述すると、抗５×ＨＩＳバイオセンサーを、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、６０秒間にわたりインキュベートして、第１のベースラインを得、その後、１２０秒間にわたり、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１８０ｎＭのｈＶＩＳＴＡ、１８０ｎＭのｍＶＩＳＴＡ、または２５０ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１をロードした。ローディングの後、バイオセンサーを、ｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中で、６０秒間にわたりインキュベートして、第２のベースラインを得、ＰＢＳ ｐＨ７．２中の、被験抗体の、２倍ずつ６点の系列希釈液（５００ｎＭ〜１５．６ｎＭ）と共に、１２０秒間または９００秒間にわたりインキュベートして、会合曲線を得た。最後に、バイオセンサーを、ＰＢＳ ｐＨ７．２中で、１２０秒間にわたりインキュベートして、解離曲線を得た。反応速度およびアフィニティー定数は、会合および解離データの、１：１に結合モデルへのグローバルフィッティングにより計算した。
Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、またはＶ４−Ｃ３１のうちのいずれも、ヒトＰＤ−Ｌ１への、著明な結合を呈さなかった（図４５Ｃ）。
この実験において、Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１の、ヒトＶＩＳＴＡおよびマウスＶＩＳＴＡへの結合について計算された、反応速度および熱力学定数を、図４５Ｄに示す。
Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１による、マウスＶＩＳＴＡタンパク質への結合を、ＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１（ＶＳＴＢ１１２ ＨＣ（配列番号２６９）＋ＶＳＴＢ１１２ ＬＣ（配列番号２７０）を含む）についての査定を含む、別個の実験において解析した。
ＶＳＴＢ１１２は、マウスＶＩＳＴＡタンパク質への著明な結合を呈さなかった（図４６Ａ）。この実験において、Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１の、マウスＶＩＳＴＡへの結合について計算された、反応速度および熱力学定数を、図４６Ｂに示す。
さらなる実験では、Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、およびＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１の、ヒトＶＩＳＴＡおよびマウスＶＩＳＴＡへの結合について解析し、反応速度および熱力学定数の計算値を、図４７Ｃに示す。
別の実験では、Ｖ４（実施例２．２の［１］）およびＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１（ＶＳＴＢ１１２ ＨＣ（配列番号２６９）＋ＶＳＴＢ１１２ ＬＣ（配列番号２７０）を含む）の、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡおよびヒトＣＤ４７への結合について解析した。抗５×ＨＩＳバイオセンサーを、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中で、６０秒間にわたりインキュベートして、第１のベースラインを得、その後、１２０秒間にわたり、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に１８０ｎＭのｈＶＩＳＴＡ、１８０ｎＭのｍＶＩＳＴＡ、または３００ｎＭのｈＣＤ４７をロードした。ローディングの後、バイオセンサーを、ｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液中で、６０秒間にわたりインキュベートして、第２のベースラインを得、ＰＢＳ ｐＨ７．２中の、被験抗体の系列希釈液（１５００ｎＭ〜４６．９ｎＭ）と共に、１２０秒間にわたりインキュベートして、会合曲線を得た。最後に、バイオセンサーを、ＰＢＳ ｐＨ７．２中で、１２０秒間にわたりインキュベートして、解離曲線を得た。反応速度およびアフィニティー定数は、会合および解離データの、１：１に結合モデルへのグローバルフィッティングにより計算した。
Ｖ４も、ＶＳＴＢ１１２も、ヒトＣＤ４７への結合を呈さなかった。ＶＳＴＢ１１２が、マウスＶＩＳＴＡタンパク質への著明な結合を呈さなかったのに対し、Ｖ４は、これを呈した。反応速度および熱力学定数の計算値を、図４８Ｂに示す。
１３．２ ＥＬＩＳＡによる結合アフィニティーの解析
ＥＬＩＳＡを使用して、異なる抗体の、ヒトＶＩＳＴＡおよびマウスＶＩＳＴＡへの結合について評価した。ＥＬＩＳＡは、上記の実施例３．３に記載した通りに実施した。
実験では、以下の抗体：
・４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１（実施例２．２の［１］；図では、「Ｖ４ｐｒ」と称される）
・Ｖ４−Ｃ１ ＩｇＧ１（実施例１３の［２１］）
・Ｖ４−Ｃ９ ＩｇＧ１（実施例１３の［２２］）
・Ｖ４−Ｃ２４ ＩｇＧ１（実施例１３の［２３］）
・Ｖ４−Ｃ２６ ＩｇＧ１（実施例１３の［２４］）
・Ｖ４−Ｃ２７ ＩｇＧ１（実施例１３の［２５］）
・Ｖ４−Ｃ２８ ＩｇＧ１（実施例１３の［２６］）
・Ｖ４−Ｃ３０ ＩｇＧ１（実施例１３の［２７］）
・Ｖ４−Ｃ３１ ＩｇＧ１（実施例１３の［２８］）
・ＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１（ＶＳＴＢ１１２ ＨＣ（配列番号２６９）＋ＶＳＴＢ１１２ ＬＣ（配列番号２７０）を含む）
・アテゾリズマブ
・ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照
について解析した。
得られた結果を、図４９Ａおよび４９Ｂに示し、抗体の、表示のタンパク質への結合についてのＥＬＩＳＡから計算されたＥＣ５０（ｎＭ）値を、図４９Ｃにまとめる。
Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１、ＶＳＴＢ１１２、およびアイソタイプ対照抗体の、ヒトＶＩＳＴＡまたはマウスＶＩＳＴＡへの結合について解析する、さらなる実験を実施した。結果を、図５０Ａおよび５０Ｂに示し、抗体の、表示のタンパク質への結合についてのＥＬＩＳＡから計算されたＥＣ５０（ｎＭ）値を、図５０Ｃにまとめる。
Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、ＶＳＴＢ１１２、およびアイソタイプ対照抗体の、ヒトＶＩＳＴＡまたはマウスＶＩＳＴＡへの結合について解析する、さらなる実験を実施した。結果を、図５１Ａおよび５１Ｂに示し、抗体の、表示のタンパク質への結合についてのＥＬＩＳＡから計算されたＥＣ５０（ｎＭ）値を、図５１Ｃにまとめる。
Ｖ４、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１、ならびにアイソタイプ対照抗体の、ヒトの、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ７、ＰＤ−１、およびＣＴＬＡ−４への結合について解析する、さらなる実験を実施した。結果を、図５６Ａ〜５６Ｇに示す。Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１の各々は、ヒトＶＩＳＴＡへの強い結合を呈し、タンパク質のＢ７ファミリーの他のメンバーに対する交差反応性を呈さなかった。
さらなる実験では、Ｖ４（図５７では、「Ｖ４Ｐ」と称される）、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１を、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡへの結合について解析した。得られた結果を、図５７Ａ〜５７Ｈに示し、抗体の、表示のタンパク質への結合についてのＥＬＩＳＡから計算されたＥＣ５０（Ｍ）値を、図５７Ｉにまとめる。
Ｖ４、ならびにＶ４由来クローンである、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１の全ては、ヒトＶＩＳＴＡ、マウスＶＩＳＴＡ、ラットＶＩＳＴＡ、およびカニクイザルＶＩＳＴＡに結合することが見出された。
１３．３ フローサイトメトリーによる、ＶＩＳＴＡ発現細胞への結合についての解析
抗ＶＩＳＴＡ抗体を、本質的に、上記の実施例３．１に記載した通りに、ＶＩＳＴＡ発現細胞に結合する、それらの能力について解析した。
略述すると、トランスフェクト細胞、またはヒトＶＩＳＴＡもしくはマウスＶＩＳＴＡをコードするベクターをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、１μｇ／ｍｌの抗ＶＩＳＴＡ抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に、４℃で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＦｃ抗体と共に、４℃で１時間にわたりインキュベートした。細胞を、再度洗浄し、次いで、フローサイトメトリーにより解析した。
実験では、以下の抗体：
・４Ｍ２−Ｃ１２ ＩｇＧ１（実施例２．２の［１］；図では、「Ｖ４Ｐ」と称される）
・Ｖ４−Ｃ２４ ＩｇＧ１（実施例１３の［２３］）
・Ｖ４−Ｃ２６ ＩｇＧ１（実施例１３の［２４］）
・Ｖ４−Ｃ２７ ＩｇＧ１（実施例１３の［２５］）
・Ｖ４−Ｃ２８ ＩｇＧ１（実施例１３の［２６］）
・Ｖ４−Ｃ３０ ＩｇＧ１（実施例１３の［２７］）
・Ｖ４−Ｃ３１ ＩｇＧ１（実施例１３の［２８］）
・ＶＳＴＢ１１２ ＩｇＧ１（ＶＳＴＢ１１２ ＨＣ（配列番号２６９）＋ＶＳＴＢ１１２ ＬＣ（配列番号２７０）を含む）
・ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照
について解析した。
結果を、図５８Ａ〜５８Ｃに示す。
１３．４ 示差走査蛍光測定法による、熱安定性についての解析
異なる抗体の熱安定性を、上記の実施例３．４に記載した通りに、示差走査蛍光測定解析により評価した。
Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、Ｖ４−Ｃ３１（すなわち、［２１］〜［２８］）、およびＶＳＴＢ１１２の熱安定性に対する、示差走査蛍光測定解析（３連の）について得られた生データの一次微分を、図５２Ａ〜５２Ｉに示し、結果を、図５２Ｊにまとめる。
Ｖ４−Ｃ１、Ｖ４−Ｃ９、Ｖ４−Ｃ２４、Ｖ４−Ｃ２６、Ｖ４−Ｃ２７、Ｖ４−Ｃ２８、Ｖ４−Ｃ３０、およびＶ４−Ｃ３１は、Ｆａｂ領域に対する溶融温度（Ｔｍ）が、Ｖ４と比較して高く（６７．５℃）、したがって、熱安定性が改善されていることが見出された。
実施例１４
免疫組織化学における、ＶＩＳＴＡ結合性抗体の使用
抗ＶＩＳＴＡ抗体である、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａ（実施例５の［１７］）を、ヒトＶＩＳＴＡタンパク質を検出するために、免疫組織化学で使用される、その能力について評価した。
切片の加工は、Ｂｏｎｄ試薬（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。正常ヒト脾臓または正常ヒト卵巣に由来する、市販のパラフィン切片を、Ｂｏｎｄ Ｄｅｗａｘ溶液中で脱パラフィン処理し、再水和させた。次いで、切片を、ステップの間の、１倍濃度のＢｏｎｄ洗浄液による、４〜５回にわたるすすぎを伴う、以下の処理：（ｉ）１００℃で、４０分間にわたる、Ｂｏｎｄ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ溶液を伴う処理による抗原の露出；（ｉｉ）室温で、１５分間にわたる、３．５％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ２を伴う処理による、内因性ペルオキシダーゼのブロッキング；（ｉｉｉ）室温で、３０分間にわたる、１０％のヤギ血清を伴う処理によるブロッキング；（ｉｖ）４℃で、一晩にわたる、９．３７ｍｇ／ｍｌ溶液の希釈率を１：５０とする、４Ｍ２−Ｃ１２ ｍＩｇＧ２ａを伴うインキュベーション；（ｖ）室温で、５分間にわたる、ＨＲＰ−ポリマーコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を伴うインキュベーション、および（ｖｉ）室温で、７分間にわたる、Ｂｏｎｄ Ｍｉｘｅｄ ＤＡＢ Ｒｅｆｉｎｅによる現像に続く、反応を停止させる、脱イオン水によるすすぎにかけた。
切片を、ヘマトキシリンにより、室温で５分間にわたり対比染色し、脱イオン水および１倍濃度のＢｏｎｄ洗浄液ですすぎ、次いで、乾燥させ、合成の封入剤中でマウンティングし、高解像度で走査した。
結果を、図５９Ａおよび５９Ｂに示す。抗ＶＩＳＴＡ抗体は、脾臓の細胞質を染色したが、正常卵巣切片（対照）内の細胞は染色しなかった。
実施例１５
さらにＶＩＳＴＡ結合性抗体が、Ｔ細胞の増殖および炎症促進性サイトカインの産生を、ＶＩＳＴＡ媒介性阻害からレスキューする能力についての解析
抗ＶＩＳＴＡ抗体を、Ｔ細胞を、ＶＩＳＴＡ媒介性抑制から解放する能力について特徴付けた。
９６ウェルプレートを、濃度を２．５μｇ／ｍｌとする、抗ＣＤ３でコーティングし、４℃で、一晩にわたりインキュベートした。ＰＢＭＣを、血液試料から単離し、Ｔ細胞を、ＰＢＭＣからエンリッチし、上記の通りに、ＣＳＦＥで標識付けし、次いで、ＣＦＳＥで標識付けされたＴ細胞を、ヒトＶＩＳＴＡをコードする構築物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞と共に、２％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中に、２：１の比で共培養した。
次いで、細胞を、濃度を０μｇ／ｍｌ（対照）、２０μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌとする、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）またはＶＳＴＢ１１２で処置した。
５日間後、細胞を採取し、フローサイトメトリーにより解析して、ＣＳＦＥ希釈プロファイルにより、細胞増殖を決定した。細胞培養物上清もまた採取し、ＩＮＦγレベルおよびＴＮＦａレベルを、ＥＬＩＳＡにより解析した。
結果を、図６０Ａ〜６０Ｄに示す。図６０Ａおよび６０Ｂは、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１が、Ｔ細胞を、増殖の、ＶＩＳＴＡ媒介性阻害から、用量依存的に解放したことを示す。図６０Ｃおよび６０Ｄは、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１が、Ｔ細胞を、ＩＮＦγおよびＴＮＦａの産生の、ＶＩＳＴＡ媒介性阻害から解放したことを示す。
さらなる実験では、未分化ＴＨＰ１細胞を、９６ウェルプレート内の、ＦＢＳまたはｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを伴わないＲＰＭＩ培地中に、２連で播種し、細胞を、２０００μｇ／ｍｌ〜７．８μｇ／ｍｌの濃度の範囲の、系列希釈された濃度の４Ｍ２−Ｃ１２ ｈＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）、またはＶＳＴＢ１１２の存在下で、ＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）により刺激した。
２４時間後、細胞培養物上清を回収し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−６およびＴＮＦａについて解析した。細胞はまた、固定し、透過処理し、フローサイトメトリーを介して、ＶＩＳＴＡの存在についても解析した。
結果を、図６１Ａ〜６１Ｃに示す。４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１は、ＩＬ−６およびＴＮＦａの、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ１細胞からの産生を、用量依存的に、ＶＳＴＢ１１２より、はるかに大きな程度で増大させることが見出された。
さらなる実験では、未分化ＴＨＰ１細胞を、９６ウェルプレート内の、ＦＢＳまたはｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを伴わないＲＰＭＩ培地中に、２連で播種し、細胞を、２０００μｇ／ｍｌ〜７．８μｇ／ｍｌの濃度の範囲の、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）、または４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４（下記に示される［２９］）の存在下で、ＬＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）およびＭｎＣｌ２（１００μＭ）により刺激した。２４時間後、細胞培養物上清を回収し、ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−６について解析した。
Figure 2021511818
 結果を、図６２に示す。ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ１細胞による、ＩＬ−６の産生の増大は、ヒトＩｇＧ１フォーマットにおける４Ｍ２−Ｃ１２を伴う処置により誘導されるＩＬ６レベルと、ヒトＩｇＧ４フォーマットにおける４Ｍ２−Ｃ１２を伴う処置により誘導されるＩＬ６レベルとの間で、有意差が観察されなかったので、Ｆｃ非依存的であることが見出された。
実施例１６
薬理学、毒性学、および免疫毒性についての、さらなる解析
急性投与研究では、ラットに、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、または２５０ｍｇ／ｋｇの、４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）または４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ４（実施例１５の［２９］）の単回投与を行った。
血液は、ベースライン（−２時間後）、投与の０．５時間後、６時間後、２４時間後、９６時間後、１６８時間後、および３３６時間後に、ラットから得た。血清中の抗体を、ＥＬＩＳＡにより定量した。
薬物動態解析のためのパラメータ：最大濃度（Ｃｍａｘ）、ＡＵＣ（０〜３３６時間）、ＡＵＣ（０〜無限大）、半減期（ｔ１／２）、クリアランス（ＣＬ）、定常状態における分布容積（Ｖｓｓ）は、非コンパートメントモデルから導出した。
結果を、図６３Ａ〜６３Ｄに示す。
別個の実験では、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）、または等容量のＰＢＳの単回投与を行った。血液試料は、９６時間後に得、ＨＭ５ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して、異なる種類の白血球の数について解析した。血液試料はまた、肝毒性および腎毒性の相関因子についても解析した。
代表的な結果を、図６４Ａ〜６４Ｃの表に示す。
さらなる実験では、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、２５０ｍｇ／ｋｇの４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１（実施例２．２の［１］）、または等容量のＰＢＳの単回投与を行った。血液試料は、６、２４、９６、および１６８時間後に得、ＨＭ５ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して、異なる種類の白血球の数について解析した。血液試料はまた、肝毒性、腎毒性、および膵毒性の相関因子についても解析した。
代表的な結果を、図６５Ａ〜６５Ｃの表に示す。
４Ｍ２−Ｃ１２−ｈＩｇＧ１の投与は、著明な毒性と関連しないことが見出され、血中の細胞型の細胞数を、著明には変更しなかった。

Claims (34)

  1. Ｆｃ媒介性機能に依存せずに、ＶＩＳＴＡに結合し、ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害することが可能な抗原結合性分子、任意選択で、単離抗原結合性分子。
  2. （ｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号３０５のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
    配列番号３０６のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
    配列番号３０７のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
    を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
    （ｉｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
    配列番号３０８のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
    配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
    を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
    を含む、請求項１に記載の抗原結合性分子。
  3. （ｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
    配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
    配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
    を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
    （ｉｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
    配列番号３０９のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
    配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
    を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
    を含む、請求項１または２に記載の抗原結合性分子。
  4. （ｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
    配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
    配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
    を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
    （ｉｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
    配列番号２９５のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
    配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
    を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
    を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
  5. （ｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号２９０のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ１
    配列番号２９１のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ２
    配列番号２７８のアミノ酸配列を有するＨＣ−ＣＤＲ３
    を組み込んだ重鎖可変（ＶＨ）領域；および
    （ｉｉ）以下のＣＤＲ：
    配列番号４１のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ１
    配列番号３００のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ２
    配列番号４３のアミノ酸配列を有するＬＣ−ＣＤＲ３
    を組み込んだ軽鎖可変（ＶＬ）領域
    を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
  6. 配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
    配列番号３１０のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
    を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
  7. 配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
    配列番号２９４のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
    を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
  8. 配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
    配列番号２９７のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
    を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
  9. 配列番号２８９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域；および
    配列番号２９９のアミノ酸配列に対する、少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
    を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性分子。
  10. （ｉ）請求項１から９のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、および（ｉｉ）ＶＩＳＴＡ以外の抗原に結合することが可能な抗原結合性分子を含む、抗原結合性分子、任意選択で、単離抗原結合性分子。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  12. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、または請求項１１に記載のＣＡＲをコードする、１つの核酸または複数の核酸、任意選択で、１つの単離核酸または複数の単離核酸。
  13. 請求項１２に記載の、１つの核酸または複数の核酸を含む、１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクター。
  14. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の、１つの核酸もしくは複数の核酸、または請求項１３に記載の、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む細胞。
  15. 請求項１２に記載の、１つの核酸もしくは複数の核酸、または請求項１３に記載の、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクターを含む細胞を、抗原結合性分子またはＣＡＲの、核酸（複数可）または発現ベクター（複数可）からの発現に適する条件下で培養するステップを含む方法。
  16. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の、１つの核酸もしくは複数の核酸、請求項１３に記載の、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、または請求項１４に記載の細胞を含む組成物。
  17. ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤をさらに含み、任意選択で、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント分子が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＢＴＬＡから選択される、請求項１６に記載の組成物。
  18. 医学的処置または予防の方法における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、請求項１３に記載の１つの発現ベクターまたは複数の発現ベクター、請求項１４に記載の細胞、または請求項１６もしくは請求項１７に記載の組成物。
  19. がんまたは感染性疾患の処置または防止の方法における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、請求項１３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、請求項１４に記載の細胞、または請求項１６もしくは請求項１７に記載の組成物。
  20. がんまたは感染性疾患の処置または防止の方法における使用のための医薬の製造における、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、請求項１３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、請求項１４に記載の細胞、または請求項１６もしくは請求項１７に記載の組成物の使用。
  21. がんまたは感染性疾患を処置または防止する方法であって、対象へと、治療または予防有効量の、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、請求項１３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、請求項１４に記載の細胞、または請求項１６もしくは請求項１７に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
  22. がんが、ＶＩＳＴＡを発現する細胞を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現する細胞の浸潤を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現するがん細胞を含むがん、血液がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、中皮腫、充実性腫瘍、肺がん、非小細胞肺癌、胃がん、胃癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、子宮がん、子宮体内膜癌、乳がん、トリプルネガティブ浸潤性乳癌、肝がん、肝細胞癌、膵がん、膵管腺癌、甲状腺がん、胸腺腫、皮膚がん、黒色腫、皮膚黒色腫、腎がん、腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、卵巣がん、卵巣癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、前立腺がん、および／または前立腺腺癌から選択される、請求項１９に記載の使用、請求項２０に記載の使用、または請求項２１に記載の方法のための、抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、または組成物。
  23. 骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、請求項１３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、請求項１４に記載の細胞、または請求項１６もしくは請求項１７に記載の組成物。
  24. 骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法における使用のための医薬の製造における、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、請求項１３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、請求項１４に記載の細胞、または請求項１６もしくは請求項１７に記載の組成物の使用。
  25. 骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）が病理学的に関与する疾患を処置または防止する方法であって、対象へと、治療または予防有効量の、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子、請求項１１に記載のＣＡＲ、請求項１２に記載の１つの核酸もしくは複数の核酸、請求項１３に記載の１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、請求項１４に記載の細胞、または請求項１６もしくは請求項１７に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
  26. 方法が、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント阻害剤により媒介されるシグナル伝達を阻害することが可能な薬剤の投与をさらに含み、任意選択で、ＶＩＳＴＡ以外の免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＴＩＧＩＴ、またはＢＴＬＡから選択される、請求項１９から２５のいずれか一項に記載の、使用のための抗原結合性分子、ＣＡＲ、１つの核酸もしくは複数の核酸、１つの発現ベクターもしくは複数の発現ベクター、細胞、もしくは組成物、使用または方法。
  27. ＶＩＳＴＡ媒介性シグナル伝達を阻害する方法であって、ＶＩＳＴＡ発現細胞を、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子と接触させるステップを含む方法。
  28. 骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の活性を阻害するための方法であって、ＭＤＳＣを、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子と接触させるステップを含む方法。
  29. エフェクター免疫細胞の数または活性を増大させるための方法であって、ＶＩＳＴＡ発現細胞の活性を、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子により阻害するステップを含む方法。
  30. ＶＩＳＴＡに結合した、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体、任意選択で、単離ｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体。
  31. ＶＩＳＴＡを含有するか、またはこれを含有することが疑われる試料を、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子の、ＶＩＳＴＡとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法。
  32. 対象を、ＶＩＳＴＡターゲティング剤による処置のために選択または層別化する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、対象に由来する試料を、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子と接触させるステップと、抗原結合性分子の、ＶＩＳＴＡとの複合体の形成を検出するステップとを含む方法。
  33. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子の、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける診断または予後診断剤としての使用。
  34. がんを検出、位置特定、またはイメージングするための方法における、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合性分子の使用であって、任意選択で、がんが、ＶＩＳＴＡを発現する細胞を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現する細胞の浸潤を含むがん、ＶＩＳＴＡを発現するがん細胞を含むがん、血液がん、白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、中皮腫、充実性腫瘍、肺がん、非小細胞肺癌、胃がん、胃癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、子宮がん、子宮体内膜癌、乳がん、トリプルネガティブ浸潤性乳癌、肝がん、肝細胞癌、膵がん、膵管腺癌、甲状腺がん、胸腺腫、皮膚がん、黒色腫、皮膚黒色腫、腎がん、腎細胞癌、乳頭状腎細胞癌、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、卵巣がん、卵巣癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、前立腺がん、および／または前立腺腺癌から選択される、使用。
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