CN119264249A - 口蹄疫病毒o型型内广谱中和性猪源单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，公开了一种口蹄疫病毒O型型内广谱中和性猪源单克隆抗体及其应用，该单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该单克隆抗体识别的抗原关键氨基酸残基为VP2蛋白77位，该位点位于结构蛋白VP2B‑C环，为构象性表位，其不与A型抗原反应，是一株型内广谱中和抗体，并表现出较强的中和效力(IC₅₀＜5μg·mL^‑1)。同时，本发明还提供了该单克隆抗体的应用。

Description

口蹄疫病毒O型型内广谱中和性猪源单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种口蹄疫病毒O型型内广谱中和性猪源单克隆抗体及应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus,FMDV)引起的一种高度传染性动物疾病，具有高度的变异性和广泛的宿主谱，能够感染包括牛、猪、羊等在内的多种偶蹄动物，对畜牧业造成巨大经济损失。FMDV属于小RNA病毒科，具有七个血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3)，其中O型血清型是全球范围内最为流行和广泛分布的类型，其毒株的频繁变异和抗原位点的复杂性，使得FMD的防控成为全球动物卫生领域的一大挑战。自20世纪以来，O型FMDV已成为全球范围内最常见且分布最广泛的血清型。从欧洲、亚洲到非洲，O型FMDV的足迹几乎遍及所有受FMD影响的国家和地区。其高传染性、快速的传播速度以及对多种宿主的适应性，使其成为全球动物卫生领域关注的焦点。近年来，O型FMDV的跨洲际传播事件频发，如2018年非洲猪瘟病毒(ASFV)与O型FMDV在亚洲地区的重叠流行，进一步加剧了疫情的复杂性，对全球动物健康和经济安全构成了严重威胁。

O型FMDV的遗传变异是其流行性的重要驱动因素。FMDV属于正链RNA病毒，由于缺乏校正酶的作用，RNA复制过程中易发生错误，导致病毒基因组的频繁变异。O型FMDV的变异不仅体现在血清型内，也表现为血清型间的跨型变异。近年来，O型FMDV的新型变异毒株不断涌现，如2010年在中东地区首次报告的O/ME-SA/Ind-2001毒株，以及随后在亚洲和非洲多国出现的O/Ind/2010-like和O/Mya-98-like等变异毒株，这些新型变异毒株的出现，对FMD的诊断与防控带来了新的难题。

FMDV的抗原性是其感染和免疫应答的关键。O型FMDV的抗原位点主要位于其病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3上，尤其是VP1的G-H环区域，被认为是主要的中和抗原位点。近年来，通过X射线晶体学、冷冻电镜等技术，科学家们对O型FMDV的抗原位点结构进行了深入解析，揭示了抗原位点的三维结构特征及其与抗体的相互作用机制，为设计高效疫苗和开发诊断试剂提供了重要的分子基础。此外，抗原位点的变异与病毒的免疫逃避机制密切相关，深入理解抗原位点的变异特征，对于预测病毒进化趋势、评估疫苗免疫效果具有重要意义。利用生物信息学技术和分子生物学手段，研究人员对FMDV O型毒株的抗原位点进行了深入解析。通过序列比对、结构预测和抗原表位预测等方法，揭示了VP1蛋白中多个关键的中和性抗原位点。这些位点不仅是病毒与宿主免疫系统相互作用的关键区域，也是疫苗设计和优化的重要靶点。例如，O/PanAsia毒株的VP1蛋白在GH环和C末端存在两个主要的线性表位，这些表位具有良好的免疫原性，能够诱导机体产生高效的中和抗体。通过进一步筛选和优化这些表位，可以开发出具有更强免疫保护力的多肽疫苗或基因工程疫苗。除了抗原位点2外，根据使用单克隆抗体选择的逃逸突变型FMDV的序列分析，定义了FMDV血清型O的VP2衣壳蛋白上的其他表位。已鉴定的VP2中和表位包括βB-βC环的残基68和74、βB-βC环附近的残基79、βE-βF环的残基133和134以及βH-βI环的残基188和191。此外，VP2 N端的非中和保守表位(残基1-5)也被鉴定出来，并用于开发FMDV的通用诊断检测。

单克隆抗体(Monoclonal Antibody,mAb)是现代免疫学的重要工具，具有高特异性、高亲和力的特点，在FMD的研究与防控中发挥着不可替代的作用。针对O型FMDV的单克隆抗体，不仅可用于病毒的快速检测与鉴定，也是研究病毒抗原性、免疫逃逸机制的重要工具。此外，单克隆抗体在FMD疫苗的研发中也展现出巨大潜力，通过筛选与病毒抗原位点高度亲和的mAb，可以指导疫苗抗原的设计，提高疫苗的免疫效果。近年来，基于mAb的FMD诊断试剂盒和治疗性抗体的研发取得了显著进展，为FMD的精准防控提供了新的手段。

O型FMDV的全球流行性、毒株的频繁变异以及抗原位点的复杂性，使得FMD的防控成为一项长期而艰巨的任务。单克隆抗体作为现代免疫学的利器，在FMD的研究与防控中展现出广阔的应用前景。面对O型FMDV的全球流行和复杂变异，深入解析其遗传变异特征、抗原位点结构与功能，以及开发高效特异的单克隆抗体，是防控策略的重要方向。新一代抗体工程技术如双特异性抗体和抗体-药物偶联物(ADCs)等将拓展应用，结合人工智能和大数据分析，推动抗体设计的智能化，为全球动物健康和经济安全保驾护航。

病毒感染后诱导机体产生抗体，产生的抗体包括中和抗体和非中和抗体。中和抗体和非中和抗体的区别在于由不同的抗原所诱生。中和抗体由病毒表面抗原诱生。而非中和抗体由病毒内部抗原或表面非中和抗原所诱生。由于中和抗体是在病毒进入细胞之前破坏病毒的，现有的疫苗如麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、乙肝疫苗、甲肝疫苗，都是使接种者产生中和抗体以抵御病毒的。抗体在医疗实践中应用甚为广泛。如用于疾病的预防、诊断和治疗方面都有一定的作用。当然，“非中和抗体”并非没有用处，它们也可以介导病毒进入巨噬细胞。然而“非中和抗体”的作用非常复杂，它们也可能引起人体其他的不良免疫反应，比如肺部免疫损伤，比如抗原抗体复合物沉淀引发的一些问题等等。

两者究其开发难度来说，成功筛选出特异性强、中和力度高的中和抗体的难度远大于筛选出非中和抗体。

本领域中关于口蹄疫病毒的单抗研究主要集中在申请人中国农业科学院兰州兽医研究所，该申请人为本申请人的联合研发单位。在前期研究中，主要集中在非中和抗体的研究，有效的中和抗体的研究一直没能研发成功。具体可见如下文献：

CN118580346A一种口蹄疫病毒广谱非中和抗体及其在制备增强诱导产生中和抗体的试剂中的应用；

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定，中国兽医科学，周莎莎等著；

口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定，中国兽医科学，王省等著；

上述三种方案都开发出了能够和特异性O型和/或A型血清型口蹄疫病毒结合的单克隆抗体，分别为猪源、牛源的单克隆抗体，但是这些抗体普遍没有中和能力。

在前期研究中，我们免疫了猪和牛，共得到70多株单克隆抗体，但是都没有明显的中和能力。

本案解决的技术问题是：如何开发出一种针对O型血清型口蹄疫病毒具有高度特异性和中和能力的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种口蹄疫病毒O型型内广谱中和性猪源单克隆抗体，该单克隆抗体识别的抗原关键氨基酸残基为VP2蛋白77位，该位点位于结构蛋白VP2 B-C环，为构象性表位，其不与A型抗原反应，是一株型内广谱中和抗体，并表现出较强的中和效力(IC₅₀＜5μg·mL^-1)。

同时，本发明还提供了该单克隆抗体的应用。

本发明的具体方案为：

一种口蹄疫病毒O型型内广谱中和性猪源单克隆抗体，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

同时，本发明还公开了采用如上所述的单克隆抗体制备疫苗的用途。

在上述的用途中，所述疫苗为用于预防和治疗O型血清型口蹄疫病毒感染的疫苗。

此外，本发明还公开了采用如上所述的单克隆抗体制备用于检测O型血清型口蹄疫病毒的试剂盒的用途。

最后本发明还公开了一种疫苗，含有如上所述的单克隆抗体。

以及，一种试剂盒，包括如上所述的单克隆抗体。

本申请的有益效果是：

本发明通过纯化O型FMDV Mya98谱系当前流行毒株HNNY/2022病毒粒子及进行生物素标记制备诱饵抗原，成功分选FMDV O型抗原免疫猪的抗原特异性B细胞，测序获得库容量为3189对BCR序列的特异性抗体库，其中IgG共2020条，占配对BCR的63％。

本发明经过对抗体特性分析，筛选并成功表达1株单克隆抗体pONY-10。IFA、间接ELISA和病毒微量中和实验结果共同指向该抗体对O型毒株的特异性反应。pONY-10对FMDVO型血清型各谱系代表毒株展现出特异性中和作用，并表现出强中和效力，对A型抗原不反应，无中和作用。

pONY-10识别的抗原关键氨基酸残基为VP2蛋白77位，该位点位于结构蛋白VP2 B-C环，为构象性表位，属于抗原位点2。pONY-10的反应性和中和特性是基于O型血清型内的各毒株，不与A型抗原反应，是一株型内广谱中和抗体。中和性单克隆抗体的研究和应用是现代医学和生物技术领域的一个重要分支，它们在提高疾病治疗效率、预防感染和促进新药开发方面发挥着关键作用。

附图说明

图1为FMDV特异性猪源B细胞受体文库构建及抗体表达流程图；

图2为流式分选抗原特异性B细胞的照片；

图3A为O/Mya98/HNNY/2022特异性抗体库序列亚型中重链分类图表；

图3B为O/Mya98/HNNY/2022特异性抗体库序列亚型中轻链分类图表；

图3C为O/Mya98/HNNY/2022特异性抗体库序列亚型中IgG、IgD、IgA、IgE的分布图表；

图4A为pONY-10的重链可变区氨基酸序列中HCDR1、HCDR2、HCDR3的标识图；

图4B为pONY-10的轻链可变区氨基酸序列中LCDR1、LCDR2、LCDR3的标识图；

图4C为pONY-10的V区CDR区氨基酸序列结构示意图；

图5为SDS-PAGE检测pONY-10抗体表达的电泳结果图；

图6为IFA检测pONY-10结合FMDV的反应性的结果图；

图7为间接ELISA检测pONY-10结合亲和力的结果图；

图8为pONY-10抗体毒株交叉中和试验结果图表；

图9为FMDV不同血清型代表毒株VP2序列比对图；

图10为竞争ELISA检测pONY-10的结合位点的结果图表。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明进行清楚、完整的描述，在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

材料与试剂

1.1细胞和FMDV毒株

BHK-21细胞、FMDV O型(O/PanAsia/Tibet/99、O/Mya98/HNNY/2022、O/Cathay/18074、O/ZK/93、O/GSLX/2010)毒株、FMDV A型(A/WH/09、A/HNXX、A/F/72)毒株均由国家口蹄疫参考实验室保存。

1.2主要试剂

FMDV O型灭活抗原(O/PanAsia/Tibet/99)由中农威特生物科技股份有限公司惠赠。生物素标记试剂盒EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin购自Thermo公司；淋巴细胞分离液Histopaque(R)-1.077sterile-filtered,density:1.077g/mL购于Sigma公司；APC荧光标记的抗生物素抗体(Anti-biotin-APC)购于Miltenyi Biotec公司；无内毒素质粒提取试剂盒购于TIGEN公司；FITC标记羊抗猪IgG抗体购于Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗猪抗体购于博奥森(Bioss)公司。

实施例1猪源单克隆抗体的制备

2.1方法

2.1.1FMDV 146S的纯化与动物免疫

将O/Mya98/HNNY/2022病毒接种长满单层，状态良好的BHK-21细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱恒温培养。观察细胞CPE，当全部细胞发生病变死亡时，反复冻融3次后离心去细胞碎片，收获细胞毒。利用蔗糖密度梯度离心法纯化浓缩FMDV完整病毒粒子146S，采用Montanide ISA 201佐剂与抗原146S混合进行乳化配制灭活疫苗。免疫经检测FMDV抗原和抗体均阴性的健康猪。选择2月龄健康三元猪肌肉注射FMDV O型HNNY/2022毒株灭活疫苗，共免疫3次，免疫间隔28d。

2.1.2流式细胞术分选抗原特异性B细胞

最后一次免疫后第4d，从猪前腔静脉采集EDTA抗凝血，并根据制造商的说明使用HISTOPAQUE 1.077分离外周血单个核细胞(PBMCs)。为制备诱饵抗原，使用生物素标记抗原FMDV 146S。

按照生产商的说明书，将高纯度的FMDV 146S抗原用EZ-Link NHSLC-Biotin试剂进行生物素化，得到的Biotin-FMDV 146S作为诱饵抗原筛选结合抗原特异性B细胞。

取约10⁷PBMCs重悬于200μL细胞分选液中，加入Biotin-FMDV 146S，4℃下反应30min后500xg离心5min清洗1遍。随后吸取1μL小鼠抗生物素APC在4℃下孵育30min后再次洗涤细胞。取500μL细胞分选液重悬细胞，避光置于冰上，等待上机。此外需取相同细胞设置一组不添加诱饵抗原的样本管作为荧光减一(FMO)对照。在FMO对照样本中圈定合适的门进行FACS，分选O型抗原特异性B细胞。

2.1.3FMDV特异性BCR库的建立

将分选到的FMDV O/Mya98/HNNY/2022抗原特异性B细胞送公司使用10X GenomicsChromium系统进行单细胞转录组及免疫组测序。首先使用凝胶珠乳液(GEM)对单个细胞进行快速液滴封装，在凝胶微珠上种上特定的DNA片段，包括Barcode、UMI和PolyT。Barcode用于区分不同的凝胶微珠，UMI用于区分原始cDNA分子，PolyT用于捕获mRNA。将每个细胞与凝胶微珠一一混合后形成油包水的小微滴，细胞膜破裂后，mRNA游离出来并与逆转录酶、凝胶微珠上的核酸引物和dNTP底物接触，发生逆转录反应，生成cDNA。紧接着将带标签的cDNA分子提取出来，加上接头，经过PCR扩增，制备成适合Illumina测序平台的测序文库进行高通量测序。测序得到的原始数据通过10X Genomics提供的Cell Ranger软件进行处理，获得单个细胞水平的基因表达谱和差异分析情况。

2.1.4单克隆抗体pONY-10的可变区氨基酸序列

抗体的可变区(V区)是抗体分子中负责识别和结合抗原的区段。抗体由两条重链和两条轻链组成，每条链的N端都有一个V区，是识别外来物的关键所在。每个V区都包含三个高度可变的区域，称为互补决定区(Complementarity Determining Regions,CDRs)，其中CDR3的变化程度最高，对抗体的特异性起着决定性的作用。除了这3个高变区，V区还包含相对保守的骨架区(Framework Regions,FRs)，这些区域在不同抗体之间变化较小，为高变区提供结构支持。V区CDRs和FRs的不同组合产生丰富多样的抗体，这种多样性是免疫系统识别和抵御广泛病原的基础。通过将测序获得的FMDV特异性IgG抗体序列上传至国际免疫基因组学数据库IMGT网站(https://www.imgt.org/HighV-QUEST/)，对测序数据进行详细注释，获得包括抗体V区基因重排、变异等信息。

2.2结果

2.2.1FMDV 146S的纯化与动物免疫

将纯化的O/Mya98/HNNY/2022抗原与201佐剂1:1混合制备灭活疫苗，免疫2月龄仔猪。第3次免疫后第4天，采集EDTA抗凝血分离PBMCs，通过流式染色标记外周血中的B细胞，加入生物素标记的诱饵抗原，分选出抗原特异性B细胞。进行细胞计数后，立即使用Chromium Next GEM单细胞5’Kit v2(10×Genomics)进行单细胞捕获和抗体文库的构建(图1)。

图1为FMDV特异性猪源B细胞受体文库构建及抗体表达流程图。

2.1.2流式细胞术分选抗原特异性B细胞

为了得到FMDV抗原特异性抗体分泌B细胞，在第3次免疫后的第4天，采集猪前腔静脉的EDTA抗凝血，分离PBMC。随即采用生物素标记的抗原146S做诱饵进行流式分选。FACS统计结果显示，100万个PBMC中鉴定出34万个淋巴细胞，其中32万个淋巴细胞被门控为单线细胞(图2)。FMDV抗原特异性B细胞在猪外周血中数量较少，约占猪外周血单个核细胞总数的1.16％，共分选获得2×10⁴个FMDV特异性抗体分泌B细胞，进行10X Genomics单细胞BCR测序。

图2为流式分选抗原特异性B细胞的照片。

2.1.3特异性抗体库的序列配对及分型

将通过FACS收集到的FMDV特异性抗体分泌B细胞送10X Genomics公司进行单细胞5’BCR免疫组库测序。获得的全长cDNA进行酶切片段化、末端修复、加A接头及连接Reads测序引物后进行抗体BCR序列的分类及配对。结果如表1所示，猪免疫O/Mya98/HNNY/2022毒株灭活疫苗后，特异性B细胞中共测得抗体序列6227条。如图3A，重链主要是IgG亚型占据大部分(1955/3076)，而主要来源于呼吸道、消化道黏膜下的浆细胞分泌的IgE亚型BCR序列未测得。轻链序列3151条(图3B)，其中Kappa亚型55％(1732/3151)，Lambda亚型45％(1419/3151)，Kappa亚型略优势于Lambda亚型(图3B)。

图3A为O/Mya98/HNNY/2022特异性抗体库序列亚型中重链分类图表；

图3B为O/Mya98/HNNY/2022特异性抗体库序列亚型中轻链分类图表；

图3C为O/Mya98/HNNY/2022特异性抗体库序列亚型中IgG、IgD、IgA、IgE的分布图表；

表1O/Mya98/HNNY/2022特异性抗体库序列分类表

抗体类型	IgA	IgD	IgG	IgE	IgK	IgL	总计
								HNNY/2022	364	757	1955	0	1732	1419	6227

分类后的BCR序列依次分别上传至IMGT

(https://www.imgt.org/HighV-QUEST/home.action)网站，进行免疫受体基因重排的分析，包括识别和比对免疫受体基因、VDJ重排分析、突变热点分析及功能注释。进一步对BCR的重链和轻链序列进行配对(表2)，共获得库容量为3189条的FMDV O型HNNY/2022毒株的特异性抗体库。如图3C所示，在机体的免疫应答及免疫防御中扮演着核心角色的IgG占配对BCR的63％。IgD和IgA分别为785对和384对，占整个库的25％和12％。

表2O/Mya98/HNNY/2022特异性BCR文库容量

抗体种类	IgA	IgD	IgG	IgE	总计
						HNNY/2022	384	785	2020	0	3189

2.1.4猪源单克隆抗体pONY-10V区序列

在五种类型的Ig中，IgG由于高浓度、广泛的分布、长半衰期、多样的功能以及在免疫记忆中的关键角色，是五种免疫球蛋白中最重要的一种。因此选择获得的IgG抗体序列进行表达和生物活性的验证。V区是抗体分子中负责识别和结合抗原的部分，由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成，通过二硫键连接形成一个独特的三维结构，形成抗原结合位点，提供广泛的免疫保护。将筛选表达验证的猪源单克隆抗体命名为pONY-10，表3列出了pONY-10抗体可变区(V区)的氨基酸序列。

表3猪源单克隆抗体pONY-10的氨基酸序列

V区中的三个互补决定区(CDR1、CDR2、CDR3)是高度可变的区域，尤其是CDR3，直接参与了与抗原的相互作用，确保抗体与抗原之间的高度特异性结合。V区的框架区(FR)相对保守，参与稳定抗体与抗原的结合。V区可变区不仅是抗体识别抗原的部位，也是抗体多样性和特异性的关键所在(图4A至图4C)。

参考图4A，在抗体pONY-10中，重链(VH)的高变区HCDR1序列为GFTISSYE，HCDR21序列为ISTSGSST，其中在抗原结合中发挥最重要作用的HCDR3长度为19个氨基酸，序列为EKICYSAYWYRRCELDRDL；

参考图4B，轻链(VL)的高变区LCDR1的氨基酸序列为QSLVFSGKSW，LCDR2的氨基酸序列为QAT，LCDR3的氨基酸序列为QQFKEFPPNG。

图4A为pONY-10的重链可变区氨基酸序列中HCDR1、HCDR2、HCDR3的标识图；

图4B为pONY-10的轻链可变区氨基酸序列中LCDR1、LCDR2、LCDR3的标识图；

图4C为pONY-10的V区CDR区氨基酸序列结构示意图；

2.3小结

通过纯化O型FMDV Mya98谱系当前流行毒株HNNY/2022病毒粒子及进行生物素标记制备诱饵抗原，成功分选FMDV O型抗原免疫猪的抗原特异性B细胞，测序获得库容量为3189对BCR序列的特异性抗体库，其中IgG共2020条，占配对BCR的63％。单克隆抗体被广泛用作各种应用的有利生物分子，为进一步研究和应用于包括传染病研究、诊断和治疗，疫苗设计提供了有价值的来源，以加强疾病预防和控制措施。

实施例2抗体生物学活性的验证

3.1方法

3.1.1抗体基因表达载体的构建及表达纯化

将抗体的重链可变区(VH)基因密码子优化后插入到含猪IgG重链框架区的CH-pcDNA3.4载体；

抗体轻链可变区(VL)也通过密码子优化后插入到含有猪IgG轻链恒定区的CL-pcDNA3.4载体，抗体恒定区添加6×His标签，序列合成与载体构建委托金唯智生物技术公司进行合成。

重组表达质粒转化DH5α感受态细胞扩增质粒，并按试剂盒说明书使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒。

将抗体重链和轻链质粒共转染至悬浮培养的293f细胞进行表达。重链质粒与轻链质粒按照2:3的重量比例稀释于D-PBS中，充分混匀。使用PEI 40000MW做转染试剂，转染试剂PEI与质粒DNA总量按重量比3:1进行混合，制备PEI-DNA转染混合物。转染复合物置于室温静置10min后，缓慢滴加至2.0×10⁶个293f细胞中。转染后的细胞置于37℃恒温悬浮培养箱中培养，48h后添加293f SUP Feed，培养7-8d时收取表达样品。4℃，10000rpm离心30min，0.22μm滤器过滤培养上清液后进行抗体纯化。使用Ni-NTA 6FF填料装填预装柱进行纯化，高浓度咪唑洗脱目的蛋白后4℃过夜置于PBS缓冲液中进行透析，更换4-6次透析液，除去蛋白中的咪唑。透析后的抗体包埋于PEG 8000中浓缩后进行SDS-PAGE电泳鉴定。

3.1.2间接免疫荧光(IFA)检测抗体反应性

将BHK-21细胞接入24孔板中，待细胞生长至80％-90％汇合度时，分别将FMDV O型和A型血清型各代表毒株接种细胞，同时设置正常细胞对照。37℃细胞培养箱中感染4h后，收集上清液灭活处理。细胞用PBS洗涤3次，加入-20℃预冷的4％多聚甲醛固定细胞，室温作用20min后经0.1％ Triton穿透胞膜10min，1％ BSA封闭后进行检测。PBS洗细胞3次，加入终浓度为5μg/mL的上述纯化后的抗体，37℃孵育1h。PBS洗3次，加入说明书指导工作浓度的FITC标记的抗猪IgG抗体，37℃孵育1h，PBS洗细胞5次后荧光显微镜观察荧光信号并拍照记录。

3.1.3间接ELISA检测抗体结合亲和力

使用FMDV灭活纯化抗原作为包被抗原来检测抗体结合的亲和力，具体操作步骤如下：浓缩纯化抗原用碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml，每孔100μL加入酶标板中，4℃过夜包被16h。PBST洗板5次，每孔加入100μL封闭液，37℃2h后，PBST洗板5次，拍干孔中液体。将待检抗体从20μg/mL开始进行2倍梯度稀释，每孔100μL加入酶标板中，37℃孵育1h；设置PBS阴性对照组。PBST洗板5次，每孔加入HRP标记抗猪抗体100μL，37C孵育30min。PBST洗板5次，TMB显色液每孔100μL加入酶标板中，37℃显色15min。加入终止液终止显色，用酶标仪测定450nm处的吸光值。S/C.O方式统计结果，S为样本OD值，C.O即Cut off值(阳性判定值)，C.O＝2.1×N(N为阴性对照OD值)。

3.1.4病毒交叉中和试验

病毒微量中和试验是一种评估抗体对中和病毒感染性的实验方法。将已知浓度(μg/mL)的单克隆抗体样品在96孔细胞培养板中进行连续2倍梯度稀释，做两个重复孔，每孔加入50μL抗体。加入50μL含有100TCID₅₀(50％组织培养感染剂量)FMDV的无血清培养基。在37℃培养箱中孵育1h，使抗原抗体中和作用发生。孵育结束后每孔加入100μL BHK-21细胞悬液，每孔约5×10⁴个细胞。置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育48h后观察细胞病变效应(Cytopathic Effect，CPE)，记录能够中和100TCID₅₀ FMDV的抗体的平均效价。选择FMDV O型和A型各代表毒株进行单克隆抗体的交叉中和试验，观察记录结果。

3.2结果

3.2.1纯化抗体的SDS-PAGE鉴定

将获得的IgG可变区序列克隆至已融合抗体框架区的pcDNA3.4载体中，分别提取VH和VL纯化质粒，共转染至293f悬浮细胞进行真核表达。表达上清经Ni-NTA预装柱纯化后进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图5所示。成功表达并纯化出了全猪源IgG抗体分子pONY-10，抗体VH链大小约为55kDa，VL约为25kDa，条带清晰与预期大小一致，无杂带。

图5为SDS-PAGE检测pONY-10抗体表达的电泳结果图。

3.2.2间接免疫荧光(IFA)检测抗体的反应性

细胞经FMDV O型各谱系代表毒株(O/PanAsia/Tibet/99、O/Cathay/18074、O/GSLX/2010和O/ZK/93)和A型各谱系代表毒株(A/WH/09、A/HNXX、A/AF/72)抗原感染后，使用纯化抗体pONY-10(终浓度5μg/mL)在4℃孵育结合，经抗猪FITC荧光二抗标记后进行观察(图6)。结果显示在O型和A型FMDV共7种试验毒株感染BHK-21细胞后，单克隆抗体pONY-10对亲本毒株O/HNNY/2022及同属Mya98谱系的O/GSLX/2010和PanAsia谱系毒株O/Tibet/99反应性强，发出特异性绿色荧光；对O型Cathay谱系的毒株反应强度减弱，仅观察到较弱的荧光信号。对A型各谱系代表毒株均不反应。展现出对O型血清型内毒株特异性结合的特征。

图6为IFA检测pONY-10结合FMDV的反应性的结果图。

3.2.3间接ELISA检测抗体结合亲和力

使用FMDV O型PanAsia谱系毒株Tibet/99和亲本毒株HNNY/2022及A型纯化抗原A/WH/09包被ELISA板，检测抗体对不同抗原的结合亲和力。根据Cut-off值对应的抗体浓度划分判定数值，分别设置0-0.05μg/mL、0.05-0.1μg/mL、0.1-1μg/mL、1-5μg/mL、>5μg/mL，共5个区间，处于这些区间内的判定数值反应强度依次标记为++++、+++、++、+、-。

依据以上标准，pONY-10与亲本毒株O/HNNY/2022发生反应处于临界值的抗体浓度为0.078μg/mL，强度+++；与O型其他谱系毒株(O/Tibet/99)反应的临界值浓度约0.156μg/mL，反应强度为++；而与A型抗原反应的临界值高于5μg/mL，判定为不反应(图7)。间接ELISA的试验结果进一步说明了相比之下pONY-10对O型抗原结合的亲和力显著高于A型抗原。

图7为间接ELISA检测pONY-10结合亲和力的结果图。

3.2.4病毒交叉中和试验

pONY-10分别与O型FMDV泛亚拓扑型代表毒株O/Tibet/99、Mya98旧毒株O/GSLX/2010和当前流行毒株O/HNNY/2022(亲本毒株)、O/ZK/93、Cathay毒株O/18074，以及A型FMDV东南亚谱系(G1和G2)和A22系代表毒株分别进行病毒中和试验。结果如表4所示，中和抗体效价以50％的抑制浓度表示(IC₅₀)，IC₅₀＜50μg·mL^-1表示具有中和作用，IC₅₀＞50μg·mL^-1表示无中和活性。

表4pONY-10抗体中和效价表

结果显示pONY-10仅中和O型血清型内各毒株，并表现出较强的中和效力(IC₅₀＜5μg·mL^-1)。中和亲本毒株的IC₅₀值为0.53μg/mL，同谱系旧毒的IC₅₀值为0.267μg/mL，中和O/Tibet/99及O/ZK/93的值分别为0.75μg/mL和4.36μg/mL；与O型Cathya谱系毒株作用弱于其他O型毒株，IC₅₀值为24μg/mL，除此之外与A型各毒株均无中和效果。数据表明pONY-10是一株针对O型型内抗原的特异性猪源中和性单克隆抗体(图8)。

图8为pONY-10抗体毒株交叉中和试验结果图表。

3.3小结

经过对抗体特性分析，筛选并成功表达1株单克隆抗体pONY-10。IFA、间接ELISA和病毒微量中和实验结果共同指向该抗体对O型毒株的特异性反应。pONY-10对FMDV O型血清型各谱系代表毒株展现出特异性中和作用，并表现出强中和效力，对A型抗原不反应，无中和作用。特异性中和单克隆抗体的研究和发现在预防和治疗传染性疾病、开发用于检测和监测病原体的高特异性和高灵敏度的诊断试剂盒、研究病原的结构和功能及设计疫苗等领域具有重要的应用价值。

实施例3抗原结合位点的鉴定

4.1方法

4.1.1中和抗体逃逸突变株的筛选及序列分析

将50μL连续10倍稀释的FMDV与50μL不同浓度的mAbs(20-50μg·mL^-1)在96孔微孔板中混合后加入100μL的BHK-21细胞悬液(5×10⁴个细胞/孔)，在37℃下孵育48h，以扩增病毒。第一代病毒从可产生约80％-100％ CPE的稀释度最高的病毒接种孔中获得。随后在24孔板中进行压力筛选，将200μL第一代的病毒液与200μL对应孔二倍浓度的mAbs(40-100μg·mL^-1)混合后加入400μL BHK-21细胞悬液(5×10⁵个细胞/孔)，在37℃下孵育24h。获得的病毒经过几轮选择，直到加入200μg·mL^-1的mAbs后可以完全逃脱中和，得到逃逸突变毒株。

取500μL逃逸突变株的上清液，参照RNeasy Mini Kit说明书提取病毒总RNA。采用One-Step RT-PCR试剂盒扩增逃逸突变毒株的P1基因，上游引物Pan204+：ACCTCCAACGGGTGGTACGC(SEQ ID NO.4)，下游引物NK61：GACATGTCCTCTTGCATCTG(SEQ IDNO.5)。扩增条件：50℃反转录30min；94℃预变性2min；94℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸2min 45s，循环35次；72℃再延伸10min。扩增结束后送往金唯智生物科技有限公司测定序列。利用软件snapgene比对突变体P1区域与亲本病毒的序列来确定突变的氨基酸。

4.1.2竞争ELISA试验鉴定结合位点

使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素试剂(Thermo Fisher Scientific，USA)对高纯度pONY-10进行生物素化，所得生物素化mAb pONY-10命名为Bio-pONY-10。用0.5μg/mLE32抗体(广谱非中和mAb)在4℃下包被酶标反应板，孵育14h。用PBST(含0.1wt％吐温的PBS)洗涤3次，然后在室温下捕获在100μL PBS中稀释的1μg/mL 146S抗原2小时，并用PBST洗涤3次。随后，用封闭缓冲液(5％蔗糖和1％ BSA的PBS溶液)在37℃下封闭ELISA板1h，并用PBST洗涤3次。将待检测的血清在50μL PBS(从1:4到1:512)中连续稀释，并在37℃下与等体积的预滴定剂量(0.5μg/mL)的Bio-pONY-10PBS溶液孵育1h。用PBST洗涤5次后，加入100μL HRP偶联链霉亲和素(33ng/mL)，并在37℃下孵育30分钟。用PBST洗涤5次后，向每个孔中加入100μL四甲基联苯胺(TMB)显色15min，用100μL 2M H₂SO₄终止显色反应。

4.2结果

4.2.1毒株特异性中和抗体识别表位鉴定

将逃逸突变株结构蛋白P1区域与亲本病毒O/HNNY/2022的序列进行比对。整理突变位点如表5所示，pONY-10抗体逃逸突变株均在VP2同一位点出现氨基酸的替换。将VP2的77位精氨酸R(Arg)突变为色氨酸W(Trp)，从而逃逸了抗体的中和作用。鉴定出的该位点属于抗原位点2，为构象性表位，位于VP2蛋白的BC环。

表5毒株特异性单克隆抗体识别的抗原表位

在对FMDV O型和A型代表毒株VP2结构蛋白氨基酸序列进行比对后发现(图9)，不同血清型间毒株的VP2蛋白77位氨基酸残基不完全相同。

O型血清型各谱系毒株的VP2 77位氨基酸均为精氨酸R(Arg)，A型和Asia1型毒株的VP2 77位是组氨酸H(His)。表现出VP2 77位氨基酸在血清型内的保守性。这进一步说明了单克隆抗体pONY-10和抗原相互作用的表位中关键氨基酸位于VP2的77位，而且这种中和作用是基于O型血清型内特异性的。

图9为FMDV不同血清型代表毒株VP2序列比对图。

4.2.2竞争ELISA试验鉴定结合位点

在实验室已有的研究结果基础上，选取了4株识别FMDV不同抗原表位的单克隆抗体，这4株抗体识别的表位分别靶向FMDV VP1 G-H环、VP1 C末端、VP2和VP3蛋白。将这4株抗体标记生物素后，通过竞争ELISA方法检测pONY-10识别的结构蛋白(图10)。结果显示pONY-10与识别VP2表位的抗体共同孵育后产生了高于50％的抑制率，这意味着pONY-10识别的抗原表位位于结构蛋白VP2。这一结果与抗体逃逸株筛选的结果一致，证明了pONY-10与FMDV结合的潜在位点与活性残基位于结构蛋白VP2。在未来的研究中，选择pONY-10作为竞争抗体建立ELISA方法，有望替代微量病毒中和试验用于田间血清样本中保护性抗体水平的测定。

图10为竞争ELISA检测pONY-10的结合位点的结果图表。

4.3小结

pONY-10识别的抗原关键氨基酸残基为VP2蛋白77位，该位点位于结构蛋白VP2 B-C环，为构象性表位，属于抗原位点2。pONY-10的反应性和中和特性是基于O型血清型内的各毒株，不与A型抗原反应，是一株型内广谱中和抗体。中和性单克隆抗体的研究和应用是现代医学和生物技术领域的一个重要分支，它们在提高疾病治疗效率、预防感染和促进新药开发方面发挥着关键作用。

Claims (6)

1.一种口蹄疫病毒O型型内广谱中和性猪源单克隆抗体，其特征在于，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.采用如权利要求1所述的单克隆抗体制备疫苗的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述疫苗为用于预防和治疗O型血清型口蹄疫病毒感染的疫苗。

4.采用如权利要求1所述的单克隆抗体制备用于检测O型血清型口蹄疫病毒的试剂盒的用途。

5.一种疫苗，其特征在于，含有如权利要求1所述的单克隆抗体。

6.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的单克隆抗体。