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CN118108837B - 口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体及其应用 - Google Patents

口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN118108837B CN202410081359.XA CN202410081359A CN118108837B CN 118108837 B CN118108837 B CN 118108837B CN 202410081359 A CN202410081359 A CN 202410081359A CN 118108837 B CN118108837 B CN 118108837B
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白兴文
马雪青
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Abstract

本发明公开了口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体及其应用。本发明公开了口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含3个重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3。本发明还公开了口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD7，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含3个重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3。本发明首次获得自然宿主源Asia1型FMDV特异性中和抗体，并鉴定其识别的关键抗原位点，为Asia1型FMDV抗原解析和血清学检测方法建立提供了有力工具。

Description

口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体及其应用。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性动物疫病，主要侵害猪、牛、羊等重要家畜和其它偶蹄动物，存在A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3共7种血清型。我国目前主要流行O型和A型FMD，但Asia1/Sindh-08毒株（G-Ⅶ群）、Asia1型G-Ⅷ病毒群和新流行毒株Asia1/BD-18（G-Ⅸ），常年流行于我国周边国家或地区，流行形势复杂且毒株多变，存在传入我国境内的高危风险，对我国畜牧业构成极大威胁。因此，加强对Asia1型FMDV的中和单克隆抗体筛选和相关诊断方法的研制具有重大意义。
FMDV病毒衣壳由60分子的VP1、VP2、VP3、VP4组成，VP1、VP2和VP3暴露于病毒衣壳表面，VP4衬于衣壳蛋白内部。FMDV抗原位点研究多数集中于O型FMDV，O型FMDV表面已鉴定出5个功能独立的抗原位点，其次为A型FMDV，而Asia1型FMDV抗原位点信息报道较少。已有研究表明，A型SEA97谱系G1和G2分支毒株存在保守抗原位点；O型和A型FMDV间存在跨血清型中和位点，但不同血清型病毒间的抗原表位差异和保守中和位点还未被系统描述，给FMD防控和血清型间/型内保护疫苗的研制造成了巨大的阻碍。
发明内容
本发明的目的是提供口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体及其应用。
本发明提供了一种口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含3个重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；
HCDR1氨基酸序列：GFTFSGTH
HCDR2氨基酸序列：IDTSGSGT
HCDR3氨基酸序列：ATWYRGGWGAMDL；
所述轻链可变区包含3个轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；
LCDR1氨基酸序列：QSIRSY
LCDR2氨基酸序列：GTS
LCDR3氨基酸序列：LQRNAVPWT。
单克隆抗体PD3的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
单克隆抗体PD3的重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3在制备预防或治疗口蹄疫的药物或诊断试剂中的应用。
本发明提供了一种口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD7，包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含3个重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；
HCDR1氨基酸序列：GFTFSTNY
HCDR2氨基酸序列：IRTTDQSS
HCDR3氨基酸序列：ATRYRGGWGALDL
所述轻链可变区包含3个轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；
LCDR1氨基酸序列：QSIRSY
LCDR2氨基酸序列：KAS
LCDR3氨基酸序列：LQRQVLPWT。
单克隆抗体PD7的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
单克隆抗体PD7的重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD7在制备预防或治疗口蹄疫的药物或诊断试剂中的应用。
本发明提供了本发明首次获得自然宿主源Asia1型FMDV特异性中和抗体，口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3和PD7可用于间接免疫荧光、间接ELISA、免疫印迹特异性检测Asia1型FMDV，为Asia1型FMDV抗原特异性检测方法提供了有力工具；PD3和PD7猪源Asia1型FMDV中和抗体，为阻断Asia1型FMDV感染提供了药物应用基础；同时鉴定了中和抗体所识别的抗原位点，为Asia1型病原表位多肽疫苗研制奠定了基础。
附图说明
图1A.Asia1/JS/05抗原透射电镜观察结果；B.生物素标记的Asia1/JS/05(Asia1/JS/05-biotin)抗原透射电镜观察结果；C.蛋白免疫印迹检测生物素标记的Asia1/JS/05(Asia1/JS/05-biotin)抗原结果；M.蛋白质分子质量标准；1.未标记生物素的Asia1/JS/05病毒抗原；2.生物素标记的Asia1/JS/05(Asia1/JS/05-biotin)病毒抗原。
图2为血清中和抗体滴度的检测及抗原特异性B细胞的分选，A.血清中和抗体滴度检测；B-F. PBMCs中Asia1- FMDV特异性B细胞的分选，其中B.外周血淋巴细胞；C.单个淋巴细胞；D.IgG+B细胞；E.IgG+ FMO 同型对照细胞；F.IgG+Asia-FMDV-Biotin+双阳性细胞。
图3为PD3和PD7抗体表达产物的检测，M.蛋白质相对分子质量标准。
图4为间接免疫荧光(IFA)检测抗体与Asia1型FMDV的反应性。
图5为间接ELISA检测抗体与Asia1型FMDV的反应性。
图6为PD3和PD7两株中和抗体识别表位的初步鉴定，A.抗体识别表位类型的鉴定；B.抗体识别结构蛋白的鉴定；M.蛋白质相对分子质量标准。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步说明。
BHK21细胞、CHO-S细胞、FMDV毒株Asia1/JS/05均由国家口蹄疫参考实验室保存；含有猪IgGH链基因载体pVH-pcDNA3.4、含有猪IgG κ链基因载体pVK-pcDNA3.4、含有猪IgGλ链基因载体pVL-pcDNA3.4由中国农业科学院兰州兽医研究所宿主抗病毒感染与免疫生物学团队保存。
淋巴细胞分离液（Histopaque-1077，1.077 g/mL）、FITC标记的兔抗猪IgG抗体购自Sigma-Aldrich公司。生物素标记试剂盒（EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin）、单细胞裂解试剂盒（SingleCell Lysis Kit）、反转录试剂盒（SS VILO MASTERMIX）、ExpiFectamine™ CHO 转染试剂盒购于Invitrogen公司。一步RT-PCR扩增试剂盒（HiScipt II One StepRT-PCR Kit）购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。小鼠抗猪IgG-FITC抗体购于Mybiosource公司。辣根过氧化物酶（HRP）标记的小鼠抗猪标签抗体购于南京金斯瑞生物科技公司。无内毒素质粒提取试剂盒购于天根生化科技有限公司。
实施例1口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3和PD7的制备
1.抗原生物素化及电镜观察
Asia1/JS/05灭活146S抗原参照试剂盒说明书进行生物素化标记，标记抗原记为Asia1-FMDV-Biotin。取Asia1/JS/05抗原和Asia1-FMDV-Biotin，分别进行磷钨酸染色和Western Blot，验证标记前后FMDV粒子的完整性和生物素化的有效性。透射电镜观察显示，Asia1/JS/05（图1A）和Asia1-FMDV-Biotin抗原（图1B）均为直径25 nm~30nm的圆形颗粒，免疫印迹结果显示Asia1-FMDV-Biotin成功被生物素化（图1C）。结果表明，生物素染料标记未对病毒146S粒子的完整性造成影响。
2.动物免疫
选取2头口蹄疫抗体阴性的健康仔猪（3月龄），颈部肌肉注射免疫Asia1/JS/05灭活疫苗，剂量为20µg/头份，首次免疫与二次免疫间隔28d。首次免疫后0 d、7 d、14 d、28 d、35 d采集动物前腔静脉血并分离血清，冻存于-70℃。
3. 抗原特异性单个B细胞的分选
加强免疫后7d采集动物抗凝血参照淋巴细胞分离液使用说明书分离PBMCs。将PBMCs稀释为1.0×107个/mL，取500µL细胞悬液于流式管中，加入1µgAsia1-FMDV-Biotin，同时设立未加标记抗原的FMO对照，冰上避光孵育20min；加入1640培养基清洗细胞2次，4℃400×g离心10 min。将细胞重悬后，加入鼠抗猪IgG-FITC和Anti-Biotin-APC抗体各2µL，冰浴20 min后清洗细胞；将细胞重悬于1640培养基，即可上机分选特异性结合Asia1-FMDV-Biotin的单个B细胞。
血清中和试验结果表明，免疫Asia1/JS/05抗原后，可诱导猪体内产生高水平的中和抗体（图2A）。在加强免疫7d后，采集动物抗凝血分离PBMCs进行染色及流式分选。通过P1门圈出淋巴细胞（图2B），P2门圈出单个细胞（图2C），P3门圈出单个淋巴细胞中IgG+B细胞（图2D），P4门圈出IgG+Asia-FMDV-Biotin+双阳性细胞（图2F），即为Asia1型FMDV抗原特异性B细胞，结果显示，抗原特异性B细胞约占PBMCs总数的2.2/10000。流式细胞术分选P4门内单个抗原特异性B细胞至已加裂解液的96孔板中进行抗体基因扩增。
4. 抗体重链和轻链可变区的PCR扩增
将单个B细胞分选于已加入10µL预混液（1µLSingle Cell DNase I +9µLSingleCell Lysis Solution）的96孔板，室温孵育5 min；随即加入1µLSingle Cell StopSolution，室温孵育2min终止反应，反应结束后按照反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。取2µLcDNA进行二轮巢氏PCR分别扩增抗体重链V区（VH）、lambda链V区（VL）和kappa链V区（VK）基因，扩增引物及反应条件参照文献【Li K, Zhu G, Zhou S, et al. Isolationand characterization of porcine monoclonal antibodiesrevealed twodistinctserotype-independent epitopes on VP2 of foot-and-mouth disease virus[J].J Gen Virol. 2021;102(7):10.1099/jgv.0.001608】；取第2轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物条带符合预期大小的样品送生物公司测序。
5.表达质粒构建及抗体的表达、纯化
从单个抗原特异性B细胞中扩增出的成对重链和轻链可变区基因序列由GenScript Incorporation（www.genscript.com）参照CHO-S细胞进行密码子优化（采用Cricetulusgriseus），在前端加入信号肽，参照文献【魏德陇. 基于单个B细胞抗体技术研制PRRSV特异性单克隆抗体[D].中国农业科学院,2021.DOI:10.27630/d.cnki.gznky.2020.000282.】。将重链合成基因通过NotⅠ和BbvCⅠ酶切位点插入到含有在C末端具有串联HA标签和His标签的猪IgG1重链恒定区基因的pCH-pcDNA 3. 4表达载体；将轻链合成基因通过NotⅠ和BstBⅠ酶切位点插入到含有猪κ轻链恒定区基因的pCK-pcDNA 3.4表达载体（参照文献【Li K, Zhu G, Zhou S, et al. Isolationand characterizationof porcine monoclonal antibodies revealed two distinct serotype-independentepitopes on VP2 of foot-and-mouth disease virus[J].J Gen Virol. 2021;102(7):10.1099/jgv.0.001608】）。将抗体重链和轻链的重组表达质粒转化至大肠杆菌JM109感受态细胞进行扩增，挑取单个阳性菌落在Amp抗性的LB培养液中过夜增殖，使用EndoFreemaxi质粒试剂盒（Tiangen）提取和纯化。将重链/轻链质粒按2:3质量比，参照ExpiFectamine™ CHO转染试剂盒说明书转染至CHO-S细胞中；培养8d~9d后，收取细胞上清，使用AKTA蛋白纯化仪进行亲和层析纯化，通过SDS-PAGE验证抗体的表达效果。
通过二轮巢式PCR扩增，获得PD3和PD7抗体序列。将2株抗体重、轻链质粒经CHO-S细胞表达、亲和层析纯化，利用SDS-PAGE验证所表达抗体。结果显示，成功表达2对猪源IgG分子，重链分子量约为50 ku，轻链分子量在25ku左右（图3）。
6、抗体序列分析：
将PD3和PD7核酸序列上传至抗体基因数据库使用IMGT/V-QUEST工具（https://www.imgt.org/IMGT_vquest/input）分析抗体序列特征，发现：
PD3和PD7重链编码基因的V基因、D基因和J基因均分别对应猪的IGHV1-10*01基因或IGHV1-4*01基因、IGHD2*01基因和IGHJ5*01基因；
PD3轻链编码基因的V基因和J基因分别对应猪的IGKV1-11*01基因或IGKV1D-11*01基因和IGKJ1*01基因，PD7轻链编码基因的V基因和J基因分别对应猪的IGKV1-11*01基因或IGKV1-11*02基因或IGKV1-14*01基因或IGKV1D-11*01基因和IGKJ1*01基因。
PD3重链可变区氨基酸序列（SEQ ID No. 1）：
EEKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFTFSGTHINWVRQAPGKGLEWLARIDTSGSGTYYADSVTGRFTISRDDSQNTAYLQMNSLRTEDTARYFCATWYRGGWGAMDLWGPGAEVVVS。
PD3 重链CDR1（HCDR1）氨基酸：GFTFSGTH。
PD3 重链CDR2（HCDR2）氨基酸：IDTSGSGT。
PD3 重链CDR3（HCDR3）氨基酸：ATWYRGGWGAMDL。
PD3重链可变区核苷酸序列（SEQ ID No. 2）：
GAGGAAAAGCTCGTCGAGAGCGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGATTCACCTTCAGTGGGACCCACATTAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTGGCACGTATTGATACTAGTGGTTCTGGCACCTACTACGCAGACTCTGTAACCGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAACCGAAGACACGGCCCGCTATTTTTGTGCAACCTGGTATAGAGGTGGCTGGGGTGCTATGGATCTCTGGGGCCCAGGTGCTGAAGTCGTCGTGTCCTCA。
PD3轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID No. 3）：
ATQLTQSPASLAASLGDTVSITCRASQSIRSYLDWYQQQSGKGPKLLIKGTSSVQSGVPARFKGSGSGTDFTLTISGLQAEDVATYYCLQRNAVPWTFGQGTKLELKRADAKPSVFIFP。
PD3 轻链CDR1（LCDR1）氨基酸：QSIRSY。
PD3 轻链CDR2（LCDR2）氨基酸：GTS。
PD3 轻链CDR3（LCDR3）氨基酸：LQRNAVPWT。
PD3轻链可变区核苷酸序列（SEQ ID No. 4）：
GCCACCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTCTAGGAGACACAGTATCCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGCATCCGCAGTTACTTAGACTGGTATCAACAACAATCAGGGAAGGGTCCTAAACTCCTGATCAAAGGTACATCCAGTGTGCAAAGTGGAGTCCCGGCCCGGTTCAAGGGCAGTGGATCTGGCACCGATTTCACCCTCACCATCAGTGGCCTGCAGGCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTTTGCAGCGTAATGCTGTACCGTGGACGTTCGGCCAAGGAACCAAGCTGGAACTCAAA。
PD7重链可变区氨基酸序列（SEQ ID No.5）：EEKLMESGGGLVQPGGSLKLSCVGSGFTFSTNYINWVRQAPGKGLEWLAQIRTTDQSSYYADSVKGRFTISRDDSQNTAYLQMNSLRTEDTARYFCATRYRGGWGALDLWGPGAEVVVS。
PD7 重链CDR1（HCDR1）氨基酸：GFTFSTNY。
PD7 重链CDR2（HCDR2）氨基酸：IRTTDQSS。
PD7 重链CDR3（HCDR3）氨基酸：ATRYRGGWGALDL。
PD7重链可变区核苷酸序列（SEQ ID No. 6）：
GAGGAGAAGCTGATGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAAACTCTCCTGTGTCGGCTCTGGATTCACCTTCAGTACTAATTACATTAACTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGCTGGCACAAATCCGTACTACTGATCAGAGTAGTTACTACGCAGACTCGGTGAAGGGCCGATTCACCATTTCCAGAGACGACTCCCAGAACACGGCCTATCTGCAAATGAACAGCCTCAGAACCGAAGACACGGCCCGCTATTTTTGTGCAACCCGGTATCGAGGTGGCTGGGGTGCCTTGGATCTCTGGGGCCCAGGTGCTGAaGTCGTCGTGTCCTCA。
PD7轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID No.7）：ATQLTQSPASLAASLGDTVSITCRASQSIRSYLDWYQQQPGKAPKLLIDKASTLQSGVPARFKGSGSGTDFTLTISGLQAEDVGTYYCLQRQVLPWTFGQGTKLELKRADAKPSVFIFP。
PD7轻链CDR1（LCDR1）氨基酸：QSIRSY。
PD7轻链CDR2（LCDR2）氨基酸：KAS。
PD7轻链CDR3（LCDR3）氨基酸：LQRQVLPWT。
PD7轻链可变区核苷酸序列（SEQ ID No. 8）：
GCCACCCAGCTGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTCTAGGAGACACAGTCTCCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGCATTAGGAGTTATTTAGACTGGTATCAACAACAACCAGGGAAGGCTCCTAAACTCCTCATTGATAAGGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCGGCCCGGTTCAAGGGCAGTGGATCTGGCACCGATTTCACCCTCACCATCAGTGGTCTGCAGGCTGAAGATGTTGGAACTTATTACTGTTTGCAGCGTCAAGTTTTACCGTGGACGTTCGGCCAAGGAACCAAGCTGGAACTCAAA。
PD3重链可变区如下：
PD3轻链可变区如下：
PD7重链可变区如下：
PD7轻链可变区如下：
实施例2.间接免疫荧光(IFA)检测抗体的反应性
将Asia1/JS/05病毒液按MOI = 1剂量接种于24孔细胞培养板中的BHK21细胞，并设立空白对照。37 ℃孵育3 h ~ 4 h后，加入预冷固定液（甲醇:丙酮 = 1:1）置于-20 ℃固定30 min，即可按常规方法进行间接免疫荧光检测。一抗为表达抗体（5 µg/mL），二抗为FITC标记的兔抗猪IgG。
IFA检测结果显示， PD3、PD7均可与感染Asia1/JS/05病毒的BHK细胞结合，出现特异性荧光（图4）。结果表明，PD3、PD7可特异性识别Asia1/JS/05，为Asia1型FMDV特异性抗体。
实施例3 间接ELISA检测抗体的反应性
将Asia1/JS/05抗原以100ng/孔剂量，4℃过夜包被于酶标板；待检抗体稀释为20µg•mL-1，并以2倍比稀释8个梯度加入酶标板，设立PBS为阴性对照，37 ℃孵育1 h。每孔加入100µL兔抗猪IgG-HRP抗体（1:5000倍稀释），37℃作用30min。加入TMB底物37℃显色10 min，终止反应后，酶标仪检测OD450 nm波长的吸光度。抗体浓度稀释至5µg/mL时，P/N ≥ 2.1判定为阳性（P为待检抗体每个稀释度下2个重复孔对应OD450nm值的平均值，N为PBS对照组所有孔OD450nm值的平均值）。
间接ELISA结果显示，抗体浓度稀释至5µg/mL及以上时，相同抗体浓度条件下，PD3、PD7的OD450nm值均高于Cut Off 值（图5）,CutOff 值即C.O（阳性判定值），C.O＝2.1×N（N 为阴性对照OD450nm值），表明二者均可与Asia1/JS/05抗原发生特异性反应，为Asia1型FMDV特异性抗体。
实施例4 中和试验(VNT)检测抗体中和活性
待测血清或抗体在96孔板中作二倍比梯度稀释8孔；加入50µL病毒稀释液（滴度为200TCID50•0.1mL-1），同时设置细胞对照和病毒回对照。37℃孵育1 h后，每孔加入100µLBHK21细胞悬液（密度为1×106mL-1）。培养48 h ~ 72 h后观察CPE，按Reed-Muench法计算血清或抗体的中和滴度，并计算抗体的中和效力（IC50=抗体浓度/中和滴度的倒数），IC50≤50µg•mL-1即可判定为中和抗体。
通过多血清型病毒中和试验测定2株抗体的中和效力，结果显示PD3和PD7可中和Asia1/JS/05毒株，不中和A型（A/WH/CHA/09）和O型FMDV（O/Tibet/99）（表1）。该结果表明，PD3和PD7为Asia1型FMDV特异性中和抗体。
实施例5 Western-blot初步分析抗体识别的抗原表位
取纯化的Asia1/JS/05146S抗原或其GST-融合表达的结构蛋白进行SDS-PAGE，随后将蛋白转印至NC膜，进行Western blot验证。一抗为表达的猪源单克隆抗体（工作浓度2µg/mL），室温孵育2 h；二抗为Anti-pig-IgG-HRP抗体，室温孵育1 h后使用曝光仪进行曝光记录。
使用Asia1/JS/05灭活抗原进行Western-blot试验鉴定2株中和抗体识别的表位类型。结果显示，PD3和PD7可特异性结合变性的Asia1型FMDV抗原（图6），说明两者均识别线性表位。利用Asia1/JS/05的GST融合结构蛋白进一步鉴定2株抗体所结合的结构蛋白。免疫印迹结果显示，PD3和PD7结合Asia1/JS/05的结构蛋白VP2（图6）。
实施例6抗体逃逸筛选抗原突变位点
将Asia1/JS/05作10倍比梯度稀释至10-6，取各个稀释度病毒50µL于96孔板，加入等体积浓度为50µg•mL-1的中和抗体，并设立无抗体的病毒对照孔；每孔加入100 µL浓度为105个•ml-1的BHK-21细胞，混匀静置于37℃培养2d~3d。取8孔的最大稀释度病毒，在24孔板中成倍加大抗体浓度进行连续传代。收获第3代各孔逃逸株提取病毒RNA，扩增FMDV结构蛋白基因并将PCR产物送往公司测序。通过比对逃逸株与亲本病毒间结构蛋白氨基酸差异，即可找出中和抗体识别病毒抗原表位的关键氨基酸。
通过筛选和比对中和抗体逃逸突变株与亲本病毒间结构蛋白氨基酸差异，鉴定抗体识别的关键氨基酸。结果（表2）表明，PD3和PD7识别的关键氨基酸均为VP2 72位残基（D）。

Claims (8)

1.一种口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3，其特征在于：所述抗体PD3包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含3个重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；
HCDR1氨基酸序列：GFTFSGTH
HCDR2氨基酸序列：IDTSGSGT
HCDR3氨基酸序列：ATWYRGGWGAMDL；
所述轻链可变区包含3个轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；
LCDR1氨基酸序列：QSIRSY
LCDR2氨基酸序列：GTS
LCDR3氨基酸序列：LQRNAVPWT。
2.如权利要求1所述的口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。
3.如权利要求1所述的口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3，其特征在于：所述重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1所述的口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD3在制备预防或治疗口蹄疫病毒 Asia1 型引起的口蹄疫的药物或口蹄疫病毒 Asia1 型诊断试剂中的应用。
5.一种口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD7，其特征在于：所述抗体PD7包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含3个重链互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；
HCDR1氨基酸序列：GFTFSTNY
HCDR2氨基酸序列：IRTTDQSS
HCDR3氨基酸序列：ATRYRGGWGALDL
所述轻链可变区包含3个轻链互补决定区LCDR1、LCDR2、LCDR3；
LCDR1氨基酸序列：QSIRSY
LCDR2氨基酸序列：KAS
LCDR3氨基酸序列：LQRQVLPWT。
6.如权利要求5所述的口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD7，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo.7所示。
7.如权利要求5所述的口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD7，其特征在于：所述重链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .6所示，所述轻链可变区的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
8.如权利要求5所述的口蹄疫病毒Asia1型中和性猪源单克隆抗体PD7在制备预防或治疗口蹄疫病毒 Asia1 型引起的口蹄疫的药物或口蹄疫病毒 Asia1 型诊断试剂中的应用。
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