CN119241684B

CN119241684B - 一种肠促胰岛素类似物及其用途

Info

Publication number: CN119241684B
Application number: CN202411681510.XA
Authority: CN
Inventors: 王婷; 滕达; 李晗雨
Original assignee: Xuzhou Medical College
Current assignee: Xuzhou Medical College
Priority date: 2024-11-22
Filing date: 2024-11-22
Publication date: 2025-02-25
Anticipated expiration: 2044-11-22
Also published as: CN119241684A

Abstract

本发明公开了一种肠促胰岛素类似物及其用途，该肠促胰岛素类似物能够同时作用于GLP‑1受体、glucagon受体和GIP受体，可以同时发挥GLP‑1、glucagon和GIP的活性；不仅具有GLP‑1对糖尿病的治疗作用，还具有glucagon对体重、能量代谢、脂质代谢的有益作用，还具有GIP对糖、脂代谢和食欲抑制的有益作用，从而对糖、脂、能量代谢产生协同影响；将其应用于制备治疗代谢综合征，诸如糖尿病、血脂异常、脂肪肝病和肥胖症等疾病药物方面具有更大的潜力。

Description

一种肠促胰岛素类似物及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种肠促胰岛素类似物及其用途。

背景技术

肥胖是能量摄入相对消耗长期过量的结果，它是由环境、遗传和内分泌等原因引起的人体生理功能障碍。近十年来，肥胖及其相关疾病已经成为全球范围内严重的公共卫生问题。值得注意的是，近90％的2型糖尿病(T2DM)患者都超重或肥胖。研究表明，肥胖患病率的增加与T2DM患病率的增加存在正相关。此外，肥胖还会导致葡萄糖耐受性下降，加剧T2DM相关的代谢异常，包括胰岛素抵抗、血脂异常和高血糖。因此，肥胖使T2DM的治疗变得更加困难。

目前治疗肥胖的药物疗效较为有限，许多治疗肥胖的药物还具有较显著的副作用，虽然部分上市的胰高血糖素样肽(GLP-1)受体激动剂已经用于治疗肥胖和T2DM，如liraglutide和semaglutide。但是，即使是目前减重效果最好的semaglutide，仍然不能满足肥胖T2DM患者对于减重的高需求。因此，需要开发新的、更有效的抗肥胖和抗糖尿病药物。

近年来，一种有效的抗肥胖T2DM药物设计策略是通过合理整合人体内源性胃肠道激素的生物活性，设计单分子多靶点多肽类药物，以实现高效降糖和减重。目前该类药物主要集中在通过合理组合GLP-1、胰高血糖素(glucagon)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)这三种胃肠道激素的生理活性，研发针对这三种多肽所对应受体的双重或三重激动剂。GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体都属于GPCR受体家族，并且从序列结构上看，GLP-1、glucagon和GIP存在一定的同源性，使得设计针对这三个受体的三重受体激动多肽化合物成为可能。通过同时作用于GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体，协同发挥各自受体在降糖或减重上的优势，能够实现较GLP-1受体激动剂显著提高的减重作用。目前此类药物研发的难点在于，由于化合物同时需要作用于3个受体，化合物对于GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体的激动活性最优比例仍然没有定论。目前普遍认为化合物需要同时具有对GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体的强效激动活性，才能实现优异的降糖和减重作用(CellMetabolism,2022,34,1234–1247)。

发明内容

本发明提供了一种肠促胰岛素类似物及其用途，该肠促胰岛素类似物能够同时作用于GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体，可以同时发挥GLP-1、glucagon和GIP的活性；不仅具有GLP-1对糖尿病的治疗作用，还具有glucagon对体重、能量代谢、脂质代谢的有益作用，还具有GIP对糖、脂代谢和食欲抑制的有益作用，从而对糖、脂、能量代谢产生协同影响；将其应用于制备治疗代谢综合征，诸如糖尿病、血脂异常、脂肪肝病和肥胖症等疾病药物方面具有更大的潜力。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种肠促胰岛素类似物，所述肠促胰岛素类似物的氨基酸序列结构为：

(SEQ ID NO:1)

本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述一种肠促胰岛素类似物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明还提供了一种肠促胰岛素类似物或一种肠促胰岛素类似物的药物组合物在制备用于治疗代谢性疾病或病症的药物中的用途。所述代谢性疾病或病症包括糖尿病、血脂异常、脂肪肝病和肥胖症。

与现有技术相比，本发明有益的技术效果在于：

(1)本发明的一种肠促胰岛素类似物能够同时作用于GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体，能同时发挥GLP-1、glucagon和GIP的活性；不仅具有GLP-1对糖尿病的治疗作用，还具有glucagon对体重、能量代谢、脂质代谢的有益作用，还具有GIP对糖、脂代谢和食欲抑制的有益作用，从而对糖、脂、能量代谢产生协同影响；将其应用于制备治疗代谢综合征，诸如糖尿病、血脂异常、脂肪肝病和肥胖症等疾病药物方面具有更大的潜力；

(2)本发明的一种肠促胰岛素类似物具有显著优于tirzepatide和SAR441255的降糖和减重活性；

(3)本发明的一种肠促胰岛素类似物对于GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体激动活性比例与已报道的同类药物都不同，却实现了更优异的降糖和减重效果，实现了意想不到的有益效果，对于此类药物的设计提供了新的思路。

附图说明

图1为本发明肠促胰岛素类似物和tirzepatide在DIO小鼠长期给药21天的体重变化百分比。

图2为本发明肠促胰岛素类似物和tirzepatide在DIO小鼠长期给药21天后进行的糖耐量实验血糖曲线。

图3为本发明肠促胰岛素类似物和SAR441255在DIO小鼠长期给药21天的体重变化百分比。

图4为本发明肠促胰岛素类似物和SAR441255在DIO小鼠长期给药21天后进行的糖耐量实验血糖曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

除非本发明另有定义，否则本说明书中所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

进一步地，本发明提及的氨基酸可根据IUPAC-IUB的命名规则缩写如下：

丙氨酸(Ala，A)；缬氨酸(Val，V)；苯丙氨酸(Phe，F)；天冬酰胺(Asn，N)；苏氨酸(Thr，T)；半胱氨酸(Cys，C)；精氨酸(Arg，R)；谷氨酰胺(Gln，Q)；甘氨酸(Gly，G)；组氨酸(His，H)；天冬氨酸(Asp，D)；异亮氨酸(Ile，I)；谷氨酸(Glu，E)；亮氨酸(Leu，L)；酪氨酸(Tyr，Y)；脯氨酸(Pro，P)；甲硫氨酸(Met，M)；丝氨酸(Ser，S)；色氨酸(Trp，W)；赖氨酸(Lys，K)。

进一步地，除非明确标明，本发明的多肽中的所有氨基酸残基优选为L构型。

进一步地，所述序列的C端上的“-NH₂”部分表明C端上的酰胺基(-CONH₂)。

进一步地，本发明序列中除了天然氨基酸以外，还使用了两种非天然氨基酸，右旋丙氨酸(dAla)和α-氨基异丁酸(Aib)。

为了更详细的说明本发明，本说明书提供了下列具体实施方案，但本发明的方案并非仅限于此。

实施例1

SEQ ID NO:1的合成

在多肽手动合成管中，使用Fmoc-RinkAmide-MBHA树脂进行多肽合成，所用树脂担载量为0.312mmol/g，合成规模为0.1mmol。首先，称取0.32g树脂置于多肽合成管中，使用7mL二氯甲烷清洗树脂3次，每次5分钟，然后使用7mL二氯甲烷溶胀树脂30分钟。滤去二氯甲烷后使用7mL DMF清洗树脂3次，完成树脂溶胀步骤。然后脱除树脂上的Fmoc保护基，加入7mL 20％哌啶/DMF溶液，氮气鼓泡半小时，滤去哌啶溶液，使用7mLDMF清洗树脂4次，完成Fmoc保护基脱除步骤。接下来，加入首个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH，氨基酸耦合使用HBTU/HOBT/DIPEA缩合剂(0.4eq,0.4eq,0.8eq)，耦合步骤采用氮气鼓泡1.5小时，耦合完成后使用7mLDMF清洗树脂3次，完成氨基酸耦合步骤。接下来，按照多肽序列，相应的依此加入氨基酸进行Fmoc脱保护和氨基酸耦合步骤，完成主肽链的合成。在多肽的脂肪酸修饰位点，14位的Lys使用Fmoc-Lys(Dde)-OH。在多肽肽链合成结束后，加入7mL 2％水合肼/DMF(v/v)鼓泡半小时脱除Dde保护基。然后，按照侧链的结构，分别加入Fmoc-Glu-OtBu，使用HBTU/HOBT/DIPEA缩合剂耦合1.5小时，反应结束后使用7mL20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基，然后再次加入Fmoc-Glu-OtBu，使用HBTU/HOBT/DIPEA缩合剂耦合1.5小时，反应结束后使用7mL20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基。最后，加入棕榈酸，使用HBTU/HOBT/DIPEA缩合剂耦合1.5小时，完成化合物的合成。

最后，将上述得到的连有多肽的树脂转移至圆底瓶中，使用切割剂Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT，90:5:3:2，V/V)5mL切割树脂，在油浴中恒温30℃反应2h，切割液倾入40mL冰乙醚中，冷冻离心后粗品用15mL冰乙醚洗涤3次，最后用氮气吹干，得到粗肽。粗肽的纯化使用制备型反相HPLC系统纯化(C18反相制备柱，250mm×20mm，12μm)，流动相A：0.1％TFA/水(V/V)，流动相B：甲醇(V/V)；流速为8mL/min；检测波长为214nm。采用线性梯度(20％B～70％B/30min)洗脱，收集目标峰，除去甲醇后冻干得纯品，纯度大于98％，通过MS确认目标多肽的分子量。理论相对分子质量为4895.6。ESI-MS m/z:计算值[M+3H]³⁺1632.9,[M+4H]⁴⁺1224.9；观察值[M+3H]³⁺1632.5,[M+4H]⁴⁺1224.7。

实施例2

肠促胰岛素类似物对GLP-1受体、glucagon受体和GIP受体的激动活性测定

稳定表达GLP-1受体、glucagon受体或GIP受体的HEK293或CHO细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM+100μg/mL Hygromycin B培养基中培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。为维持细胞的生理活性，实验细胞融合度控制在80％左右。将化合物用DMSO进行梯度稀释，然后用1×Stimulation Buffer按照10倍梯度稀释化合物，稳转系细胞培养至80％融合度，Cell Dissociation Buffer溶液消化处理收集细胞，经计数后接种9μL/well于384-well板中。取1μL稀释好的化合物加入至相应实验孔中，离心后置于37℃孵育30min。将Eu-cAMP用Detection buffer稀释至工作浓度，取5μL/well加入相应实验孔中。将ULight-anti-cAMP用Detectionbuffer稀释至工作浓度，然后取5μL/well加入相应实验孔中；离心后放置于室温孵育1h。孵育完成后，利用Perkin Elmer多功能酶标仪检测665nm和620nm读值。通过Ratio(665/620)与化合物浓度作图，用GraphPad Prism软件非线性回归方法进行曲线拟合及EC₅₀计算。

表1：肠促胰岛素类似物对人GLP-1受体、glucagon受体及GIP受体的EC₅₀值(以pM表示)

如表1所示，本发明的肠促胰岛素类似物对人GLP-1受体的激动活性比天然GLP-1强约3.5倍；对人GIP受体的激动活性比天然GIP弱约1.9倍；对人glucagon受体的激动活性比天然glucagon弱约20.5倍。与目前已报道的同类药物相比(Cell Metabolism,2022,34,1–16；Cell Metabolism,2022,34,1234–1247)，本发明的肠促胰岛素类似物具有强GLP-1受体激动活性、强GIP受体激动活性和较弱的glucagon受体激动活性，其对GLP-1受体、glucagon受体及GIP受体的激动活性比例与已报道的同类药物相比明显不同，具有特殊的GLP-1受体、glucagon受体及GIP受体激动活性比例。

实施例3

肠促胰岛素类似物对饮食诱导肥胖(DIO)小鼠体重、血糖和血脂的影响

雄性C57BL/6J小鼠，体重22g左右，用Research Diets公司的D12492高脂饲料饲养18周造DIO小鼠模型。选择体重在46–54克范围内的DIO小鼠参与实验，动物分配到不同的治疗组是基于体重进行的，以确保各组初始体重均匀。为了测定各组小鼠食物摄入量，DIO小鼠单笼饲养，每组8只。实验共6组，分别为空白对照物(生理盐水)、tirzepatide(30nmol/kg)和SEQ ID NO:1(30nmol/kg)组；以及空白对照物(生理盐水)、SAR441255(30nmol/kg)和SEQ ID NO:1(30nmol/kg)组。注射频率为每日一次(生理盐水、SAR441255和SEQ ID NO:1)或每两天一次(tirzepatide)，给药持续21天，每次注射体积为5mL/kg。每天记录小鼠体重，在21天治疗实验结束后，于第22天进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。DIO小鼠经过8小时的过夜禁食后，口服给予1.5g/kg的葡萄糖。随后在不同时间点(0、15、30、60和120分钟)测量血糖水平，以评估葡萄糖耐量的变化。完成OGTT后，各组DIO小鼠休息一天。第23天，各组DIO小鼠在非禁食状态下采集血样制取血清，并测量甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量。

表2：DIO小鼠在3周给药周期内的体重和糖耐量变化

^***：与空白对照组相比P<0.001；^#：与tirzepatide组比P<0.05；^###：与tirzepatide组比P<0.001，结果表示为每组8只小鼠平均值±SD。

如图1、图2和表2结果显示，本发明的肠促胰岛素类似物在DIO小鼠体内连续给药21天，能够显著的降低DIO小鼠的体重，并且其减重作用还显著优于已上市的GLP-1/GIP受体双重激动剂tirzepatide。此外，治疗结束后的OGTT血糖数值及血糖AUC数值表明，本发明的肠促胰岛素类似物改善DIO小鼠糖耐量的作用也显著优于tirzepatide，说明本发明的肠促胰岛素类似物具有优异的降糖和减重作用。

表3：DIO小鼠在3周给药周期内的体重和糖耐量变化

^***：与空白对照组相比P<0.001；^###：与SAR441255组比P<0.001，结果表示为每组8只小鼠平均值±SD。

如图3、图4和表3结果显示，本发明的肠促胰岛素类似物在DIO小鼠体内连续给药21天，能够显著的降低DIO小鼠的体重，并且其减重作用还显著优于同类型临床药物SAR441255。此外，治疗结束后的OGTT血糖数值及血糖AUC数值表明，本发明的肠促胰岛素类似物改善DIO小鼠糖耐量的作用也显著优于SAR441255，说明本发明的肠促胰岛素类似物具有优异的降糖和减重作用。值得注意的是，相较于SAR441255已报道的体外GLP-1受体、glucagon受体及GIP受体激动活性(Cell Metabolism,2022,34,1–16)，本发明的肠促胰岛素类似物具有更强的GLP-1受体激动活性，类似的GIP受体激动活性和明显更弱的glucagon受体激动活性，但是本发明的肠促胰岛素类似物却显示出了明显更优异的降糖和减重作用。

表4：DIO小鼠治疗3周后的血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量

样品(剂量)	总胆固醇(mmol/L)	甘油三酯(mmol/L)
			空白对照(生理盐水组)	8.26±0.62	1.22±0.11
Tirzepatide(30nmol/kg)	6.35±0.54^***	0.71±0.08^***
			SEQ ID NO:1(30nmol/kg)	4.32±0.29^***,###	0.38±0.05^***,###

^***：与空白对照组相比P<0.001；^###：与tirzepatide组比P<0.001，结果表示为每组8只小鼠平均值±SD。

表5：DIO小鼠治疗3周后的血清甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)含量

样品(剂量)	胆固醇(mmol/L)	甘油三酯(mmol/L)
			空白对照(生理盐水组)	7.93±0.48	1.14±0.09
SAR441255(30nmol/kg)	5.86±0.51^***	0.54±0.07^***
			SEQ ID NO:1(30nmol/kg)	4.55±0.32^***,###	0.41±0.06^***,#

^***：与空白对照组相比P<0.001；^#：与SAR441255组比P<0.05；^###：与SAR441255组比P<0.001，结果表示为每组8只小鼠平均值±SD。

如表4和表5结果显示，本发明的肠促胰岛素类似物在DIO小鼠体内连续给药21天，可以显著降低小鼠的血清甘油三酯和胆固醇含量，并且本发明的肠促胰岛素类似物的降低血清脂质含量的作用显著强于tirzepatide和SAR441255。

Claims

1.一种肠促胰岛素类似物，其特征在于，所述肠促胰岛素类似物的氨基酸序列结构为：

。

2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1所述的肠促胰岛素类似物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

3.一种权利要求1所述的肠促胰岛素类似物或一种权利要求2所述的药物组合物在制备用于治疗代谢性疾病或病症的药物中的用途；所述代谢性疾病或病症为糖尿病、血脂异常、脂肪肝病或肥胖症。