CN119173632A - 靶向cfp-elk1基因间区域的反义寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与ELK1‑CFP前体mRNA转录物互补并且使得细胞中所述转录物的水平降低的反义寡核苷酸。本发明进一步涉及所述反义寡核苷酸的缀合物、盐和药物组合物；以及用于治疗与ELK1‑CFP前体mRNA转录物的水平增加相关联的包括肌萎缩性侧索硬化症在内的疾病的方法。

Description

靶向CFP-ELK1基因间区域的反义寡核苷酸

技术领域

本发明涉及与经转录的人CFP-ELK1基因间区域互补的反义寡核苷酸。这些反义寡核苷酸可以引起细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平降低。本发明进一步涉及其缀合物、盐和药物组合物；以及用于治疗与ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平增加相关联的疾病包括肌萎缩性侧索硬化症的方法。

背景技术

TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)由TARDBP编码，并且在转录阻遏、前体mRNA剪接和翻译调节中发挥作用。这还包括RNA转录物的聚腺苷酸化。因此，去除或降低TDP-43的表达可能引起poly(A)尾脱离前体mRNA转录物。

TDP-43耗竭在一系列疾病中表现出来，称为TDP-43病理，并包括诸如以下的疾病：肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、孤独症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

ALS也称为运动神经元疾病或葛雷克氏症。它是神经退行性的，并且导致脑和脊柱运动神经元逐渐丧失。TARDBP突变与ALS相关联，C9orf72、SOD1和FUS基因突变也与ALS相关联(Edgar等人2021,Neurobiol Aging,108)。目前，尚无已知ALS治愈，并且它可以影响任何年龄的人。它可能发生在有该病史的家族中，但也可能偶发于无家族病例的受试者中。典型的治疗涉及辅助通气形式，这可以延长受试者的生命，但不能治愈该疾病。目前可用的药物，例如利鲁唑(US 5,527,81)，同样只能短期延长生命，而不能提供治愈。

本发明旨在设计用于神经退行性疾病(诸如ALS)的新治疗。

CFP基因编码备解素，这是一种血浆糖蛋白，在活化先天免疫系统的补体系统中发挥作用。CFP的表达会触发补体级联，并且其通常仅在肝脏中表达。备解素允许通过与人细胞膜结合来形成稳定的C3和C5转化酶攻击复合物。然后，攻击复合物的形成可以引起垂死细胞的裂解。CFP在身体其他部位的过度表达可能与神经退行性疾病有关。特别地，中枢神经系统中补体活化的增加已与神经退行性疾病有关，包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)(等人2018,Mol.Immun.102)。

本发明寻求提供通过靶向CFP来改善TDP-43耗竭的影响的反义寡核苷酸。

发明内容

本发明涉及与经转录的人CFP-ELK1基因间区域互补的反义寡核苷酸。

ELK1基因编码ETS样-1蛋白，该蛋白起到转录活化因子的作用。它与补体因子备解素基因(CFP)相邻。本发明人已惊人地确定，TDP-43的缺乏引起ELK1前体mRNA转录物的poly(A)尾脱离。这又引起ELK1的转录继续前往相邻的CFP基因，从而引起单个组合的前体mRNAELK1-CFP转录物的转录。该转录物包括来自两个基因以及它们之间的基因间区域的经转录的mRNA。

由于终止密码子下游超过50个碱基处存在外显子-外显子剪接连接，所以预计组合的前体mRNA ELK1-CFP转录物将经历无义介导的(NMD)衰变。然而，本发明人已惊人地确定这可能并不总是发生，而是可能引起CFP表达增加。

TDP-43缺乏或水平降低可能引起脑中CFP表达增加，因为备解素蛋白可能是从组合的ELK1-CFP转录物翻译而来的。通过这种方式，TDP-43缺乏或水平降低已与神经退行性疾病(包括ALS)有关。本发明的一个目的是提供反义寡核苷酸，其通过靶向ELK1-CFP基因间区域来改善TDP-43耗竭的影响。

本发明提供了与ELK1-CFP基因间区域互补的反义寡核苷酸。这些反义寡核苷酸可能能够降低细胞中ELK1-CFP前体mRNA的水平

本发明的反义寡核苷酸可以通过与ELK1-CFP前体mRNA结合来降低ELK1-CFP前体mRNA水平。

据信本发明的反义寡核苷酸与转录后的ELK1-CFP前体mRNA结合，从而引起RNA酶H1的募集，这引起ELK1-CFP前体mRNA的裂解。据信裂解的ELK1-CFP前体mRNA转录物被降解。因此，细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平降低。

因此，本发明的反义寡核苷酸可以用于去除或降低细胞中ELK1-CFP前体mRNA的水平。

在一方面，本发明提供了一种长度为8至40个核苷酸的反义寡核苷酸，其包含长度为至少8个核苷酸的连续核苷酸序列并且其与经转录的人CFP-ELK1基因间区域互补。

在一些实施例中，与经转录的人CFP-ELK1基因间区域互补的反义寡核苷酸可以包含与经转录的人ELK1-CFP基因间区域至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或完全互补的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，经转录的人ELK1-CFP基因间区域在人ELK1-CFP前体mRNA转录物内。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为8至40个核苷酸。

在一些实施例中，反义寡核苷酸是单链的。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷。

在一些实施例中，反义寡核苷酸能够募集RNA酶H1。

在一些实施例中，反义寡核苷酸为间隔聚体。

在一些实施例中，反义寡核苷酸可以包含至少一个经修饰的核苷间键。

在一些实施例中，经修饰的核苷间键中的一者或多者或全部可以包括硫代磷酸酯键。

在一些实施例中，反义寡核苷酸内存在的全部核苷间键可以为硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，与对照相比，反义寡核苷酸可能能够将细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。

在一些实施例中，对照可以为尚未暴露于反义寡核苷酸的细胞。

在一些实施例中，反义寡核苷酸可以共价附接至至少一个缀合物部分。

在一些实施例中，反义寡核苷酸可以呈药用盐的形式。

在一些实施例中，盐可以为钠盐或钾盐。

在一些实施例中，反义寡核苷酸可以封装在基于脂质的递送媒介物中、共价连接至或封装在树枝状聚合物中、或缀合至适体。

本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸以及药用的稀释剂、载体、盐和/或辅助剂。

在一些实施例中，药物组合物可以包含水性稀释剂或溶剂，诸如磷酸盐缓冲盐水。

本发明提供了一种用于降低正在转录ELK1-CFP前体mRNA的细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平的体内或体外方法，该方法包括使所述细胞暴露于有效量的本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物。

在一些实施例中，细胞可以为人细胞或哺乳动物细胞。

在一些实施例中，与对照相比，人ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平可以降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％。

在一些实施例中，对照为尚未暴露于反义寡核苷酸的细胞。

本发明还提供了一种治疗或预防疾病的方法，该方法包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防有效量的本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物。

本发明还提供了一种本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物，其作为用于治疗或预防受试者的疾病的药物使用。

本发明还提供了本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防受试者的疾病。

在一些实施例中，疾病可以与人ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平增加有关。

在一些实施例中，疾病可以为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

附图说明

图1-图1展示了来自ELK1和CFP基因的下一代序列读段映射，其中经映射的读段来自未处理细胞(PBS对照)的两个样品和来自用化合物A(SEQ ID 2)处理以耗竭TDP-43蛋白表达的细胞的两个样品。灰色箭头指示恰好在用化合物A(SEQ ID 2)处理的细胞中ELK1mRNA下游映射的mRNA读段的表达增加。黑色箭头指示下游CFP基因的表达增加(约10倍)。

图2-图2显示了CFP基因相对于测试的间隔聚体ASO(反义寡核苷酸)的定位的表达水平。将完全未处理的细胞和使用ASO之前TDP-43耗竭的细胞中的CFP mRNA水平叠加作为基准。

图3-图3显示了ELK1基因相对于测试的间隔聚体ASO的定位的表达水平。将完全未处理的细胞和使用ASO之前TDP-43耗竭的细胞中的ELK1 mRNA水平叠加作为基准。

具体实施方式

本发明基于以下确定：在TDP-43耗竭的细胞中，ELK1基因的转录继续前往相邻的CFP基因，从而引起单个组合的前体mRNA ELK1-CFP转录物的转录。该转录物包括来自两个基因以及它们之间的基因间区域的经转录的mRNA。

本发明人已鉴定，可以通过用反义寡核苷酸靶向ELK1-CFP前体mRNA来降低ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平。这可以降低脑中的CFP表达，从而可以用于治疗神经退行性疾患，诸如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

本文描述了存在于人ELK1-CFP前体mRNA转录物中的靶位点，其可以被反义寡核苷酸靶向。在一些实施例中，反义寡核苷酸可能能够降低ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平。

本发明人已惊人地确定，靶向人ELK1-CFP前体mRNA转录物的基因间区域例如在降低脑中的CFP表达方面可能特别有效。

不希望受理论束缚，认为本发明的反义寡核苷酸可以通过与ELK1-CFP前体mRNA转录物结合来降低ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平。据信本发明的反义寡核苷酸与ELK1-CFP前体mRNA转录物的基因间区域的结合引起RNA酶H1募集至ELK1-CFP前体mRNA转录物，从而引起ELK1-CFP前体mRNA转录物的裂解以及随后裂解的前体mRNA的降解。因此，存在ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平的降低以及由此产生的CFP表达的降低。CFP表达的降低可以在脑或其他地方中。

ELK1-CFP前体mRNA转录物和CFP表达的水平的降低对于治疗一系列以脑中CFP表达增加为特征或由其引起的疾患是理想的。这些包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

反义寡核苷酸

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”被定义为能够通过与靶核酸杂交，特别地与靶核酸上的连续序列杂交而调节靶mRNA转录物的水平的寡核苷酸。如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个与靶标mRNA的核苷酸互补的共价连接的核苷的分子。此类共价结合核苷也可称为核酸分子或寡聚物。

反义寡核苷酸通常不是双链的，并且因此不为siRNA或shRNA。

反义寡核苷酸通常是在实验室中通过先经固相化学合成后再加以纯化和分离而制备的。当提及反义寡核苷酸的序列时，提及的是共价连接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的反义寡核苷酸为人造的，并且为化学合成的，并且通常为经过纯化或分离的。本发明的反义寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷，诸如2'糖修饰的核苷。本发明的反义寡核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸为单链反义寡核苷酸。应了解的是，本发明的单链反义寡核苷酸可形成发夹或分子间双链体结构(同一反义寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要其内部或其间自互补的程度低于横跨反义寡核苷酸的全长的大约50％。

在一些实施例中，本发明的单链反义寡核苷酸可以不含RNA核苷。

有利地，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。此外，在本发明的一些反义寡核苷酸中，可能有利的是未修饰的核苷为DNA核苷。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为至少40个核苷酸的连续核苷酸序列，诸如长度为8至40个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸的长度为至少12个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸的长度为至少14个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸的长度为至少16个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸的长度为至少18个核苷酸。

优选地，本发明的反义寡核苷酸的长度为16至20个核苷酸。

更优选地，本发明的反义寡核苷酸的长度为18至20个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列。

在一些实施例中，反义寡核苷酸由连续核苷酸序列组成。

在一些实施例中，反义寡核苷酸为连续核苷酸序列。

经修饰的反义寡核苷酸

根据本发明的反义寡核苷酸可以为经修饰的反义寡核苷酸。

术语经修饰的反义寡核苷酸描述了一种反义寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合反义寡核苷酸”是已经在文献中用于描述包含糖修饰的核苷和DNA核苷的反义寡核苷酸的术语。在一些实施例中，可能有利的是，根据本发明的反义寡核苷酸为嵌合反义寡核苷酸。

在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以包括经修饰的核碱基，这些经修饰的核碱基在碱基配对中充当典型的核碱基，例如可以使用5-甲基胞嘧啶代替甲基胞嘧啶。肌苷可用作通用碱基。

应当理解，连续核碱基序列(基序序列)可经修饰以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。

将经修饰的核苷(如高亲和力修饰的核苷)并入反义寡核苷酸序列中的模式通常称为反义寡核苷酸设计。

在实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸包含至少1个经修饰的核苷，诸如至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19个经修饰的核苷。

在一些实施例中，反义寡核苷酸的全部核苷可以为经修饰的核苷。

合适的修饰在本文中在标题“修饰的核苷”、“高亲和力修饰的核苷”、“糖修饰”、“2'糖修饰”和“锁核酸(LNA)”下进行了描述。

间隔聚体

间隔聚体是短的DNA反义寡核苷酸，在中央DNA区域的任一端有模拟RNA的区段。间隔聚体将与含有与间隔聚体DNA序列互补的序列的前体mRNA转录物结合，其中模拟RNA的区段确保高结合亲和力。高结合亲和力确保减少脱靶效应，而间隔聚体与前体mRNA之间的杂交可以阻止RNA聚合酶对前体mRNA的完全转录。

间隔聚体还通过募集RNA酶H来诱导前体mRNA转录物的裂解，从而裂解RNA-DNA杂合体。通过修饰，特别是通过使用锁核酸，可以对间隔聚体进行工程化，以增加核酸酶抗性并降低免疫原性和毒性。然后，已被RNA酶H裂解的前体mRNA被降解，从而阻止了间隔聚体靶向转录物的翻译。通过这种方式，间隔聚体可以用作治疗剂来限制其中过度表达可能引起或导致疾病和负面患者结果的基因的前体mRNA的水平。因此，间隔聚体可以被工程化和合成以靶向特定的前体mRNA转录物，从而治疗或预防由经鉴定基因的过度表达引起的疾病。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸为间隔聚体。

如本文所用，术语“间隔聚体”是指一种反义寡核苷酸，其包含募集RNA酶H的反义寡核苷酸(缺口)的区域，该区域在5'和3'侧接有一个或多个亲和力增强修饰的核苷(侧翼)。各种间隔聚体设计如本文所述。

头聚物和尾聚物是能够募集RNA酶H的反义寡核苷酸，其中侧翼之一缺失，即该反义寡核苷酸两端中仅一端包含亲和力增强修饰的核苷。头聚物缺失3'侧翼(即5'侧翼包含亲和力增强修饰的核苷)，并且尾聚物缺失5'侧翼(即3'侧翼包含亲和力增强修饰的核苷)。

在本发明中，反义寡核苷酸可以是头聚物或尾聚物。

术语“LNA间隔聚体”是指一种间隔聚体反义寡核苷酸，其中亲和力增强修饰的核苷中的至少一者为LNA核苷。在本发明中，反义寡核苷酸可以是LNA间隔聚体。

术语“混合翼间隔聚体”是指这样的LNA间隔聚体，其中侧翼区域包含至少一个LNA核苷和至少一个非LNA修饰的核苷，诸如至少一个2'取代的修饰的核苷，诸如例如一个或多个2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。在一些实施例中，混合翼间隔聚体具有一个包含LNA核苷(例如5'或3')的侧翼，而另一个侧翼(分别为3'或5')包含2'取代的修饰的核苷。在本发明中，反义寡核苷酸可以是混合翼间隔聚体。

间隔聚体设计

在一个优选的实施例中，本发明的反义寡核苷酸具有间隔聚体设计或结构，在本文中也仅称为“间隔聚体”。

在间隔聚体结构中，反义寡核苷酸包含至少三个不同的结构区：'5->3'方向的5'-侧翼、缺口和3'-侧翼F-G-F'。在此设计中，当反义寡核苷酸处于与靶核酸的双链体中时，侧翼区域F和F'(也称为翼区)包含一段连续的经修饰的核苷，该核苷与ELK1-CFP前体mRNA转录物靶核酸的基因间区域互补，而缺口区域G包含一段连续的核苷酸，其能够募集核酸酶，优选核酸内切酶，诸如RNA酶，例如RNA酶H。能够募集核酸酶、特别是RNA酶H的核苷可以选自由以下项组成的组：DNA、α-L-氧基-LNA、2'-氟-ANA和UNA。

在区域G的5'和3'端侧翼的区域F和F'优选包含募集非核酸酶的核苷(具有3'内式结构的核苷)，更优选一个或多个亲和力增强修饰的核苷。

在一些实施例中，3'侧翼包含至少一个LNA核苷，优选至少2个LNA核苷。在一些实施例中，5'侧翼包含至少一个LNA核苷，优选至少2个LNA核苷。在一些实施例中，5'和3'侧翼区域均包含LNA核苷，优选至少2个LNA核苷。在一些实施例中，侧翼区域中的全部核苷均为LNA核苷。

在其他实施例中，侧翼区域可以包含LNA核苷和其他核苷二者(混合侧翼)，诸如DNA核苷和/或非LNA修饰的核苷，诸如2'取代的核苷。在这种情况下，缺口被定义为至少5个募集RNA酶H的核苷(具有2'内式结构的核苷，优选DNA)的连续序列，其5'和3'端侧接有亲和力增强修饰的核苷，优选LNA，诸如β-D-氧基-LNA。因此，与缺口区域相邻的5'侧翼区域和3'侧翼区域的核苷是经修饰的核苷，优选募集非核酸酶的核苷。在具有其中侧翼包含DNA的混合侧翼的反义寡核苷酸中，5'和3'核苷是经修饰的核苷。

核苷酸和核苷

核苷酸和核苷是反义寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸，包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可互换称为“单元”或“单体”。

经修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。

有利地，根据本发明的反义寡核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷。

在一些实施例中，连续核碱基序列(基序序列)可以经修饰以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。有利地，使用高亲和力修饰的核苷。

有利地，根据本发明的反义寡核苷酸的一个或多个经修饰的核苷可以包含经修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(Watson Crick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。可以在根据本发明的反义寡核苷酸中使用的示例性经修饰的核苷包括LNA、2'-O-MOE、2'oMe和吗啉代核苷类似物。

锁核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”为2'-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥接核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的反义寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可通过测量反义寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729，Morita等人，Bioorganic&Med.Chem。Lett.12,73-76；Seth等人,J.Org.Chem.2010,第75(5)卷第1569-81页，和Mitsuoka等人,Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238，以及Wan和Seth,J.Medical Chemistry2016,59,9645-9667，该参考文献均整体并入本文。

其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。

方案1：

特定LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA，诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。

一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。

修饰的核苷间键合

有利地，根据本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷间键。

如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。本发明的反义寡核苷酸可以因此包含一个或多个经修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％、诸如至少90％或更多的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。

在另一个实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。如果连续核苷酸序列内的至少75％诸如所有的核苷间键合是硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷间键合，则是有利的。

有利地，根据本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的全部核苷间键可以为硫代磷酸酯，或者根据本发明的反义寡核苷酸的全部核苷间键可以为硫代磷酸酯键。

核碱基

术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基也涵盖与天然存在核碱基不同但在核酸杂交期间具有功能性的经修饰的核碱基。在该上下文中，“核碱基”指的是诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤的天然存在核碱基以及非天然存在变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)，Accounts of Chemical Research，第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，增刊37 1.4.1中。

在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

该核碱基部分可通过针对每个对应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括等效功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性的反义寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，5-甲基胞嘧啶LNA核苷可用于LNA间隔聚体。5-甲基胞嘧啶可表示为“E”。

高亲和力修饰的核苷

高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，当并入反义寡核苷酸中时，可增强反义寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一经修饰的核苷的解链温度增加介于+0.5℃至+12℃之间，更优选地介于+1.5℃至+10℃之间，最优选地介于+3℃至+8℃之间。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2'取代的核苷以及锁核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),203-213)。

糖修饰

当与DNA和RNA中发现的核糖部分相比较时，根据本发明的反义寡核苷酸可包含一种或多种具有经修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。

已经制备了许多具有核糖糖部分修饰的核苷，主要目的为改善反义寡核苷酸的某些特性，如亲和力和/或核酸酶抗性。

这些修饰包括这样的修饰，其中对核糖环结构进行修饰，例如替代为己糖环(HNA)或双环，其通常在核糖环(LNA)上的C2与C4碳原子之间具有双基桥(biradicle bridge)的双环，或通常在C2与C3碳原子之间缺少键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷也包括将糖部分取代为非糖部分的核苷，例如就肽核酸(PNA)或吗啉基核酸而言。

糖修饰还包括经由将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2'-OH基团而进行的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。

2'糖修饰的核苷

2'糖修饰的核苷是一种核苷，其在2'位置具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核苷)或包含能够在2'碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2'糖取代的核苷，并且发现许多2'取代的核苷掺入反义寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对反义寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷的实例为2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA(2'oMe)、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),203-213以及Deleavey和Damha,Chemistry and Biology 2012,19,937。下面为一些2'取代的修饰的核苷的示意图。

关于本发明，2'取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2'桥连的核苷。

在一个实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，诸如2'糖修饰的核苷。优选地，根据本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个2'糖修饰的核苷，其独立地选自由以下项组成的组：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA(2'oMe)、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(2'MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个经修饰的核苷是锁核酸(LNA)，则是优选的。

吗啉代寡核苷酸

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含吗啉代核苷或由吗啉代核苷组成(即，是吗啉代寡聚物和作为磷酸二氨基酯吗啉代寡聚物(PMO))。剪接调节吗啉代反义寡核苷酸已被批准用于临床使用-参见例如依特普森(eteplirsen)，靶向DMD中框移突变的30nt吗啉代反义寡核苷酸，用于治疗杜氏肌营养不良。吗啉代反义寡核苷酸具有附着在六元吗啉环上而不是核糖上的核酸酶，诸如通过磷酸二氨基酯基团连接的亚甲基吗啉环，例如由以下4个连续的吗啉代核苷酸所说明：

在一些实施例中，根据本发明的吗啉代反义寡核苷酸的长度可以是例如8至40个吗啉代核苷酸，诸如长度为16至20个吗啉代核苷酸，诸如长度为18至20个吗啉代核苷酸。

接头

键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段连接。缀合物部分可直接或通过连接部分(例如接头或系链)附接到反义寡核苷酸。接头用于将第三区域例如缀合物部分(区域C)与第一区域共价连接，该第一区域例如与靶核酸互补的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A)。

在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或反义寡核苷酸可以任选地包含位于与靶核酸互补的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)与缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。

区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理不稳定的接头经历化学转变(例如，裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或药剂，以及哺乳动物细胞内发现或类似于哺乳动物细胞中遇到的盐浓度。哺乳动物细胞内条件也包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性(诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶)的存在。在一个实施例中，该生物可裂解接头易受S1核酸酶裂解影响。在一些实施例中，核酸酶敏感性接头包含1个至5个核苷，诸如包含至少两个连续磷酸二酯键的一个或多个DNA核苷。含有磷酸二酯的可生物裂解接头更详细地描述于WO 2014/076195中。

区域Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)与反义寡核苷酸(区域A或第一区域)共价连接的接头。区域Y接头可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的反义寡核苷酸可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，接头(区域Y)为氨基烷基(诸如C2-C36氨基烷基基团)，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头(区域Y)为C6氨基烷基基团。

靶标

本发明的反义寡核苷酸是靶向ELK1-CFP前体mRNA转录物的寡核苷酸。

本发明的反义寡核苷酸包含与经转录的人CFP-ELK1基因间区域互补的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，靶序列是人ELK1-CFP前体mRNA转录物。

人ELK1-CFP前体mRNA转录物可以称为靶序列。

在一些实施例中，靶序列是人ELK1-CFP前体mRNA转录物，其可以由SEQ ID NO.1或其片段编码。

本发明的一方面涉及一种反义寡核苷酸，其包含与SEQ ID NO 1或其片段互补的长度为8至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一个实施例中，片段的长度可以为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO 1至少约75％互补，诸如至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约100％互补的连续序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含连续序列，该连续序列可以包含连续核苷酸序列与靶核酸(即，人CFP-ELK1基因间区域)之间的一个或两个错配。

在一个优选的实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与SEQ IDNO 1完全互补(即约100％互补)。

本发明的一个方面涉及一种反义寡核苷酸，其包含长度为8至40个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列或其片段互补：SEQ ID NO95、SEQ ID NO 96、SEQ ID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 100、SEQ IDNO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO 103、SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105、SEQ ID NO 106、SEQ ID NO 107、SEQ ID NO 108、SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 111、SEQ IDNO 112、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQ ID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ IDNO 123、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO 125、SEQ ID NO126、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 129、SEQ ID NO 130、SEQ ID NO 131、SEQ ID NO 132、SEQ ID NO 133、SEQ IDNO 134、SEQ ID NO 135、SEQ ID NO 136、SEQ ID NO 137、SEQ ID NO 138、SEQ ID NO 139、SEQ ID NO 140、SEQ ID NO 141、SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQ ID NO 144、SEQ IDNO 145、SEQ ID NO 146、SEQ ID NO 147、SEQ ID NO 148、SEQ ID NO 149、SEQ ID NO 150、SEQ ID NO 151、SEQ ID NO 152、SEQ ID NO 153、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 155、SEQ IDNO 156、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO 158、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ IDNO 167、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO 169、SEQ ID NO 170、SEQ ID NO 171、SEQ ID NO 172、SEQ ID NO 173、SEQ ID NO 174、SEQ ID NO 175、SEQ ID NO 176、SEQ ID NO 177、SEQ IDNO 178、SEQ ID NO 179、SEQ ID NO 180、SEQ ID NO 181、SEQ ID NO 182、SEQ ID NO 183、SEQ ID NO 184、SEQ ID NO 185、SEQ ID NO 186和SEQ ID NO 187。

在一个实施例中，片段的长度可以为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含与选自由以下项组成的组的序列或其片段至少约75％互补，诸如至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约100％互补的连续序列：SEQID NO 95、SEQ ID NO 96、SEQ ID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 100、SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO 103、SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105、SEQ IDNO 106、SEQ ID NO 107、SEQ ID NO 108、SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 111、SEQ ID NO 112、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116、SEQ IDNO 117、SEQ ID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQ ID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO 125、SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 127、SEQ IDNO 128、SEQ ID NO 129、SEQ ID NO 130、SEQ ID NO 131、SEQ ID NO 132、SEQ ID NO 133、SEQ ID NO 134、SEQ ID NO 135、SEQ ID NO 136、SEQ ID NO 137、SEQ ID NO 138、SEQ IDNO 139、SEQ ID NO 140、SEQ ID NO 141、SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQ ID NO 144、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 146、SEQ ID NO 147、SEQ ID NO 148、SEQ ID NO 149、SEQ IDNO 150、SEQ ID NO 151、SEQ ID NO 152、SEQ ID NO 153、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 155、SEQ ID NO 156、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO 158、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQ IDNO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO 169、SEQ ID NO 170、SEQ ID NO 171、SEQ IDNO 172、SEQ ID NO 173、SEQ ID NO 174、SEQ ID NO 175、SEQ ID NO 176、SEQ ID NO 177、SEQ ID NO 178、SEQ ID NO 179、SEQ ID NO 180、SEQ ID NO 181、SEQ ID NO 182、SEQ IDNO 183、SEQ ID NO 184、SEQ ID NO 185、SEQ ID NO 186和SEQ ID NO 187。

在一个优选的实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列或其片段完全互补(100％互补)：SEQ ID NO 95、SEQ ID NO 96、SEQID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 100、SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO 103、SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105、SEQ ID NO 106、SEQ ID NO 107、SEQ IDNO 108、SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 111、SEQ ID NO 112、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 118、SEQ IDNO 119、SEQ ID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO 125、SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 129、SEQ IDNO 130、SEQ ID NO 131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO 133、SEQ ID NO 134、SEQ ID NO 135、SEQ ID NO 136、SEQ ID NO 137、SEQ ID NO 138、SEQ ID NO 139、SEQ ID NO 140、SEQ IDNO 141、SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQ ID NO 144、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 146、SEQ ID NO 147、SEQ ID NO 148、SEQ ID NO 149、SEQ ID NO 150、SEQ ID NO 151、SEQ IDNO 152、SEQ ID NO 153、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 155、SEQ ID NO 156、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO 158、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ IDNO 163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO 169、SEQ ID NO 170、SEQ ID NO 171、SEQ ID NO 172、SEQ ID NO 173、SEQ IDNO 174、SEQ ID NO 175、SEQ ID NO 176、SEQ ID NO 177、SEQ ID NO 178、SEQ ID NO 179、SEQ ID NO 180、SEQ ID NO 181、SEQ ID NO 182、SEQ ID NO 183、SEQ ID NO 184、SEQ IDNO 185、SEQ ID NO 186和SEQ ID NO 187。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够将CFP的表达降低至至少未经处理的细胞的水平(100％)。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含与选自由以下项组成的组的序列或其片段至少约75％互补，诸如至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约100％互补的连续序列：SEQID NO 98、SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO 105、SEQ ID NO 107、SEQ ID NO109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116、SEQ ID NO 117、SEQID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQ ID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO123、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO 125、SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 128、SEQID NO 129、SEQ ID NO 130、SEQ ID NO 131、SEQ ID NO 132、SEQ ID NO 133、SEQ ID NO134、SEQ ID NO 135、SEQ ID NO 138、SEQ ID NO139、SEQ ID NO 140、SEQ ID NO 141、SEQID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQ ID NO 144、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 146、SEQ ID NO147、SEQ ID NO 148、SEQ ID NO 149、SEQ ID NO 150、SEQ ID NO 151、SEQ ID NO 152、SEQID NO 153、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 155、SEQ ID NO 156、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO 169、SEQ ID NO170、SEQ ID NO 171、SEQ ID NO 172、SEQ ID NO 173、SEQ ID NO 174、SEQ ID NO 178、SEQID NO 179、SEQ ID NO 182、SEQ ID NO 183、SEQ ID NO 185、SEQ ID NO 186和SEQ ID NO187。

在一个优选的实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列或其片段完全互补(100％互补)：SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 101、SEQID NO 102、SEQ ID NO 105、SEQ ID NO 107、SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO113、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO125、SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 129、SEQ ID NO 130、SEQID NO 131、SEQ ID NO 132、SEQ ID NO 133、SEQ ID NO 134、SEQ ID NO 135、SEQ ID NO138、SEQ ID NO 139、SEQ ID NO 140、SEQ ID NO 141、SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQID NO 144、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 146、SEQ ID NO 147、SEQ ID NO 148、SEQ ID NO149、SEQ ID NO 150、SEQ ID NO 151、SEQ ID NO 152、SEQ ID NO 153、SEQ ID NO 154、SEQID NO 155、SEQ ID NO 156、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO 158、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO160、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQID NO 167、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO 169、SEQ ID NO 170、SEQ ID NO 171、SEQ ID NO172、SEQ ID NO 173、SEQ ID NO174、SEQ ID NO 178、SEQ ID NO 179、SEQ ID NO 182、SEQID NO 183、SEQ ID NO 185、SEQ ID NO 186和SEQ ID NO 187。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够使CFP表达降低至低于未经处理的细胞中水平的10％。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含与选自由以下项组成的组的序列或其片段至少约75％互补，诸如至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或约100％互补的连续序列：SEQID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO132、SEQ ID NO 141、SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 157、SEQID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQ ID NO164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO 169和SEQ ID NO 172。

在一个优选的实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列或其片段完全互补(100％互补)：SEQ ID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQID NO 124、SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 132、SEQ ID NO 141、SEQ ID NO142、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO168、SEQ ID NO 169和SEQ ID NO 172。

反义寡核苷酸设计

本发明的反义寡核苷酸是包含长度为至少8个核苷酸的连续核苷酸序列的寡核苷酸，该连续核苷酸序列与经转录的人CFP-ELK1基因间区域互补。反义寡核苷酸可能能够降低细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平。

在一些实施例中，反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，并且可任选地包含其他一个或多个核苷酸，例如可用于将官能团(例如，缀合物基团)附接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。应当理解，反义寡核苷酸的连续核苷酸序列不能比反义寡核苷酸本身长，并且反义寡核苷酸不能比连续核苷酸序列短。

连续核苷酸序列

术语“连续核苷酸序列”是指反义寡核苷酸的与靶核酸互补的区域，其可以为或可以包含反义寡核苷酸基序序列。在本文中，该术语与“连续核碱基序列”可互换使用。

反义寡核苷酸包含连续核苷酸序列，并且可任选地包含另外一个或多个核苷酸，例如可用于将官能团(例如，缀合物基团)附接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。

应当理解，反义寡核苷酸的连续核苷酸序列不能比反义寡核苷酸本身长，并且反义寡核苷酸不能比连续核苷酸序列短。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸的整个核苷酸序列为连续核苷酸序列。

连续核苷酸序列是本发明的反义寡核苷酸中核苷酸的序列，其与靶核酸、靶序列或靶位点序列互补，并且在一些情况下完全互补。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为8至40个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为至少12个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为至少14个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为至少16个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为至少18个核苷酸。

在一个优选的实施例中，连续核苷酸序列的长度为16至20个核苷酸。

更优选地，连续核苷酸序列的长度为18至20个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸由连续核苷酸序列组成。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸为连续核苷酸序列。

在一些实施例中，连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或其片段：SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44、SEQID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQID NO 51、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 55、SEQ ID NO 56、SEQID NO 57、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74、SEQID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 80、SEQID NO 81、SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 86、SEQID NO 87、SEQ ID NO 88、SEQ ID NO 89、SEQ ID NO 90、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 92、SEQID NO 93和SEQ ID NO 94。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够将CFP的表达降低至至少未经处理的细胞中的水平(100％)。

在一个优选的实施例中，连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或其片段：SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 55、SEQ ID NO 56、SEQ ID NO57、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 81、SEQ ID NO84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 89、SEQ ID NO 90、SEQ ID NO 92、SEQ ID NO 93和SEQ IDNO 94。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够使CFP表达降低至低于未经处理的细胞中水平的10％。

在一个优选的实施例中，连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或其片段：SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 35、SEQ IDNO 39、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 64、SEQ IDNO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ IDNO 72、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76和SEQ ID NO 79。

在一些实施例中，片段可以是连续核苷酸序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18或至少19个连续核苷酸，优选其至少10个连续核苷酸。能够降低ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平

本发明的反义寡核苷酸可能能够降低ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平。

如本文使用，术语“降低水平”应理解为描述当与其中细胞未暴露于本发明的反义寡核苷酸的对照相比时，反义寡核苷酸降低细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平的能力的总术语。

不希望受理论束缚，认为由反义寡核苷酸实现的降低与其例如通过降解或去除ELK1-CFP前体mRNA转录物或通过阻断或阻止与ELK1-CFP前体mRNA转录物相关联的聚合酶活性来降低、去除、阻止、减少、减小或终止ELK1-CFP前体mRNA转录物的能力有关。

在某些实施例中，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸可以使ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平降低至少约10％。更优选地，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸可以使ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平降低至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够将CFP的表达降低至至少未经处理的细胞的水平(100％)。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够使CFP表达降低至低于未经处理的细胞的水平的90％、低于未经处理的细胞的水平的80％、低于未经处理的细胞的水平的70％、低于未经处理的细胞的水平的60％、低于未经处理的细胞的水平的50％、低于未经处理的细胞的水平的40％、低于未经处理的细胞的水平的30％、低于未经处理的细胞的水平的20％或低于未经处理的细胞的水平的10％。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够使CFP表达降低至低于未经处理的细胞的水平的10％。

优选地，本发明的反义寡核苷酸通过降解或去除ELK1-CFP前体mRNA转录物来降低细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平。

对照

当关于测量反义寡核苷酸的效果使用术语“对照”时，通常理解对照是尚未暴露于反义寡核苷酸的细胞。

可替代地，可以通过参考暴露于反义寡核苷酸之前细胞中存在的ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平来确定ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平的降低。

在其他实施例中，对照可以是用非靶向寡核苷酸处理的细胞。

在一些实施例中，对照可以是模拟转染，例如其中用PBS处理细胞。

缀合物

本发明涵盖一种本发明的反义寡核苷酸，其与至少一个缀合物部分共价附接。在一些实施例中，这可以称为本发明的缀合物。

如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的本发明的反义寡核苷酸。缀合物部分可以与本发明的反义寡核苷酸共价连接，任选地经由接头基团(诸如区域D'或D”)共价连接。

反义寡核苷酸缀合物及其合成也已在综述：Manoharan,Antisense DrugTechnology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke编辑，第16章，Marcel Dekker,Inc.,2001和Manoharan,Antisense and Nucleic Acid DrugDevelopment,2002,12,103中报导，该参考文献通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物(例如GalNAc)、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或其组合组成的组。

RNA酶H活性和募集

反义寡核苷酸的RNA酶H活性指的是当反义寡核苷酸与互补RNA分子在双链体中时募集RNA酶H的能力。WO01/23613(整体并入本文)提供用于确定RNA酶H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNA酶H的能力。

如果反义寡核苷酸在提供有互补靶核酸序列的情况下具有的初始速率是与所测试修饰的反义寡核苷酸相同的碱基序列但仅含在反义寡核苷酸中所有单体之间均具有硫代磷酸酯键的DNA单体的寡核苷酸并使用WO 01/23613(特此通过引用并入)的实例91至95提供的方法确定的初始速率(以pmol/l/min测量)的至少5％诸如至少10％、至少20％或超过20％，则一般认为该反义寡核苷酸能够募集RNA酶H。针对确定RNA酶H活性中的用途，来自Lubio Science GmbH,Lucerne,Switzerland的重组RNA酶H1是可用的。

已知DNA反义寡核苷酸可有效募集RNA酶H，间隔聚体反义寡核苷酸也是如此，其包含DNA核苷区域(通常至少5或6个连续的DNA核苷)，其5'和3'侧接有包含2'糖修饰的核苷(通常为高亲和力2'糖修饰的核苷，诸如2-O-MOE和/或LNA)的区域。

核酸酶介导的降解

在一些实施例中，反义寡核苷酸可经由靶核酸的核酸酶介导的降解而发挥作用，其中本发明的反义寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选内切核糖核酸酶(RNA酶)诸如RNA酶H。经由核酸酶介导的机制而运作的反义寡核苷酸设计实例是这样的反义寡核苷酸，其通常包含至少5或6个DNA核苷的区域，并且在一侧或两侧上侧接有亲和力增强的核苷，例如间隔聚体、头聚物及尾聚物。

互补性

术语“互补性”描绘核苷/核苷酸的瓦特生-克里克(Watson-Crick)碱基配对能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。

应当理解，寡核苷酸可以包含具有修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，并且因此，术语互补性涵盖未修饰的核碱基与修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷,第2055页，以及Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊371.4.1)。

如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如反义寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5'-3'和3'-5'的反义寡核苷酸序列比对时)互补(形成Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以反义寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在此类比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称为错配。不允许在连续核苷酸序列的％互补性的计算中进行插入和删除。应当理解的是，在确定互补性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5'-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

在本发明中，术语“互补”要求连续核苷酸序列与人ELK1-CFP前体mRNA转录物至少约75％互补，或至少约80％互补，或至少约85％互补，或至少约90％互补，或至少约95％互补。在一些实施例中，连续核苷酸序列可以与人ELK1-CFP前体mRNA转录物至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％互补。

换句话说，在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列可以包括一个、二个、三个、四个、五个或更多个错配，其中错配为连续核苷酸序列内不与其靶标碱基配对的核苷酸。

术语“完全互补”指的是100％互补性。

在一些实施例中，连续核苷酸序列与人ELK1-CFP前体mRNA转录物完全互补。在一些实施例中，人ELK1-CFP前体mRNA转录物可以具有SEQ ID NO 1的序列或其片段。

应理解，靶ELK1-CFP前体mRNA转录物核酸可以是SEQ ID NO 1的等位基因变体，诸如包含人ELK1-CFP前体mRNA转录物核酸序列中的一种或多种多态性的等位基因变体。

同一性

如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如反义寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。

因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以反义寡核苷酸的核苷酸总数并乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性的百分比＝(匹配数x 100)/对齐区域(例如连续核苷酸序列)的长度。不允许在连续核苷酸序列的同一性的百分比的计算中进行插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

因此，应当理解，同一性和互补性之间存在关系，使得与靶序列互补的本发明的反义寡核苷酸内的连续核苷酸序列也与所述互补序列共享一定百分比的同一性。

杂交

如本文所用，术语“杂交”(hybridising/hybridises)应当理解为两条核酸链(例如反义寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间的结合亲和力为杂交的强度。它通常用解链温度(Tm)来描述，解链温度(Tm)定义为一半反义寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm与亲和力并非严格成正比(Mergny和Lacroix,2003,Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(Kd)通过ΔG°＝-RTln(Kd)相关，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，反义寡核苷酸与该靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°体现该反义寡核苷酸与该靶核酸之间的强势杂交。ΔG°为与其中含水浓度为1M、pH为7并且温度为37℃的反应相关联的能量。反义寡核苷酸与靶核酸的杂交为自发性反应，而自发性反应的ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验测量，例如，通过利用如Hansen等人,1965,Chem.Comm.36–38和Holdgate等人，2005,Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)方法测量。技术人员将知道，商用设备可用于ΔG°测量。ΔG°也可以通过使用如SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人，2004,Biochemistry 43:5388–5405描述的推导的热力学参数进行数值上的估计。

在一些实施例中，对于长度为10至30个核苷酸的反义寡核苷酸，本发明的反义寡核苷酸以低于-10kcal的估计ΔG°值与靶核酸杂交。

在一些实施例中，该杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°来测量。本发明的反义寡核苷酸可以与靶核酸以低于-10kcal范围，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的ΔG°估值杂交。在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:1的靶核酸子序列以低于-10kcal的ΔG°，诸如介于-10kcal至-60kcal之间，诸如介于-12kcal至-40kcal之间，诸如介于-15kcal至-30kcal之间或介于-16kcal至-27kcal之间，诸如介于-18kcal至-25kcal之间的ΔG°杂交。

在一些实施例中，该杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°来测量。本发明的反义寡核苷酸可以与靶核酸以低于-10kcal范围，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的ΔG°估值杂交。在某些实施例中，本发明的反义寡核苷酸与SEQ ID NO:1的靶核酸子序列以低于-10kcal的ΔG°，诸如介于-10kcal至-60kcal之间，诸如介于-12kcal至-40kcal之间，诸如介于-15kcal至-30kcal之间或介于-16kcal至-27kcal之间，诸如介于-18kcal至-25kcal之间的ΔG°杂交。

反义寡核苷酸的递送

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸封装在基于脂质的递送媒介物中，共价连接至或封装在树枝状聚合物中，或缀合至适体。

这可能是为了将本发明的反义寡核苷酸递送到靶细胞和/或改善本发明的反义寡核苷酸的药物动力学。

基于脂质的递送载体的实例包括水包油乳液、微胶粒、脂质体和脂质纳米颗粒。

盐

如本文使用的术语“盐”符合其通常已知的含义，即阴离子和阳离子的离子组装体。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药用盐。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸，其中该反义寡核苷酸呈药用盐的形式。在一些实施例中，药用盐可以为钠盐或钾盐。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸的药用钠盐。

本发明提供了根据本发明的反义寡核苷酸的药用钾盐。

药物组合物

在进一步的方面，本发明提供了包含本发明的反义寡核苷酸以及药用的稀释剂、载体、盐和/或辅助剂的药物组合物。药用的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。

本发明提供了一种根据本发明的药物组合物，其中药物组合物包含本发明的反义寡核苷酸和水性稀释剂或溶剂。

本发明提供了一种本发明的反义寡核苷酸的溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液。适当地，本发明的溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液为无菌溶液。

WO 2007/031091(通过引用并入本文)提供了药用的稀释剂、载体和辅助剂的合适的和优选的实例。W02007/031091中也提供了合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂。

本发明的寡核苷酸可与药用活性或惰性物质混合以制备药物组合物或配制物。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或反义寡核苷酸缀合物是前药。特别地，对于反义寡核苷酸缀合物，一旦前药被递送至作用位点例如靶细胞，反义寡核苷酸的缀合物部分就被裂解下来。

靶细胞

如本文所用，术语“靶细胞”是指表达靶核酸的细胞。在一些实施例中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类动物细胞，诸如猴子细胞或人类细胞。

应用

本发明的反义寡核苷酸可以用作例如治疗剂和预防剂以及研究试剂。

研究试剂

本发明的反义寡核苷酸可以用作研究试剂。在研究中，此类反义寡核苷酸可以用于特异性降低细胞(例如，体外细胞培养物)和实验动物中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平，从而有助于靶标的功能分析或对其作为治疗干预靶标的可用性的评估。

用于调节ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平的方法

本发明提供了一种用于细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的降低、水平下调或去除的方法，该细胞诸如正在转录ELK1-CFP前体mRNA转录物的细胞或为TDP-43缺陷或TDP-43耗竭的细胞，所述方法包括将有效量的本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物暴露于所述细胞。

在一些实施例中，该方法为体外方法。

在一些实施例中，该方法为体内方法。

在一些实施例中，该细胞为人细胞或哺乳动物细胞。

在一些实施例中，细胞是患有或易患与ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平增加相关联的疾病的受试者的一部分或衍生自该受试者。此类疾病包括但不限于肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

治疗

如本文所用，术语‘治疗’是指既存疾病(例如本文所指的疾病或疾患)的治疗或疾病的阻止(即预防)。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。

本发明提供用以治疗或预防疾病的方法，该方法包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的本发明的反义寡核苷酸或药物组合物。

本发明提供了一种用于治疗或预防与ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平增加相关联的疾病的方法，该方法包括向患有或易患与ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平增加相关联的疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物。

在一些实施例中，该疾病可以是与TDP-43水平降低相关联的疾病。

在一个实施例中，疾病是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

在一些实施例中，受试者是动物，优选哺乳动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠或猴子，或优选人。

本发明提供了一种本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物，其作为药物使用。

在本发明中，本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物通常以有效量施用。

本发明提供了一种本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物，其用于制备药物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的药物组合物，其用于在疗法中使用。

本发明的方法优选地用于治疗或预防由ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平异常引起的疾病。该疾病可以特别是由ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平增加引起的。

在一些实施例中，该疾病可以是与TDP-43水平降低相关联的疾病。

本发明进一步涉及如本文所定义的本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物用于制备药物中的用途，该药物用于治疗异常水平的ELK1-CFP前体mRNA转录物、特别是高水平的ELK1-CFP前体mRNA转录物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或本发明的药物组合物用于制备药物的用途，该药物用于治疗或预防肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。

施用

本发明的反义寡核苷酸或药物组合物可以局部施用(诸如施用至皮肤、吸入、眼部或耳部)或肠内施用(诸如口服或通过胃肠道施用)或肠胃外施用(诸如静脉内、皮下、肌肉内、脑内、脑室内或鞘内施用)。

在一个优选的实施例中，本发明的反义寡核苷酸或药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注，鞘内或颅内，例如，脑内或脑室内施用。在一个实施例中，反义寡核苷酸通过脑内或脑室内施用。在另一个实施例中，本发明的反义寡核苷酸经鞘内施用。

组合疗法

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸或药物组合物是用以与另一治疗剂进行结合治疗。

制造方法

在进一步的方面，本发明提供了用于制造本发明的反义寡核苷酸的方法，该方法包括使核苷酸单元反应并由此形成包含在反义寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，该方法使用亚磷酰胺WO 2017/081223PCT/EP2016/077383化学(参见例如Caruthers等人，1987，Methods in Enzymology第154卷，第287至313页)，该参考文献整体通过引用并入。

在进一步的实施例中，该方法进一步包括使连续核苷酸序列与缀合物部分(配体)反应。在进一步的方面，提供了一种用于制造本发明的组合物的方法，该方法包括将本发明的反义寡核苷酸或缀合的反义寡核苷酸与药用的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或辅助剂混合。

实例

实例1

TDP-43已被证明会影响mRNA剪接。为了鉴定出其mRNA受TDP-43的存在调节的新基因，在神经元细胞模型中进行了TDP-43敲低。对细胞进行了RNA测序，并进行了从头转录物分析，以鉴定具有新剪接模式的受影响基因。

将人谷氨酸能神经元(Fujifilms)以60,000个活细胞与10,000个活星形胶质细胞(Fujifilms)一起铺在涂有层粘连蛋白和聚(乙烯亚胺)溶液(Sigma Aldrich)的200μl培养基中的96孔板中(第-1天)。

为了敲低TDP-43，在第0天将5μM的化合物A(SEQ ID 2)添加到培养基中，在其他孔中则添加PBS作为对照。在整个实验期间(第2、5、7、10、12、14和17天)，每周三次更换一半的细胞培养基(100μl)。在第20天使用Magnapure裂解缓冲液(Roche)收获细胞，并根据制造商的说明(包括DNA酶处理步骤)使用MagNA pure 96系统(Roche)分离RNA。使用KAPA mRNAHyperPrep试剂盒Illumina平台(Roche)从100ng总RNA中制备NGS文库。使文库在NovaSeq6000测序仪(Illumina)上以150-bp读段长度经受配对末端测序。使用CLCGenomics Workbench 21进行数据分析。首先通过使用hg38基因组组装运行大缺口映射分析来分析数据，然后进行转录物发现。通过目视检查来检查预测的新转录物变化，以鉴定真实的变化。

在分析中，由于TDP-43耗竭而预测的新转录物变化之一是恰好在X染色体上ELK1基因下游的新转录物(图1，灰色箭头)。然而，更接近的手动检查揭示，来自染色体该区域的RNA的表达增加是由于ELK1mRNA转录物缺乏适当的聚腺苷酸化，从而使得RNA聚合酶继续DNA转录。有趣的是，注意到此前已在条件性小鼠TARDBP敲除模型中描述了由于TDP-43耗竭而使得ELK1缺乏适当的聚腺苷酸化(Wu等人2019)。这种跨物种机制的保守性值得注意，因为普遍认为TDP-43的mRNA靶标在物种间并不高度保守。

此外，由于神经元细胞中TDP-43耗竭，观察到CFP基因明显上调10倍。CFP基因以相同方向位于ELK1下游(图1)。据推测，CFP mRNA表达的增加可能是由从ELK1启动子开始的RNA聚合酶II的通读引起的，从而产生具有两个开放阅读框的长融合转录物。通常，由于终止密码子下游超过50个碱基处存在外显子-外显子剪接连接，所以预计此类mRNA会经历无义介导的(NMD)衰变。然而，由于观察到经剪接的CFP mRNA表达增加，并且甚至ELK1 mRNA上调2倍，因此推测该长融合转录物在两个开放阅读框中均被翻译，从而使得其细胞核中缺乏TDP-43表达的神经元中CFP的表达可能增加。

实例2

为了证明同时含有ELK1和CFP阅读框的单个mRNA是神经元细胞中TDP43耗竭的结果，我们设计了覆瓦式间隔聚体ASO(反义寡核苷酸)文库，其通过基因间区域与含有ELK1基因的区域互补并进入CFP的第一外显子。如果该区域表达为单个mRNA，则该区域中任何起作用的ASO都会使得基因ELK1和CFP均下调。

在这里，我们证明ASO能够下调组合的前体mRNA ELK1-CFP转录物，这被认为是TDP-43耗竭细胞中ELK1聚腺苷酸化缺失的结果。

将人谷氨酸能神经元(Fujifilms)以60,000个活细胞与10,000个活星形胶质细胞(Fujifilms)一起铺在涂有层粘连蛋白和聚(乙烯亚胺)溶液(Sigma Aldrich)的200μl培养基中的96孔板中(第-1天)。

为了敲低TDP-43，在第0天将5μM化合物A(SEQ ID NO 2)添加到培养基中(每个板四个含PBS的对照孔除外)。在整个实验期间(第2、5、7、9、12、14、16和19天)，每周三次更换一半的细胞培养基(100μl)。在第5天，将1μM的每种靶向ELK1-CFP融合转录物的ASO添加到培养基中。

总共添加了92种不同的ASO(SEQ ID NO 3-94)。88个孔仅接受化合物A(SEQ ID NO2)以充当基线参考。化合物表提供了所使用的ASO、它们的HELM序列和天然类似物序列以及它们的靶序列。

在第20天使用Magnapure裂解缓冲液(Roche)收获细胞，并根据制造商的说明(包括DNA酶处理步骤)使用MagNA pure 96系统(Roche)分离RNA。在cDNA合成之前，将纯化的RNA在90℃变性30秒。根据制造商的说明，使用用于RT-qPCR(Biorad)的iScript高级cDNA合成试剂盒生成cDNA。

使用QX1系统(Bio-Rad)与QX1软件标准版通过液滴式数字PCR完成对靶基因的表达水平的测量。PCR探针测定用于测量两个基因ELK1和CFP的表达。将其归一化为HPRT1mRNA的表达，并且最后测量TSRBP的表达以验证敲低的效果。

使用以下PCR探针测定(获自Integrated DNA technologies)：TARDBP:

引物1：CAGCTCATCCTCAGTCATGTC(SEQ ID NO.188)，引物2：GATGGTGTGACTGCAAACTTC(SEQ ID NO.189)，探针：/5Cy5/CAGCGCCCCACAAACACTTTTCT/3IAbRQSp/(SEQ ID NO.190)

ELK1(外显子3-4)：

引物1：TCAGGGTAGGACACAAACTTG(SEQ ID NO.191)，

引物2：GACCAACATGAATTACGACAAGC(SEQ ID NO.192)，

探针：/5HEX/CAAGAACAT/ZEN/CATCCGCAAGGTGAGC/3IABkFQ/(SEQ ID NO.193)

CFP(外显子9-10)：

引物1：CCTTGTAGCTCCTCACACC(SEQ ID NO.194)，

引物2：GCCTCTGCACACCCTTG(SEQ ID NO.195)，

探针：/56-FAM/CTTCTCGCC/ZEN/CTGACCTTCGACC/3IABkFQ/(SEQ ID NO.196)

使用以下CY5.5标记的HPRT1探针(获自BioRad)：dHsaCPE13136107

将表1中显示的数据归一化为管家基因HPRT1的表达，并最终归一化为未接受任何TDP-43敲低或CA重复ASO的每板四个对照(PBS)孔的平均表达值。

表1-ASO引起的CFP和ELK1表达降低。

数据证实了实例1中描述的观察结果，因为在仅具有TDP-43敲低的孔中测量到CFP表达的13倍增加和ELK1表达的3倍增加。

所有测试的间隔聚体ASO都能够将ELK1和CFP转录物二者自TDP-43耗竭细胞中观察到的ELK1 305％和CFP 1332％的平均起点下调。88种测试的ASO中，有72种能够使CFP表达降低至至少未经处理的细胞的水平(100％)，并且21种ASO能够使CFP表达降低至低于未经处理的细胞中观察到的水平的10％。

数据验证了CFP mRNA表达的增加是由ELK1启动子的转录引起的，因为即使是靶向ELK1内含子1的ASO间隔聚体也能够显著降低CFP的表达(图2)。同样，靶向CFP mRNA内的区域的ASO能够将ELK1mRNA的表达自TDP-43耗竭细胞中观察到的305％降低(图3)。

综合这些数据表明，靶向ELK1和CFP之间的基因间间隙的ASO可以使得能够仅在患病细胞(其中TDP-43由于蛋白质聚集而耗竭)中选择性敲低CFP和ELK1，而在身体的剩余‘健康’细胞(其中需要ELK1和CFP正常表达)中则不然。

参考文献

Wu等人(2019)Transcriptomopathies of pre-and postsymptomaticfrontotemporal dementia-like mice with TDP-43depletion in forebrain neurons,Acta Neuropathologica Communications 7(50)https://doi.org/10.1186/s40478-019-0674-x

SEQ ID NO 1是ELK1->CFP融合转录物的序列。该序列如下所示，并且基于Ensamble Havana v 17基因注释：

HG 38Chr X：47.650.604->47.623.172，负链方向。

CTCGGGCCCACGTGAGCTGTAGGGAAACGCAGGGGCGGCTTCTAGGT

GCTGCCGCCGCCACCGCCACCACCACCTCCACCGCCGCCTCGGAACCC

AGGCCTGGGGGGCGGTGGGGCCGCGTATGGAGCCCCCGCCCCCCGGA

GCTGCCAACATTGCCAACGCCACCGCCACGCTACACACAGGTGAGCT

CTGGGCCTGGAGGGTGGAGGGCCCAGTCCGTGACCCCACGTATCCTTC

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GACTCCCCGCCGCCACCACCACGGCTGGTGGACCTGCGTGTGGCATTG

CTCAAGCCCTTCGTCCCTTATAGTGGATCTGACCGTGGCCTAACCTCC

CCCTCCCGTTGTATAATGGATCGGTCTGCGTGCTTATGTTTTTCCCCAC

GCCAACTTAGGGTGGACTCGTCCATAGGCTTTCCCCCTACCCCTACCC

CCACCCGCCCCCCACCCACCCCCACTTATAGGGAGCTAGCCTGTGACA

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TAGCCTCAACTTTCAGGAGACCCGTCCGTGGCCTTATTTATTCCACCCT

TCCTGTACATCGTAGCGAATCAATCCGTGGCGCCGCACTCCTCCGCAT

CCCTCTTTAACAGTGAGTCTACCTGAGTTTGTATTCCTGCCTCCTCCAG

TCCCCCAATGCATCAGTCCATGGCTTTTTTCAAAACCACCCCCCCCCC

CCACCACCACCACCACCATTTTATAGTGGATCAGTCTTCATGTTTGGA

TTCACGTCCCTTTAGCTATCAGTCCATTGCCCTGTCTCCTCTTTTTCGTA

GACTGTCGCTCTAGCGCTTGGGGTTCTCTCCTTTTTAATAGTGGGTTAG

TTTAGTGCTTTACATCTCCCTATTTTCAGTAGCTCAGTCCATAGCCTTT

TCCCTCTCTGCTTTGAATCAGTCTGTGTGATGGCTTTTCTCTCCTCTCA

CTGTGGTGCAGGAGTCTGTAAGGTTTTCTGCTCCCCTTCCCCTCAGAC

GATGAGCCTCATCACCCCTCCCTTTGCAGTGGATCTGTTCATTGGCCTT

CCTCCCCCACACCCCTGTATGCTTGCACAGTCCCCCGCATACCCTCCC

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AACCACACTGGTTCCACCACACAGCTCCTCAAACATAGCAGGCATGG

GCCAGCCTCAGGGCCTTTGCATTGGCTGTTCTTTGTGCCTTGAACACC

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GTGCTAGTTGTATATGTGAATAAGGACTGTGTTGTTGCATTGAAAGAA

TGTGTTCACAAAACTGTGGTGTGTAGCTGGGCACAGGGGTGTGCACTT

ATAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGTGGGAGGATAGCTTGAGCC

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TCCCGTTGCCCTTTATCACTGTCTGACACACTGTGTGGGTTACTTGTTT

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AGGGATATGAGAGCTAATTAGTTGGGACTGTTCCTGCAACCAACCTTT

ACTGAGCCCCTTGTGAGTACCAGGCACTCTTCTAGGTGCTGGAATATG

GCAAGGAACGAAACAGGGCGAAATATTTGTGCTTGTGGAGCTGACAT

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CAAAAAAATTAGCTGGGTGTGGCGGCGTGCGCCTGTAATCCCAGTTAC

TTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCAGGAGGCGGAGGT

TGCAGTGAGCCAAGATTGCACCATGCACTCCAGCATGGGTGACAGAG

CGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCCAAGCTGGGGA

GACAGACTATGTGAACAAAATAAATAAGTAAAATTAGCATAATAGAC

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TGGGGGTGGTTGAAATCTTAGGCATAGGGAAGGTGACTCTTGAATTAG

GGCCTCACGGTAGAGACGGAGAGAGCCTTAATGTCTACGGGAAGAGC

ATACCAGGCAGAAGGAAGTGCCAGTTCAGAGGCCCTGAGGTGGGATG

GTGCCTGCCATGTTCAAGGAACATCAAGGCGGCCAGTGTGGCTGGAG

CAGAGTGCGGGGAAGGGTAGAAGGTGAGGTCACACAGGTGATGGGA

GCCAGATAGTGCAGGTGATACATAGGATAGGATTGCAGGGGCAGGGG

GAGAAGGATGACACACTAGCTAATAGCTAATATCTGTGGAGTATCTGC

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TATGGAGGCACAGGTATAAAAGCTGTTTCTAAGAGTGCTAGTTGTATA

TGTGAATAAGGACTGTGTTGTTGCATTGAAAGAATGTGTTCACAAAAC

TGTGGTGTATAGCTGGGCACAGAGGCTGAGGTGGGAGGATCACTTGA

GCCCAGGAGTTCCAGGCCAGCCTGTGCAACATAGTGAGATCCCCGTCT

CCGAAAAAAAACCCAAAAAATAACCACTGTGGTGTGCATAATACACT

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TCTGGCACCTGGGTAGTGTTATTTCAGTAAATATTCATTGTTAAACACT

ATGGTGCTTGGAATATACTATACAAAGGCACATGTATAAAAAAGAAG

TTCCTAACAATGCTACTTGTAAAAACAAAAAAAAAAGTCAACCCCTC

AAGTCTTTTACAGAAGTATTTTACAGAATTGACACAGTTAATCCTCAC

AGAAGCCTTGGAGGGTAGGTGTACTTTTGAGAATATTTGACTTTGAGA

GTAAAATATCCCCATTTTACAGATGAGGAAACAAGCAAAGAGAGGCT

GAGTAACTTGCTCAGGGTAACCTTGAGCCAGAATAGCCAGAACAGGG

GCAGAGGAACATAAGGCTGAAGACTCAGAAAGAAGAACAGATTTGCA

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GGAAGAGCTCTCCCTGCGGGGAGAGCAGCCCGTGCTTACCCTCAGAG

GTTGGAACTGTCTCGGGAACGGTAGATAGTTCAGGGTGGCTGCCTCAG

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TGTACCTCCATTGCCTCATGTGGAAAATGGGGGAAATGATAATCCCCA

CCCTTTAACGGTGGTTTGAGGATTCAATGAGTTAAATGATTCAAAGAG

TGTGCAGCCCACGGTAAGGATCGTATGCCTGGCTTGCATTTTTAAATT

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CTGCAAGGCTCCCACCTCAGCTGACCACAATGCTGTCTTTGTGGGTGA

TTAGGCCACAAACCTAGACTCACCCTGGACCCTTCTCTCACCTCCCCC

GGGCATGCTATCTGTCAGCAAGTCCTATTCTGTGTTCAGGCTTTCTCCA

GACCCCAGCTACTTCTCGCCAGCCCCACTGCTACCACCATCATCTACC

GCAGTGGCTTCTTCAGCCCCAACAGTCTGTTCTTCTCACAACCGCCAG

GGGGATCCTGTTGAAATCTCAGTCACAGCCTGTCATCCCTCTGTTCAC

AACCCTCTTGTGGCTCCTGTCTCACTCAACATCCTGACAGCACCCGAA

AAAGCCTGGCTCAGTCTGGCCCCCGTCACTCTGTTCTCCTCTCCCGCTG

CCTCCCTCCTCTCCCCCGAACCCATGTCAGCCTCCTCTCCCCATGTCAC

CTGCCAGGCACTCTCCAGCCTTGGGCCCTTCACACCGGCTGCCGCTTC

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AGAACTGGTAAAATTGCCTGTCTTTGCCACCAGGAGTCACTCTGAACT

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CTTTGCCACATGTGGCCTGTGGAAGGTACGTAGACATTTGTGCCTCCG

CTGCCTCATTTATAAGTTAATGACAGGAAGACTACCTACTTCTCAGAG

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CGTGAGCACTCCCCCAGCGATGGACCCATCTGTGACGCTGTGGCAGTT

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GACTTCACGGGATGGTGGTGAATTCAAGCTGGTGGATGCAGAGGAGG

TGGCCCGGCTGTGGGGGCTACGCAAGAACAAGACCAACATGAATTAC

GACAAGCTCAGCCGGGCCTTGCGGTACTACTATGACAAGGTACAGTCT

CTCAGACCAGGGCTGGAACCCCCCCCTGACATTTATATCAGAGATTTT

ATTTTGTTTTAATTGCCATAGCTATGACTTTGAAAGCAATGTTAAAATT

TATCAGTTTTTAACCCATCCATTGGTACCCTAAGACCAGTATTGGGCC

CCTAAACACTATCTCACCTACTTTCTTGTCTTACTGCTTTGGCGAAAAC

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CCTCTCAGACCCCCAGGCCACTGCTGGGTTTCTCCTCCCCCCAATATTT

ATACCAGTTATTTCATTTTCTTAATCCTTCTACTGAAATTTCCCAAACA

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ATATTTATACCAGTATTTTTAATATTCTTGTCTAATTGCTGTTAGTTACT

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AGGCCTCCTCACCCTCTCCTCTGCAGTGACCTTGCCCTGTTCCACTTCT

GTATCATTAGCTTCAAATAATCCTCTGTATTAATAATTCATCACCCCAT

CCATCTACATTAATTTACTTTCTTCCAACATTTATATCAGTTACTTCAT

TTTCTTGTCTTATTGCATTTGCTAGTCTCCAAAACTGTGTCCTGACAGT

CACCCACAAGGCCTGGCCCTGTGAACCTCTGGTTCTTGGAGCCAGGAA

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AGGGACGGGAAAGCCGGAGAGGAGCAAGTGGGAAGAAAGCCACTAG

GAGAAGAGAAATGCCACTCCACCCCCCTCCTCCCCCCTGACACCCTGC

CTCCAGCCTGCCCCTTTCCTCTAAGGCCCTCTGTTCCTCTCCTCCCTTC

CTAGAACATCATCCGCAAGGTGAGCGGCCAGAAGTTCGTCTACAAGT

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CCCAGCCAGAGGTGTCTGTTACCTCCACCATGCCAAATGTGGCCCCTG

CTGCTATACATGCCGCCCCAGGGGACACTGTCTCTGGAAAGCCAGGC

ACACCCAAGGGTGCAGGAATGGCAGGCCCAGGCGGTTTGGCACGCAG

CAGCCGGAACGAGTACATGCGCTCGGGCCTCTATTCCACCTTCACCAT

CCAGTCTCTGCAGCCGCAGCCACCCCCTCATCCTCGGCCTGCTGTGGT

GCTCCCCAGTGCAGCTCCTGCAGGGGCAGCAGCGCCCCCCTCGGGGA

GCAGGAGCACCAGTCCAAGCCCCTTGGAGGCCTGTCTGGAGGCTGAA

GAGGCCGGCTTGCCTCTGCAGGTAAGGACTGGAATATAGAAATTCAG

TAAGAGGAGGCAGTAAAGAGGAGGGATGTGTAATCCCCGGATGACGA

GGGAGGCTGGTAGAAGAGACATAGCTGTCCCGTTAAAGGAGATAATG

GTGGAAGGAAGACATCCTCTTAGAAGGAGGGGTGGGGCAGAGAGCTA

CACAAATCCTGAGACAGAAAGGGGAGAATACTGTGCTACAGTTAGTA

GCTGCCGAACATGTAGGTGCCTGGAATATGTTTAATGCACTGGTTCTC

GCACTCTAGTGCTCATCAGAATCACCTGTAGGTCTTGTTAAACCACAG

ATTGCCAGGCACACCCCCAGAGTTTCTGAATTTGTGGGGCTGGGGAGG

GGCCCAATAATTTGCATTTTTAACTTGTTACCAAATGAGGCAGATATT

GCTGGTCCAGAGGAAGGTAAATTTTTGAGAACCACTGTTTTAATGAAT

GAGGATGGTATCCCTCAGATTCCTACCCGCTTCAGGTTGTCTCACCCC

AAGTCCCCTGTCCCATAGGAGGACCTGCCCCAGAGGAAGCCCTACTTC

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CATGCCCTGAGTACCAAGTGCCACCTTCCCGGGGAAATCACTGGGTGG

CCCACAGGAGAATCCTGTGGTCCCAACAATCCTTACACACCCTCTTTG

TGCCTGCTCCTCTACCAGGTCATCCTGACCCCGCCCGAGGCCCCAAAC

CTGAAATCGGAAGAGCTTAATGTGGAGCCGGGTTTGGGCCGGGCTTTG

CCCCCAGAAGTGAAAGTAGAAGGGCCCAAGGAAGAGTTGGAAGTTGC

GGGGGAGAGAGGGTTTGTGCCAGAAACCACCAAGGCCGAGCCAGAA

GTCCCTCCACAGGAGGGCGTGCCAGCCCGGCTGCCCGCGGTTGTTATG

GACACCGCAGGGCAGGCGGGCGGCCATGCGGCTTCCAGCCCTGAGAT

CTCCCAGCCGCAGAAGGGCCGGAAGCCCCGGGACCTAGAGCTTCCAC

TCAGCCCGAGCCTGCTAGGTGGGCCGGGACCCGAACGGACCCCAGGA

TCGGGAAGTGGCTCCGGCCTCCAGGCTCCGGGGCCGGCGCTGACCCC

ATCCCTGCTTCCTACGCATACATTGGTGAGTGCCTGCGGAGGGGTGGG

GTGTGTGGGCGCCAGCACCAATGGGATTGGCATGTGGCGGGTGACTG

ACAGGAATCAGAGGAGGGTGAGTGTGGTTGTTCCTGAAGAGGGTGGA

GCCTTTGAGTGTGATTGACTGGGCTGATGCTGGCTGGAGGGATGGGGT

TTGATTAGTGAAGGGCAGGGCTGGGGACTTTTGTGGGTGGGACCGAG

GGTCTTTCTGTGGGACTGTTTCTAGGTTGGGGTGTGGCTTAAGGAACC

TGAGCAGGGCTTTTTGGTCTGGGATGTGCATATGGGGTTTCATGGGTG

GGACATGAGTTGGAAGTTGACCCTGAGCTGTTGGGATGGTGACTTGAG

AGGTTTGAGAGCAGCATTTGGATAGGGTCTTGTGGGTGGTCTTGACCA

ATGAGGTCTCAGCAACTGAGGGTGGGCTCTCGGGAGTGGGGAGTGGG

GGGTGTCTGCAGAGTTTGAGAGATCATAGGCATGGCCTCCATGGTTAC

CATCTAGGTGTGTGCACTTTGGGGAGTGACCCTGGGAGTGTGAGTGGG

AAATCTGTGGTGGGGCCGGGACCAAGTCCCTTCCAGCATCCCACATCT

ACTTTCTACTCACTTGAGCTCCGACCACCCTCTCCCCACAGACCCCGG

TGCTGCTGACACCCAGCTCGCTGCCTCCTAGCATTCACTTCTGGAGCA

CCCTGAGTCCCATTGCGCCCCGTAGCCCGGCCAAGCTCTCCTTCCAGG

TAGGATCCTCTTTCCCCGTTTTGGACAGGGTGAGAGACCCAAGAATGG

CCCCCATCTGTGACCTCTCCCTCTTTTTGCCCCCAGTTTCCATCCAGTG

GCAGCGCCCAGGTGCACATCCCTTCTATCAGCGTGGATGGCCTCTCGA

CCCCCGTGGTGCTCTCCCCAGGGCCCCAGAAGCCATGACTACTACCAC

CACCACCACCACCCCTTCTGGGGTCACTCCATCCATGCTCTCTCCAGC

CAGCCATCTCAAGGAGAAACATAGTTCAACTGAAAGACTCATGCTCT

GATTGTGGTGGGGTGGGGATCCTTGGGAAGAATTACTCCCAAGAGTA

ACTCTCATTATCTCCTCCACAGAAAACACACAGCTTCCACAACTTCTC

TGTTTTCTGTCAGTCCCCCAGTGGCCGCCCTTACACGTCTCCTACTTCA

ATGGTAGGGGCGGTTTATTTATTTATTTTTTGAAGGCCACTGGGAGGA

GCCTGACCTAACCTTTTAGGGTGGTTAGGACATCTCCCCCACCTCCCC

ACTTTTTTCCCCAAGACAAGACAATCGAGGTCTGGCTTGAGAACGACC

TTTCTTTCTTTATTTCTCAGCCTGCCCTTGGGGAGATGAGGGAGCCCTG

TCTGCGTTTTTGGATGTGAGTAGAAGAGTTAGTTTGTTTTGTTTTATTA

TTCCTGGCCATACTCAGGGGTCCAGGAAGAATTTGTACCATTTAATGG

GTTGGGAGTCTTGGCCAAGGAAGAATCACACCCTTGGAATAGAAATTT

CCACCTCCCCAACCTTTCTCTCAGACAGCTTATCCTTTTCAACCAACTT

TTTGGCCAGGGAGGAATGTCCCTTTTGTTCTTCCCCCTGAGAAGCCAT

TCCTTTGTCTGCCAACCTCCCTGGGGTCCTGCCTGTTTCCTCCCAATGG

AGGGTTTTTTTGGGGGGTGGTCCCCGTCTGGGGGGCCCCTCCAGCCAG

TACTCCAGGTCTCCCTGTCTCTCCCCCGCTGCCATTTTGATAGTATAAT

CTATTTTTAAATGGGGCTTTTCAATAGGGGAGAGGGAGTCATCTCTTC

CTATATTTGGTGGGGTGGGTGGGAAGGAAGGGATTTGGGGGGGAATC

TTCCTGCCGCCTCCCCCACTCCAAGTGTTTATTTTTGATACCAAACATG

AATTTTCAGTTCCCTCCCTCCCAGCCCCCCAATTTCCTGCGGGCGGGTA

CAAAGGACCCTTTCAATGTCCCTGGAGTTGGGAGGGAGGAATGGGGG

ACATAAAGCCTGTCCTGTCTCTATTCTAGGCAAGAGAGAGTGGGTTCA

AAAGACTCCTGGGCTCACCTGTTAGCGCTGGCCCAGCCCAGGCCTTGG

GACCTGGGGGTTGGTGATTTGGGGGACAGTGCTACACTCGTCTCCACT

GTTTGTTTTACTTCCCCAAAATGGACCTTTTTTTTTTCTAAAGAGTCCC

AGAGAATGGGGAATTGTTCCTGTAAATATATATTTTTCAAAGTGATGC

TGGAGGCTGCTGGCACTTTTTCTCTGATGTTGTCAGGACTAGCTGAGC

GTGACACGCATGACTGTGTGTGGAGGGTGTGAGGCAGAGGTCGATTG

TGAGAGAAACGGTGTGATGGCGTGTGTGAGAAACAATAGTAGGGACT

GCATATCGGTAACCATGTGTGTGTCAGAGACGTGGAAAGCTGTGATTG

TGTGTGAGAGTGTGCAGAAGTTGTGACCACAGACTTTTGATGGTGTGT

CTATGTGGGAAATTGTGGCTGTGTTTCAGAAAATAACTGAGCCTGGAT

GAATAGTCAAGGTACTGTACAAGAACCTGTGATGGTATGCACAAAAT

AATGTCTACGAGAAGGGAACGGGGACTGCAGCCCTGTCACTGTTTGA

TGGCGAGCAAGACAGACTGGGTGACCAAAACCACATGTGAGAGACTA

CGTGGGCATGAAACTACAGTAGAGGTTGTCAGGGATTGTGGCAAAGA

TTGTGTAGGTGACAAACCTCACTGTAGGCGACTCAACGTTTGAGAAAT

AGATGATGTGCAAAACTGTTTACTTGAGGCTGTAGTGTCAGCTAAAGC

TGTAAGACTGTATGGGTGCGAACTTGATTGTACGGGAGAGAATGGCT

GGGAGACCAAACCAGTGACCGAGACCAAAGATACAAGAAGGTGCAA

TTGTGTGTACGAAAGCAGGCGTGAGAGACTGCAGCAAAGACTGAGAA

AAACGAATGGCTGTGACTGGGAGAGTGTGACAGGCTGTGTGTGTGTG

TGTGTACACCTGAAACTAGTTGCAAATCGATTTACCATTACTACCACA

GTCTATCCCACAGGTTCAGGGACTGTGAGAAAGTAGGAGAGAAAATG

ACGGTGAGCCGGACGGAGCCACTGACATGGTGTGAGAGACCACATCA

CTGGGCATGCAAGGGAGAGGGACAAGGAACTGTTTATGAGAGACTTG

GCAGTAGCAGTAACTGGAAGTCAGAAACTGTGGGAGAGGAACTTGAC

AACTGAGTGATGTCAGAGCACCAGGGGGTCTGTGAAACAGTTCATAA

GAAACCATAAATCAGGGGCCATACAAAAGAGCTGAGCAAATGAGAC

ATGCCAAGTGACCACGTGACAGTGTGTGAGAAACTTGTAAAGCTGTG

CACGTGTGTCCGTGATGAGCTGACCATATGAAGAAAATGACGGTGTG

CACGACTGAGAGGGCATGGGTGACTGTGGGTGACTTATCGAGGGCCT

AGTGGTGATTGTGAAATACTGACCGAGTATATCAGAAGCTGACTGAG

GGACAGTGATGACTGAGACAGTGGCTGAGAAACGGATTGTGTGTCCA

TGGGTAAACCCTTTGCAAGAGACTTTATGAAAGGCTGTAAATCAAGG

ACTGAGGGTACTGGAAGCTGATTGAGAAGAAACGTGAGACTAGGTGA

CGACAGTGTCTGAGATACTGTGTGATTGTGTATGCGTGTGAATGTCTT

TGTGGGAGAGGCTGTAATCAGGGATCGTGGGTGTGTGAAAAAGTGGC

TTGAGTGAGAAAGGGGTAGGAGAGGTGATTTTTGTGCATGTGTGGGA

AACTTCATGAGAGACTAGTTAGTGGTGACTATAAATCAGTGACTATTT

GTGTATGTGAGAAAGTAACAGGCCAAATGAGTGCCTAAACGTTTCAT

GAGATTGTGTGACTGCACGTGTATGTAAGGAACTGACTGGTGAGAGA

AACTATTGGCAATATTGACTGAATGAGACAGGCTGTTAAACATGATTG

TGTGTGTGAAACTGTTAGGAGACTGTAGTAAGGCTGGAATCCATGACA

CAGAAAATGACTATGAGTGACAGAATGTCTGAGAGGCTGTGTGATTA

AGAGAATATAGTAGAGGCTGTAAATCCGGACTGGGTGCGGTGGCTCA

TGCTTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCAAGGTGGGAGGATCACTTG

AGGCCAGGAGCTTGAGACCAGCCTGGGCCACATGGTGAGACCCCGTC

ACTACTAAAAATTTAAAAAATTAGCATAACGTAGTGTTGTGCACCTGT

AATCCCAGCTACATGGGAGGCTGATGTGGGAGGACTACTTGAGGCCA

GGATTTTGAGTTTGAGACCAACCTGGGCAACATAGAAGGACCCTGCC

GCTACCAAAACAAAAAACAAAATTACCCAGGTATAGTGGTGCATGCC

TGTAGTCCCAGCTACTGAGGACACTGAGTTGGGAGGATCGCTTCAGCC

CAGGAGTTTGAGTTTGAGACCAGCCTGGGCAATGTGGCAAAACCCTG

TCTCTCCAAATAGTTTAAAAAATTAGCCAGGTGTGGCGTGTGCCTGTA

GTCCCAGTTACTCGGGAGGCTGAGGTGGGAGGATGGTTTGAGCCCAG

GAGGTTGAGGCTGTAGTCTGCGATCACGCCACTGCACTCCAGCCTGGG

TAACAGAACCAGACCCTGTCTCGAAAAGAAAAGAAAGAAAAGAAAA

ACATAACTGTGTAGATAGGTTTAAAAAAAAAAAGAGAGAGAGAGAA

AATAACAGACCAAATGAGACTGTGTGAGAGGTCTAATGCCCTGCAGA

CCCTCGAATGTTCCAGGCCCTGGAGAAAAACCCTCTTCTGTTTTTCCTG

TTCCTCCACAGGCCCCTCCTGCTCAGTCCGCTGGGCTGGCTTCTCCTAC

TTCTCTAAAACTTGAAATGCTGGGGTTCCCCAGGGCAAAGCCCTGGGA

TTCCCTTCTCTCTTCTCACGCATCCTCTCTAGGTCATCTTATCCAGGTCT

TCACACTTGAAATACTACTTATCCTCCATGGGATGCCCACATTTTTACC

TCTAACTCAGACTGTCCTTCTGGCATTTTATCGTAATCTCTAAAGTTTT

GTTTATTTCATTGATTGATTCATTTAGCAGATGTTTATTGAGCATCCAC

TGTTTCCTGGTGCCTATCTAATGCCCTGCAGACCCAGCAGTTAACAAG

CCAGACAAAAATCCCTGCCCTTGTGGAACTGATATTTAGGGAGTGAG

AATAACAAGAAGCAGGCAAATACATAGTAGCAGGTAGGGATGTAATA

ATTAAATAAGACAAGACTCTCACTCTTTGTTTAAGGAATCTGCAGTCA

TTTTATTGCCTAAACGTGTGGGAAAAGATAGAGTGCTGACAGTCCTCT

TCCACAGGGAATCCTATGAGTATTTATACAGTTTAGAAACAAAGGAA

ATATTGTTAATATTATTACCAGGGCAACAGGTGGTTAAATAAAGAAGC

CAGCCAGAATTTCAGGTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGAC

AGAGTCTCACTCTGTCGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACGATCTCAG

CTCACTAGAGCCTCTGCCTCCCGAGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAG

CCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCATCCGCCACCACGCCTGGCTAA

TTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGCGTTTCACCATGTTGACCAGGCTGG

TCTCGAACTCCTGACGTCAGGTGATCCACCTGCCTCAATCTCCCAAAG

TGTTGGGATTACAGGCGTGAGCCACCATGCCTGGCCAGTTTCAGGTCT

CTTGGAGAGTGTTTTCACAGGATAACACAGCAATGATTGTCTTGAAGT

CGTAGAATCTTAATAAGACTCCTTTGTTCAAAGCACATTTTCAAGGAT

AGCCTTATGTTATCAGAGAACAGAGTATGTCTGTAATGGATACAGATA

TTAACACATACTTTACTGCCCATAAAACAAGTGTTCCTGAAGAACTTC

TGTTTTAACAGCTGACCAAATTATTACATTTGAATTTGCAGAATTCCTC

TGCCTCCCTGAGAGCAGAGGAAATTAGGCATTGCCTTCCTATCTTTCT

TGTGCTTCTTTTTGTTAATTAAAAGCAAAATAAAAATTTTAAAGTGGG

CCCTGGAGTTTCATTAGGGTTTATAAAAAAAAAATAAAAAAATAAAA

AAAAAAGAAGGGCTGGTGTGATGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACT

TTGGGAGGCTGAGGTTGGGAGAAAATATTGAAGCCAGGAGTTTGAGA

CCAGCCTGGGCAACACAACGAGACCCCATCTATACAGAAAATAAAAA

CATTAGTTGTGTGGTGGTGTGTGCCTGTAGTCCCAGCTACTTGGGGAC

GCTAAGGTGGGAAAATCACTTGAGCCCAGGAGTTTGAGGCTGCAATG

AGCTATGATCAGACCACTGCACTCCAGCCCAGGTGACAGCAAGACTC

TGTCTCTTTAAAACAAAACAAACAAAAAAACAGGTTTGGAAGCTACT

GGGCTAGAGAGTGACAGGGATGCCAGACAAGGGTATGGGGAAGGCCT

CTGTGAGGAGGGGCAACATTTGTTATCCATCTTCTCGAGGGCCAGGAT

TTTTGTCTGTCCTATTCTCTGCTCTAATGCTAAGAACCGCATCTGGCAT

CCAGTAGGTGCTCAATAAATGTTGAATAAATTTATCAAACACAGAGCA

CCTACTATATGCCAGGCACTGTTCTAAAGACTTTCCAAAAGCTTAACT

CCTGGCCGGGCACGGTGACTCACGCCTGTAATCCTAGCACTTTGGGAG

GCCAAGGCAGGTGGATAACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTG

GCCAACATGGTGAAACCCTGTCTCCACTAAAAATACAAAAATTAGCT

GGACATGGTGGTACACGGCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAG

GCAGGAGAATTGGTTGAAATCGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGA

GATCGTGACACTGCACGCCAGCCTGGGCGACGGAGTGAGACTCCATC

TCGACAAAACAAACAAAAGCTTAACTCGCAATCTTTGCAACACACCCT

ACCTATGTTGTAGGTGCTGTCTGTGAGCACATTTTACAGAGGGGAAAC

AGGCTCCAGAAGGGGGGTGTTATCTGCCTGAGGGTTCTCTGATGGAAT

ATGGCCCAGCTTATTCCCTCCTAATCACCCCAGACCCTGGTGTTGTCCC

CAGCTGGGCCCATGGAACAATGGATAGACCCCATTCCCCTCCTGAATC

CCTCCCCAGGCTCCTGCCACTTCCCTTTCTCACTTCCCTTGTGCTGACC

TCCCCGACCACAAGCTGACCACAGGGAACCTCTCAGGAAAGGAGGGC

CGAGGTTAAGGGAGGGTGGAAGGTGGAGCAACTGACTCGATGCTCCC

TCCACCCCCACGAGCAGGAACATACTGAGCACCGCACACTCACTTCAC

CCTGGTTCAACACCCCCACGAGGTTGACCCCGTCATTATGTTAGAGAT

TATGCATTTTCCACATAGGGAAACTGAGGCTCAGGGGTGTTAAGTGAC

TCACCCAAGGTCACACGGCTAGGAAGTTGCTGCACGCTCCTATGCTCC

ATTTCCTCTGGGTGAGAATTTGTCCTAGGAGCTTCTATTGAACACTGTG

AGGTTGCTGGGAGGAGCGCGAGGTGCTGGGGATATAGTAACAAACAG

AACAAGACCAAGAGTAAGACAGGAAATGGGGAGGGGAGAGTAGAGA

AGGAGGCAGAGGGGACAGGGTGGGGTCAAAGCAGGATGCCCTCCCA

GTTCCTCCTGCCTCTAGGTTCCTCTTTCCCTGCTGATTCCAGGAGCCTA

TCAACCCAGATAAAGCGGGACCTCCTCTCTGGTAGAGGTGCAGGGGG

CAGTACTCAACATGATCACAGAGGGAGCGCAGGCCCCTCGATTGTTG

CTGCCGCCGCTGCTCCTGCTGCTCACCCTGCCAGCCACAGGTGAGGGG

GTGAGGGCCCAGCTGGCCCCAGGGGTGTCCAGGCCCACCACATCCCT

GACCGAGCCCCACCCACCCATCCCCTGGCCCTGTTACAGGCTCAGACC

CCGTGCTCTGCTTCACCCAGTATGAAGAATCCTCCGGCAAGTGCAAGG

GCCTCCTGGGGGGTGGTGTCAGCGTGGAAGACTGCTGTCTCAACACTG

CCTTTGCCTACCAGAAACGTAGTGGTGGGCTCTGTCAGCCTTGCAGGT

TAGGGGGAGCCTGGGGTGGGGGATGGGGGGGAGGGAAGGACTGTCT

GTGGGGGTCACCCAAAACTGGGCACTTTCTTTCTCTGGGACTTCCAAG

GGTGGCCCTGAGGCCCTGATCGTGACCATACCTCAGGGTTTCTCAACC

TTGTTACTATTGACATTTGGGGCTGGAAATTCTTGGCTGGGGGAGGGG

ATTGCTTACCTGTGTATTGTGGGATGTTTTGTAACACCCCTAGCCTTCC

ACTAGATGCCAGTAGCAATTCTCCCCACCAGCTGTGACAACCAAACAT

GTCAGCAGACATTGCCAAATGTCCCCTGGGGGTCAAAATCACCCCTGA

TTGAGAACCACTGACATAGCTCACACATATTGAGCACCTCCTGCACAC

TGGAAGCATTGCAGGTGGGGTGCAGCTTGGTATTTCCCTAATTTTGAT

GACAGCTCATGTTTATTGAGTGCTTACTGTATATGGACACACTGTGGG

GGCGGGAAAGTTTGGGGAATTCAAAGGGCAGCTCTAGGCCCCTAATT

ATGATGACACTTCACATTCATTGAGCACTCCCTGTATACCAGCTGCAT

GGCAGGGTTGGGAGATGAGCTTGAGGATTTCTGAGGGTAGCTCTAGTC

TCCTGATCATGATTTCCAGCTTGCATGGATTGAGCCCTTACCGTATGCC

AGACCTGTTTTCTACTTGTTTACTATATATCCCAGATACACCGTGGGCA

TGGGGAGCTTGGGGATTTTTGAGGGCAGCTCTGGGCCCCAAGTCATGT

CAACAGTTCATCACATCTATTTGGCATGAACAGCATACCTAGGGCTAT

GCAGTGGGTTGGGGATAGATCTGGGGTTATTTCTGAGGAGGCCTCTGA

GGTCATAGGGATGATGGCTCAGGTTTATTAAGCACTTTCTATTTACCT

ACTACCGTGTAGTGTGGTGATCTGGTGGGTTTCTGACAGCAGCCCTTG

GTTTCTAGTCCTTACCTTTGCTTACTGCGGACCTGGTGTTGGCCATGCA

GCCTTCCAATGGTAACTCCAGATGCCTGATTGTGAAGGTAAATGACAT

TATCAAGCACTTATTGTATATCCACTGCTTCCCATCAGTATCCCAATAT

CCCTAAAAGGTAAGGACTTATCAATCCATCGCACACGCACTTGCCTAG

CAACCCTTCGTGTCTGCCCACACTCTGGAGTCCCACATGCCATTCTTGT

TAGCTCATGCCAGGATGGGATGTGTGTGCTCTTCTCCACAGGTCCCCA

CGATGGTCCCTGTGGTCCACATGGGCCCCCTGTTCGGTGACGTGCTCT

GAGGGCTCCCAGCTGCGGTACCGGCGCTGTGTGGGCTGGAATGGGCA

GTGCTCTGGAAAGGTGGCACCTGGGACCCTGGAGTGGCAGCTCCAGG

CCTGTGAGGACCAGCAGTGCTGTCCTGGTGAGGAGGATGAGCAAGGC

GGGCAAGCACTCCCTGTCACCCAGCACTGGTGGGAACGATCGGTACA

GAGGTCCTCAGAGTGGGCCCGTCCCCAGTGTTTGTAAGGACCTAAGG

AGGAGAGTGGTGGGAGGTGAGGTCAGAGAGGTGAGGAGGGTCCATTG

CCTGGGGGCCACAGAGAGGACGTTGGCTTTTCATCTGAGTAATTTGGA

CTGTGGGCAGAGGAGGAACGTGATCTGACTGGGGTTGGGAGGAGAAC

AGACTGTGCACGGTGAGGGTGAGAGGGGAAGCGGAGGCACCCATGTG

AAGGTTGCTGCGGCAGGCCCGGTGAGCGGGGATGGTGGGCCCAGAAT

GGTGGCAGAGGATATAAGGACAGGATTAGCTCATGTGGGGCACTCAA

GGAAGCAAAGAGCCCTGAATGACACCCCACCTCCATCCCATTACCCTC

TCTTCTCTCCCACAGAGATGGGCGGCTGGTCTGGCTGGGGGCCCTGGG

AGCCTTGCTCTGTCACCTGCTCCAAAGGGACCCGGACCCGCAGGCGA

GCCTGTAATCACCCTGCTCCCAAGTGTGGGGGCCACTGCCCAGGACAG

GCACAGGAATCAGAGGCCTGTGACACCCAGCAGGTCTGCCCCAGTGA

GTGAGGGAAGCCACAGGATGCTGATGGGTGCACCCAGCGTGGGTCTG

CGGGGTTACAGCAGGGAACTGCCAGGCTGAGAGGACTTTAGCATGCA

TGACCACACCTGCATCCCTCCACCTCCCACCCCACCACAGCACACGGG

GCCTGGGCCACCTGGGGCCCCTGGACCCCCTGCTCAGCCTCCTGCCAC

GGTGGACCCCACGAACCTAAGGAGACACGAAGCCGCAAGTGTTCTGC

ACCTGAGCCCTCCCAGAAACCTCCTGGGAAGCCCTGCCCGGGGCTAG

CCTACGAGCAGCGGAGGTGCACCGGCCTGCCACCCTGCCCAGGTACA

CCAGGATGAGGCTGCTGATGTTGCTGGTGGGGCTCTTGATTGAGGGCA

GAGATGCTCTGCCATTTCTAGAGTTCCTAGGCCATGTGACCATGCAGC

CCTTCATTTGGGGACAGTCTGCTTCAAGGGTCTAGGGGCTGAGAGGAA

GGATTGAGGAGGCCTTTCTCCTCACTCCCTTTCCTCCTCCAACAGTGGC

TGGGGGCTGGGGGCCTTGGGGCCCTGTGAGCCCCTGCCCTGTGACCTG

TGGCCTGGGCCAGACCATGGAACAACGGACGTGCAATCACCCTGTGC

CCCAGCATGGGGGCCCCTTCTGTGCTGGCGATGCCACCCGGACCCACA

TCTGCAACACAGCTGTGCCCTGCCCTGGTCAGCATCTCAGGGTTCACG

ATTTGCATGCCTAAGTCCCCCTTGCCCTTCTCTGCTGCCCAGCTCCTGC

TGCTGAGGCCTTGTTCCTGTCTCTGATTCCTCCTTTCCTGGCCCTGATA

CCTTGTTTCCACCCCTGGTCCCCCATTCACACATCTGATCACCTCTACT

CCCTCCTACCGCCCTCATTCCTTCCTCTGAACCCCCTTGCTGATTCCCT

GCTTTGGTCCAATCCCCTGTTGCCCTGTCTCTGCAGTGGATGGGGAGT

GGGACTCGTGGGGGGAGTGGAGCCCCTGTATCCGACGGAACATGAAG

TCCATCAGCTGTCAAGAAATCCCGGGCCAGCAGTCACGCGGGAGGAC

CTGCAGGGGCCGCAAGTTTGACGGACATCGATGTGCCGGGCAACAGC

AGGATATCCGGCACTGCTACAGCATCCAGCACTGCCCCTGTGAGTGTC

CCACAGACTGTGCTCTGAGGGTGGGGTGGCCCATGCAGGATAAGGGG

TTTCCAACTCTCTGCTGTGGACCTCACGTCTCTGCAGCCTCCCTCTCAC

TTTCCCACCAAGACCTCCAGTTCTGACTCTGTGACCCCTACCCCTCATT

GCAGTGAAAGGATCATGGTCAGAGTGGAGTACCTGGGGGCTGTGCAT

GCCCCCCTGTGGACCTAATCCTACCCGTGCCCGCCAGCGCCTCTGCAC

ACCCTTGCTCCCCAAGTACCCGTGAGTGAGAGGGCAAAGTATGCCTG

GGAGGGGGTCATTATATTACAGGCGGGAGAGTCGGCTACCCCAGGAA

ACCAGGGTTTCCACTGCTGAATCTAAGGTATCTGCCTTGCCGAGTGCC

ACCTCCCAGCTGCAGGAAGTGGGGAGAAACTAAGAAGATGAGAAAG

AAGTTCTTGGAGGATAATTCGTAGCCTCTGTGCCCCTCAGTCACCTGT

TCAGTCACTCATCCACTTAGTCCTTCATGTGTCATTGACTCCGACCTTC

AGTTACCCATGCTTTTAGCTGCCATCACTCAGGCCTCCATTCACTGCCT

GCCTCCCACAGTCACTCATGCCTCCATCCACTTTGTCAGCATCTCACTG

AGCCAAGGCACTCCAAGGCTTTTTCAGCAACAGTTGCAGATACACAC

AGCCCAGATCCTGTGGATCCTCCAAGGGACCCAGCTGAGCAAGCCCC

TGACAGGAGGCATATGAGGAACAGCTGGTGCATGCAACAGGTGCTGC

CACCTCAACCTAGGTCCAGGAAGCTGACTGGGCCTCCCAGGGCAGGT

AGGGGTTGGGAAAGGCATTCCTGGCATCAAGACTGTGAACGGAGCCT

TGGAGCTAGGTGATTAGCCGCTATAAGTGTTTCCAGGTGCCAGAGGGG

CCCAGGTGTTAGAGAGGGTTAAAATGTTCATCCCTTTTCTTCCTTCCAC

ATACATCAAGCTACTAGATTAAGTGAACTATTCCCAGCTCGTGGAAGG

GCTGCCATCTGGGAAGGGATCTCCCGGCTGAGGGGGTTAGAGTGGGG

CCTGAAGATTAGAGGTGTTGAATGGAGGCACAAAGGACTTGAGTGAG

CGAGAGACTGAGTGGAGGAAGAAGCAATTGAGAGAACTGGGATGGG

AGTGAATGGAGGGCTTTCCTAGTGGGACAAATAACCCAGGTAAAGAC

CTTTCTGGACAGGGACTGAGCTTGAATAAAGTGGAGGAGACAGAGAG

AGAGATTGGCTTGGGGCAGGGATTTGGGCCCAACAATAAGGCCTTGA

ATGTCAGGACAAGGCATTGGGTTTTTTCCTGGAGGCAGTGGAAAGAG

ATATAAAGGGTATATATTTCGGAGGTAAAAGAAAGTAGCTCATGCCA

ACAAGTAACATTCACCAGCATTTATTGAGCACTTGCTGTGTGCCAGGC

ACTGCTCTGAGCACTTTACCTGAATTAACTCATTTATCCTCATTCAACC

CCGTGAGGTGAGTATTAATATTACTATTCCTACCATTCTCATTTTGCAG

ATGAGGGAAACCGAGGCACAGAGAAGCTAAAGAAATTGCCCAATATC

CTATAGCTAAAAAGTAGTGTTGGGAGGCCAGGCACAGTGGCTCACGC

CTGTAATCCCAGCAACACTTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGCATCACTT

GAGCCCAGGAGATTGAGGCTGCAGTGAGCTATGATTGTGCCACTGCA

CTGCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACCCTGCCTCAAAAAAAAAAAAG

GAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTAGCCCTCGGCATATAGCAGGCACT

CAATAAGAATTGAATGCATTCTTGCCTTCCCTGAGATTCTCCCTTCCGT

TCCTCCCCACCCCTAATGCCTCAGGCCCACCGTTTCCATGGTCGAAGG

TCAGGGCGAGAAGAACGTGACCTTCTGGGGGAGACCGCTGCCACGGT

GTGAGGAGCTACAAGGGCAGAAGCTGGTGGTGGAGGAGAAACGACC

ATGTCTACACGTGCCTGCTTGCAAAGACCCTGAGGAAGAGGAACTCT

AACACTTCTCTCCTCCACTCTGAGCCCCCTGACCTTCCAAACCTCAATA

AACTAGCCTCTTCGAGTTCGTCTACGATTCCTTAAAGGAGGAAAAACA

ACCTATCCCCTTCCCCAAAAGTAGGGTGATAGCATCTCATAGGGCAAA

CAGCACAGCACGGGCCAAGACACAGCAGCCTGTTGCGGAAAACAGTA

TTTTCCACTGTGGTCGCAGGTTGGCAGGAGTGAAAGCGAGTGTGCAGT

CCCAGCCTCTCCCCGCCGCTGCCATAACCCCAATGTCTGGGCCCTGCG

CAGCCCCCTTAGAGCCTCAGGGCCGCCCGGCACGTTCCTCTGCAGAGC

TCCGCGTTACGGGTTTCCTGATTGGCTACTTGTCCTGGCAGGCACTTCT

TGATTGGCCGGCGTGCTTGTTCGTTGTCTCCCCGTCTCCTGGACCTCCC

TAGATTCCCACCAGCCGGAACCCTGGAGGAGCCTCTGCCGGCCGACTC

CGACTCCGCGTCAGTCGAGGATGAACGGCAGAGGCGTGGCCGAGGCT

GGCACCCTGCCGCCCGAGCACCTGCACCCACCCACTCCCGACAGCCC

AGCTCCAATGCCACAATTACCAGCGACAAATAGCTCGGCGAGGCGGG

GGGCGGGCCGAGGAAGTGCCTGTGTTGCGCTCTGAGCTGAGGAGGGG

CAAAGAAGCTAGAGTCAGTATCCGCCCGGAGGAGCCCCCAAGACAAA

TCCAGACACTTTCCTCTGGTAATTTGTTCATTCATTCAACACTTATTAG

CGCCTGCTGTATGCTAAAGCTGAGTCTGAGCATCTAGGGTGGAGGAG

GGCTGGTAGAAAGAGGACATCTGAGTGAGGGAACAGACTCAGAAGGT

ATTCCTTTCGTGTGAACATCTATTCAACACTTAACGCCTACTGTATACT

AACAATAGTGCTGGACATCACGGAGAATAGAGAAGAAGAGGAATCA

GAGCGTTACGTGTCTCCGCAGTAAAGGGAACAAAGCCAGACACCAGT

GCTTTTAGCATTTGCTCATTCATTTACCACTTACTGAATGCCGGGCCCC

TTGTGAAGAGACGCATCATAAGAATCATAATAATCATGGTAATAGCTA

CTACTT

化合物表

Helm注释索引：

[LR](G)为β-D-氧基-LNA鸟嘌呤核苷[LR](T)为β-D-氧基-LNA胸腺嘧啶核苷[LR](A)为β-D-氧基-LNA腺嘌呤核苷[LR]([5meC])为β-D-氧基-LNA 5-甲基胞嘧啶核苷[dR](G)为DNA鸟嘌呤核苷[dR](T)为DNA胸腺嘧啶核苷[dR](A)为DNA腺嘌呤核苷[dR](C)为DNA胞嘧啶核苷

Claims (46)

1.一种反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的长度为8至40个核苷酸并且包含长度为至少8个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与经转录的人CFP-ELK1基因间区域互补。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与所述反义寡核苷酸的长度相同。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与所述经转录的人ELK1-CFP基因间区域至少75％互补。

5.根据权利要求4所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与所述经转录的人ELK1-CFP基因间区域至少80％、至少85％、至少90％或至少95％互补。

6.根据权利要求5所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与所述经转录的人ELK1-CFP基因间区域完全互补。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述经转录的人ELK1-CFP基因间区域包含SEQ ID NO 1或其片段。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述经转录的人ELK1-CFP基因间区域由SEQ ID NO 1或其片段组成。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述经转录的人ELK1-CFP基因间区域为SEQ ID NO 1或其片段。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述片段的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述经转录的人ELK1-CFP基因间区域在人ELK1-CFP前体mRNA转录物内。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列或其片段互补：SEQID NO 95、SEQ ID NO 96、SEQ ID NO 97、SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 100、SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQID NO103、SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105、SEQ ID NO 106、SEQ ID NO 107、SEQ ID NO 108、SEQID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 111、SEQ ID NO 112、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116、SEQ ID NO 117、SEQID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO125、SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 129、SEQ ID NO 130、SEQID NO 131、SEQ ID NO 132、SEQID NO 133、SEQ ID NO 134、SEQ ID NO 135、SEQ ID NO136、SEQ ID NO 137、SEQ ID NO 138、SEQ ID NO 139、SEQ ID NO 140、SEQ ID NO 141、SEQID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQ ID NO 144、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 146、SEQ ID NO147、SEQID NO 148、SEQ ID NO 149、SEQ ID NO 150、SEQ ID NO 151、SEQ ID NO 152、SEQID NO 153、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 155、SEQ ID NO 156、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQID NO 163、SEQID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO169、SEQ ID NO 170、SEQ ID NO 171、SEQ ID NO 172、SEQ ID NO 173、SEQ ID NO 174、SEQID NO 175、SEQ ID NO 176、SEQ ID NO 177、SEQID NO 178、SEQ ID NO 179、SEQ ID NO180、SEQ ID NO 181、SEQ ID NO 182、SEQ ID NO 183、SEQ ID NO 184、SEQ ID NO 185、SEQID NO 186和SEQ ID NO 187。

13.根据权利要求12所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列或其片段互补：SEQ ID NO 98、SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO105、SEQ ID NO 107、SEQ ID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO 115、SEQID NO 116、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 118、SEQID NO 119、SEQ ID NO 120、SEQ ID NO121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO 125、SEQ ID NO 126、SEQID NO 127、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 129、SEQ ID NO 130、SEQ ID NO 131、SEQ ID NO132、SEQ ID NO 133、SEQID NO 134、SEQ ID NO 135、SEQ ID NO 138、SEQ ID NO 139、SEQID NO 140、SEQ ID NO 141、SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQ ID NO 144、SEQ ID NO145、SEQ ID NO 146、SEQ ID NO 147、SEQ ID NO 148、SEQ ID NO 149、SEQ ID NO 150、SEQID NO 151、SEQ ID NO 152、SEQ ID NO 153、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 155、SEQ IDNO 156、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO 158、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQID NO 167、SEQ IDNO 168、SEQ ID NO 169、SEQ ID NO 170、SEQ ID NO 171、SEQ ID NO 172、SEQ ID NO 173、SEQ ID NO 174、SEQ ID NO 178、SEQ ID NO 179、SEQ ID NO 182、SEQ ID NO 183、SEQ IDNO 185、SEQ ID NO 186和SEQ ID NO 187。

14.根据权利要求13所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列或其片段互补：SEQ ID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQ ID NO 124、SEQ IDNO 126、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 132、SEQ ID NO 141、SEQ ID NO 142、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO 159、SEQID NO 160、SEQ ID NO 161、SEQ IDNO 162、SEQ ID NO 163、SEQ ID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO 169和SEQ ID NO 172。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述片段的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸是单链的。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或其至少10个连续核苷酸：SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ IDNO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ IDNO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ IDNO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ IDNO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ IDNO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ IDNO 41、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ IDNO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 52、SEQ IDNO 53、SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 55、SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58、SEQ IDNO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ IDNO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ IDNO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ IDNO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 79、SEQ ID NO 80、SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 82、SEQ IDNO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 86、SEQ ID NO 87、SEQ ID NO 88、SEQ IDNO 89、SEQ ID NO90、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO 92、SEQ ID NO 93和SEQ ID NO 94。

18.根据权利要求17所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或其至少10个连续核苷酸：SEQID NO 5、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQID NO 12、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 20、SEQ ID NO 22、SEQID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQID NO 41、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQID NO 49、SEQ ID NO 50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 54、SEQID NO 55、SEQ ID NO 56、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQID NO 61、SEQ ID NO 62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQID NO 74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 79、SEQID NO 80、SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO 89、SEQ ID NO 90、SEQID NO 92、SEQ ID NO 93和SEQ ID NO 94。

19.根据权利要求18所述的反义寡核苷酸，其中所述连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或其至少10个连续核苷酸：SEQID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO52、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO 68、SEQ ID NO69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76和SEQ IDNO 79。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的反义寡核苷酸，其包含一个或多个经修饰的核苷。

21.根据权利要求20所述的反义寡核苷酸，其中所述一个或多个经修饰的核苷独立地选自2'-O-甲基-RNA和LNA核苷。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸在5'端包含任意数量的LNA。

23.根据权利要求20或权利要求21所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸在3'端包含任意数量的LNA。

24.根据权利要求20或权利要求21所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸在5'端包含任意数量的LNA并且在3'端包含任意数量的LNA。

25.根据权利要求1至24中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸能够募集RNA酶H1。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为间隔聚体。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间键。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述经修饰的核苷间键中的一者或多者或全部包括硫代磷酸酯键。

29.根据权利要求28所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸内存在的全部所述核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的反义寡核苷酸，其中与对照相比，所述反义寡核苷酸能够使细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

31.根据权利要求30所述的反义寡核苷酸，其中所述对照为尚未暴露于所述反义寡核苷酸的细胞。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸共价附接到至少一个缀合物部分。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸呈药用盐的形式。

34.根据权利要求33所述的反义寡核苷酸，其中所述盐为钠盐或钾盐。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸封装在基于脂质的递送媒介物中、共价连接至或封装在树枝状聚合物中、或缀合至适体。

36.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至35中任一项所述的反义寡核苷酸以及药用的稀释剂、载体、盐和/或辅助剂。

37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含水性稀释剂或溶剂，诸如磷酸盐缓冲盐水。

38.一种用于降低靶细胞中ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平的体内或体外方法，所述方法包括将所述细胞暴露于有效量的根据权利要求1至31中任一项所述的反义寡核苷酸或者根据权利要求36或权利要求37所述的药物组合物。

39.根据权利要求37所述的方法，其中所述细胞为人细胞或哺乳动物细胞。

40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中与对照相比，人ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述对照为尚未暴露于所述反义寡核苷酸的细胞。

42.一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向患有或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防有效量的根据权利要求1至35中任一项所述的反义寡核苷酸或者根据权利要求36或权利要求37所述的药物组合物。

43.根据权利要求1至35中任一项所述的反义寡核苷酸或者根据权利要求36或权利要求37所述的药物组合物，其作为用于治疗或预防受试者的疾病的药物使用。

44.根据权利要求1至35中任一项所述的反义寡核苷酸或者根据权利要求36或权利要求37所述的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防受试者的疾病。

45.根据权利要求42所述的方法、根据权利要求43所述使用的反义寡核苷酸或药物组合物或者根据权利要求44所述的用途，其中所述疾病与人ELK1-CFP前体mRNA转录物的水平增加相关联。

46.根据权利要求42所述的方法、根据权利要求44所述使用的反义寡核苷酸或药物组合物或者根据权利要求45所述的用途，其中所述疾病为肌萎缩性侧索硬化症(ALS)。