CN119119270B - 一种抗Human CD24单克隆抗体、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗Human CD24单克隆抗体、其制备方法及其应用。本发明提供的Human CD24单克隆抗体的开发方法，避免了杂交瘤技术、噬菌体展示技术的缺点，缩短了目的抗体的开发耗时，制备得到的抗Human CD24单克隆抗体亲和力强，在分子、细胞层面均有良好的抗原抗体结合活性。

Description

一种抗Human CD24单克隆抗体、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种抗Human CD24单克隆抗体、其制备方法及其应用。

背景技术

CD24是一种高度糖基化的蛋白质，通过糖基-磷脂酰肌醇与质膜相连，主要在免疫细胞上表达，比如B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等。正常情况下，CD24可以促进B细胞的增殖和分化，也可以调节T细胞的活化和效应功能。此外，CD24在信号传导中也发挥着作用，主要由于其定位在脂筏上。有报道称，CD24的表达有可能影响了其它脂筏相关蛋白的功能或定位，例如CXCR4受体和β1-整合素，并且与Src激酶家族存在着相互作用。此外，研究人员检测到一些肿瘤细胞过表达CD24蛋白，如宫颈癌、胆管癌、结直肠和胃癌等。在肿瘤细胞中，CD24也参与信号传递，这对于细胞的粘附、迁移和分化等功能至关重要。例如，CD24与P-选择素相互作用可能有助于乳腺癌细胞在内皮细胞上的滚动和与血小板的粘附，并促进卵巢癌细胞与间皮的粘附，从而增强肿瘤细胞的扩散。并且，卵巢癌、三阴性乳腺癌等细胞表面的CD24通过与巨噬细胞上的Siglec-10结合具有抑制巨噬细胞吞噬的作用，从而实现免疫逃逸。囊泡的释放在肿瘤细胞上十分活跃。研究表明，在卵巢癌和乳腺癌的患者血清中检测到CD24阳性囊泡。

因此，在医学诊断中有可能通过CD24实现对肿瘤的检测。现有诊断检测试剂盒的核心试剂抗体不能自己生产，价格高，且质量和稳定性无法得到保障；有的试剂盒还受限于使用多克隆抗体，多抗供量有限且批间差异大，导致试剂盒质量不稳定，影响检测效果。如果开发一种高亲和力的抗Human CD24单克隆抗体，可以为研究CD24在肿瘤细胞中的作用甚至是诊断提供支持。

开发抗Human CD24单克隆抗体的方法中，最早以杂交瘤技术为主，也是应用最普遍的单克隆抗体开发平台，但是其耗时长且细胞融合效率低，并且可应用的物种有限。噬菌体展示技术虽然缩短了抗体开发时长，但由于不能保证轻重链的天然配对而影响了抗体的特异性、亲和力。

鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高亲和力的抗Human CD24单克隆抗体、制备方法及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

在本发明的第一方面，提供了一种抗Human CD24单克隆抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；

CDR-H1的氨基酸序列：NTYMH(SEQ ID NO:1)；

CDR-H2的氨基酸序列：RIDPANGNTKYAPKFQG(SEQ ID NO:2)；

CDR-H3的氨基酸序列：EDLKTYYAMDY(SEQ ID NO:3)；

优选地，所述的重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列相同或具有至少90％序列同一性。

所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

EVQLQQSVAELVRPGASVNLSCTASGFNIKNTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYAPKFQ GKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAIYYCAREDLKTYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)

在本发明的第二方面，提供了一种抗Human CD24单克隆抗体的重链，所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。

在本发明的第三方面，提供了一种抗Human CD24单克隆抗体的轻链可变区，所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3；

CDR-L1的氨基酸序列：RASESVSIHGTHLMH(SEQ ID NO:4)；

CDR-L2的氨基酸序列：AASNLES(SEQ ID NO:5)；

CDR-L3的氨基酸序列：QQSIEDPRT(SEQ ID NO:6)；

优选地，所述的轻链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列相同或具有至少90％序列同一性。

所述的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVSIHGTHLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGVPAR FSGSGSETDFTLNIHPVEEEDAATYFCQQSIEDPRTFGGGTKLEIK。(SEQ ID NO:8)

在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。

在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有如本发明第一方面所述的重链可变区，和/或如本发明第三方面所述的轻链可变区。

在另一优选例中，所述抗体具有如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗Human CD24抗体的抗体。

在本发明的第六方面，提供了一种多核苷酸，它的编码选自如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体。

在本发明的第七方面，提供了一种载体，它含有如本发明第六方面所述的多核苷酸。

在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，它含有如本发明第七方面所述的载体或本发明第六方面所述的多核苷酸。

在本发明的第九方面，提供了一种抗Human CD24单克隆抗体的制备方法，具体制备过程如下：

S1.依据Human CD24的蛋白序列信息(Genbank：P25063)，在其C端连接Human Fc-tag，表达Human CD24/hFc Protein蛋白；

S2.用步骤S1获得的Human CD24/hFc Protein结合水溶性佐剂对小鼠进行快速免疫后，提取小鼠脾脏和骨髓细胞；

S3.以步骤S2获得的小鼠细胞为原材料，通过流式分选细胞仪进行阳性细胞分选，经过单细胞建库系统，构建抗体文库并进行二代测序；

S4.筛选步骤S3获得的抗体序列，提取轻重链天然配对的抗体序列，并克隆至载体中；

S5.通过哺乳动物细胞高通量表达系统诱导抗Human CD24抗体高通量表达，获得抗Human CD24的单克隆抗体；

S6.进行抗原结合实验和抗原抗体亲和力验证。

在另一优选例中，本发明所述抗原结合检测为ELISA方法；所述抗原抗体亲和力检测为SPR方法。

在本发明的第十方面，提供了如本发明第五方面所述的抗Human CD24单克隆抗体在制备Human CD24蛋白检测试剂中的应用。

在本发明的第十一方面，提供了如本发明第五方面所述的抗Human CD24单克隆抗体在制备与Human CD24蛋白结合的产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的技术效果如下：本发明提供的单克隆抗体开发方法具有耗时短、通量高、阳性率高等优点，获得的单克隆抗体具有抗原结合活性好和亲和力强等优点。本发明以单个B细胞作为研究主体，利用流式细胞术分选出阳性细胞，采用单细胞抗体建库方法，保持了抗体轻重链的天然配对，并替代了效率低、耗时长且易受污染的杂交瘤细胞融合与培养。

附图说明

图1显示了本发明不同稀释度下的小鼠血清效价检测结果；

图2显示了流式细胞分选仪分选表达阳性抗体的细胞的检测结果；

图3显示了本发明抗原结合试验中能表现抗体的抗原结合活性的ELISA实验结果图；

图4显示了本发明抗原抗体亲和力检测中SPR实验结果图，其中a为阳性对照的亲和力检测结果，b为Ab1的亲和力检测结果，c为Ab2的亲和力检测结果，d为Ab3的亲和力检测结果，e为Ab4的亲和力检测结果，f为Ab5的亲和力检测结果，g为Ab6的亲和力检测结果，h为Ab7的亲和力检测结果，i为Ab8的亲和力检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。

本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本发明的抗Human CD24单克隆抗体的开发方法，包括如下过程：

S1、抗原修饰

依据Human CD24的蛋白序列和基因序列信息(Genbank：P25063)，表达抗原并在其C端连接human Fc-tag，获得经修饰的Human CD24/hFc蛋白，用于后续小鼠免疫。

S2、标记抗原

利用AlexaFluor 488抗体标记试剂盒(购自Thermo Fisher，货号A20181)对HumanCD24/hFc蛋白进行AF488荧光标记，得到的标记抗原AF488-Human CD24/hFc蛋白，用于后续的小鼠的细胞筛选。

S3、免疫小鼠

用步骤S1获得的Human CD24/hFc蛋白加水溶性佐剂对小鼠进行快速免疫，具体操作步骤为：

(1)初次免疫：用水溶性佐剂与Human CD24/hFc蛋白混合后，腹腔及皮下注射小鼠；

(2)二次免疫：在第10天再次用Human CD24/hFc蛋白进行第2次免疫，3天后采血检测Anti-Human CD24/hFc血清效价；

S4、ELISA检测血清效价，检测过程如下：

(1)酶标板包被5μg/mL的Human CD24/hFc蛋白，37℃孵育2h；

(2)0.05％PBST清洗，用1％BSA室温封闭2h；0.05％PBST清洗，分别加入3倍梯度稀释的小鼠免疫前后的血清，首孔为1000倍稀释，室温孵育1h；

(3)0.05％PBST清洗，加入Goat Anti-mouse IgG(Fc specific)HRP(购自Sigma公司，货号A0168)，室温孵育30min；0.05％PBST清洗；

(4)加入碧云天TMB显色液，室温反应10min，而后加入碧云天TMB终止液立即终止反应，即刻读取OD450。

二次免疫后的抗血清效价为27,000，小鼠血清效价检测结果如图1所示。显示实施例1中步骤S1制备的抗原可诱导小鼠产生特异性针对Human CD24/hFc蛋白的高滴度抗血清。

S5、血清效价合格后收集小鼠脾脏和骨髓细胞：

收集免疫小鼠的脾脏和骨髓细胞，400g离心5min，加入1mL红细胞裂解缓冲液重悬，冰上裂解1min，大体积Macs buffer终止裂红，400g离心5min，用1mLMacs buffer重悬，加入步骤S2得到的标记抗原AF488-Human CD24/hFc蛋白以及B细胞特异性分子标志物的荧光抗体，4℃孵育1h，大体积Macs buffer重悬，400g离心5min，弃上清，buffer重悬细胞，用流式细胞分选仪进行抗原阳性细胞分选。

流式检测结果如图2所示；抗原阳性细胞比例约为1.18％。

S6、小鼠阳性单细胞建库，过程如下：

(1)利用单细胞建库平台对分选得到的阳性小鼠细胞进行建库，通过油包水技术生成含单个小鼠阳性细胞的油滴，并在油滴内完成细胞的裂解、mRNA的捕获、反转录，对携带有细胞标签barcode的反转录产物进行cDNA预扩增、抗体VDJ基因扩增，在打断后连接上接头及文库标签，得到抗体文库，通过二代测序及数据分析获得轻重链天然配对的抗体；

(2)根据频率挑选8条抗体序列，依托哺乳动物高通量抗体表达平台表达并纯化得到8个抗体，分别为Ab1～Ab8。

实施例2

抗原结合试验：通过ELISA检测8个抗体的抗原结合活性，具体步骤如下：

(1)酶标板包被2μg/mL的Human CD24/hFc蛋白，4℃过夜；

(2)0.05％PBST清洗，用1％BSA室温封闭2h；

(3)0.05％PBST清洗，分别加入5倍梯度稀释的8个抗体、Anti-HEL Human IgG1-Kappa Isotype、阳性对照，室温孵育1h；

(4)0.05％PBST清洗，加入Anti-human IgG(Fc specific)HRP(购自Sigma公司，货号A0170)，室温孵育30min；0.05％PBST清洗，加入碧云天TMB显色液，室温反应10min，而后加入碧云天TMB终止液立即终止反应，即刻读取OD450。

抗原结合试验检测结果如图3所示：8个抗体的阳性率为100％(8/8)。

实施例3

抗原抗体亲和力检测试验：通过SPR检测8个抗体的亲和力，具体步骤如下：

(1)用0.1M MES pH 5.5(购自Carterra公司，货号CAT3625)将抗体稀释至50μg/mL，通过NHS/EDC氨基偶联到HC200M芯片(购自Carterra公司，货号CAT4287)表面，NHS/EDC活化15min，偶联20min，用1M Ethanolamine封闭8min，捕获高度大约2000RU；

(2)仪器运行buffer置换成10xHBSTE buffer(购自Carterra公司，货号CAT3630)，单通道注射抗原2000nM，3倍梯度稀释，11个浓度作为分析物，每一个浓度的抗原结合180s，解离300s，10mM Glycine HCL(购自Carterra公司，货号CAT3640),pH 2.0再生20s/3次；

(3)设置7个缓冲buffer循环和11个抗原浓度循环；

(4)运行结束后，打开Carterra LSA分析软件进行数据分析。

抗原抗体亲和力检测结果如图4所示：Ab1的KD(M)值为8.25E-10，与KD值为8.95E-10的阳性抗体Anti-Human CD24(克隆号为ATG-031)接近，具有亲和力强的优点。

编号为Ab1的抗human CD24单克隆抗体序列如下表所示：

最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1. 一种抗Human CD24单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括以下三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3；

CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述抗体的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3；

CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的重链可变区氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列相同或具有至少90%序列同一性；所述的轻链可变区氨基酸序列与SEQ IDNO:8所示氨基酸序列相同或具有至少90%序列同一性。

3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自如权利要求1-2任意一项所述的抗体。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体或权利要求3所述的多核苷酸。

6.如权利要求1-2任意一项所述抗Human CD24单克隆抗体在制备Human CD24蛋白检测试剂中的应用。