CN117285637B - 一种抗独特型抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及抗体药物领域，特别涉及一种抗独特型抗体及其应用。本申请提供一种抗独特型抗体，适于特异性结合抗RANKL抗体或其衍生物，所述抗独特型抗体包括重链可变区与轻链可变区，其中，重链可变区包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:1‑3的重链可变区的CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3，轻链可变区包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:4‑6的轻链可变区的CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3。本申请的抗独特型抗体具有抗RANKL抗体高结合力和高特异性，可用于检测样本中抗RANKL抗体药物的含量，从而在抗RANKL抗体类药物的药代动力学和药效学分析中起着重要作用。

Description

一种抗独特型抗体及其应用

技术领域

本申请涉及抗体药物领域，特别涉及一种抗独特型抗体及其应用。

背景技术

NF kappa-B配体(RANKL)的受体激活剂，也称为骨保护素配体(OPGL)和肿瘤坏死因子配体超家族成员11(TNFSF11)，是TNF超家族的成员(Anderson DM,et.al,Nature 390(6656):175-179)。RANKL可以在细胞表面以可溶形式表达(Findlay DM,et.al,OsteoporosInt 22(10):2597-2602)。通过与破骨细胞及其前体上的受体RANK结合，介导破骨细胞的形成、活化和存活(Hsu H,et.al,Proc Natl Acad Sci U S A.1999Mar 30；96(7):3540-2545)。越来越多的证据也表明，肿瘤细胞在骨内相互作用，刺激RANK-RANKL系统的受体激活剂，导致癌症诱发的骨质破坏(Roodman GD,N Engl J Med 2004；350:1655-1664)。

早期动物研究证明了RANKL作为治疗破骨细胞介导的骨丢失的治疗靶标的潜力(Lacey DL,et.al,Cell.1998；93:165-176；Ann E.Kearns,et.al,Endocrine Reviews 29(2):155-192)。使用OPG Fc融合蛋白(一种内源性RNAKL抑制剂)的动物研究和临床试验提供了RANKL在骨重建中至关重要的有力证据(Ann E.Kearns,et.al,Endocrine Reviews 29(2):155-192；Bekker PJ,J Bone Miner Res.2001；16:348-360)。

抗独特型抗体是指针对抗体分子可变区上特异抗原表位群（独特型）的抗体，能够特异性识别并结合另一抗体独特位点。抗独特型抗体是抗体类药物开发过程主要工具试剂之一，主要用于：1）抗独特型抗体因为特异性结合表位不同，可用于检测血液中各种类型抗体药物的含量（游离型、结合型和总量），从而在抗体类药物的药代动力学（PK）和药效学（PD）分析中起着重要作用；2）抗独特型抗体作为抗药抗体（ADA）检测的阳性对照，在免疫原性评估中也发挥着重要作用。

因此，需要开发针对RANKL抗体的高结合力和高特异性的抗独特型抗体，以应用于抗体类药物开发和免疫原性评估等方面。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种抗独特型抗体及其应用，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种抗独特型抗体，适于特异性结合抗RANKL抗体或其衍生物，抗独特型抗体包括重链可变区与轻链可变区，其中，重链可变区包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:1-3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:4-6的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。

氨基酸序列具体如下：

CDR-H1：DSSMK（SEQ ID No:1）

CDR-H2：DINQNNGDSFKNQKFKD（SEQ ID No:2）

CDR-H3：EQYGSIYVEYSWFAY（SEQ ID No:3）

CDR-L1：KAMQNVDTSVA（SEQ ID No:4）

CDR-L2：SASYQRS（SEQ ID No:5）

CDR-L3：QQYKVYPFT（SEQ ID No:6）。

“抗独特型抗体”是指，特异性地识别/结合用于制备它们的抗体的独特型的抗体(即，以用于制备它们的抗体的可变区的独特型作为抗原表位)，其能够模拟/重建用于制备它们的抗体所识别的抗原表位。本申请的抗独特型抗体为抗RANKL单抗的抗独特型抗体，可以识别抗RANKL单克隆抗体分子可变区上特异抗原表位，对RANKL单克隆抗体具有高结合力和高特异性。“亲和力”或“亲和性”是指免疫球蛋白分子(即，抗体)或其片段与抗原之间非共价相互作用的强度。“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在蛋白，例如本发明抗独特型抗体与抗RANKL抗体蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。

本申请提供的抗独特型抗体中，重链可变区还包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:7-10的框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4，具体序列如下所示：

HFR1：EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT（SEQ ID No:7）

HFR2：WVRQSHGKSLEWIG（SEQ ID No:8）

HFR3：RATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCSR（SEQ ID No:9）

HFR4：WGQGTLVTVSA（SEQ ID No:10）。

本申请提供的抗独特型抗体中，轻链可变区还包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:11-14的框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，具体序列如下所示：

LFR1：DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC（SEQ ID No:11）

LFR2：WYQQKPGQSPKTLIY（SEQ ID No:12）

LFR3：GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC（SEQ ID No:13）

LFR4：FGSGTKLEIK（SEQ ID No:14）。

本申请提供的抗独特型抗体中，抗独特型抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQID No:15所示；抗独特型抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示。具体序列如下：

重链可变区如下，其中CDR区以加粗表示：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDSSMKWVRQSHGKSLEWIGDINQNNGDSFKNQKFKDRATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCSREQYGSIYVEYSWFAYWGQGTLVTVSA（SEQ ID No:15）；

轻链可变区如下，其中CDR区以加粗表示：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKAMQNVDTSVAWYQQKPGQSPKTLIYSASYQRSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYKVYPFTFGSGTKLEIK（SEQ ID No:16）。

本申请提供的抗独特型抗体中，重链的氨基酸序列包括SEQ ID No:17所示的序列，重链可变区以下划线示出，CDR区以加粗示出，具体序列如下：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDSSMKWVRQSHGKSLEWIGDINQNNGDSFKNQKFKDRA TLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCSREQYGSIYVEYSWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（SEQ ID No:17）。

本申请提供的抗独特型抗体中，轻链的氨基酸序列包括SEQ ID No:18所示的序列，轻链可变区以下划线示出，CDR区以加粗示出，具体序列如下：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKAMQNVDTSVAWYQQKPGQSPKTLIYSASYQRSGVPDRFTGSGSG TDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYKVYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ IDNo:18）。

本申请提供的抗独特型抗体中，抗独特型抗体为全长抗体、Fab片段、F（ab）₂片段、Fv片段、scFv片段或单域抗体。在本申请一具体实施例中，抗独特型抗体为全长抗体。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。

本申请提供的抗独特型抗体中，抗独特型抗体为阻断型抗体。阻断型抗体是指与目的蛋白结合直接影响蛋白的功能的抗体，如阻断粘附蛋白与受体配体的结合。本申请的阻断型抗体可以识别抗RANKL抗体，不识别对照human IgG，可以阻断抗RANKL抗体与RANKL的结合，因此认为是阻断型抗体。

本申请提供的抗独特型抗体为抗原阻断性抗体，可以特异性结合抗RANKL抗体及其衍生物，并阻断抗RANKL抗体及其衍生物与RANKL的结合。抗RANKL抗体及其衍生物可以特异性结合RANKL，从而阻止RANKL与RANK的相互作用。抗RANKL抗体例如可以为地舒单抗。地舒单抗是一种全人源单克隆抗体，可用于人体治疗的RANKL抑制剂。抗RANKL抗体衍生物例如可以为抗体偶联药物( antibody-drug conjugate，ADC)。ADC是将单克隆抗体药物的高特异性和小分子细胞毒药物的高活性相结合，用以提高肿瘤药物的靶向性、减少毒副作用。

本申请第二方面提供一种用于检测样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的方法，包括：

(a) 在足以使前述的抗独特型抗体与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物形成免疫复合物的条件下，使样品接触前述的抗独特型抗体；

(b) 检测所述免疫复合物的存在，免疫复合物存在则表明所述样品中存在抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物。

本申请提供的检测样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的方法可以为疾病诊断或治疗方法，也可以为非疾病诊断或治疗的方法，具体地，例如可以用于抗RANKL抗体耐药性检测、抗RANKL抗体药物免疫原性评估、药物筛选、药物评价等方面。

本申请提供的方法中，步骤(a)中，抗原和相应抗体结合形成的物质称为免疫复合物。

步骤(a)中，使抗独特型抗体或抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物直接或间接固定化至固相支持物。在一些实施方式中，固相支持物选自醋酸纤维膜、试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔和微球。

步骤(b)中，检测是用已知的抗独特型抗体和样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明样品中有相应的抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物存在。基于对于样品进行检测，可以对抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物进行临床前药代分析，例如抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物在体内的吸收、分布和转运。对样品进行定量检测时，反应中加入的抗独特型抗体的浓度与形成免疫复合物的浓度呈函数关系，可以是根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的含量：在一定的反应条件下，加入的抗独特型抗体的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物量成正比。抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的量可经由检测标记物的量而确定。可用实验性标准曲线推算出样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测。因此可以对抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物进行药代动力学分析，例如在体内药物浓度随时间变化的规律。

本申请提供的方法中，步骤(b)中，检测免疫复合物的存在是如下的方法实现：

i. 经由直接或间接连接到抗独特型抗体的可检测标记物实现；

ii. 经由结合抗独特型抗体或抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的其他试剂实现，其他试剂直接或间接连接有可检测标记物；

iii. 经由另一种前述的抗独特型抗体实现，另一种抗独特型抗体直接或间接连接有可检测标记物且识别另外的独特型；

iv. 经由另外加入的抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物实现，另外加入的抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物直接或间接连接有可检测标记物。

在一些实施方式中，i.是指当抗独特型抗体与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合形成免疫复合物时，由于抗独特型抗体直接或间接带有的可检测标记物，可以通过可检测标记物的检测，识别出免疫复合物的存在。

在一些实施方式中，ii.中的其他试剂例如可以为二抗，二抗与抗独特型抗体同源，与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物不同源，因此可以与抗独特型抗体结合，不与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合。二抗作为检测抗体，可用于检测抗独特型抗体与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的结合，若结合产生免疫复合物，那么二抗带有的可检测标记物可以识别出来，若抗独特型抗体与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物没有结合，那么二抗无法检测出免疫复合物的存在。

在一些实施方式中，iii.和iv.例如可以为双抗夹心法。

iii.中双抗夹心法的原理是将抗独特型抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和样品中的相应抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合形成免疫复合物，洗涤后再另外加入抗独特型抗体，另外加入的抗独特型抗体直接或间接连接有可检测标记物，与免疫复合物结合形成抗独特型抗体-抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物-抗独特型抗体复合物，加底物显色，判断样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的情况。

iv.中双抗夹心法的原理是将抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合到固相载体上形成固相抗体，然后和抗独特型抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再另外加入抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物，另外加入的抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物直接或间接连接有可检测标记物，与免疫复合物结合形成抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物-抗独特型抗体-抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物复合物，加底物显色，判断抗独特型抗体的情况。

在一些实施方式中，可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物、报告基因、定位信号等。具体地，可检测标记物包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测方法例如ELISA(酶联免疫吸附测定法)和免疫荧光技术、免疫放射技术、免疫酶技术和免疫胶体金技术、免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测方法，合适的标记为本领域技术人员所熟知。

本申请第三方面提供分离的核苷酸分子，编码前述的抗独特型抗体。本申请的抗独特型抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可以将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成抗独特型抗体。

本申请第四方面提供一种载体，含有前述的分离的核苷酸分子。“载体”指在引入合适的宿主细胞中时可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。本发明中的载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。

本申请第五方面提供一种宿主细胞，含有前述的载体或基因组中整合有前述的分离的核苷酸分子。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

本申请第六方面提供一种试剂盒，包括前述的抗独特型抗体、前述的分离的核苷酸分子、前述的载体、或前述的宿主细胞。

本申请提供的试剂盒中，试剂盒为抗RANKL抗体检测试盒或抗RANKL抗体免疫原性检测试剂盒。试剂盒中含有的抗独特型抗体可与抗RANKL抗体结合，因此抗RANKL抗体检测试盒用于直接检测抗RANKL抗体，抗RANKL抗体免疫原性检测试剂盒用于作为检测抗RANKL抗体的阳性对照。

本申请的试剂盒可以是胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。该试剂盒将其中包含的抗独特型抗体、分离的核苷酸分子、载体、宿主细胞、或组合物直接使用即可。同时，试剂盒中还可以包括检测所必需的常规缓冲液、洗涤液、包被液等试剂。

本申请第七方面提供前述的抗独特型抗体、前述的分离的核苷酸分子、前述的载体、前述的宿主细胞、或前述的试剂盒在制备抗RANKL抗体检测产品、抗RANKL抗体耐药性检测产品的阳性对照、抗RANKL抗体药物免疫原性检测产品的阳性对照或抗RANKL抗体中和抗体的阳性对照中的用途。

本申请提供的用途中，抗RANKL抗体检测产品用于抗RANKL抗体或其衍生物的定性或定量分析。进一步地，抗RANKL抗体检测产品为：抗体药物药代动力学分析或药效学分析产品。

抗RANKL抗体衍生物可以是指抗RANKL抗体上修饰有官能团，其具有与未修饰的抗体相近的抗原特异性识别能力与结合能力或者更高的反应活性。用于修饰的官能团包括但不限于荧光染料、药物、造影剂、桥联分子、聚乙二醇、糖类、脂类、核酸、蛋白质、肽、肽类似物和金属螯合剂。所述抗RANKL抗体衍生物也可以是与其他抗体偶联形成的双特异或多特异抗体。

药物代谢动力学(pharmacokinetics)简称药代动力学，主要研究机体对药物的处置(Dispostion) 的动态变化。包括药物在机体内的吸收、分布、生化转换(或称代谢) 及排泄的过程，特别是血药浓度随时间变化的规律。药物的代谢与人的年龄、性别、个体差异和遗传因素等有关。药效学和药代动力学有着共同的影响因素，例如剂量、药物益处和不良反应。药效学特别强调剂量对应的反应关系，即药物浓度与其对应的生物的影响（无论是阴性还是阳性）之间的关系。本发明的抗独特型抗体可以用于检测抗RANKL抗体在药物药代动力学分析试验及药物药效学分析中抗RANKL抗体的变化规律及代谢情况。

抗RANKL抗体耐药性的产生的一种可能的机理是由于机体含有对抗RANKL抗体的抗体，进而阻止了抗RANKL抗体与RANKL的结合或者加速了抗RANKL抗体的体内清除速度，最终影响了药效。抗RANKL抗体耐药性的检测产品是用来检测抗RANKL抗体的抗体，本申请的抗独特型抗体可以高特异性地结合抗RANKL抗体并阻断其与RANKL的结合，因此可以作为抗RANKL抗体耐药性的检测产品的阳性对照。

抗RANKL抗体中和抗体是指能与抗RANKL抗体结合，并阻断其抗原结合功能的抗体。本申请的抗独特型抗体可以与抗RANKL抗体结合，并阻断抗RANKL抗体与RANKL结合，因此可以作为抗RANKL抗体中和抗体检测的阳性对照。

本申请的抗独特型抗体、分离的核苷酸分子、载体、宿主细胞、或试剂盒可特异性结合RANKL抗体，因此能够作为检测RANKL抗体的结合剂的阳性对照。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：

1、本申请的抗独特型抗体具有抗RANKL抗体高结合力和高特异性，可用于检测样本中抗RANKL抗体药物的含量，从而在抗RANKL抗体类药物的药代动力学和药效学分析中起着重要作用。

2、本申请的抗独特型抗体性能测试良好，可以用作免疫原性ADA分析阳性对照，在免疫原性评估中发挥着重要作用。

3、本申请的抗独特型抗体作为靶点阻断型抗独特型抗体，该株靶点阻断型抗体可以用作抗RANKL单克隆抗体的中和抗体分析阳性对照。

附图说明

图1为抗RANKL人源化单抗定量检测的标准曲线图。

图2为抗独特型抗体ADA分析曲线图。

图3为抗独特型抗体中和抗体分析曲线图（配体结合分析）。

图4为抗独特型抗体中和抗体分析曲线图（细胞分析）。

具体实施方式

为了使本申请的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本申请，并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。

本申请的发明人经过大量探索研究，发现了一种抗独特型抗体及其应用，在此基础上完成了本申请。

下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

实施例1

抗独特型抗体的制备

1、动物免疫和抗体制备

胃蛋白酶（公司Sigma，货号P6887）酶切抗RANKL人源化单抗（即地舒单抗，迈威(上海)生物科技股份有限公司生产），去除抗体的Fc区域，制备得到F(ab)₂样品。将获得的F(ab)₂样品作为免疫动物的免疫原，对5只Balb/c小鼠进行免疫，每只免疫3次，每次周期为3周。免疫后的小鼠血清与相应的免疫原要有特异性结合，抗血清效价应在1:10,000以上。

选取免疫小鼠中效价最高的1-2只小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。扩增培养杂交瘤细胞，取上清以ELISA检测效价，并检测抗体亚型；选取针对抗RANKL人源化单抗呈阳性且针对无关人IgG呈阴性的细胞进行克隆。为保证杂交瘤细胞株的阳性率和抗体的稳定产生，进行3-4次克隆，每次克隆间隔1-2周，3-4次均为100%阳性克隆后，细胞扩大培养后接种到小鼠中制备腹水，获得抗独特型抗体。在克隆过程中通过间接ELISA方法检测杂交瘤上清的特异性，即上清中的鼠单抗仅结合抗RANKL人源化单抗，而不结合无关人IgG，最终获得1株独特性单克隆抗体（克隆号S-56-7），结果见表1。

表1. 杂交瘤上清特异性鉴定结果

2、靶点竞争性和非竞争性测试

对杂交瘤细胞所产生的1株抗体进行检测，满足以下条件：

1）靶点非阻断型抗体：以ELISA方法检测，识别抗RANKL抗体，不识别对照humanIgG，不能阻断抗RANKL抗体与RANKL的结合(ELISA板包被抗原，抗RANKL抗体与所制备的抗独特型抗体孵育后加入ELISA板，使用抗人IgG二抗进行检测，信号值与未加入抗独特型抗体孵育组（PBS组）相比没有降低)；

2）靶点阻断型抗体：以ELISA方法检测，识别抗RANKL抗体，不识别对照human IgG，可以阻断抗RANKL抗体与RANKL的结合(ELISA板包被抗原，抗RANKL抗体与所制备的抗独特型抗体孵育后加入ELISA板，使用抗人IgG二抗进行检测，信号值与未加入抗独特型抗体孵育组（PBS）相比有显著降低)。

结果如表2所示，通过比较加入抗体组与未加入抗体组OD值差异，判断抗独特型抗体的靶点阻断性。S-56-7为靶点阻断型抗体。

表2.靶点竞争性和非竞争性测试结果

实施例2

抗独特型抗体的测序

1、实验流程

扩大培养杂交瘤细胞，提取细胞总RNA，反转录获得cDNA。PCR扩增获得抗体的重链和轻链可变区基因，测序并进行序列的生物信息学分析，剔除非功能的抗体基因。抗体按照其来源的杂交瘤细胞克隆命名，重链和轻链的氨基酸序列如下所示。重链和轻链的可变区以下划线示出，根据KABAT命名系统定义的重链和轻链的CDR区（互补决定区）以加粗示出。

2、测序结果

S-56-7完整抗体序列

重链序列：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDSSMKWVRQSHGKSLEWIGDINQNNGDSFKNQKFKDRA TLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCSREQYGSIYVEYSWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（SEQ ID No:17）

轻链序列：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKAMQNVDTSVAWYQQKPGQSPKTLIYSASYQRSGVPDRFTGSGSG TDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYKVYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC*（SEQID No:18）

上述抗体可通过常规基因工程获得分离的单抗，例如合成上述抗体的基因，构建重组载体后，转染293细胞后重组表达，纯化后制备获得。

实施例3

Anti-RANKL抗体的抗独特型抗体在非临床和临床药物分析中的应用

一、抗独特型抗体在非临床药代中的应用

本实施例利用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，以食蟹猴血清药代分析为例，用靶点蛋白重组人RANKL胞外蛋白作为捕获试剂，用抗独特型抗体作为检测试剂，考察了本发明中的抗独特型抗体在非临床药代分析中的应用。

试验方法

包被与封闭：将重组人RANKL胞外蛋白（公司ACRO，货号RAL-H5240）用包被液稀释至2μg/mL，2~8℃过夜；将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，加入3% BSA/PBST，室温孵育2h；封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

标准曲线和质控品稀释：抗RANKL人源化单抗（江苏迈威康新药研发有限公司生产）用100%混合猴血清（pooled monkey serum，PMS）稀释制备标准曲线，浓度分别为：10000ng/ml（ULOQ，定量上限）、5000ng/ml、2500ng/ml、1250ng/ml、625ng/ml、312.5ng/ml、156.25ng/ml（LLOQ，定量下限）、78.12ng/ml（锚点）。空白对照（0ng/ml）作为标准曲线的一部分，但不参与标准曲线拟合。5个质控品浓度也是用100%混合猴血清制备，浓度为：10000ng/mL（ULOQ，定量上限）、8000ng/mL（HQC，高浓度质控）、2000ng/mL（MQC，中浓度质控）、400ng/mL（LQC，低浓度质控）、156.25ng/mL（LLOQ，定量下限）。

待测样品稀释和加样：将待测的猴血清样品、标准曲线样品和质控品分别用1%BSA/PBST预稀释50倍后，按照100μl/孔加入ELISA板中，设复孔，室温静置孵育2h。

加入检测抗体：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次；用1% BSA/PBST将抗原阻断型独特型抗体（S-56-7）稀释至2μg/ml后加入ELISA板，室温静置孵育1h。

加入检测二抗：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次；用1% BSA/PBST将山羊抗鼠IgG HRP标记二抗（Jackson ImmunoResearch，货号115-035-003）稀释20000倍后加入ELISA板，室温静置孵育1h。

显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次；将事先平衡至室温的TMB底物（KPL，货号5120-0047）加入ELISA板，室温避光孵育10min左右；加入1 M H₃PO₄终止反应。

读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

浓度计算：将标准曲线浓度与OD值进行四参数拟合，用拟合方程计算待测样品的药物浓度。

应用此方法检测猴血清中抗RANKL人源化单抗药物浓度，标准曲线如图1，抗原阻断型抗体（S-56-7）可以作为药代分析的检测抗体，且具有较高的方法检测灵敏度和信号响应值。用该抗体进行方法准确度和精密度考察，结果如表3所示，该抗体可以准确定量食蟹猴血清中的药物浓度。

表3 准确度和精密度（S-56-7）

二、抗独特型抗体在药物免疫原性ADA检测中的应用

治疗性蛋白药物的免疫反应可能会影响该药物的药代动力学、药效学、安全性和有效性。大多数药物的不良反应由体液免疫机制介导的免疫应答所致，抗药抗体（ADA）的检测是评估药物免疫原性的主要方法。本实施例主要考察了抗独特型抗体在免疫原性ADA检测中的应用。

试验步骤

包被与封闭：将抗RANKL人源化单抗（江苏迈威康新药研发有限公司生产）用包被液稀释至1μg/ml，2~8℃过夜；将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，加入3% BSA/PBST，室温孵育2h；封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

准备待测样品：将抗独特型抗体（S-56-7）用10% 混合猴血清（10% PMS）稀释至10μg/ml作为起始浓度，3倍梯度稀释共7个点，以10% PMS 作为0点。

加样：用EZ-LINK NHS-LC-LC-Biotin（Thermo，Cat#21343）按照说明书标记抗RANKL人源化单抗，得到抗RANKL抗体-Biotin，将其用1% BSA/PBST稀释至50ng/ml。将上述稀释好的抗独特型抗体样品和抗RANKL抗体-Biotin分别以50μl/孔加入ELISA板中，设复孔，室温孵育2 h。

加入SA-HRP：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将SA-HRP（SouthernBiotech，货号7105-05）用1% BSA/PBST按1:5000稀释后加入ELISA板，室温孵育1h。

显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将事先平衡至室温的TMB底物（KPL，货号5120-0047）加入ELISA板，室温避光孵育10min左右。加入1 M H₃PO₄终止反应。

读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

试验结果

结果如图2所示，S-56-7这个抗独特型抗体性能测试良好，信号值与抗体浓度呈现出良好的量效关系，可以用作ADA分析阳性对照。

三、抗独特型抗体在药物中和抗体检测中的应用

中和活性是指抗药抗体具有抑制药物生物学活性的能力。中和抗体可以阻断产品与其靶标或干扰受体/配体结合，干扰药物的体内活性。本实施例分别从基于非细胞的配体结合分析和基于细胞的中和活性分析评估抗独特型抗体的中和活性能力。

方法一：配体结合分析

包被与封闭：将重组人RANKL胞外蛋白（公司ACRO，货号RAL-H5240）用包被液稀释至1μg/mL，2~8℃过夜；将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，加入3% BSA/PBST，室温孵育2h；封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

准备待测样品：将抗独特型抗体（S-56-7）用10%混合猴血清（10% PMS）稀释至10μg/ml作为起始浓度，2倍梯度稀释共11个点，以10% PMS 作为0点。

加样：用EZ-LINK NHS-LC-LC-Biotin（Thermo，Cat#21343）按照说明书标记抗RANKL人源化单抗（江苏迈威康新药研发有限公司生产），得到抗RANKL抗体-Biotin，将其用1% BSA/PBST稀释至50 ng/ml。将上述稀释好的抗独特型抗体样品和抗RANKL抗体-Biotin分别以50μl/孔加入ELISA板中，设复孔，室温孵育2 h。

加入SA-HRP：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将SA-HRP（SouthernBiotech，货号7105-05）用1% BSA/PBST按1:5000稀释后加入ELISA板，室温孵育1h。

显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将事先平衡至室温的TMB底物（KPL，货号5120-0047）加入ELISA板，室温避光孵育10min左右。加入1 M H₃PO₄终止反应。

读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

试验结果

结果如图3和表4所示， S-56-7为靶点阻断型抗独特型抗体，可以浓度依赖性的阻断抗RANKL人源化单抗与RANKL蛋白的结合。因此，靶点阻断型抗体S-56-7可以用作抗RANKL人源化单抗中和抗体分析试验中的阳性对照。

表4抗独特型抗体中和抗体分析数据（配体结合）

方法二：细胞分析

细胞准备：

取1瓶转入RANK基因和NF-κB-RE和荧光素酶报告基因的细胞RANK-GloResponseNF-κB-RE-luc2P HEK293 Cell Line（MW03 RGA cell，江苏迈威康新药研发有限公司构建），收集细胞，调整细胞密度至10×10⁴个/ml，100 μl/孔接种于96孔白色细胞板，37℃，5%CO₂细胞培养箱培养过夜。此HEK293细胞表面过度表达RANKL的受体RANK蛋白，当RANKL与细胞表面的RANK结合时，将激活细胞内部的NF-κB信号通路，进而增加荧光素酶报告基因（luc2P）的表达，而荧光素酶表达的水平可以通过检测加入荧光素酶底物后的发光信号来实现。当抗RANKL人源化单抗加入时，阻断了RNAKL与RANK的结合，抑制了最终的信号；当加入S-56-7抗体时，可以阻断抗RANKL人源化单抗与RANKL的结合，进而恢复RNAKL与RANK的结合，最终的信号也能得到恢复。

样品稀释及孵育

将抗RANKL人源化单抗（江苏迈威康新药研发有限公司生产）和重组人RANKL胞外蛋白（公司ACRO，货号RAL-H5240）分别用含10%FBS的DMEM培养基稀释至50ng/ml和300ng/ml。用含10%FBS的DMEM培养基将抗独特型抗体稀释至5000ng/ml，然后再依次3倍稀释8个浓度梯度。取干净离心管，每管等体积加入稀释的抗独特型抗体和抗RANKL人源化单抗，混合均匀。

加样

将上述抗独特型抗体和抗RANKL人源化单抗混合液以50μl/孔加入前一天铺有细胞96孔白色细胞板中，再50 μl/孔向各孔板中加入稀释好的重组人RANKL胞外蛋白，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中，反应4~6h。

显色及读板

取出96孔白色细胞板，倒去板内培养基，50μl/孔加入Bright-Glo™ LuciferaseAssay System（公司Promega，货号E2620）工作液，室温避光反应5分钟；在Luminescence模式下，Intergration选择500（仪器默认值），读取RLU。

试验结果

结果如表5和图4所示，抗独特型抗体（S-56-7）能够阻断抗RANKL人源化抗体与RANKL的结合，随着抗独特型抗体浓度的增加，能够与RANKL结合的抗RANKL人源化抗体越低，因而与细胞上RANK结合的RANKL越多，RANK与RANKL结合后能够激活NF-κB信号通路，启动报告基因表达，发生荧光。因此，该株抗独特型抗体为靶点阻断型，可以用作中和抗体分析阳性对照。

表5抗独特型抗体中和抗体分析数据（细胞分析）

综上，本申请的特异性识别抗RANKL人源化单抗的抗独特型单抗，均一性好，结合力强，可广泛应用于药物研发领域，主要应用于抗体药物的免疫原性分析及药代动力学分析等。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。

Claims (16)

1.一种抗独特型抗体，适于特异性结合抗RANKL抗体，所述抗独特型抗体包括重链可变区与轻链可变区，其中，重链可变区包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:1-3的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，轻链可变区包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:4-6的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；所述抗RANKL抗体为地舒单抗。

2.如权利要求1所述的抗独特型抗体，其特征在于，所述重链可变区还包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:7-10的框架区HFR1、HFR2、HFR3和HFR4；

和/或，所述轻链可变区还包括氨基酸序列分别为SEQ ID No:11-14的框架区LFR1、LFR2、LFR3和LFR4。

3.如权利要求1所述的抗独特型抗体，其特征在于，所述抗独特型抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示。

4.如权利要求1所述的抗独特型抗体，其特征在于，所述抗独特型抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示；所述抗独特型抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。

5.如权利要求1所述的抗独特型抗体，其特征在于，所述抗独特型抗体为全长抗体、Fab片段、F(ab)₂片段、Fv片段或scFv片段。

6.如权利要求1所述的抗独特型抗体，其特征在于，所述抗独特型抗体为阻断型抗体。

7.一种用于检测样品中抗RANKL单克隆抗体药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)在足以使权利要求1～6中任一项所述的抗独特型抗体与抗RANKL单克隆抗体药物形成免疫复合物的条件下，使样品接触权利要求1至6中任一项所述的抗独特型抗体；

(b)检测所述免疫复合物的存在，所述免疫复合物存在则表明所述样品中存在所述抗RANKL单克隆抗体药物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，使所述抗独特型抗体或抗RANKL单克隆抗体药物直接或间接固定化至固相支持物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，检测所述免疫复合物的存在是采用如下的方法实现：

i.经由直接或间接连接到所述抗独特型抗体的可检测标记物实现；

ii.经由结合所述抗独特型抗体或所述抗RANKL单克隆抗体药物的二抗实现，所述二抗直接或间接连接有可检测标记物；

iii.经由另一种权利要求1～6中任一项所述的抗独特型抗体实现，所述另一种抗独特型抗体直接或间接连接有可检测标记物且识别另外的独特型；具体步骤为将抗独特型抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和样品中的相应抗RANKL单克隆抗体药物结合形成免疫复合物，洗涤后再另外加入抗独特型抗体，另外加入的抗独特型抗体直接或间接连接有可检测标记物，与免疫复合物结合形成抗独特型抗体-抗RANKL单克隆抗体药物-抗独特型抗体复合物，加底物显色，判断样品中抗RANKL单克隆抗体药物的情况；

iv.经由另外加入的所述抗RANKL单克隆抗体药物实现，另外加入的抗RANKL单克隆抗体药物直接或间接连接有可检测标记物；具体步骤为将抗RANKL单克隆抗体药物结合到固相载体上形成固相抗体，然后和抗独特型抗体结合形成免疫复合物，洗涤后再另外加入抗RANKL单克隆抗体药物，另外加入的抗RANKL单克隆抗体药物直接或间接连接有可检测标记物，与免疫复合物结合形成抗RANKL单克隆抗体药物-抗独特型抗体-抗RANKL单克隆抗体药物复合物，加底物显色，判断抗独特型抗体的情况。

10.分离的核苷酸分子，编码如权利要求1～6任一项所述的抗独特型抗体。

11.一种载体，其包含如权利要求10所述的分离的核苷酸分子。

12.一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的载体或基因组中整合有如权利要求10所述的分离的核苷酸分子。

13.一种试剂盒，包括如权利要求1～6任一所述的抗独特型抗体、如权利要求10所述的分离的核苷酸分子、如权利要求11所述的载体或如权利要求12所述的宿主细胞。

14.如权利要求1～6任一所述的抗独特型抗体、如权利要求10所述的分离的核苷酸分子、如权利要求11所述的载体、如权利要求12所述的宿主细胞、或如权利要求13所述的试剂盒在制备抗RANKL抗体检测产品、抗RANKL抗体耐药性检测产品的阳性对照、抗RANKL抗体药物免疫原性检测产品的阳性对照或抗RANKL抗体中和抗体的阳性对照中的用途；所述抗RANKL抗体为地舒单抗。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述抗RANKL抗体检测产品用于抗RANKL抗体的定性或定量分析。

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述抗RANKL抗体检测产品为：抗体药物药代动力学分析或药效学分析产品；所述抗体药物为地舒单抗。