CN117264071B

CN117264071B - 一种抗rankl单克隆抗体或其衍生物的结合剂及其应用

Info

Publication number: CN117264071B
Application number: CN202311563001.2A
Authority: CN
Inventors: 方鹏; 曹雨霞; 游猛; 施磊; 冯庆君; 朱晓红
Original assignee: Jiangsu T Mab Biopharma Co ltd; Jiangsu Maiweikang New Drug Research And Development Co ltd
Current assignee: Jiangsu T Mab Biopharma Co ltd; Jiangsu Maiweikang New Drug Research And Development Co ltd
Priority date: 2023-11-22
Filing date: 2023-11-22
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2043-11-22
Also published as: CN117264071A

Abstract

本申请涉及抗体药物领域，特别涉及一种抗RANKL单克隆抗体或其衍生物的结合剂及其应用。本申请的抗独特型抗体具有抗RANKL抗体高结合力和高特异性，可用于检测样本中抗RANKL抗体药物的含量，从而在抗RANKL抗体类药物的药代动力学和药效学分析中起着重要作用。

Description

一种抗RANKL单克隆抗体或其衍生物的结合剂及其应用

技术领域

本申请涉及抗体药物领域，特别涉及一种抗RANKL单克隆抗体或其衍生物的结合剂及其应用。

背景技术

核因子κ-B受体致活剂配体（Receptor activator of nuclear factor kappa-Bligand，RANKL）是一种II型跨膜蛋白，是核因子κ-B受体致活剂 (Receptor activator ofnuclear factor kappa-B ，RANK)的配体。RANKL是 NF-κB 的激活剂，当与NF-κB结合后，其诱导单核细胞/巨噬细胞谱系细胞分化为破骨细胞，并进一步导致破骨细胞前体成熟。RANKL/RANK/OGP系统是RANKL参与骨重建的典型途径，成骨细胞表达的RANKL与破骨前体细胞的RANK相结合，RANK与下游肿瘤坏死因子相关受体6（TRAF6）相结合可启动破骨细胞生产基因的转录，将破骨前体细胞诱导为成熟的破骨细胞。RANKL是肿瘤坏死因子超家族的一员，为破骨细胞分化激活的关键因子，具有诱导破骨细胞生产活化，抑制破骨细胞凋亡的作用，可用于骨质疏松的治疗。

抗独特型抗体（anti-idiotypic antibody）是指针对抗体分子可变区上特异抗原表位群（独特型）的抗体，能够特异性识别并结合另一抗体独特位点 (Idiotype)。在抗体类药物开发过程中，有两项检测是以抗独特型抗体为主要工具试剂：1）抗独特型抗体因为特异性结合表位不同，可用于检测血液中各种类型抗体药物的含量（游离型、结合型和总量），从而在抗体类药物的药代动力学（PK）和药效学（PD）分析中起着重要作用2）抗独特型抗体作为抗药抗体（Anti-drug antibodies，ADA）检测的阳性对照，在免疫原性（immunogenicity）评估中也发挥着重要作用。

因此，需要开发针对RANKL这一靶点的高结合力和高特异性的抗独特型抗体，以应用于抗体类药物开发和免疫原性评估等方面。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种抗RANKL单克隆抗体或其衍生物的结合剂及其应用，用于解决现有技术中的问题。

本申请第一方面提供一种抗RANKL单克隆抗体或其衍生物的结合剂，结合剂包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3序列；

其中，HCDR1的序列如SEQ ID No:1、或SEQ ID No:2所示的序列；

HCDR2的序列如SEQ ID No:3、或SEQ ID No:4所示的序列；

HCDR3的序列如SEQ ID No:5、或SEQ ID No:6所示的序列；

LCDR1的序列如SEQ ID No:7、或SEQ ID No:8所示的序列；

LCDR2的序列如SEQ ID No:9、或SEQ ID No:10所示的序列；

LCDR3的序列如SEQ ID No:11、或SEQ ID No:12所示的序列。

氨基酸序列具体如下：

HCDR1：DYAMK（SEQ ID No:1）

HCDR1：SYKIE（SEQ ID No:2）

HCDR2：DINPNSGDSFYNWKFKD（SEQ ID No:3）

HCDR2：EISPEWNNTQYNEKFKG（SEQ ID No:4）

HCDR3：EQYGHIYSEYSWFAY（SEQ ID No:5）

HCDR3：EEDYCYDY（SEQ ID No:6）

LCDR1：KASQTVDTNVA（SEQ ID No:7）

LCDR1：RSGQSLKHSNGDTYLH（SEQ ID No:8）

LCDR2：SASRQSS（SEQ ID No:9）

LCDR2：QVLNRFS（SEQ ID No:10）

LCDR3：QQYNVYGFT（SEQ ID No:11）

LCDR3：SQSTVVPYT（SEQ ID No:12）。

本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为架构区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈p一折叠构型，由形成接连环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分p折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

本申请提供的结合剂中，重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3选自以下任一种：

（1）HCDR1如SEQ ID No:1所示的序列， HCDR2如SEQ ID No:3所示的序列， HCDR3如SEQ ID No:5所示的序列；

（2）HCDR1如SEQ ID No:2所示的序列， HCDR2如SEQ ID No:4所示的序列， HCDR3如SEQ ID No:6所示的序列。

本申请提供的结合剂中，轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3选自以下任一种：

（1）LCDR1如SEQ ID No:7所示的序列， LCDR2如SEQ ID No:9所示的序列， LCDR3如SEQ ID No:11所示的序列；

（2）LCDR1如SEQ ID No:8所示的序列， LCDR2如SEQ ID No:10所示的序列， LCDR3如SEQ ID No:12所示的序列。

本申请提供的结合剂中，重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3和轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3选自以下任一种：

（1）HCDR1如SEQ ID No:1所示的序列， HCDR2如SEQ ID No:3所示的序列， HCDR3如SEQ ID No:5所示的序列，LCDR1如SEQ ID No:7所示的序列， LCDR2如SEQ ID No:9所示的序列， LCDR3如SEQ ID No:11所示的序列；

（2）HCDR1如SEQ ID No:2所示的序列， HCDR2如SEQ ID No:4所示的序列， HCDR3如SEQ ID No:6所示的序列，LCDR1如SEQ ID No:8所示的序列， LCDR2如SEQ ID No:10所示的序列， LCDR3如SEQ ID No:12所示的序列。

本申请提供的结合剂中，重链可变区还包括框架区HFR1-HFR4；HFR1的氨基酸序列如SEQ ID No:13、或SEQ ID No:14所示的序列； HFR2的氨基酸序列如SEQ ID No:15、或SEQID No:16所示的序列；HFR3的氨基酸序列如SEQ ID No:17、或SEQ ID No:18所示的序列；HFR4的氨基酸序列如SEQ ID No:19、或SEQ ID No:20所示的序列，具体序列如下所示：

HFR1：EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFT（SEQ ID No:13）

HFR1：QVQLQQSGAELKKPGASVKISCKATGYTFI（SEQ ID No:14）

HFR2：WVRQSHGKSLEWIG（SEQ ID No:15）

HFR2：WIKQRPGHGLEWIG（SEQ ID No:16）

HFR3：RATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCSR（SEQ ID No:17）

HFR3：KATFTADTSSNTVYLRLSSLTSEDSAVYYCAR（SEQ ID No:18）

HFR4：WGQGTLVTVSA（SEQ ID No:19）

HFR4：WGQGTTLTVSS（SEQ ID No:20）。

本申请提供的结合剂中，重链可变区的框架区选自以下任一种：

（1）HFR1的氨基酸序列SEQ ID No:13所示的序列，HFR2的氨基酸序列SEQ ID No:15所示的序列，HFR3的氨基酸序列SEQ ID No:17所示的序列，HFR4的氨基酸序列SEQ IDNo:19所示的序列；

（2）HFR1的氨基酸序列SEQ ID No:14所示的序列，HFR2的氨基酸序列SEQ ID No:16所示的序列，HFR3的氨基酸序列SEQ ID No:18所示的序列，HFR4的氨基酸序列SEQ IDNo:20所示的序列。

本申请提供的结合剂中，轻链可变区还包括框架区LFR1-LFR4；LFR1的氨基酸序列如SEQ ID No:21、或SEQ ID No:22所示的序列；LFR2的氨基酸序列如SEQ ID No:23、或SEQID No:24所示的序列；LFR3的氨基酸序列如SEQ ID No:25、或SEQ ID No:26所示的序列；LFR4的氨基酸序列如SEQ ID No:27、或SEQ ID No:28所示的序列，具体序列如下所示：

LFR1：DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTC（SEQ ID No:21）

LFR1：DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC（SEQ ID No:22）

LFR2：WYQQKPGQSPKTLIY（SEQ ID No:23）

LFR2：WYLQKPGQSPKVLIY（SEQ ID No:24）

LFR3：GVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC（SEQ ID No:25）

LFR3：GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC（SEQ ID No:26）

LFR4：FGSGTKLEIK（SEQ ID No:27）

LFR4：FGGGTKLEIK（SEQ ID No:28）。

本申请提供的结合剂中，轻链可变区的框架区选自以下任一种：

（1）LFR1的氨基酸序列如SEQ ID No:21所示的序列，LFR2的氨基酸序列如SEQ IDNo:23所示的序列，LFR3的氨基酸序列如SEQ ID No:25所示的序列，LFR4的氨基酸序列如SEQ ID No:27所示的序列；

（2）LFR1的氨基酸序列如SEQ ID No:22所示的序列，LFR2的氨基酸序列如SEQ IDNo:24所示的序列，LFR3的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示的序列，LFR4的氨基酸序列如SEQ ID No:28所示的序列。

本申请提供的结合剂中，结合剂的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29或SEQ ID No:30所示，重链可变区如下，其中CDR区以加粗表示：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYAMKWVRQSHGKSLEWIGDINPNSGDSFYNWKFKDRATLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCSREQYGHIYSEYSWFAYWGQGTLVTVSA （SEQ ID No:29）；

QVQLQQSGAELKKPGASVKISCKATGYTFISYKIEWIKQRPGHGLEWIGEISPEWNNTQYNEKFKGKATFTADTSSNTVYLRLSSLTSEDSAVYYCAREEDYCYDYWGQGTTLTVSS（SEQ ID No:30）。

本申请提供的结合剂中，结合剂的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31或SEQ ID No:32所示，轻链可变区如下，其中CDR区以加粗表示：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQTVDTNVAWYQQKPGQSPKTLIYSASRQSSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNVYGFTFGSGTKLEIK（SEQ ID No:31）；

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSGQSLKHSNGDTYLHWYLQKPGQSPKVLIYQVLNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTVVPYTFGGGTKLEIK（SEQ ID No:32）。

本申请提供的结合剂中，结合剂的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列选自以下任一种：

（1）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31所示；

（2）重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:30所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示。

本申请提供的结合剂中，结合剂的重链的氨基酸序列如SEQ ID No:33或SEQ IDNo:34所示，可变区以下划线示出，CDR区以加粗示出，具体序列如下：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYAMKWVRQSHGKSLEWIGDINPNSGDSFYNWKFKDRA TLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCSREQYGHIYSEYSWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK*（SEQ ID No:33）；

QVQLQQSGAELKKPGASVKISCKATGYTFISYKIEWIKQRPGHGLEWIGEISPEWNNTQYNEKFKGKA TFTADTSSNTVYLRLSSLTSEDSAVYYCAREEDYCYDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK（SEQ IDNo:34）。

本申请提供的结合剂中，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:35或SEQ ID No:36所示，可变区以下划线示出，CDR区以加粗示出，具体序列如下：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQTVDTNVAWYQQKPGQSPKTLIYSASRQSSGVPDRFTGSGSG TDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNVYGFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC*（SEQID No:35）；

DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSGQSLKHSNGDTYLHWYLQKPGQSPKVLIYQVLNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTVVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC*（SEQ ID No:36）。

本申请提供的结合剂中，结合剂的氨基酸序列选自以下任一种:

（1）重链的氨基酸序列如SEQ ID No:33所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示，即本申请的S-60-1；

（2）重链的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:36所示，即本申请的S-320-1。

本申请针对RANKL这一靶点，提供S-60-1和S-320-1这2个抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列，序列为首次披露。本申请的抗RANKL抗独特型抗体具有高结合力和高特异性。

本申请提供的结合剂中，结合剂为全长抗体、Fab片段、F（ab）₂片段、Fv片段、scFv片段或单域抗体。

“全长抗体”是包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。可变区是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原结合的结构域。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是显示出多种效应子功能。抗体的轻链可以基于其恒定区的氨基酸序列归为两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))。抗体的重链可以基于其恒定区的氨基酸序列而划分为主要5种不同的类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类型中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。

“Fab片段”由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段。

“F(ab)₂片段”是具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab)部分，F(ab)₂片段抗体是由胃蛋白酶消化整个IgG抗体，去除大部分Fc区同时完整保留一些铰链区后得到的。

“Fv片段”由抗体单臂VL和VH构成。

“scFv片段”Fv片段的两个结构域VL和VH可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分，称为单链Fc(scFv)。

“单域抗体”(sdAb)，也称为域抗体，是仅包含整个抗体的单个可变结构域的抗体片段。第一个 sdAb 来源于骆驼的抗体，它是两条重链的二聚体，没有轻链。这种类型的抗体也在软骨鱼类中发现，例如鲨鱼。迄今为止，大多数生成的 sdAb 是从骆驼科动物或软骨鱼类中工程改造的，称为 V H H。此外，来自常见 IgG 轻链的 sdAb 也被证明在抗原结合中具有活性。尽管 sdAb 比其他形式的抗体（如 Fab 和 scFv）小得多（通常为 12-15KD），但它具有抗原结合所需的所有元素。

上述这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。

本申请提供的结合剂中，结合剂为单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、重组抗体、嵌合抗体、标记抗体、抗独特型抗体或融合蛋白。

“单克隆抗体”（monoclonal antibody, mAb）就是指由单一B细胞（其基因仅能编码一种抗体）克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。

“双特异性抗体”(bispecific antibody，BsAb)简称双抗，是具有两条抗原结合臂的抗体变形结构，能够同时识别两种不同的抗原，它是一种特殊形式的人工抗体。双特异性抗体通过结合肿瘤相关抗原位点与免疫细胞表面受体(多为T淋E细胞受体)，同时连接肿瘤细胞和T淋己细胞，触发具有导向性的免疫反应，从而特异性杀伤脚瘤细胞。

“多特异性抗体”同时特异性结合多个抗原或抗原表位的人工抗体。多特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组DNA技术制备实现的。由于其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。

“重组抗体”是利用重组DNA技术，将一段DNA片段插入酵母、病毒或细菌中制成的抗体，即使是来自不同物种的重组生物也会表达抗体，研究人员可以从中提取抗体用于医学实验和研究在某些情况下，医学科学家能够利用重组DNA来治疗和治疗病人的疾病。重组DNA技术需要一个实验室环境，研究人员可以在实验室环境中与多种生物进行合作载体。载体是感兴趣的DNA的载体，研究人员可以根据遗传物质和过去的成功或失败，选择最合适的生物体和载体，并小心地将DNA插入生物体，迫使其克隆和表达抗体。在控制条件下，她可以培育出多代生物，这些生物都能产生重组抗体。

“嵌合抗体”是由鼠源性抗体的V 区基因与人抗体的C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。

“标记抗体”是抗体经过酶标记、铁蛋白标记或通过胶体金标记获得。

“融合蛋白”是一种由至少两个结构域组成的蛋白质，这些结构域由单独的基因编码，这些基因已经连接在一起，因此它们作为一个单元被转录和翻译，从而产生一个多肽。

本申请提供的结合剂中，结合剂选自抗独特型抗体，适于特异性结合抗RANKL抗体药物或其衍生物。

“抗独特型抗体”是指，特异性地识别/结合用于制备它们的抗体的独特型的抗体(即，以用于制备它们的抗体的可变区的独特型作为抗原表位)，其能够模拟/重建用于制备它们的抗体所识别的抗原表位。本申请的抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的结合剂为抗RANKL单抗的抗独特型抗体，可以识别抗RANKL单克隆抗体分子可变区上特异抗原表位，对RANKL单克隆抗体具有高结合力和高特异性。

“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。

“适于”是指本申请的结合剂在合适的条件下下，可以特异性结合抗RANKL抗体药物或其衍生物，具体是指能够特异性结合抗RANKL单克隆抗体可变区上的抗原表位群。抗RANKL抗体药物或其衍生物可以特异性结合RANKL。抗RANKL抗体药物例如可以为地舒单抗。地舒单抗是一种人源化IgG2单克隆抗体，可与RANKL进行特定的结合，RANKL是破骨细胞形成、发挥功能和生存所必需的跨膜或可溶性蛋白；破骨细胞负责骨吸收，从而调节骨钙释放。

抗RANKL单克隆抗体药物衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其他蛋白质等方法修饰的抗体。可以通过已知技术进行任何许多化学修饰，这些技术包括但不限于：特定化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。该衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。抗RANKL单克隆抗体药物衍生物还可以为抗体-药物偶联物(ADC)。“药物”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、血管生成抑制剂、细胞毒性剂、其它抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。

本申请提供的结合剂中，抗独特型抗体为非阻断型抗体。“非阻断型抗体”是指以ELISA方法检测，识别抗RANKL抗体，不识别对照human IgG，不能阻断抗RANKL抗体与RANKL的结合(ELISA板包被抗原，抗RANKL抗体与所制备的抗独特型抗体孵育后加入ELISA板，使用抗人IgG二抗进行检测，信号值与未加入抗独特型抗体孵育组（PBS组）相比没有降低)。

本申请另一方面提供与前述的结合剂相关的生物材料，包括如下中的一种或多种：

1）编码前述结合剂的核苷酸分子。本申请的结合剂的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可以将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成抗独特型抗体。

2）含有1）的核苷酸的重组表达载体。“重组表达载体”具有位于启动子序列附近的合宜限制位点以提供编码异源蛋白的核酸序列的插入。可存在在表达宿主中有效的选择标记。合适的表达载体包括但不限于细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、病毒载体或其他载体。病毒载体的实例包括但不限于基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒、单纯疱疹病毒；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒，及源自逆转录病毒如劳氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病的载体)等。

3）含有2）的重组表达载体或基因组中整合有1）的核苷酸的宿主细胞。合适的宿主细胞包括真核宿主细胞，如哺乳动物细胞、昆虫宿主细胞、酵母细胞；和原核细胞，如细菌细胞。目标基因向宿主细胞的引入可以，例如，通过磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、电穿孔或其它已知方法来实现。

4）包括前述的结合剂、1）的核苷酸、2）的重组表达载体、或3）的宿主细胞的试剂盒。试盒中含有的抗独特型抗体可与抗RANKL抗体结合，因此可用于直接检测抗RANKL抗体。抗RANKL抗体免疫原性检测试剂盒中抗独特型抗体可与抗RANKL抗体结合，可作为检测抗RANKL抗体的阳性对照。本申请的试剂盒还可以包括检测所必需的常规缓冲液、洗涤液、包被液等试剂。试剂盒可以是胶体金免疫试剂盒、化学发光试剂盒、放射免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒或荧光免疫试剂盒。该试剂盒将其中包含的抗独特型抗体、生物材料直接使用即可。

本申请另一方面提供前述的结合剂、前述的生物材料在制备抗RANKL单克隆抗体检测产品、或抗RANKL抗体药物免疫原性检测产品的阳性对照中的用途。

本申请提供的用途中，抗RANKL单克隆抗体检测产品包括用于抗RANKL单克隆抗体或其衍生物的定性或定量分析；进一步地，所述抗RANKL单克隆抗体检测产品为：抗体药物药代动力学分析或药效学分析产品。

抗RANKL抗体衍生物可以是指抗RANKL抗体上修饰有官能团，其具有与未修饰的抗体具有相近的抗原特异性识别能力与结合能力或者更高的反应活性。

药效学和药代动力学有着共同的影响因素，例如剂量、药物益处和不良反应。本发明的抗独特型抗体可以用于检测抗RANKL抗体在药物药代动力学分析试验及药物药效学分析中抗RANKL抗体的变化规律及代谢情况。

本申请另一方面提供一种非疾病诊断或治疗目的的用于检测样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的方法，包括：

(a) 使样品接触前述的结合剂；

(b) 检测是否存在前述的结合剂与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合的免疫复合物，以定性分析样品中是否存在抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物；或检测所述免疫复合物的量，以定量分析样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物。

步骤(a)中，使结合剂直接或间接固定化至固相支持物。在一些实施方式中，固相支持物选自醋酸纤维膜、试管、EP管、多孔板、微量反应板凹孔和微球。

本申请提供的方法中，步骤(b)中，检测免疫复合物的存在或检测免疫复合物的量是采用选自如下的方法实现：

i. 经由直接或间接连接到结合剂的可检测标记物实现；

ii. 经由结合结合剂或抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的其他试剂实现，其他试剂直接或间接连接有可检测标记物；

iii. 经由另一种前述的结合剂实现，另一种结合剂直接或间接连接有可检测标记物且识别另外的独特型；

iv. 经由另外加入的抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物实现，抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物直接或间接连接有可检测标记物。

在一些实施方式中，i.是指当结合剂与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合形成免疫复合物时，由于结合剂直接或间接带有的可检测标记物，可以通过可检测标记物的检测，识别出免疫复合物的存在。

在一些实施方式中，ii.中的其他试剂例如可以为二抗，二抗与结合剂同源，与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物不同源，因此可以与结合剂结合，不与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合。二抗作为检测抗体，可用于检测结合剂与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的结合，若结合产生免疫复合物，那么二抗带有的可检测标记物可以识别出来，若结合剂与抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物没有结合，那么二抗无法检测出免疫复合物的存在。

在一些实施方式中，iii.和iv.例如可以为双抗夹心法。

iii.中双抗夹心法的原理是将结合剂结合到固相载体上形成固相抗体，然后和样品中的相应抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合形成免疫复合物，洗涤后再另外加入结合剂，另外加入的结合剂直接或间接连接有可检测标记物，与免疫复合物结合形成结合剂-抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物-结合剂复合物，加底物显色，判断样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的情况。

iv.中双抗夹心法的原理是将抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物结合到固相载体上形成固相抗体，然后和结合剂结合形成免疫复合物，洗涤后再另外加入抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物，另外加入的抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物直接或间接连接有可检测标记物，与免疫复合物结合形成抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物-结合剂-抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物复合物，加底物显色，判断结合剂的情况。

对样品进行定量检测时，以反应中加入的结合剂的浓度与形成免疫复合物的浓度呈函数关系，可以是根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的含量：在一定的反应条件下，加入的结合剂的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物量成正比。抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的量可经由检测标记物的量而确定。可用实验性标准曲线推算出样品中抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测。因此可以对抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物进行药代动力学分析，例如在体内药物浓度随时间变化的规律。

在一些实施方式中，可检测标记物包括：胶体金、放射性标记、发光物质、有色物质、酶，例如荧光标记、发色团标记、电子致密标记，例如放射性同位素、荧光团、罗丹明及其衍生物、荧光素酶、荧光素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，生物素/抗生物素蛋白，自旋标记等。

在一些实施方式中，可以使用任何适当的体外测定，基于细胞的测定，体内测定，动物模型等检测本公开抗体的效果如结合活性和/交叉反应性。在一些实施方式中，所述测定可以包括例如ELISA(酶联免疫吸附测定法)，FACS(流式细胞荧光分选技术)结合测定，Biacore，竞争性结合测定等。在一些实施方式中，例如在ELISA中表征本公开的抗体与抗原(抗原肽)结合的反应性，例如通过过氧化物酶标记的ELISA法读取450nm处的反应值≧0.5确定为有较好反应性，可用于免疫测定。

与现有技术相比，本申请的有益效果为：

1、本申请的抗独特型抗体具有抗RANKL抗体高结合力和高特异性，可用于检测样本中抗RANKL抗体药物的含量，从而在抗RANKL抗体类药物的药代动力学和药效学分析中起着重要作用。

2、本申请的抗独特型抗体性能测试良好，可以用作免疫原性ADA分析阳性对照，在免疫原性评估中发挥着重要作用。

附图说明

图1为抗RANKL人源化单抗的定量分析标准曲线图。

图2为抗独特型抗体ADA分析曲线图。

具体实施方式

为了使本申请的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本申请，并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。

本申请的发明人经过大量探索研究，发现了一种抗RANKL单克隆抗体药物或其衍生物的结合剂及其应用，在此基础上完成了本申请。

下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。

实施例1

抗独特型抗体的制备

1、动物免疫和抗体制备

胃蛋白酶（公司Sigma，货号P6887）酶切抗RANKL人源化单抗（即地舒单抗，迈威(上海)生物科技股份有限公司生产），去除抗体的Fc区域，制备得到F(ab)₂样品。将获得的F(ab)₂样品作为免疫动物的免疫原，对5只Balb/c小鼠进行免疫，每只免疫3次，每次周期为3周。免疫后的小鼠血清与相应的免疫原要有特异性结合，抗血清效价应在1:10,000以上。

选取免疫小鼠中效价最高的1-2只小鼠的脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。扩增培养杂交瘤细胞，取上清以ELISA检测效价，并检测抗体亚型；选取针对抗RANKL人源化单抗呈阳性且针对无关人IgG呈阴性的细胞进行克隆。为保证杂交瘤细胞株的阳性率和抗体的稳定产生，进行3-4次克隆，每次克隆间隔1-2周，3-4次均为100%阳性克隆后，细胞扩大培养后接种到小鼠中制备腹水，获得抗独特型抗体。在克隆过程中通过间接ELISA方法检测杂交瘤上清的特异性，即上清中的鼠单抗仅结合抗RANKL人源化单抗，而不结合无关人IgG，结果如表1所示，S-66-3这株抗体特异性不好，与人IgG有交叉反应，最终获得S-60-1和S-320-1这2株特异性好的独特性单克隆抗体。

表1. 杂交瘤上清特异性鉴定结果

2、靶点竞争性和非竞争性测试

对杂交瘤细胞所产生的2株抗体进行检测，应该分别满足以下条件：

1）靶点非阻断型抗体：以ELISA方法检测，识别抗RANKL抗体，不识别对照humanIgG，不能阻断抗RANKL抗体与RANKL的结合(ELISA板包被抗原，抗RANKL抗体与所制备的抗独特型抗体孵育后加入ELISA板，使用抗人IgG二抗进行检测，信号值与未加入抗独特型抗体孵育组（PBS组）相比没有降低)；

2）靶点阻断型抗体：以ELISA方法检测，识别抗RANKL抗体，不识别对照human IgG，可以阻断抗RANKL抗体与RANKL的结合(ELISA板包被抗原，抗RANKL抗体与所制备的抗独特型抗体孵育后加入ELISA板，使用抗人IgG二抗进行检测，信号值与未加入抗独特型抗体孵育组（PBS）相比有显著降低)。

结果如下表所示，通过比较加入抗体组与未加入抗体组OD值差异，判断抗独特型抗体的靶点阻断性。结果显示，加入S-60-1和S-320-1后信号值与加入PBS组类似，因此为靶点非阻断型抗体。

实施例2

抗独特型抗体的测序

1、实验流程

扩大培养杂交瘤细胞，提取细胞总RNA，反转录获得cDNA。PCR扩增获得抗体的重链和轻链可变区基因，测序并进行序列的生物信息学分析，剔除非功能的抗体基因。抗体按照其来源的杂交瘤细胞克隆命名，重链和轻链的氨基酸序列如下所示。重链和轻链的可变区以下划线示出，根据KABAT命名系统定义的重链和轻链的CDR区（互补决定区）以加粗示出。

2、测序结果

S-60-1完整抗体序列

重链序列：

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYAMKWVRQSHGKSLEWIGDINPNSGDSFYNWKFKDRA TLTVDKSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCSREQYGHIYSEYSWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK*（SEQ ID No:33）。

轻链序列：

DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQTVDTNVAWYQQKPGQSPKTLIYSASRQSSGVPDRFTGSGSG TDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNVYGFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC*（SEQID No:35）。

S-320-1完整抗体序列

重链序列：

轻链序列：

上述抗体可通过常规基因工程获得分离的单抗，例如合成上述抗体的基因，构建重组载体后，转染293细胞后重组表达，纯化后制备获得。

实施例3

Anti-RANKL抗体的抗独特型抗体在非临床和临床药物分析中的应用

一、抗独特型抗体在非临床药代中的应用

酶联免疫吸附试验（ELISA）经常被应用于抗体药物临床和非临床的药代动力学研究。本实施例以食蟹猴血清药代分析为例，以靶点蛋白重组人RANKL胞外蛋白作为捕获试剂，以抗独特性抗体作为检测试剂，考察了本发明中的两个抗独特性抗体在非临床药代分析中的应用。

1. 试验方法

1.1 包被与封闭：将重组人RANKL胞外蛋白（公司ACRO，货号RAL-H5240）用包被液稀释至2μg/mL，2~8℃过夜；将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，加入3% BSA/PBST，室温孵育2h；封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

1.2 标准曲线和质控品稀释：抗RANKL人源化单抗（江苏迈威康新药研发有限公司生产）用100%混合猴血清（pooled monkey serum，PMS）稀释制备标准曲线，浓度分别为：10000ng/ml（ULOQ，定量上限）、5000ng/ml、2500ng/ml、1250ng/ml、625ng/ml、312.5ng/ml、156.25ng/ml（LLOQ，定量下限）、78.12ng/ml（锚点）。空白对照（0ng/ml）作为标准曲线的一部分，但不参与标准曲线拟合。5个质控品浓度也是用100%混合猴血清制备，浓度为：10000ng/ml（ULOQ，定量上限）、8000ng/ml（HQC，高浓度质控）、2000ng/ml（MQC，中浓度质控）、400ng/ml（LQC，低浓度质控）、156.25ng/ml（LLOQ，定量下限）。

1.3 待测样品稀释和加样：将待测的猴血清样品、标准曲线样品和质控品分别用1%BSA/PBST预稀释50倍后，按照100μl/孔加入ELISA板中，设复孔，室温静置孵育2h。

1.4 加入检测抗体：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次；用1%BSA/PBST分别将2株抗独特型抗体（S-320-1、S-60-1）稀释至2μg/ml后加入ELISA板，室温静置孵育1h。

1.5 加入检测二抗：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次；用1%BSA/PBST将山羊抗鼠IgG HRP标记二抗（Jackson ImmunoResearch，货号115-035-003）稀释20000倍后加入ELISA板，室温静置孵育1h。

1.6 显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次；将事先平衡至室温的TMB底物（KPL，货号5120-0047）加入ELISA板，室温避光孵育10min左右；加入1 M H₃PO₄终止反应。

1.7 读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

1.8 浓度计算：将标准曲线浓度与OD值进行四参数拟合，用拟合方程计算待测样品的药物浓度。

1.9 应用此方法检测猴血清中抗RANKL人源化单抗药物浓度，标准曲线如图1所示，S-60-1和S-320-1这两个抗独特型抗体均可作为药代分析的检测抗体，且S-60-1这个抗体具有更高的方法检测灵敏度和检测信号强度。结果如表2所示，这两个抗体建立的药代分析方法都具有良好的准确度和精密度，可以准确定量食蟹猴血清中的药物浓度。

表2 准确度和精密度

二、抗独特型抗体在药物免疫原性ADA检测中的应用

治疗性蛋白药物的免疫反应可能会影响该药物的药代动力学、药效学、安全性和有效性。大多数药物的不良反应由体液免疫机制介导的免疫应答所致，抗药抗体（ADA）的检测是评估药物免疫原性的主要方法。本实施例主要考察了抗独特性抗体在免疫原性ADA检测中的应用。

1. 试验步骤

1.1 包被与封闭：将抗RANKL人源化单抗（江苏迈威康新药研发有限公司生产）用包被液稀释至1μg/ml， 2~8℃过夜；将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次；将ELISA板拍干，加入3% BSA/PBST，室温孵育2h；封闭后的ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板3次。

1.2 准备待测样品：将2株抗独特型抗体（S-320-1、S-60-1）分别用10%混合猴血清（10% PMS）稀释至10μg/ml作为起始浓度，3倍梯度稀释共7个点，以10% PMS作为0点。

1.3 加样：用EZ-LINK NHS-LC-LC-Biotin（Thermo，Cat#21343）按照说明书标记抗RANKL人源化单抗，得到抗RANKL抗体-Biotin，将其用1% BSA/PBST稀释至50ng/ml。将上述稀释好的每一种抗独特型抗体样品和抗RANKL抗体-Biotin分别以50μl/孔加入ELISA板中，设复孔，室温孵育2 h。

1.4 加入SA-HRP：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将SA-HRP（SouthernBiotech，货号7105-05）用1% BSA/PBST按1:5000稀释后加入ELISA板，室温孵育1h。

1.5 显色：孵育后将ELISA板拍干，洗涤缓冲液冲洗ELISA板6次。将事先平衡至室温的TMB底物（KPL，货号5120-0047）加入ELISA板，室温避光孵育3min左右。加入1 M H₃PO₄终止反应。

1.6 读板：显色反应终止后，以650nm为参比波长，读取450nm波长处OD值。

2. 试验结果

结果如图2所示， S-60-1这个抗独特型抗体性能测试良好，抗体浓度和信号值呈良好的量效关系，可以用作ADA分析阳性对照。

综上，本申请的特异性识别抗RANKL人源化单抗的抗独特型单抗，均一性好，结合力强，可广泛应用于药物研发领域，主要应用于抗体药物的免疫原性分析及药代动力学分析等。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种抗RANKL单克隆抗体的结合剂，所述结合剂包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中，所述重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3和轻链可变区的LCDR1、LCDR2、LCDR3选自以下任一种：(1)所述HCDR1的序列如SEQ ID No:1所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID No:3所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID No:5所示，所述LCDR1的序列如SEQ ID No:7所示，所述LCDR2的序列如SEQ IDNo:9所示，以及所述LCDR3的序列如SEQ ID No:11所示；(2)所述HCDR1的序列如SEQ ID No:2所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID No:4所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID No:6所示，所述LCDR1的序列如SEQ ID No:8所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID No:10所示，以及所述LCDR3的序列如SEQ ID No:12所示。

2.如权利要求1所述的结合剂，其特征在于，所述结合剂的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列选自以下任一种：(1)重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:29所示；和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:31所示；(2)重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo:30所示；和轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:32所示。

3.如权利要求1所述的结合剂，其特征在于，所述结合剂的氨基酸序列选自以下任一种：

(1)重链的氨基酸序列如SEQ ID No:33所示，和轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:35所示；(2)重链的氨基酸序列如SEQ ID No:34所示，和轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:36所示。

4.如权利要求1所述的结合剂，其特征在于，所述结合剂为全长抗体、Fab片段、F(ab)₂片段、Fv片段或scFv片段。

5.如权利要求1所述的结合剂，其特征在于，所述结合剂为单克隆抗体或抗独特型抗体。

6.如权利要求5所述的结合剂，其特征在于，所述结合剂为抗独特型抗体，适于特异性结合抗RANKL抗体药物。

7.如权利要求6所述的结合剂，其特征在于，所述抗RANKL抗体药物为地舒单抗；和/或，所述抗独特型抗体为非阻断型抗体。

8.与权利要求1～7任一项所述的结合剂相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括如下中的一种或多种：

1)编码如权利要求1～7任一项权利要求所述的结合剂的多核苷酸；

2)含有1)所述的多核苷酸的重组表达载体；

3)含有2)所述的重组表达载体或基因组中整合有1)所述的多核苷酸的宿主细胞；

4)包括如权利要求1～7任一项权利要求所述的结合剂、1)所述的多核苷酸、2)所述的重组表达载体、或3)所述的宿主细胞的试剂盒。

9.如权利要求1～7任一项所述的结合剂或如权利要求8所述的生物材料在制备抗RANKL单克隆抗体检测产品或抗RANKL抗体药物免疫原性检测产品的阳性对照中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述抗RANKL单克隆抗体检测产品包括用于抗RANKL单克隆抗体的定性或定量分析。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述抗RANKL单克隆抗体检测产品为：抗体药物药代动力学分析或药效学分析产品。

12.一种非疾病诊断或治疗目的的用于检测样品中抗RANKL单克隆抗体药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)使样品接触如权利要求1～7任一项所述的结合剂；

(b)检测是否存在如权利要求1～7任一项所述的结合剂与抗RANKL单克隆抗体药物结合的免疫复合物，以定性分析样品中是否存在抗RANKL单克隆抗体药物；或检测所述免疫复合物的量，以定量分析样品中抗RANKL单克隆抗体药物。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，具有以下特征中的一项或多项：

步骤(a)中，使所述结合剂或抗RANKL单克隆抗体药物直接或间接固定化至固相支持物；步骤(b)中，检测所述免疫复合物的存在或检测所述免疫复合物的量是采用选自如下任一种的方法实现：

i.经由直接或间接连接到所述结合剂的可检测标记物实现；

ii.经由结合所述结合剂或所述抗RANKL单克隆抗体药物的二抗实现，所述二抗直接或间接连接有可检测标记物；

iii.经由另外加入的所述抗RANKL单克隆抗体药物实现，所述抗RANKL单克隆抗体药物直接或间接连接有可检测标记物。