CN119080838B

CN119080838B - 一种抗病毒药物及其用途

Info

Publication number: CN119080838B
Application number: CN202411578482.9A
Authority: CN
Inventors: 何公欣; 侯凯; 吴豪; 卢长亮
Original assignee: Shanghai Kejun Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Kejun Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2024-11-07
Filing date: 2024-11-07
Publication date: 2025-03-11
Anticipated expiration: 2044-11-07
Also published as: CN119080838A

Abstract

本发明公开了一种抗病毒药物及其用途。本发明提供了一种如式I所示化合物或其药学上可接受的盐。本发明提供的化合物药物具有优异的抗病毒活性，且毒性低，转化效率高。

Description

一种抗病毒药物及其用途

技术领域

本发明涉及一种抗病毒药物及其用途。

背景技术

核苷酸抗病毒剂可通过直接与天然脱氧核糖底物竞争性结合，引起病毒DNA链合成的终止来抑制病毒聚合酶。在已知的用于病毒抑制的核苷酸中，替诺福韦（TFV）是带有膦酸酯基团的核苷酸逆转录酶抑制剂，并且可用作治疗HIV或HBV感染的单一药物或与其他药物组合的组分。然而，由于膦酸酯基团在生理pH下是二价阴离子，所以TFV具有差的细胞膜渗透性和低的口服生物利用度（＜10%），这限制了其治疗效果。

已经做出了许多努力来开发用于临床应用的抗HBV和HIV药物。例如，富马酸替诺福韦二吡呋酯（TDF）是由吉利德科学公司（Gilead Sciences Inc.）开发的第一代替诺福韦前药。然而，TDF在生理pH和血浆中的稳定性差。因此，必须通过口服施用以高剂量给药，以便在靶组织中产生足够浓度的TFV并达到其治疗效果。结果，由于TFV的不稳定性，在血浆中也形成高浓度的TFV，从而引起剂量依赖性肾和骨毒性。此外，前药在代谢时还会释放两分子潜在毒性的甲醛。替诺福韦艾拉酚胺（TAF，也称为GS-7340）是吉利德的第二代替诺福韦前药，其具有比TDF改善的血浆稳定性、疗效和安全性。然而，TAF含有酚作为良好的离去基团，因此TAF在生理pH和血浆中的稳定性仍然不好。此外，TAF的合成和制造非常困难，并且TAF片剂必须与大量干燥剂一起包装在厚壁瓶中。TDF和TAF在生理pH和血浆中的稳定性不足，使得这些前药不适合作为用于治疗HIV和HBV感染的长效肌内注射制剂的组分。含有苯酚或具有良好离去能力的类似分子的替诺福韦的其他前药，例如在TAF的丙氨酸部分添加了一个甲基的HS-10234，具有相同的问题。

WO2022271880A1、CN103842369A与WO2012048013A2公开了结构类似于替诺福韦前药的化合物，但WO2022271880A1提供的化合物主要应用于治疗癌症，不涉及抗病毒药物的研究，无法解决抗HBV和HIV药物稳定性较差的技术问题；

CN103842369A与WO2012048013A2提供的化合物主要用于治疗抗丙型肝炎病毒感染（HCV病毒），不涉及抗HBV和HIV药物效果的研究，抗HCV药物与抗HBV、HIV药物的核苷完全不同，其同样无法解决抗HBV和HIV药物稳定性较差的技术问题。

因此本领域仍然需要进一步开发具有进一步改善的稳定性、功效和毒性的抗HBV和HIV药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种有良好稳定性和功效以及低毒性的抗HBV和HIV药物。本发明提供了一种抗病毒药物及其用途。本发明提供的化合物药物具有优异的抗病毒活性，且毒性低，转化效率高。

本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明提供一种如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，

其中，带“#1”磷原子为手性磷原子，为S构型和/或R构型；

带“#2”碳原子为手性碳原子或非手性碳原子，当为手性碳原子时，为S构型和/或R构型；

带“#3”碳原子为手性碳原子或非手性碳原子，当为手性碳原子时，为S构型和/或R构型；

R¹和R²独立地为C₄-C₈烷基；

R³为C₁-C₈烷基、C₃-C₈环烷基、被一个或多个R^b取代的C₁-C₈烷基或被一个或多个R^c取代的C₃-C₈环烷基；

R⁴和R⁵独立地为氢、C₁-C₄烷基、C₆-C₁₀芳基、被一个或多个R^d取代的C₁-C₄烷基或被一个或多个R^e取代的C₆-C₁₀芳基；

R⁶为氢或C₁-C₄烷基；

R^a、R^b、R^c、R^d和R^e独立地为氰基、卤素、C₁-C₈烷基、C₁-C₈烷氧基、C₃-C₈环烷基、-O-(C₃-C₈环烷基)、C₆-C₁₀芳基。

在本发明某些优选实施方案中，所述的如式I所示的化合物或其药学上可接受的盐中的某些基团如下定义，未提及的基团同本发明任一方案所述（简称“在本发明一些实施方案”）。

在本发明的一些实施方案中，R³为C₁-C₈烷基。

在本发明的一些实施方案中，R⁴为氢或C₁-C₄烷基。

在本发明的一些实施方案中，R⁵为C₁-C₄烷基。

在本发明的一些实施方案中，R⁶为C₁-C₄烷基。

在本发明的一些实施方案中，所述C₄-C₈烷基为正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、2-甲基丁基、2-乙基丁基或3-甲基丁基；例如正戊基、或；优选为C₅-C₈烷基，例如正戊基或。

在本发明的一些实施方案中，各所述C₁-C₈烷基独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；优选为乙基、异丙基或正丁基。

在本发明的一些实施方案中，各所述C₁-C₄烷基独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；优选甲基。

在本发明的一些实施方案中，各所述C₃-C₈环烷基独立地为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

在本发明的一些实施方案中，各所述C₆-C₁₀芳基独立地为苯环或萘环。

在本发明的一些实施方案中，所述C₁-C₈烷氧基可为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。

在本发明的一些实施方案中，所述卤素可为F、Cl、Br或I。

在本发明的一些实施方案中，R³为乙基、异丙基或正丁基。

在本发明的一些实施方案中，R⁴为氢或甲基。

在本发明的一些实施方案中，R⁵为甲基。

在本发明的一些实施方案中，R⁶为甲基。

在本发明的一些实施方案中，所述如式I所示化合物为以下任意一种：

、、、和。

、、和。

本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明任一方案所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

在一些实施方案中，所述药物组合物还进一步包含选自抗病毒剂、免疫治疗剂和抗感染剂的附加试剂。

本发明还提供一种本发明任一方案所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐或本发明任一方案所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用；所述病毒可为HBV病毒或HIV病毒。

本发明化合物可被配制成药学上可接受的盐或呈药学上可接受的盐形式。除非相反地规定，否则本文所提供的化合物包括此类化合物的药学上可接受的盐。

术语“药学上可接受”是指相对无毒、安全、适合于患者使用。

术语“药学上可接受的盐”是指化合物与药学上可接受的酸或碱反应得到的盐。当化合物中含有相对酸性的官能团时，可以通过在合适的惰性溶剂中用足量的药学上可接受的碱与化合物接触的方式获得碱加成盐。当化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在合适的惰性溶剂中用足量的药学上可接受的酸与化合物接触的方式获得酸加成盐。具体可参见Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (P.Heinrich Stahl, Camille G. Wermuth, 2011, 2nd Revised Edition)。

术语“药学上可接受的辅料”是指除活性药物成分以外，包含在药物制剂中的所有物质，一般分为赋形剂和附加剂两大类。具体可参见《中华人民共和国药典（2020年版）》、Handbook of Pharmaceutical Excipients (Paul J Sheskey, Bruno C Hancock, GaryP Moss, David J Goldfarb, 2020, 9th Edition)。

术语“治疗”是指消除病因或缓解症状。

术语“预防”是指降低发生疾病的风险。

术语“一个或多个”是指1个、2个或3个。

术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。

术语“烷基”是指具有指定碳原子数（例如，C₁-C₈、C₄-C₈等）的、直链或支链的、饱和的一价烃基。烷基包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。

术语“烷氧基”是指基团R^X-O-，R^X的定义同术语“烷基”。烷氧基包括但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基等。

术语“环烷基”是指具有指定碳原子数（例如，C₃-C₈）的、环状的、饱和的一价烃基，其为单环或双环。（单环）环烷基包括但不限于：、、、等。

术语“芳基”是指具有指定碳原子数（例如，C₆-C₁₀）的、环状的、不饱和的一价烃基，其为单环或多环（例如，2个或3个），为多环时，相邻单环之间共用两个原子和一根键，且每个环均具有芳香性。芳基包括但不限于：苯基、萘基等。

在一个方面，本发明提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐，其可用作TFV前药。

在一些实施方案中，本发明的化合物可在施用后转化为TFV。在一些实施方案中，本发明的化合物可在口服施用后转化为TFV。在一些实施方案中，本发明的化合物可在肠胃外施用后转化为TFV。在一些实施方案中，本发明的化合物可在靶细胞中转化为TFV。在一些实施方案中，本发明的化合物可在人肝细胞和淋巴细胞中转化为TFV。

对于前药，可能期望前药在体循环中时保持完整（即，未裂解），而在靶组织中被裂解（即，释放母体药物）。另选地，可能期望前药在胃肠道（GI）中时保持完整（即，未裂解），而在从胃肠腔吸收或摄取后（例如，在胃肠腔内壁的肠上皮细胞中或在血液中）裂解（即，释放母体药物）。有用的稳定性水平可至少部分地由前药的机制和药代动力学决定。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

（1）本发明提供的如式I所示化合物具有优异的抗HBV和抗HIV的体外抗病毒活性，且毒性低。

（2）本发明提供的如式I所示化合物在PBMC或者Hep G2细胞中，均具有优异的转化效率。

具体实施方式

出于说明的目的，包括以下实例。然而，应理解，这些实例并不限制本申请，并且仅意图表明实践本申请的方法。本领域的技术人员将认识到，所述的化学反应可易于适用于制备本申请的多种其它化合物，并且用于制备本申请化合物的替代方法被认为在本申请的范围内。例如，可通过本领域的技术人员显而易见的修饰，例如通过适当地保护干扰基团、通过利用除所述试剂和构建块外的本领域中已知的其它适合试剂和构建块和/或通过常规地改变反应条件，成功地合成根据本申请的非示例性化合物。或者，本文所公开或本领域中已知的其它反应将被认为适用于制备本申请的其它化合物。

应当理解，化合物中的手性中心可以“S”或“R”立体构型存在，或者以两者的混合物存在。在分子内，从手性中心画成直线的每个键包括(R)和(S)立体异构体两者以及它们的混合物。本文提供的实施例的化合物含有磷手性中心。通过HPLC分离下面实施例部分的每个实施例中的异构体混合物，得到异构体#A和异构体#B。这两者的结构式，由其对应的混合物结构式中用*标记相应的磷原子来表示。下面实施例部分中的每个“A”和“B”异构体中的磷手性中心的绝对立体化学（R或S）尚未确定。

LCMS条件：

仪器：配备有LC20AD泵和PDA检测器的Shimadzu；柱：Restek Ultra C18（50mm×2.1mm×5.0μm）；流动相：0.1% HCOOH的H₂O/ACN溶液；梯度：ACN在0.1分钟至2.5分钟内从5%到95%，ACN在2.5分钟至3.0分钟内为95%，ACN在3.0分钟至4.0分钟内从95%到98%，ACN在4.0分钟至4.15分钟内从98%到5%，ACN在4.15分钟至4.55分钟内为5%；柱温：25^oC；检测波长：214/254nm；流速：1.0mL/分钟；进样量：5μL。

HPLC分析条件：

仪器：具有DAD检测器的Agilent 1200系统；柱：Kinetex 5u EVO C18 100Å（150mm×4.6mm）；流动相：0.1% TFA的H₂O/ACN溶液；梯度：ACN在0.1分钟至7.5分钟内从5%到95%，ACN在7.5分钟至9.5分钟内为95%，ACN在9.5分钟至10分钟内从95%到5%；柱温：25^oC；检测波长：214/254nm；流速：1.0mL/分钟；进样量：5μL。

手性HPLC分析条件：

仪器：具有DAD的Agilent 1200系统；柱：Daicel AD-H（250mm×4.6mm×5.0μm）；流动相：己烷:IPA:MeOH=80:15:5，0.1% DEA；柱温：35^oC；检测波长：214/254nm；流速：1.0mL/分钟；运行时间：30分钟。

制备型HPLC（正相）条件：

仪器：Varian PREP-HPLC系统；柱：Uni Silica（250mm×21.2×10μm，120Å）；流动相和梯度：在20分钟内，DCM:MeOH=97:3至90:10；柱温：25^oC；检测波长：214/254nm；流速：20mL/分钟；进样量：0.5mL（样品浓度50mg/mL）。

制备型HPLC（反相）条件：

方法A：仪器：Shimadzu LC8AP PREP-HPLC系统；柱：Boston ODS（250mm×21.2mm×10μm，120Å）；流动相：0.1% TFA的H₂O/ACN溶液；梯度：ACN在1分钟至5分钟内为5%，ACN在5分钟至20分钟内从5%到25%，ACN在20分钟至25分钟内为25%；柱温：25^oC；检测波长：214/254nm；流速：20mL/分钟；进样量：1mL（样品浓度50mg/mL）。

方法B：仪器：Shimadzu LC8AP PREP-HPLC系统；柱：Boston ODS（250mm×21.2mm×10μm，120Å）；流动相：0.1% TFA的H₂O/ACN溶液；梯度：ACN在1分钟至5分钟内为5%，ACN在5分钟至20分钟内从10%到30%，ACN在20分钟至25分钟内为25%；柱温：25^oC；检测波长：214/254nm；流速：20mL/分钟；进样量：1mL（样品浓度50mg/mL）。

方法C：仪器：Shimadzu LC8AP PREP-HPLC系统；柱：Boston ODS（250mm×21.2mm×10μm，120Å）；流动相：0.1% TFA的H₂O/ACN溶液；梯度：ACN在1分钟至5分钟内为5%，ACN在5分钟至20分钟内从20%到50%，ACN在20分钟至25分钟内为25%；柱温：25^oC；检测波长：214/254nm；流速：20mL/分钟；进样量：1mL（样品浓度50mg/mL）。

手性制备型HPLC条件：

仪器：Shimadzu LC8AP PREP-HPLC系统；柱：Daicel AD-H Semi-Prep（250mm×10.0mm×5.0μm）；流动相：己烷:IPA:MeOH=80:15:5，0.1% DEA；柱温：35^oC；检测波长：214/254nm；流速：5.0mL/分钟；运行时间：15分钟。

表1 化合物列表

。

实施例1：中间体的合成

中间体s1的合成：

在N₂和0^oC下，向(R)-(((1-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)丙-2-基)氧基)甲基)膦酸（200mg，0.7mmol，1.0当量）在ACN（10mL）中的混合物中加入SOCl₂（828.7mg，7.0mmol，10当量）。将所得混合物加热回流4小时。然后将混合物冷却至室温，并减压浓缩，得到为黄色固体的粗品s1（226mg，黄色固体），其不经进一步纯化即用于下一步骤。

中间体s4的合成

向化合物s4-1（5g，46.7mmol）在MeOH（200mL）中的溶液中加入2-乙基丁醛（19g，186.67mmol，4当量）和HAC（1.5mL），在室温下搅拌1小时。然后在0^oC下向反应混合物中分批加入NaBH(OAc)3（39g，186.67mmol，4当量），在室温下搅拌16小时。真空除去反应溶剂，残余物通过快速硅胶色谱法（PE=100%）纯化，得到s4-2（7.8g无色油状物）。

向化合物s4-2（7.8g）在MeOH/THF（20mL/40mL）中的溶液中加入Pd/C（0.7g，10% w/w），在H₂和室温下搅拌16小时。然后过滤反应混合物，将滤液浓缩至干，将残余物s4（4.8g无色油状物）直接用于下一步骤。

实施例2 化合物的合成

对比化合物1A和1B：

在N₂下向冷却至0^oC的二丙胺（1.39g，13.75mmol，5.0当量）、(S)-异丙基2-氨基丙酸酯盐酸盐（462mg，2.75mmol，1.0当量）和DIPEA（1.77g，13.75mmol，5.0当量）在DCM（10mL）中的溶液中缓慢加入粗品s1的无水DCM（10mL）溶液，然后将混合物在室温下搅拌30分钟。将反应混合物用H₂O（50mL）猝灭，并用DCM（60mL×3）萃取，将合并的有机层用盐水（60mL×3）洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩至干。将残余物通过硅胶快速柱色谱法（DCM/MeOH=93:7）纯化，得到为浅黄色固体的1（225mg，13%产率），将其通过手性HPLC分离，得到为白色固体的1A（先出峰，118.8mg，52%产率）和为白色固体的1B（后出峰，67.4mg，30%产率）。

1A:

LCMS: Rt = 2.6 min; m/z= 484 [M+1]⁺;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.32 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 5.86 (brs, 2H),5.08 – 4.97 (m, 1H), 4.30 (dd, J = 14.3, 3.0 Hz, 1H), 4.18 - 4.08 (m, 1H),3.98 – 3.83 (m, 2H), 3.80 – 3.66 (m, 1H), 3.47 – 3.36 (m, 1H), 3.36 – 3.26(m, 1H), 2.84 – 2.65 (m, 4H), 1.42 – 1.31 (m, 7H), 1.25 – 1.20 (m, 9H), 0.78– 0.70 (m, 6H).

1B:

LCMS: Rt = 2.6 min; m/z= 484 [M+1]⁺;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.32 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 5.80 (brs, 2H),5.00 – 4.91 (m, 1H), 4.39 (dd, J = 14.3, 3.2 Hz, 1H), 4.23 – 4.16 (m, 1H),4.15-3.96 (m, 2H), 3.85 – 3.76 (m, 1H), 3.52 – 3.42 (m, 1H), 3.14 (t, J =10.0 Hz, 1H), 2.89-2.85 (m, 4H), 1.51 – 1.40 (m, 4H), 1.33 – 1.29 (d, J = 7.1Hz, 3H), 1.22 – 1.15 (m, 9H), 0.84 – 0.79 (m, 6H).

其余化合物使用与上述方法类似的方法，通过对应的中间体制备得到。

化合物 2A 和 2B：将对比化合物1A和1B的合成方法中的二丙胺替换为二戊胺（5当量），与 s1制得

2A或2B

2B或2A

2A:

LCMS: Rt = 1.581 min; m/z= 540 [M+1]+;

¹H NMR (400 MHz, cdcl3) δ 8.33 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 5.78 (s, 2H),5.08 – 4.97 (m, 1H), 4.33 – 4.29 (m, 1H), 4.18 – 4.08 (m, 1H), 3.92 (s, 2H),3.74 – 3.71 (m, 1H), 3.43 – 3.41 (m, 1H), 3.27 (s, 1H), 2.78 (s, 4H), 1.39(d, J = 6.9 Hz, 4H), 1.36 – 1.30 (m, 4H), 1.24 (d, J = 4.9 Hz, 15H), 1.10 –1.09 (m, 4H), 0.86 – 0.82 (m, 9H).

2B:

LCMS: Rt = 1.581 min; m/z= 540 [M+1]+;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃3) δ 8.32 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 5.78 (s, 2H),4.96 (s, 1H), 4.41– 4.38 (m, 1H), 4.23 – 4.12 (m, 1H), 3.94 (s, 2H), 3.84 –3.75 (m, 1H), 3.49 – 3.43 (m, 1H), 3.15 (s, 1H), 2.93 (d, J = 8.6 Hz, 4H),1.42 (s, 4H), 1.32 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.30 – 1.24 (m, 4H), 1.22 – 1.15 (m,13H), 0.87 (d, J = 6.9 Hz, 6H).

化合物 3：将对比化合物1的合成方法中的二丙胺替换为中间体s4（5当量），与 s1制得

LCMS: Rt = 1.967 min; m/z = 568 [M+1]⁺;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.33 (s, 1H), 7.96 (m, 1H), 5.76 (s, 2H),5.08 – 4.87 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.23 – 4.10 (m, 1H), 4.01 – 3.91 (m, 2H),3.90 – 3.81 (m, 0.5H), 3.72 (dd, J = 12.5, 10.1 Hz, 0.5H), 3.49 (m, 1H), 3.24(t, J = 11.1 Hz, 0.5H), 2.99 (t, J = 9.8 Hz, 0.5H), 2.92 – 2.62 (m, 4H), 1.46– 1.31 (m, 8H), 1.25 – 1.22 (m, 6H), 1.16 (m, 8H), 0.81 (m, 12H).

化合物4: 将对比化合物1的合成方法中的二丙胺替换为中间体s4（5当量），(S)-异丙基2-氨基丙酸酯盐酸盐替换为L-丙氨酸丁酯（1当量），与s1制得

LCMS: Rt = 2.133 min; m/z = 582 [M+1]⁺;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.34 (s, 1H), 8.00 (s, 0.4H), 7.92 (s,0.6H), 5.59 (m, 2H), 4.43 – 4.16 (m, 1H), 4.12 (m, 2H), 4.07 – 3.83 (m, 3H),3.72 (dd, J = 12.5, 10.0 Hz, 0.5H), 3.55 – 3.43 (m, 1.5H), 3.20 (t, J = 11.0Hz, 0.5H), 2.97 (m, 0.5H), 2.91 – 2.62 (m, 4H), 1.56 (m, 2H), 1.43 – 1.35 (m,6H), 1.30 (m, 4H), 1.24 – 1.14 (m, 8H), 0.92 (t, J = 8.3 Hz, 3H), 0.82 (m,12H).

化合物 5A 和 5B: 将对比化合物1A和1B的合成方法中的二丙胺替换为二异戊胺（5.0当量），(S)-异丙基2-氨基丙酸酯盐酸盐替换为2-氨基异丁酸乙酯盐酸盐（1当量），与s1制得

5A或5B

5B或5A

5A:

LCMS: Rt = 2.067 min; m/z= 540 [M+1]⁺;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.33 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 5.73 (s, 2H),4.33 (dd, J = 14.0, 2.4 Hz, 1H), 4.23-4.12 (m, 3H), 3.97 – 3.88 (m, 1H), 3.73– 3.63 (m, 2H), 3.51 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.39 (dd, J = 12.6, 7.7 Hz, 1H),2.87 (dd, J = 17.7, 8.9 Hz, 4H), 1.56 (s, 3H), 1.52 (s, 3H), 1.48 – 1.37 (m,2H), 1.31-1.25 (m, 6H), 1.24-1.20 (m, 4H), 0.83 (dd, J = 6.2, 4.7 Hz, 12H).

5B:

LCMS: Rt = 2.000 min; m/z= 540 [M+1]⁺;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.33 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 5.63 (s, 2H),4.42-4.34 (m, 1H), 4.22-4.12 (m, 3H), 3.98-3.89 (m, 1H), 3.71 (dd, J = 12.4,7.0 Hz, 1H), 3.48-3.39 (m, 2H), 3.05 – 2.87 (m, 4H), 1.51 (s, 3H), 1.49 –1.42 (m, 5H), 1.41 – 1.29 (m, 4H), 1.27 – 1.23 (m, 3H), 1.19 (d, J = 6.1 Hz,3H), 0.87 (d, J = 6.5 Hz, 12H).

化合物6: 将对比化合物1的合成方法中的二丙胺替换为中间体s4（5当量），(S)-异丙基2-氨基丙酸酯盐酸盐替换为2-氨基异丁酸乙酯盐酸盐（1当量），与 s1制得

LCMS: Rt = 2.300 min; m/z = 568 [M+1]⁺;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.33 (s, 1H), 7.95 (m, 1H), 5.60 (s, 2H),4.33 (m, 1H), 4.24 – 4.10 (m, 3H), 3.95 (m, 1H), 3.85 (dd, J = 12.6, 7.0 Hz,0.5H), 3.79 – 3.71 (m, 0.5H), 3.50 (m, 1H), 3.43 (d, J = 9.3 Hz, 0.5H), 3.25(d, J = 9.0 Hz, 0.5H), 2.89 – 2.62 (m, 4H), 1.55 (m, 3H), 1.45 (m, 3H), 1.36(m, 3H), 1.29 – 1.19 (m, 11H), 1.15 – 1.03 (m, 2H), 0.82 (m, 12H).

实施例3：抗病毒实验

抗HBV的体外抗病毒活性

如下所述使用HepG2.2.15细胞（来源：ATCC）评价体外抗HBV活性和细胞毒性。

抗病毒活性测定：将HepG2.2.15细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种到96孔板中，并维持在37°C/5% CO₂。在孵育24小时后，加入不同浓度的测试化合物和阳性对照（GS-7340和HS-10234）以及不含抑制剂（仅DMSO）的对照样品。采用8点系列稀释的方式评价测试化合物，其中每个点进行3倍稀释。在孵育72小时后，用含有相同浓度的相同测试化合物/阳性对照的新鲜培养基更换原培养基，并再继续培养3天。6天后收集细胞培养基的上清液，通过定量聚合酶链反应（qPCR）测定来确定HBV DNA的含量。通过以下等式计算抑制%：抑制（%）=100－(测试样品的DNA复制)/(DMSO的DNA复制)×100。EC₅₀由抑制曲线确定（采用GraphpadPrism 对数据进行Log(inhibitor) vs. response- Variable slope (four parameters)曲线拟合计算），并且结果示于表2中。

细胞毒性测定：用发光细胞生存力测定法评价细胞毒性。使用与抗病毒活性测定相同的方法接种HepG2.2.15细胞，并在测试化合物/阳性对照的存在下进行孵育。在孵育6天后，将Cell-Titer Glo（Promega）加入到每个孔中，并记录发光，以用于细胞生存力测定。通过以下等式计算细胞生存力%：

细胞生存力（%）=(测试样品的发光－培养基的平均发光)/(对照样品的平均发光－培养基的平均发光)×100。CC₅₀由生存力曲线确定（采用Graphpad Prism 对数据进行Log(inhibitor) vs. response- Variable slope (four parameters)曲线拟合计算），并且结果示于表2中。

表2 体外抗HBV活性和细胞毒性

EC₅₀：A:<100 nM; B:100-1000nM; C:>1000nM

从表2中可以看出，本申请的化合物对HBV病毒具有强抑制作用，并且细胞毒性低，与阳性对照GS-7340或HS-10234相当。

实施例4：对人外周血单核细胞（PBMC）中前药转化的评估

冷冻保存的人PBMC（来源：赛笠生物 SAILYBIO）用于评价前药向活性三磷酸酯形式的转化。将PBMC以2*10⁶/mL的细胞密度重悬于培养基中，并在37°C/5% CO₂下孵育1小时。细胞复苏后，切取5mL细胞悬液至15mL试管中，并与5mL在培养基中的5μM测试化合物（前药）或对照（替诺福韦艾拉酚胺，TAF）混合。在37°C/5% CO₂下再孵育3小时后，将样品以300g离心10分钟，然后弃去上清液。将细胞沉淀用10mL冰冷的PBS洗涤两次，并用700μL的70%甲醇裂解。将裂解物在-20°C下放置过夜，并在4°C下以10000rmp离心10分钟。最后，将650μL上清液转移至干净的96孔板中，并用氮气蒸发至干。然后将干燥的残余物用200μL初始LC流动相溶解，并上样到LC-MS/MS仪器中。针对每个样品测定三磷酸酯代谢物的响应。为了评估转化效率，计算从测试化合物测定的三磷酸酯代谢物相对于对照的响应比。相应结果见表3。

对Hep G2细胞中前药转化的评估

Hep G2细胞（来源：ATCC）也用于评价前药向活性三磷酸酯形式的转化。将Hep G2细胞用0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA消化，并以2×10⁶/mL的密度悬浮。为了接种细胞，在6孔板的每孔中加入1.5mL培养基和1mL细胞悬液。轻轻振荡，将平板置于培养箱中以37°C/5%CO₂过夜，从而允许细胞附着。细胞附着后，用含有5μM测试化合物（前药）或对照（替诺福韦艾拉酚胺，TAF）的新培养基更换培养基，并在37°C/5% CO₂下孵育。在每个特定时间点（1小时、4小时、7小时、24小时），除去培养基并用3mL冰冷的PBS洗涤细胞两次。洗涤后，用100μL0.25%胰蛋白酶-0.53mM EDTA在20°C解离细胞5分钟，并用500μL冰冷的70%甲醇裂解。将裂解物放置在-20°C下以用于裂解，并在4°C下以10000rmp离心10分钟。最后，将600μL上清液转移至干净的96孔板中，并用氮气蒸发至干。然后将干燥的残余物用200μL初始LC流动相溶解，并上样到LC-MS/MS仪器中。针对每个样品测定三磷酸酯代谢物的响应。为了评估转化效率，计算在每个时间点从测试化合物测定的三磷酸酯代谢物相对于对照的响应比。相应结果见表4。

表3 人外周血单核细胞(PBMCs)前药转化

表4 在Hep G2细胞中前药转化

。

表3与表4示出了在Hep G2细胞中，本申请实施例化合物与TAF相比的前药向活性三磷酸的转化率之比。从表中可以看出，本申请化合物2-6与TAF相比，不论是在PBMC中或者是在Hep G2细胞中，转化效率与TAF相比均有大幅增长，表明了本申请化合物在体内具有优于对比例的转化为活性物质三磷酸的能力，从而能够更好地发挥药效。

上述描述仅被视为本申请的原理的说明。此外，由于许多修改和变化对于本领域的技术人员来说将显而易见，所以并不期望将本申请限于如上文所示的确切构造和过程。因此，所有适合的修改和等效方案可以被视为属于由所附权利要求书界定的本申请的范围内。

Claims

1.一种如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，

其中，带“#1”磷原子为手性磷原子，为S构型和/或R构型；

R¹和R²独立地为C₄-C₈烷基；所述C₄-C₈烷基为正戊基、

R³为C₁-C₈烷基或C₃-C₈环烷基；

R⁴和R⁵独立地为氢或C₁-C₄烷基；

R⁶为氢或C₁-C₄烷基。

2.如权利要求1所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其满足如下条件中的一种或多种：

(1)R³为C₁-C₈烷基；

(2)R⁵为C₁-C₄烷基；

(3)R⁶为C₁-C₄烷基。

3.如权利要求1所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其满足如下条件中的一种或多种：

(1)各所述C₁-C₈烷基独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；

(2)各所述C₁-C₄烷基独立地为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；

(3)各所述C₃-C₈环烷基独立地为环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

4.如权利要求3所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其满足如下条件中的一种或多种：

(1)各所述C₁-C₈烷基独立地为乙基、异丙基或正丁基；

(2)各所述C₁-C₄烷基独立地为甲基。

5.如权利要求4所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其满足如下条件中的一种或多种：

(1)R³为乙基、异丙基或正丁基；

(2)R⁴为氢或甲基；

(3)R⁵为甲基；

(4)R⁶为甲基；

(5)所述C₄-C₈烷基为正戊基或

6.如权利要求1所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述如式I所示化合物为以下任意一种：

7.如权利要求1所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述如式I所示化合物为以下任意一种：

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1～7任一项所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还进一步包含抗感染剂的附加试剂。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还进一步包含抗病毒剂的附加试剂。

11.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还进一步包含免疫治疗剂的附加试剂。

12.一种如权利要求1～7任一项所述的如式I所示化合物或其药学上可接受的盐或如权利要求8～11任一项所述的药物组合物在制备用于预防和/或治疗病毒感染的药物中的应用；所述病毒为HBV病毒。