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CN116120327B - β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116120327B CN202310169653.1A CN202310169653A CN116120327B CN 116120327 B CN116120327 B CN 116120327B CN 202310169653 A CN202310169653 A CN 202310169653A CN 116120327 B CN116120327 B CN 116120327B
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Abstract

本发明公开β‑榄香烯13,14‑位对称的双取代衍生物及其制备方法和应用。β‑榄香烯13,14‑位对称的双取代衍生物的结构式如式(I)所示。通过在小分子的榄香烯上连接极性的胺基取代基团，可以显著改善分子整体的类药物特性，既保留了榄香烯原有的三个碳‑碳双键部分，同时又引入了含1个到多个杂原子，且整体分力量较小，提升药物穿透血脑屏障的能力，使穿透血脑屏障成为可能，有望开发出新型的抗脑胶质瘤药物。

Description

β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于β-榄香烯衍生物的制备技术领域，具体涉及β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
榄香烯是一类小分子挥发油类化合物，主要从温郁金的块根中提取获得。目前文献中所报道的榄香烯主要包括α-榄香烯、(±)-β-榄香烯、γ-榄香烯和δ-榄香烯，其中(-)-β-榄香烯是其发挥抗肿瘤作用的主要活性成分，具有广谱抗肿瘤活性，对多种癌症均有一定的疗效，如肝癌、乳腺癌、肺癌等。目前，以榄香烯为主要成分的多种制剂在临床上均取得了一定的抗癌疗效。
但是由于榄香烯极性小、水溶性差，生物口服利用度低，限制了其临床应用。因此，需要对榄香烯进行结构改造以获得水溶性好、生物口服利用度更高，生物活性优于榄香烯，且毒副作用小的榄香烯衍生物。
在过去的20～30年里，科研人员对β-榄香烯进行了大量的结构改造及活性研究工作。在不破坏榄香烯基本骨架及其双键的前提下，大部分的研究主要集中在β-榄香烯13-位点上的修饰，也有部分研究报道了在13和14位点上以相同取代基修饰，相对较少的报道涉及到13和14位β-榄香烯进行独特双胺化结构修饰。
脑胶质瘤是一种神经上皮来源的原发性颅内中枢神经系统的恶性肿瘤，是人类最难治疗的恶性肿瘤。大量抗肿瘤药物对治疗脑胶质瘤效果不明显，主要是因中枢神经系统与外周血循环之间存在血脑屏障(Blood–Brain Barrier,BBB)，使得许多药物无法穿过这一屏障，而不能发挥其抗脑胶质瘤活性。BBB是由彼此重叠覆盖连接紧密的内皮细胞，连续不断的基膜，以及星形细胞(星形胶质细胞，astrocyte，AS)等层层包围组成。这种多层膜性结构，构成了脑组织的防护性屏障，严格限制了血液与脑组织之间物质的交换，充分地保护了大脑免受外来化学物质的伤害。但对于存在病的大脑而言，BBB同样阻止了药物进入脑组织，进而严重影响了药物对脑部疾病的治疗。研究表明接近100％的大分子和98％的小分子药物不能够通过BBB，这就直接导致了帕唑帕尼、紫杉醇和多柔比星等常用抗肿瘤药物对脑胶质瘤疗效较差。而能够有效的穿过BBB的抗肿瘤药物在脑胶质瘤的治疗中可发挥更好的疗效，如替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)，尽管其体外抑制脑胶质瘤细胞增殖活性并不强，但在临床上已经作为抗脑胶质瘤药物广泛应用。
在研究和开发靶向药物治疗脑胶质瘤的过程中，如何提升药物穿透血脑屏障的能力仍然是亟待科学家们去解决的攻关难题。相比而言，提高药物的体外生物活性(抑制脑胶质瘤的增殖)则容易得多。因此，通过合适的方法修饰药物(如引入含氮原子的官能团，调整分子的物理化学属性)以提升药物穿透血脑屏障能力是药物学家多年来的研究热点。
榄香烯是从温郁金中提取出来的倍半萜化合物。它的分子量很小(MW 204)，具有广谱的抗肿瘤细胞活性。有文献表明，榄香烯本身具有穿透血脑屏障的能力，但是穿透程度仍然有限。另外有文献表明，榄香烯对脑胶质瘤有一定的抑制作用。榄香烯本身就具有一定的穿透血脑屏障的能力，但是这个能力比较弱。
通过在小分子的榄香烯上连接极性的胺基取代基团，可以显著改善分子整体的类药物特性(如良好的溶解性、亲脂性、膜穿透性以及代谢稳定性和理想的药代动力学和药效学特性等)。因此，在β-榄香烯的13-位和14-位连接分子量较小的含氮胺基取代基团，形成一类结构新颖的榄香烯双胺基取代化合物。这一类全新的分子实体保留了榄香烯原有的三个碳-碳双键部分(这三个碳-碳双键是榄香烯抗肿瘤活性的主要贡献元素)，同时又引入了含1个到多个杂原子，且整体分力量较小，使穿透血脑屏障成为可能，有望开发出新型的抗脑胶质瘤药物。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一类β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物。
β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物，其特征在于，所述β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物的结构式如式(I)所示：
式(I)中：
R1、R2各自独立选自以下结构片段：H、C1-6的烷基、-SO2R3、-COR3、-CO(O)R3，且R1、R2不同时为H、甲基、乙基和异丙基；
或者R1和R2与连接它们的N原子一起形成一个单杂环或一个多杂环结构，所述的单杂环或多杂环选择性地含有额外的0-3个选自N、O、S的杂原子；
R3选自C1-6的烷基、C2-6的烯基、C3-6的炔基、C3-6的环烷基或3-至7元的杂环基；
作为优选，所述R1和R2与连接它们的N原子一起形成一个单杂环或一个多杂环结构选自如下结构片段之一：
其中，R4选自氢、C1-6的烷基、C3-6的烯基、C3-6的炔基、C2-6的环烷基、3-至7元的杂环基、-C(O)R3或-SO2R3。
作为优选，所述选自如下结构片段之一：
在另外一个优选例中，所述β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物(I)为如下结构所示的化合物1～20中的任一种：
本发明的第二个目的是提供β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物的制备方法。
对于R1或R2为氢的式(I)结构β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物，可采用合成路线一：
其中，R1和R2的定义如上所述；
具体包括步骤：
(1)将β-榄香烯A-1进行13-位与14-位的烯丙位双氯代反应得中间体β-榄香烯双氯化合物A-2；
(2)将含有R1、R2取代基的氮杂原子官能团结构片段A-3，通过亲核取代反应连接到β-榄香烯的13-位与14-位上，得式(I)所示的β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物。
此外，对于R1和R2都不为氢的且不构成单杂环或多杂环结构的结构式(I)β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物，可采用合成路线二来制备：
具体包括步骤：
(1)将β-榄香烯A-1进行13-位与14-位的烯丙位双氯代反应得中间体β-榄香烯双氯化合物A-2；
(2)将含有R2取代基与P1保护基的氮杂原子官能团结构片段A-4，通过亲核取代反应连接到β-榄香烯的13-位与14-位上，得化合物A-5；
(3)去除化合物A-5中的保护基，并将所得的胺中间体与R1-X在碱性条件下进行取代反应，得式(I)化合物。
对于R1和R2都不为氢的且不构成单杂环或多杂环的式(I)β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物，还可采用合成路线三来制备：
具体的是，将合成路线二的中间体A-5去保护，所得的胺与适当的含R1的醛进行还原胺化反应，得式(I)化合物。
本发明式(I)化合物可通过如上的方法制得，然而该方法的条件，如反应物、溶剂、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于上面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易地进行。
本发明各合成路线的步骤(1)均可采用现有技术，如公开号为CN110683932A中公开的方法。
本发明的第三个目的是提供β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供了一种抗肿瘤药物，含有安全有效量的所述的β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物，或其光学异构体、消旋体、单一对映异构体、可能的非对映异构体，或其药学上可接受的盐、前药、氘代衍生物、水合物、溶剂化物。
作为优选，所述抗肿瘤药物还可以包括药学上可以接受的载体或赋形剂。
作为优选，所述应用和所述抗肿瘤药物中，所述肿瘤包括结肠癌、肺癌、前列腺癌、脑胶质瘤。
由于本发明化合物具有抑制各种肿瘤细胞株增殖的活性，因此，本发明化合物及其各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解各种疾病，包括各种癌症。
本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-1000mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组分能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)和局部给药。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，如甘油；(d)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠；(e)缓溶剂，如石蜡；(f)吸收加速剂，如季胺化合物；(g)润湿剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，如高岭土；(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
固体剂型，如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部位中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型，包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂，包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要推进剂一起混合。
作为优选，本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～5000mg，优选5～2000mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明提供了式(I)所示结构的β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物、含有式(I)化合物的药物组合物及水合物，以及这些化合物的同位素衍生物、手性异构体、变构体、不同的盐、前药和制剂等。本发明还提供了所述β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物的制备方法、用途，以及这些化合物对各种肿瘤细胞株的增殖的活性。本发明中的β-榄香烯13,14-位对称的双取代衍生物有望成为抗肿瘤候选药物，治疗脑胶质瘤等。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：化合物1的制备
中间体1-b
将β-榄香烯1-a(3.8g,18.6mmoL)溶于二氯甲烷(25mL)与冰乙酸(22mL)的混合溶液中。加入催化量的TBAF，冰浴下缓慢滴入NaClO(M＝3.0，28mL,84mmoL)水溶液，耗时5小时，滴完继续保持0℃搅拌1小时。加入10％亚硫酸钠水溶液(30mL)及饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)淬灭反应。上述的反应液用乙酸乙酯萃取(3×50mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗(30mL)，并用无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，滤液在减压条件下浓缩，所得粗品经硅胶柱层析(100％石油醚)得到无色液体化合物1-b(1.84g,收率37％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.80(dd,J＝17.1,11.1Hz,1H),5.29(d,J＝1.0Hz,1H),5.18(d,J＝1.0Hz,1H),5.05(s,1H),4.98–4.90(m,3H),4.14–4.08(dd,J＝11.6,0.8Hz,1H),4.11(s,2H),3.98(dd,J＝11.6,0.8Hz,1H),2.37–2.22(m,2H),1.79–
1.63(m,2H),1.59–1.43(m,4H),0.99(s,3H)。
中间体1-d
将化合物1-b(783mg,2.88mmoL)溶于干燥DMF(1mL)。于室温下加入真空干燥的碳酸铯(250mg,1.8mmoL)和双胺1-c(349mg,1.65mmoL)，70℃搅拌10小时。减压除去DMF，剩余物用乙酸乙酯稀释(40mL)，并用水洗(20mL)，水相用乙酸乙酯反萃(20mL)。合并的有机相用饱和食盐水洗(20mL)，并用无水硫酸钠干燥。过滤除去干燥剂，滤液在减压条件下浓缩后所得粗品经硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1:1)得到无色液体化合物1-d(220mg,收率63％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ5.77(dd,J＝17.5,10.8Hz,1H),5.05(d,J＝1.6Hz,1H),4.93(d,J＝1.7Hz,1H),4.91–4.80(m,3H),4.72(d,J＝1.7Hz,1H),3.54(s,4H),3.18(s,4H),2.91(dd,J＝231.9,13.9Hz,2H),3.07–2.88(m,2H),2.75(dt,J＝8.6,4.1Hz,4H),2.62–2.45(m,4H),2.41–2.25(m,4H),2.15(dd,J＝12.6,3.3Hz,1H),2.04(d,J＝7.4Hz,1H),1.66–1.55(m,2H),1.54–1.45(m,2H),1.44(s,18H),1.44–1.35(m,2H),0.97(s,3H).
化合物1
将化合物1-d(220mg,0.35mmoL)溶于干燥二氯甲烷中(2mL)，加入CF3COOH(1mL)，逐渐升至室温搅拌3小时。饱和碳酸氢钠溶液(10mL)调节PH＝9，二氯甲烷(3×10mL)萃取，有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，所得的粗品经C18柱层析(乙腈：水＝1:10)纯化，得无色油状化合物1(97.8mg，收率65％)。1HNMR(500MHz,MeOH)δ5.70(dd,J＝17.5,10.8Hz,1H),5.37(s,1H),5.25(d,J＝6.4Hz,2H),5.15(s,1H),4.94–4.84(m,4H),4.28–3.65(m,5H),3.51(s,4H),3.40(t,J＝10.7Hz,5H),3.35–3.23(m,8H),3.21(s,2H),3.15(s,3H),2.12(dd,J＝10.9,4.9Hz,1H),2.01(dq,J＝12.4,5.9,5.2Hz,1H),1.60(dd,J＝11.9,6.0Hz,2H),1.50–1.33(m,4H),0.91(s,3H).
实施例2：化合物2的制备
化合物2
将化合物1(157.8mg,0.35mmoL)溶于干燥二氯甲烷(2mL)，向反应液中加入甲醛(105mg,3.5mmoL)和三乙酰氧基硼氢化钠(440mg,2.0mmoL),将反应液室温下搅拌8小时，向反应液中加入碳酸钾水溶液调节PH＝9，二氯甲烷萃取，有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇＝15:1)纯化，得无色油状化合物2(62mg，收率39％)。1H NMR(500MHz,MeOH)δ5.74(dd,J＝17.6,10.8Hz,1H),4.97(d,J＝1.7Hz,1H),4.85(d,J＝1.6Hz,1H),4.81(dd,J＝5.6,1.6Hz,2H),4.78(dd,J＝3.2,1.4Hz,1H),4.69(d,J＝1.8Hz,1H),3.13(d,J＝13.4Hz,1H),2.95(s,2H),2.73–2.65(m,4H),2.65–2.57(m,5H),2.41(dd,J＝9.3,6.5Hz,1H),2.34(dd,J＝5.6,3.8Hz,4H),2.30–2.27(m,2H),2.26(d,J＝3.3Hz,1H),2.24(d,J＝3.0Hz,1H),2.22(s,3H),2.22(s,3H),2.21–2.18(m,2H),2.18–2.12(m,4H),2.02(ddq,J＝11.8,7.5,3.8Hz,1H),1.67–1.51(m,2H),1.45(dddd,J＝15.7,9.9,6.1,2.6Hz,3H),1.40–1.28(m,2H),1.28–1.12(m,2H),0.92(s,3H).
实施例3：化合物3的制备
化合物3
将化合物1-b(100mg,0.36mmoL)溶于干燥DMF(1.5mL)。于室温下加入DIPEA(298mg,2.31mmoL)和化合物2-a(119mg,1.10mmoL)，100℃搅拌8小时。减压除去DMF，剩余物用乙酸乙酯稀释(20mL)，并用水洗(20mL)，水相在减压条件下浓缩。浓缩后所得粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝40:1)得到无色油状化合物3(30mg,收率31％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.81–5.69(m,1H),5.04–4.69(m,6H),3.30(d,J＝13.2Hz,1H),3.13(d,J＝13.0Hz,1H),3.03(d,J＝13.0Hz,1H),2.72(d,J＝13.3Hz,1H),2.17(d,J＝9.9Hz,7H),2.01(qd,J＝9.9,3.4Hz,1H),1.69–1.31(m,9H),0.96(s,3H),0.48–0.32(m,8H).
实施例4：化合物4的制备
中间体3-b
将NaH(48.5mg,1.2mmoL)冰浴条件下溶于干燥DMF(1.5mL)中，搅拌15min后加入化合物2-b，70℃搅拌8个小时。完全转化，向反应液中加水(10mL)终止反应，再用乙酸乙酯萃取(3×15mL)。合并的有机相用饱和食盐水(2×15mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥。干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝15：1)纯化，得无色油状化合物4(115mg,收率62％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.85–5.77(m,1H),4.97–4.72(m,6H),3.76(dq,J＝50.4,16.4Hz,4H),2.50(d,J＝8.3Hz,2H),1.88(dd,J＝11.6,4.5Hz,2H),1.71–1.55(m,4H),1.47(d,J＝3.0Hz,22H),1.01(s,3H),0.72–0.46(m,9H).
化合物4
将化合物3-b(115mg,0.22mmoL)溶于干燥甲醇(2mL)。于0℃下加入HCl的二氧六环溶液(2mL,0.5mmoL),逐渐升至室温搅拌3小时。减压除去甲醇，再用乙酸乙酯稀释后萃取(10mL)，水相减压抽干后得白色固体化合物4(68mg,收率100％)。1HNMR(500MHz,MeOH)δ5.88(dd,J＝17.5,10.8Hz,1H),5.41(s,1H),5.28(d,J＝5.0Hz,2H),5.20(s,1H),5.03–4.95(m,2H),3.86–3.74(m,2H),3.64(s,2H),2.76(dtt,J＝18.8,7.5,3.9Hz,2H),2.42(dd,J＝12.8,3.0Hz,1H),2.27(td,J＝10.2,8.7,6.0Hz,1H),1.79(dq,J＝13.4,2.8Hz,1H),1.73(ddd,J＝15.0,6.2,3.2Hz,1H),1.69–1.63(m,1H),1.63–1.57(m,1H),1.53(ddd,J＝14.8,7.8,3.6Hz,2H),1.08–0.96(m,7H),0.89(tq,J＝5.9,3.6,2.9Hz,4H).
实施例5：化合物5的制备
参照实例3中化合物3的合成步骤，得到黄色油状化合物5(45mg，收率36％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ5.75(dd,J＝17.5,10.8Hz,1H),5.05(q,J＝1.5Hz,1H),4.94–4.88(m,4H),4.80(dt,J＝11.3,6.8Hz,5H),4.49–4.38(m,4H),3.94(dddd,J＝20.2,13.1,7.0,6.1Hz,2H),3.17(s,2H),3.09(dt,J＝2.5,1.2Hz,2H),2.05(td,J＝11.6,11.2,5.8Hz,2H),1.67–1.40(m,8H),0.99(s,3H).
实施例6：化合物6的制备
中间体5-b
将化合物5-a(74.5mg,0.33mmoL)溶于干燥DMF(1.0mL)。于室温下加入K2CO3(50mg,0.36mmoL)和化合物2-b(30mg,0.11mmoL)，80℃搅拌8小时。减压除去DMF，剩余物用乙酸乙酯稀释(20mL)，并用水洗(20mL)，水相用乙酸乙酯反萃(20mL)。合并的有机相用饱和食盐水(2×15mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥。干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩。浓缩后所得粗品经硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝40:1)得到无色油状化合物5-b(70mg,收率98％)。1HNMR(500MHz,MeOH)δ5.85–5.77(m,1H),4.97–4.92(m,2H),4.90(dt,J＝3.3,1.6Hz,2H),4.84(s,1H),3.36(q,J＝5.2,4.8Hz,8H),3.17(s,2H),3.11(d,J＝7.4Hz,7H),3.05(d,J＝7.8Hz,2H),2.01(ddt,J＝14.9,11.8,3.2Hz,2H),1.71(ddd,J＝11.7,7.2,4.4Hz,8H),1.67–1.42(m,25H).
化合物6
参照实例4中化合物4的合成步骤，得到白色固体化合物6(18mg，收率60％)。1HNMR(500MHz,MeOH)δ5.87(dd,J＝17.4,10.7Hz,1H),5.54(s,1H),5.37(d,J＝18.5Hz,2H),5.24(s,1H),5.03–4.96(m,2H),4.27(t,J＝9.2Hz,2H),4.16(dd,J＝24.0,11.4Hz,3H),4.00(td,J＝24.1,9.2Hz,5H),3.88(d,J＝12.6Hz,1H),3.77(d,J＝12.6Hz,1H),3.28(s,4H),3.20(d,J＝6.4Hz,4H),2.44–2.31(m,5H),2.20(t,J＝10.3Hz,5H),1.80–1.70(m,2H),1.70–1.56(m,3H),1.54(d,J＝7.3Hz,2H),1.05(s,3H).
实施例7：化合物7的制备
中间体6-b
参照实例6中中间体5-b的合成步骤，得到黄色油状化合物6-b(78mg，收率40％)。1H NMR(500MHz,MeOH)δ5.72(dd,J＝17.5,10.8Hz,1H),4.98(s,1H),4.87(d,J＝1.5Hz,1H),4.82–4.77(m,2H),3.78–3.68(m,8H),3.22–3.13(m,3H),2.97(s,2H),2.65–2.58(m,3H),2.56(s,1H),2.53–2.39(m,5H),1.95(q,J＝6.8Hz,4H),1.33(s,21H),0.92(s,2H).
化合物7
将化合物6-b(40mg,0.06mmoL)溶于干燥甲醇(1mL)。于0℃下加入HCl的二氧六环溶液(1mL,0.5mmoL),逐渐升至室温搅拌3小时。减压除去甲醇，再用乙酸乙酯稀释后萃取(10mL)。水相在减压条件下浓缩，浓缩后所得粗品经C18柱层析(乙腈：水＝0：1)得到无色油状化合物7(23mg，收率67％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.87(dd,J＝17.5,10.7Hz,1H),5.56(s,1H),5.40(s,1H),5.35(s,1H),5.28(s,1H),5.03–4.93(m,3H),4.57–4.26(m,6H),4.15(dd,J＝19.4,10.7Hz,7H),3.83(t,J＝14.2Hz,4H),3.71–3.36(m,8H),2.58(tt,J＝7.9,3.9Hz,4H),2.48(dd,J＝12.7,2.9Hz,1H),2.32(d,J＝12.0Hz,1H),1.89(d,J＝13.0Hz,1H),1.78(dd,J＝12.7,5.3Hz,1H),1.70–1.53(m,4H),1.04(s,3H).
实施例8：化合物8的制备
中间体7-b
参照实例3中化合物3的合成步骤，得到黄色油状化合物7-b(247mg，收率51.6％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ5.79(dd,J＝17.5,10.7Hz,1H),5.02(s,1H),4.94–4.80(m,4H),4.77(s,1H),3.74–3.49(m,8H),2.98(d,J＝13.9Hz,1H),2.89(d,J＝13.4Hz,1H),2.82(d,J＝13.4Hz,1H),2.57(d,J＝13.8Hz,1H),2.47–2.11(m,8H),2.10–1.95(m,2H),1.44(s,24H),0.99(s,3H).
化合物8
参照实例3中化合物3的合成步骤，得到黄色油状化合物7-b(22mg，51.6％)。1HNMR(500MHz,MeOH)δ5.87(dd,J＝17.5,10.8Hz,1H),5.51(s,1H),5.44–5.37(m,2H),5.35(s,1H),5.04–4.93(m,2H),4.08–4.00(m,5H),3.91(s,4H),3.70(dd,J＝13.0,10.4Hz,2H),3.66(s,4H),3.42(d,J＝12.8Hz,1H),3.10(qd,J＝9.8,7.8,3.5Hz,2H),3.01(s,2H),2.98–2.85(m,2H),2.54(dd,J＝12.5,2.7Hz,1H),2.40–2.28(m,8H),2.01(d,J＝4.6Hz,2H),1.91–1.85(m,1H),1.75(d,J＝11.8Hz,1H),1.66(dd,J＝14.7,11.5Hz,1H),1.61(dd,J＝11.8,2.7Hz,1H),1.58–1.49(m,2H),1.25–1.15(m,2H),1.03(s,3H).
实施例9：化合物9的制备
参照实例1中化合物1-d的合成步骤，得到无色油状化合物9(87mg，收率73％)。1HNMR(500MHz,DMSO)δ7.65(d,J＝2.3Hz,1H),7.58(d,J＝2.3Hz,1H),7.43(d,J＝1.8Hz,2H),6.25(dt,J＝4.1,2.1Hz,2H),5.84(dd,J＝17.4,10.8Hz,1H),5.02–4.88(m,3H),4.77(d,J＝31.0Hz,3H),4.62(d,J＝6.2Hz,4H),1.82(ddd,J＝67.2,12.3,3.3Hz,2H),1.59–1.29(m,6H),0.97(s,3H).
实施例10：化合物10的制备
参照实例4中化合物3-b的合成步骤，得到无色油状化合物10(170mg，收率71.7％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.83(dd,J＝17.4,10.7Hz,1H),5.14(s,1H),5.04(d,J＝9.5Hz,2H),4.97–4.87(m,3H),3.98(d,J＝14.5Hz,1H),3.79–3.67(m,2H),3.28(d,J＝14.5Hz,1H),2.83(s,3H),2.80(s,3H),2.76(s,3H),2.73(s,3H),2.14(dd,J＝12.5,3.6Hz,1H),2.11–2.04(m,2H),1.68(d,J＝5.9Hz,1H),1.63(s,1H),1.61–1.54(m,3H),1.54–1.46(m,2H),1.02(s,3H).
实施例11：化合物11的制备
中间体10-b
参照实例3中化合物3的合成步骤，得到黄色油状化合物10-b(170mg，收率54％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.73(dd,J＝17.6,10.8Hz,1H),4.98(s,1H),4.87(s,1H),4.84(d,J＝6.1Hz,1H),4.80(d,J＝3.1Hz,1H),4.72(s,1H),3.47–3.24(m,8H),2.96(d,J＝13.8Hz,1H),2.84(q,J＝13.4Hz,2H),2.58(d,J＝13.9Hz,1H),2.33–2.21(m,6H),2.15(t,J＝15.1Hz,3H),1.39(d,J＝1.5Hz,24H),0.93(s,3H).
化合物11
将化合物10-b(115mg,0.22mmoL)溶于干燥二氯甲烷(2mL)，室温下加入CF3COOH，搅拌3个小时。反应液DCM稀释(20mL)，并用水洗，水相饱和碳酸氢钠溶液调节PH＝9，再用二氯甲烷萃取，有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠燥，干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，得无色油状化合物11(80mg，收率98％)。1H NMR(500MHz,DMSO)δ5.81(dd,J＝17.5,10.7Hz,1H),5.02(s,1H),4.91(s,2H),4.90–4.83(m,2H),4.78(s,1H),2.97(d,J＝13.7Hz,1H),2.93–2.68(m,9H),2.61(t,J＝15.4Hz,2H),2.41–2.14(m,8H),2.04(q,J＝16.8,14.1Hz,2H),1.67–1.60(m,1H),1.57(d,J＝12.1Hz,1H),1.52–1.39(m,3H),1.35(d,J＝10.8Hz,1H),0.97(s,3H).
实施例12：化合物12的制备
参照实例1中化合物1-d的合成步骤，得到无色油状化合物12(66mg，收率91％)。1HNMR(500MHz,DMSO)δ5.86–5.76(m,1H),4.99(d,J＝5.8Hz,1H),4.94–4.84(m,4H),4.77(d,J＝2.0Hz,1H),3.00(d,J＝13.4Hz,1H),2.87(s,2H),2.45–2.18(m,16H),2.15(s,6H),2.05(tt,J＝11.8,3.5Hz,2H),1.65–1.33(m,7H),0.97(s,3H).
实施例13：化合物13的制备
中间体12-b
参照实例1中化合物1-d的合成步骤，得到黄色油状化合物12-b(426mg，收率91％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.82(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),4.97–4.93(m,1H),4.92(q,J＝1.3Hz,1H),4.86(s,2H),4.76–4.72(m,2H),4.25(d,J＝17.1Hz,1H),4.16(d,J＝2.9Hz,2H),3.89(d,J＝17.1Hz,1H),1.99–1.87(m,2H),1.71–1.65(m,1H),1.64(s,4H),1.63–1.58(m,2H),1.46(d,J＝2.9Hz,35H),1.01(s,3H).
化合物13
参照实例6中化合物5-b的合成步骤，得到无色油状化合物13(20mg，收率12％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.26(dd,J＝7.8,4.8Hz,4H),6.51(dt,J＝7.7,4.7Hz,2H),5.83(dd,J＝17.4,10.9Hz,1H),5.09(d,J＝1.3Hz,1H),4.98(q,J＝1.4Hz,1H),4.97–4.94(m,2H),4.92–4.89(m,1H),4.79(s,1H),4.11–4.01(m,3H),3.90(ddt,J＝16.1,5.2,1.4Hz,1H),2.04(td,J＝10.5,9.0,4.6Hz,2H),1.73–1.65(m,3H),1.52–1.45(m,3H),1.02(s,3H).
实施例14：化合物14的制备
中间体13-b
参照实例2中化合物2的合成步骤，得到无色油状化合物13(214mg，收率100％)。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ4.03(s,2H),2.99(d,J＝68.6Hz,2H),2.79(d,J＝11.0Hz,2H),2.35(s,4H),1.44(s,9H).
中间体14
参照实例3中化合物3的合成步骤，得到黄色油状化合物14(31mg，收率35％)。1HNMR(500MHz,MeOH)δ5.85–5.78(m,1H),4.95–4.87(m,4H),4.82(d,J＝13.7Hz,3H),3.51(d,J＝6.1Hz,2H),3.48(t,J＝7.0Hz,2H),3.14–2.97(m,3H),2.87(d,J＝3.6Hz,5H),2.85–2.78(m,5H),2.41(s,5H),2.40(s,3H),2.08–2.00(m,2H),1.94(dd,J＝8.4,5.3Hz,2H),1.70–1.58(m,2H),1.58–1.50(m,3H),1.50–1.40(m,2H),1.01(s,3H).
实施例15：化合物15的制备
化合物15
将化合物14-a(27.6mg，0.19mmoL)、HATU(82.1mg，0.21mmoL)、DIPEA(46.4mg，0.36mmoL)溶于DMF(1mL)中，加入化合物12-c(30mg，0.09mmoL)，室温搅拌8个小时。反应液用DCM(2×10mL)萃取，有机相饱和食盐水(2×10mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥。干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)纯化，得无色油状化合物1(30mg，收率69％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.73(ddd,J＝8.5,5.1,2.5Hz,4H),7.11–6.95(m,4H),5.74(dd,J＝17.3,10.9Hz,1H),4.98(s,1H),4.93–4.83(m,4H),4.75(s,1H),4.07–3.91(m,3H),3.81(dd,J＝15.9,5.2Hz,1H),2.02–1.89(m,3H),1.83(s,1H),1.68–1.50(m,3H),1.50–1.38(m,3H),0.94(s,3H).
实施例16：化合物16的制备
化合物15-b
将化合物15-a(176mg，0.538mmoL)溶于干燥乙醇(2mL)中，加入Et3N(113mg，1.12mmoL)和化合物11(100mg，0.224mmoL)，60℃搅拌4个小时。反应液用二氯甲烷(2×10mL)萃取，有机相饱和食盐水(2×10mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥。干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)纯化，得黄色油状化合物15-b(135mg，收率48％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.70(dd,J＝8.8,3.3Hz,2H),5.86–5.78(m,1H),5.38(d,J＝1.5Hz,4H),5.10(s,1H),5.00–4.97(m,2H),4.94(d,J＝1.3Hz,1H),4.92–4.89(m,1H),4.84(s,1H),3.88–3.61(m,8H),3.26–3.00(m,4H),3.00–2.82(m,4H),2.52(s,8H),1.34–1.19(m,8H),1.02(d,J＝3.2Hz,3H),0.99–0.94(m,4H).
化合物16
将化合物15-b(135mg，0.141mmoL)溶于干燥二氯甲烷(1mL)中，加入CF3COOH(0.5mL)，室温搅拌3个小时。反应液用饱和NaHCO3溶液(10mL)洗，二氯甲烷(2×10mL)萃取，有机相饱和食盐水(2×10mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥。干燥剂经过滤除去，滤液在减压条件下浓缩，所得的粗品经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝1：1)纯化，得黄色油状化合物16(35.7mg，收率36％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.69(dd,J＝5.7,3.4Hz,2H),5.79(dd,J＝17.5,10.7Hz,1H),5.44(d,J＝1.6Hz,3H),4.96(d,J＝4.1Hz,2H),4.92(d,J＝1.3Hz,1H),4.90–4.84(m,2H),4.83(s,1H),3.44(t,J＝5.5Hz,8H),3.10(d,J＝13.8Hz,1H),3.02–2.88(m,2H),2.70(d,J＝13.8Hz,1H),2.59–2.47(m,6H),2.40(d,J＝13.4Hz,2H),2.20(dd,J＝12.9,3.2Hz,1H),2.11–2.03(m,1H),1.62(td,J＝18.0,15.3,9.7Hz,2H),1.47(dtd,J＝17.8,13.6,4.5Hz,4H),0.99(s,4H).
肿瘤细胞增殖抑制实验
体外抗肿瘤活性评价
1.实验设备与试剂
1.1仪器
生物安全柜(上海百基生物科技有限公司)、恒温二氧化碳培养箱(THERMO)、酶联免疫分析仪(Spark)、倒置显微镜(Nikon)、移液枪一套(eppendorf)和离心机(beckmancoulter)。
1.2试剂
DMEM(浙江森瑞生物科技有限公司)、RPMI 1640(浙江森瑞生物科技有限公司)、McCoy’S 5A(浙江森瑞生物科技有限公司)、Fatal Bovine Serum(BI)、PBS(浙江森瑞生物科技有限公司)、Trypsin(浙江森瑞生物科技有限公司)、DMSO(Coolaber)和CCK-8(Coolaber)。
1.3细胞株
人结肠癌细胞(HCT116)、人肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞PC-3、人脑胶质瘤细胞U87MG和人脑胶质瘤细胞U251。
2.实验方法
1)取对数生长期的受试细胞，经胰酶消化、计数后，以5×104/mL的浓度接种于96空培养板中，每孔100μL(每孔5×103个细胞)，于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；
2)用10％FBS/DMEM或RPMI 1640或McCoy’S 5A完全培养基稀释待测药物至不同浓度。实验组更换含不同浓度被测样品的培养液，对照组更换含等体积溶剂(DMSO)的培养液，每组设立3个平行孔，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养48h；
其中，PC-3细胞、A549细胞使用RPMI 1640完全培养基，U87MG细胞、U251细胞使用DMEM完全培养基，HCT116细胞使用McCoy’S 5A完全培养基。
3)每孔加入CCK-8溶液10μL，于37℃继续培养1-4h，酶标仪在490nm处测定每个孔的吸光度值(OD值)；
4)用以下公式计算存活率和抑制率
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％
抑制率＝[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100％
应用GraphPad Prism 7.0软件,使用非线性回归模型绘制S型剂量-存活率曲线并计算IC50值。
As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物)的吸光度
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、溶媒(DMSO)的吸光度
Ab：空白孔(不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8)的吸光度
3.实验结果
按上述实验方法测定了目标化合物对两种肿瘤细胞的增殖抑制作用，结果如表1所示。
表1目标化合物对U87和U251细胞的单浓度抑制率
注：其中“A”表示抑制率大于或等于70％，“B”表示抑制率在20％-70％之间，“C”表示抑制率在20％以下。
上述测试结果表明，化合物1，2，6，7，9，10对U87和U251细胞的抑制效果均优于β–elemene。
此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种β-榄香烯13，14-位对称的双取代衍生物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述β-榄香烯13，14-位对称的双取代衍生物的结构如式(I)所示：
式(I)中：
所述选自如下结构片段之一：
2.一种β-榄香烯13，14-位对称的双取代衍生物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述β-榄香烯13，14-位对称的双取代衍生物为如下结构所示的化合物中的任一种：
3.一种如权利要求1-2任一项所述β-榄香烯13，14-位对称的双取代衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法采用合成路线一：
具体包括步骤：
(1)将β-榄香烯A-1进行13-位与14-位的烯丙位双氯代反应得中间体β-榄香烯双氯化合物A-2；
(2)将含有R1、R2取代基的氮杂原子官能团结构片段A-3，在碱的作用下与A-2通过亲核取代获得式(I)所示的β-榄香烯13，14-位对称的双取代衍生物。
4.根据权利要求1-2任一项所述的β-榄香烯13，14-位对称的双取代衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤。
5.一种抗肿瘤药物，其特征在于，含有安全有效量的权利要求1-2任一项所述的β-榄香烯13，14-位对称的双取代衍生物，或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求5所述的一种抗肿瘤药物，其特征在于，还包括药学上可以接受的载体或赋形剂。
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