CN118955627B - 一种混合型抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种混合型抑制α‑葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物。所述组合物其氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本发明提供一种混合型抑制α‑葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物，包含两条抑制α‑葡萄糖苷酶活性较好，并且在体内可以延缓淀粉消化的甘薯蛋白肽，经抑制动力学表明，属于混合型抑制剂。

Description

一种混合型抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种混合型抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物。

背景技术

糖尿病是一种广泛存在的代谢紊乱疾病，长期高血糖会导致各种组织的慢性损伤和功能障碍，并引起视网膜损伤、慢性肾衰竭、等并发症。因此控制血糖，尤其是餐后血糖，是糖尿病有效的治疗方法，而延迟碳水化合物的代谢则是控制餐后血糖的主要措施。α-葡萄糖苷酶是参与碳水化合物代谢的关键酶，主要位于小肠黏膜刷状缘细胞处。α-葡萄糖苷酶抑制剂控制餐后血糖的机制主要为：抑制小肠部位的各种α-葡萄糖苷酶，使碳水化合物分解为葡萄糖的速度减缓，从而减慢葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖症状。虽然，合成的α-葡萄糖苷酶抑制药物已经上市(如阿卡波糖等)，但由于它们有一定的毒副作用，因此从天然产物中发现更高效和安全的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有广阔的前景。

甘薯(Dioscorea esculenta(Lour.)Burkill)现为我国第五大粮食作物，在中国各地得到广泛种植，总产量和种植面积均居世界首位。甘薯主要用于淀粉加工，其加工副产物含有较为丰富的蛋白质、膳食纤维、微量元素等营养物质，具有产量大、含水量高等特点，估计每年因生产甘薯淀粉而产生的废水量达2000万～4000万t，直接丢弃会导致严重的环境污染和资源浪费。

目前已有文献报道过甘薯蛋白多肽的抗氧化、降血压等活性，但没有从甘薯蛋白中制备抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的报道。而酶的抑制动力学角度来看，酶的抑制剂又分为竞争型抑制剂、反竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂，混合型抑制剂等。甘薯肽作为α-葡萄糖苷酶的酶制剂的应用也未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题为目前已有文献报道过甘薯蛋白多肽的抗氧化、降血压等活性，但没有从甘薯蛋白中制备抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的报道。

为解决上述问题，本发明提供一种混合型抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物，包含两条抑制α-葡萄糖苷酶活性较好，并且在体内可以延缓淀粉消化的甘薯蛋白肽，经抑制动力学表明，属于混合型抑制剂。

为达到上述目的，本发明通过以下技术手段实现：一种混合型抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

SEQ ID NO.1：

氨基酸序列Trp-Glu-Ser-Gly-Pro-Trp，缩写WESGPW。

SEQ ID NO.2：

氨基酸序列Gly-Thr-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Lys-Glu，缩写GTPPPPPPPPKE。

进一步的，上述甘薯肽组合物由人工合成。

上述甘薯肽组合物在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性制品中的应用。两种甘薯肽具有竞争性和非竞争性抑制的特点，不仅可以与底物竞争对应的α-葡萄糖苷酶催化活性位点，而且还与非活性位点相互作用。由于酶催化位点的数量是一定的，当甘薯肽与酶的活性位点优先结合后，对应的底物就无法与酶上的活性位点进行结合，降低了酶与寡糖之间的结合率；同时，它们与酶的非活性位点结合，形成寡肽-酶-底物三元复合物，使得寡糖的糖苷键不能被裂解，大量寡糖无法被酶催化为人体所能吸收的单糖，从而避免出现餐后高血糖。

本发明的有益效果在于：

(1)从甘薯肽中得到了两个新型肽段，抑制动力学表明属于混合型抑制α-葡萄糖苷酶抑制剂，无毒无致敏性，不仅在体外具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且在体内也表现出α-葡萄糖苷酶抑制活性，为抑制α-葡萄糖苷酶活性制品提供了新的原料。

(2)两个新型肽段均来自甘薯蛋白，为甘薯蛋白的研究开拓了新的方向。

附图说明

图1是SEQ ID NO.1所示多肽的化学结构式。

图2是SEQ ID NO.2所示多肽的化学结构式。

图3是SEQ ID NO.1所示多肽的二级质谱图。

图4是SEQ ID NO.2所示多肽的二级质谱图。

图5是P1(WESGPW)和P2(GTPPPPPPPPKE)与α-葡萄糖苷酶的对接结果。

图6是P1(A)和P2(B)对α-葡萄糖苷酶抑制活性。

图7是P1和P2餐后3小时内的血糖水平。其中，图A代表P1和P2对正常小鼠淀粉灌胃后血糖水平的影响；图B代表P1和P2对正常小鼠麦芽糖灌胃后血糖水平的影响；图C是麦芽糖灌胃后血糖的曲线下面积；图D是淀粉灌胃后血糖的曲线下面积。

图8是WESGPW和GTPPPPPPPPKE对α-葡萄糖苷酶的酶促反应速率图。

图9是Lineweaver-Burk图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另，本发明实施例中所用各材料，如无特殊说明，均由市场购买获得。

实施例1：

一种混合型抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物，包括其氨基酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。

SEQ ID NO.1：

WESGPW。

SEQ ID NO.2：

GTPPPPPPPPKE。

其化学结构式和二级质谱图如图1-4所示，两种甘薯肽具有竞争性和非竞争性抑制的特点，不仅可以与底物竞争对应的α-葡萄糖苷酶催化活性位点，而且还与非活性位点相互作用。由于酶催化位点的数量是一定的，当甘薯肽与酶的活性位点优先结合后，对应的底物就无法与酶上的活性位点进行结合，降低了酶与寡糖之间的结合率；同时，它们与酶的非活性位点结合，形成寡肽-酶-底物三元复合物，使得寡糖的糖苷键不能被裂解，大量寡糖无法被酶催化为人体所能吸收的单糖，从而避免出现餐后高血糖。

实施例2：

实施例1所述甘薯肽组合物在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性制品中的应用。

实施例3：

上述甘薯肽组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)甘薯清洗去皮，加入甘薯4～5倍体积量的水粉碎和浸提，浸提液静置6h～8h后采用纱布过滤，去除甘薯纤维和大颗粒淀粉，得到上清液。将上清液调节pH值为4，静置沉淀后离心，得到沉淀物，沉淀物冷冻干燥，即得到甘薯粗蛋白。

(2)称取适量甘薯粗蛋白，以1:20(w/v)的比例加入蒸馏水，90℃加热10min后在200MPa高压处理6min，再使用1mol/LNaOH调节pH为10，加入4％(w/w)碱性蛋白酶后于55℃恒温水浴锅内水解3h。酶解结束后4℃，10000r/min，离心15min取上清，获得甘薯蛋白酶解液(SPP)。

(3)将实施例1得到的酶解液用微孔滤膜(孔径0.22μm)进行过滤。然后在超滤系统中经过分子量Mw截留值为3的超滤膜处理，得到Mw＜3kDa的甘薯肽SPP-1。

(4)经分离纯化和序列鉴定确定所述的甘薯肽。

LC-MS/MS鉴定甘薯蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽序列。除盐后多肽样品经离心干燥后，重新溶解于Nano-LC流动相A(0.1％甲酸/水)中装瓶上样，进行在线LCMS分析。溶解后的样品以合适的体积上样到nanoViper C18预柱上(3μm，)，然后20μl体积冲洗脱盐。样品在预柱上脱盐保留后再经C18反相色谱柱(Acclaim PepMap RSLC，75μm×25cm C18-2μm)分离，实验所用梯度为60min内流动相B(80％乙腈，0.1％甲酸)由5％升高至38％。质谱采用ThermoFisher Q Exactive plus系统(ThermoFisher,USA)结合纳升喷雾Nano Flex离子源(ThermoFisher,USA)，喷雾电压为1.9kV，离子传输管加热温度为320℃。

效果验证：

1.将多肽与α-葡萄糖苷酶(PDB ID：2QMJ)进行分子对接。根据结合能选择最佳的对接构象。对接结果文件pdbqt转化为pdb文件后，导入Pymol软件及在线网站PLIP(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)进行结果可视化分析。利用ChemDraw绘制化学结构，随后将P1-P2与α-葡萄糖苷酶进行分子对接(如图5所示)。肽与α-葡萄糖苷酶对接所需的结合能如表1所示，以配体和受体的结合能大小评价两者的结合程度，结合能越小，说明两者越容易结合，相互作用越强。P1、P2与α-葡萄糖苷酶结合能为-9kcal/mol。因此，推测P1、P2具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。与α-葡萄糖苷酶产生的相互作用力如表2所示，P1与α-葡萄糖苷酶的氨基酸残基Asp203、Thr205、Ser448、Arg526、Asp542之间形成氢键，与Tyr299、Trp406、Trp441、Asp542、Phe575、Ala576之间形成疏水相互作用力。P2与α-葡萄糖苷酶的氨基酸残基Thr205、Asn207、Asn209、Arg526、Asp542、Gln603、Tyr605之间形成氢键，与Thr205、Asn207、Tyr299、Trp406、Phe450、Leu473、Lys480、Gln603、Tyr605之间形成疏水相互作用力。活性肽与大分子的结合主要依赖于氢键相互作用力、范德华力、疏水相互作用力以及静电相互作用力等多种分子间作用力，而氢键相互作用力在稳定对接复合物方面发挥着重要作用。此外，Asp 542和Arg 526被认为是α-葡萄糖苷酶活性口袋与底物结合的必需氨基酸残基。因此，P1、P2能通过氢键作用占据α-葡萄糖苷酶的关键结合位点，并受到疏水相互作用力的影响与α-葡萄糖苷酶结合，从而抑制α-葡萄糖苷酶在体内起到延缓血糖上升的作用。

表1：肽与α-葡萄糖苷酶对接所需的结合能

表2：与α-葡萄糖苷酶产生的相互作用力

2.将实施例1中的肽段进行人工合成，合成多肽纯度均>95％，合成后分别测定各肽段抑制α-葡萄糖苷酶的能力。取200μL样品加入200μLα-葡萄糖苷酶(0.2U/mL)，将上述溶液混匀后在37℃孵育5min。再添加200μL 2.5mM对硝基苯-α-葡萄糖苷溶液(pNPG)和0.1M的磷酸盐缓冲液(pH 6.8)至2mL在37℃孵育20min，最后加入200μL 0.4M碳酸钠停止反应，于405nm处测吸光值。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下：

α-葡萄糖苷酶抑制率(％)＝[1－(A1－A2)/(A3－A4)]×100％

式中：A1—样品组的吸光值，

A2—样品背景的吸光值，

A3—无样品的吸光值，

A4—无样品空白组的吸光值。

如图6所示，P1、P2的IC₅₀值分别为4.137±0.640mg/mL、3.239±0.37mg/mL。表明P1、P2在体外实验中显示较强α-葡萄糖苷酶抑制活性，且P2的活性强于P1。

3.将小鼠灌胃P1、P2和淀粉或麦芽糖后分析餐后3小时内的血糖水平。图7A-B结果显示，小鼠的餐后血糖首先升高，并在0.5h内达到最大值。血糖浓度随时间降低，并在3h内恢复至初始水平。灌胃淀粉后，三种纯肽可以抑制餐后血糖含量的增加；与对照组相比，阿卡波糖、P1、P2组显著降低了血糖曲线下面积(p<0.05)，与体外抑制α-葡萄糖苷酶活性的结果一致。与淀粉试验结果相比，2个肽段对麦芽糖诱导的小鼠餐后血糖水平的影响呈现相同趋势。因此，P1、P2在体内具有明显的降糖作用，推测这两种多肽可能在体内对α-葡萄糖苷酶具有抑制作用。

4.在肽不同浓度下，WESGPW和GTPPPPPPPPKE对α-葡萄糖苷酶的酶促反应速率作图，如图8所示，所有直线均通过了原点，且呈良好的线性关系，而且直线的斜率随着肽的不断增加而减小，说明α-葡萄糖苷酶的活性没有被完全抑制，但其催化速率逐渐降低。据报道，不可逆抑制剂可以与酶通过共价相互作用，形成稳定的酶-抑制剂复合物，使酶完全失活。因此，实验结果显示：WESGPW和GTPPPPPPPPKE是可逆的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

Lineweaver-Burk图用于研究抑制剂的抑制类型和抑制动力学参数。根据Lineweaver-Burk方程线的截距(1/Vmax)计算的最大初始消化速度(Vmax)几乎没有变化(表3)。同时，根据方程斜率(Km/vmax)计算的抑制常数(Ki)沿着QAGPDPW浓度的增加而增加(表3)。WESGPW和GTPPPPPPPPKE的拟合曲线均相交于第二象限，符合混合型抑制类型。由表3可见，WESGPW和GTPPPPPPPPKE在不同浓度下的最大反应速度值均随浓度的升高而降低。Ki为50％的酶与抑制剂结合时对应的抑制剂的浓度，反映的是抑制剂的抑制强度，Ki值越小说明抑制能力越强。通过计算，抑制作用排序为GTPPPPPPPPKE>WESGPW，该结果与上述IC₅₀结论一致。

表3

毒性预测使用ToxinPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/ multi_submit.php)。致敏性预测使用AllerTOP v2.0(http://www.ddg-pharmfac.net/ AllerTOP/)。经证明，上述甘薯肽无毒无致敏性。

最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种混合型抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽组合物，包括其氨基酸序列如SEQ IDNO.1-2所示的多肽；所述甘薯肽组合物由人工合成。

2.权利要求1所述的甘薯肽组合物在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性制品中的应用。