CN118853806A

CN118853806A - 一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽及其制备方法

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Publication number: CN118853806A
Application number: CN202411349165.XA
Authority: CN
Inventors: 高翔; 李涛; 李伟; 朱梦佳
Original assignee: Shandong Huatao Food Co ltd
Current assignee: Shandong Huatao Food Co ltd
Priority date: 2024-09-26
Filing date: 2024-09-26
Publication date: 2024-10-29
Anticipated expiration: 2044-09-26
Also published as: CN118853806B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抑制α‑葡萄糖苷酶活性的甘薯肽及其制备方法。利用酸沉方法回收甘薯淀粉废水蛋白，对甘薯蛋白进行热结合超高压预处理辅助酶解得到抑制α‑葡萄糖苷酶活性的甘薯肽。本发明首次得到了抑制α‑葡萄糖苷酶活性较好，稳定性较高，并且在体内可以延缓淀粉消化的甘薯肽，利于甘薯淀粉废水的高值化利用，为抑制α‑葡萄糖苷酶活性制品提供了新的原料。

Description

一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽及其制备方法。

背景技术

α-葡萄糖苷酶主要位于小肠刷状缘细胞膜上，它是在生物糖代谢过程中起关键作用的酶，能将双糖，如蔗糖、麦芽糖等低聚糖水解成可被人体小肠部分吸收的单糖。α-葡萄糖苷酶的抑制剂有助于降低酶活性，降低低聚糖分解成葡萄糖的速度，从而降低餐后血糖峰值和降低血糖波动，减少高血糖对胰腺等脏器的刺激，将餐后血糖浓度维持在正常水平，改善餐后高血糖。

甘薯（Dioscorea esculenta (Lour.) Burkill）亦称番薯、红薯、白薯、红苕、山芋等。16世纪末甘薯从南洋被引入中国，现为我国第五大粮食作物，也是主要蔬菜之一，在中国各地得到广泛种植，总产量和种植面积均居世界首位。我国甘薯加工的80%为淀粉生产，而甘薯淀粉加工最突出的问题有2个，一是除甘薯淀粉被利用外，甘薯蛋白和多糖等其他活性成分完全没有被利用，资源浪费；二是未被利用的甘薯活性成分随甘薯淀粉废水一起造成了环境污染。我国年生产甘薯淀粉逾100万t，每生产1t淀粉将产生废水15~20 t，估计每年因生产甘薯淀粉而产生的废水量达2000万～4000万t。

酶解技术是一种比较温和绿色的方法，常用于活性肽的制备。但甘薯蛋白分子结构致密，导致酶解速率受阻，肽转化率低的问题一直没有得到很好的解决。热处理（Heattreatment，HT）和高静压（High hydrostatic pressure，HHP）是食品工业中常见的处理方法，可用于拉伸蛋白质结构，暴露更多活性位点，最终提高酶解效率。然而，单独使用HT或HHP来提高酶解效率存在局限性。例如，HT时会形成大的聚集体，从而导致酶促反应受阻。相比之下，加热结合高静压预处理（HT+HHP）可以改变热聚集形态以获得更小的蛋白质颗粒，从而使蛋白质结构更充分地展开并提高获得生物活性肽的可能性。然而，关于提高甘薯蛋白的酶解效率以及使用合适的预处理方法评估其对甘薯蛋白的结构、酶性质和水解产物的影响的研究较少。另外，目前已有文献报道过甘薯蛋白多肽的抗氧化、降高压等活性，但没有从甘薯蛋白中制备抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题为我国每年因生产甘薯淀粉而产生的废水量达2000万～4000万t，目前尚没有好的回收利用的方式。另外，目前也没有从甘薯蛋白中制备抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的报道，而且甘薯蛋白分子结构致密，导致酶解速率受阻，肽转化率低的问题也一直没有得到很好的解决。

为解决上述问题，本发明提供一种抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备方法及应用。本发明制备方法是利用酸沉方法回收甘薯淀粉废水蛋白，对甘薯蛋白进行热和超高压预处理辅助酶解，可以提高多肽含量，且提高抑制GAA的活性。

为达到上述目的，本发明通过以下技术手段实现：一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）将甘薯淀粉加工废水的pH值调节为4，静置沉淀后离心，得到沉淀物，沉淀物冷冻干燥，即得到甘薯粗蛋白；提取蛋白质的方法是碱提酸沉法，是蛋白质提取常用、较为传统的方法。它的原理是，在碱性条件下，蛋白质结构发生变化，蛋白质分子次级键(氢键)发生破坏，某些极性基团发生解离，促进结合物与蛋白质分离，调整离心后的上清液的pH值，使pH达到蛋白质的等电点，增加了蛋白质的溶解性，从而让蛋白质析出。该方法提取蛋白操作容易，不会产生有害物质，对环境的污染较小、成本低，适合工业化生产。由于原料是液体，故直接酸沉，文献表明，甘薯蛋白的最佳等电点是4，在此pH下，蛋白析出最多，故采用pH值为4。

（2）称取适量甘薯粗蛋白，加入蒸馏水，加热后再超高压处理，再调节pH为10，加入碱性蛋白酶水解；酶解结束后离心取上清，获得抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽（Sweetpotato peptides，SPP）。加热和高压处理都是为了拉伸蛋白质结构，暴露更多活性位点，提高酶解效率。单独使用加热或超高压来提高酶解效率存在局限性。例如，加热时会形成大的聚集体，从而导致酶促反应受阻。相比之下，加热结合超高压预处理可以改变热聚集形态以获得更小的蛋白质颗粒，从而使蛋白质结构更充分地展开并提高获得生物活性肽的可能性。发明人研究了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，根据多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，发现碱性蛋白酶的效果最好，故选择碱性蛋白酶，而碱性蛋白酶的最佳酶解条件为pH为10，所以调节pH为10后加入碱性蛋白酶水解。

进一步的，用甘薯提取淀粉后的上清液替代淀粉加工废水：甘薯清洗去皮，加入甘薯4～5倍体积量的水粉碎和浸提，浸提液静置6h～8h后采用纱布过滤，去除甘薯纤维和大颗粒淀粉，得到上清液，调节上清液的pH值为4。

进一步的，步骤（2）中以1：15~1：30（w/v）的比例加入蒸馏水；90℃加热10 min后再进行超高压处理。

进一步的，步骤（2）中高压处理的参数为：100 ~400MPa超高压处理4~10min。

进一步的，步骤（2）酶解条件为2~5%（w/w）碱性蛋白酶后于55℃恒温水浴锅内水解2~5 h。

进一步的，步骤（2）酶解结束后100℃灭酶10～15min后在4℃下离心取上清液。

进一步的，步骤（2）离心的参数为10000 r/min，离心15 min。

进一步的，将步骤（2）获得的甘薯肽SPP用微孔滤膜进行过滤，然后在超滤系统中经过分子量Mw截留值为3的超滤膜处理，得到得Mw ＜ 3 kDa的甘薯肽SPP-1。

进一步的，所述微孔滤膜孔径为0.22 μm。

上述任一方法制备得到的甘薯肽。

上述甘薯肽在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性制品中的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明与现有技术相比，采用热加工和高压结合技术，有效节约酶解时间并提高酶解产率；实验过程所使用的试剂对环境无影响，提取多肽得率较高。

（2）本发明首次得到了抑制α-葡萄糖苷酶活性较好，并且在体内可以延缓淀粉消化的甘薯肽，利于甘薯淀粉废水的高值化利用。

（3）本发明首次验证了甘薯肽具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，为抑制α-葡萄糖苷酶活性制品提供了新的原料。

附图说明

图1是不同蛋白酶对α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；

图2是不同预处理对α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；

图3是料液比对α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；

图4是酶添加量对α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；

图5是酶解时间对α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；

图6是高压压力对α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；

图7是高压时间对α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；

图8是响应面对α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率的影响；

图9是超滤各组分α-葡萄糖苷酶抑制率的比较；

图10是SPP-1组分α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC₅₀；

图11是温度对SPP-1组分稳定性的影响；

图12是pH对SPP-1组分稳定性的影响；

图13是口腔、胃肠道消化对SPP-1组分稳定性的影响；

图14是小鼠分别灌胃不同剂量SPP-1、淀粉、麦芽糖后餐后3小时内的血糖水平图；（A-B）为曲线图，（C-D）是相应曲线下的面积。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另，本发明实施例中所用各材料，如无特殊说明，均由市场购买获得。

检测方法：

（1）多肽得率测定：

分别取中2 mL酶解液与10% TCA溶液混匀后静置10 min，4000 r/min离心15 min后取上清用5% TCA定容至50 mL，取上述溶液3 mL加入2 mL双缩脲试剂混匀后静置10 min，测定其在540 nm处的吸光值，并绘制标准曲线。多肽得率计算公式如下：

多肽得率（%）=酶解液多肽含量/原料蛋白含量×100（1）；

（2）α-葡萄糖苷酶抑制率测定：

取200 μL 样品加入200 μL α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mL），将上述溶液混匀后在37℃孵育5min。再添加200 μL 2.5mM对硝基苯-α-葡萄糖苷溶液（pNPG）和0.1 M的磷酸盐缓冲液（pH 6.8）至2 mL在37℃孵育20 min，最后加入200 μL 0.4 M碳酸钠停止反应，于405nm处测吸光值。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下：

α-葡萄糖苷酶抑制率（%）=［1－（A₁－A₂）/ （A₃－A₄）］×100 （2）；

式中：A₁—样品组的吸光值；

A₂—样品背景的吸光值；

A₃—无样品的吸光值；

A₄—无样品空白组的吸光值。

实施例1：

一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽的制备方法，包括以下步骤：

（1）甘薯清洗去皮，加入甘薯4～5倍体积量的水粉碎和浸提，浸提液静置6h～8h后采用纱布过滤，去除甘薯纤维和大颗粒淀粉，得到上清液。将上清液调节pH值为4，静置沉淀后离心，得到沉淀物，沉淀物冷冻干燥，即得到甘薯粗蛋白。

（2）称取适量甘薯粗蛋白，以1:20（w/v）的比例加入蒸馏水，90℃加热10 min后在200 MPa高压处理6 min，再使用1 mol/L NaOH调节pH为10，加入4%（w/w）碱性蛋白酶后于55℃恒温水浴锅内水解3 h。酶解结束后4℃，10000 r/min，离心15 min取上清，获得甘薯蛋白酶解液（SPP）。

实施例2：

（1）将甘薯淀粉加工废水（废水取自山东华涛食品有限公司甘薯淀粉生产线）的调节pH值为4，静置沉淀后离心，得到沉淀物，沉淀物冷冻干燥，即得到甘薯粗蛋白。

（2）称取适量甘薯粗蛋白，以1:20（w/v）的比例加入蒸馏水，90℃加热10 min后在200 MPa高压处理6 min，再使用1 mol/L NaOH调节pH为10，加入4%（w/w）碱性蛋白酶后于55℃恒温水浴锅内水解3 h。酶解结束后4℃，10000 r/min，离心15 min取上清，获得SPP。

实施例3：

将实施例1或2得到的酶解液用微孔滤膜（孔径0.22 μm）进行过滤。然后在超滤系统中经过分子量Mw截留值为3 kDa的超滤膜处理，得到得Mw ＜ 3 kDa的甘薯肽SPP-1。

对比实施例1：

将上述酶解液用微孔滤膜（孔径0.22 μm）进行过滤。然后在超滤系统中经过分子量（Mw）截留值为3和5 kDa的超滤膜分级处理，获得5 kDa＜ Mw ＜ 3 kDa（SPP-2）和Mw ＞5 kDa（SPP-3）。

工艺参数调整：

1.甘薯肽酶解不同蛋白酶的筛选：

（1）与实施例1或实施例2中步骤（1）相同。

（2）选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶，以1:20（w/v）的比例加入蒸馏水，酶添加量为3％，pH和温度为各种酶最适条件下进行酶解，酶解3h之后取出，100℃灭酶10～15min后离心取上清液，测定酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率。

（3）不同蛋白酶酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率见图1。如图1所示，碱性蛋白酶的水解产物对α-葡萄糖苷酶的抑制能力最高，抑制率为46.7%。其次是胃蛋白酶和胰蛋白酶。在多肽得率方面，碱性蛋白酶多肽得率为54.35%，显著高于其他四种蛋白酶（p <0.05）。据报道，碱性蛋白酶（2 × 10⁵U/g，南宁庞博生物工程有限公司）是食品工业中常用的蛋白酶，因为它具有更广泛的特异性具有高肽产率和酶水解催化活性的能力。因此，本研究选用碱性蛋白酶作为制备SPP的最佳水解酶。

2.甘薯肽酶解预处理的选择：

将实施例1或实施例2步骤（1）获得的甘薯粗蛋白按1:20（w/v）的比例加入蒸馏水，将蛋白液分别进行90℃加热10 min、300 MPa高压处理6 min、90℃加热10 min后再300 MPa高压处理6 min以及不做任何预处理各组别，再使用1 mol/L NaOH调节pH为10，加入3%（w/w）碱性蛋白酶后于55℃恒温水浴锅内酶解3h之后取出，100℃灭酶10～15min后离心取上清液，测定酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率。

不同预处理组中SPP的多肽得率和α-葡萄糖苷酶活性如图2所示。与对照组相比，所有预处理都显著提高SPP的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率（p <0.05）。与单一处理组相比，HT+HHP进一步增强SPP的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率。这与HT+HHP对甘薯蛋白结构的破坏有关。HT+HHP处理后获得的甘薯蛋白的分子结构更加彻底地展开，暴露出更多与碱性蛋白酶结合的活性位点。因此，选择HT+HHP预处理方式作为后续研究。

3.甘薯肽酶解单因素实验：

本试验例中均采用HT+HHP预处理方式和3%碱性蛋白酶在pH10和温度55℃恒温水浴锅内进行酶解，100℃灭酶10～15min后离心取上清液。

（1）料液比对酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响：

选取料液比1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，90℃加热10 min后300MPa高压6min，酶添加量为3％，在pH10酶解温度为55℃的条件下，酶解3h，待酶解结束后测定酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率。

由图3可知，多肽得率随液料比的增大而降低，这是因为底物浓度越低，其与酶结合的几率就越低，多肽得率也越低。α-葡萄糖苷酶活性抑制率呈现先上升后下降的趋势，在液料比为1：20 g/mL时α-葡萄糖苷酶抑制率最高为60.93%。因此优先选择1：20 g/mL为下一步优化的基础。

（2）酶添加量对酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响：

选取料液比1：20，90℃加热10 min后300MPa高压6min，酶添加量分别为1、2、3、4、5％，在pH10酶解温度为55℃的条件下，酶解3h，待酶解结束后测定酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率。

由图4可知，随着酶添加量的增大，蛋白液不断被酶解解，多肽得率随之上升，α-葡萄糖苷酶抑制率先上升后下降，增大酶添加量使其与底物充分接触，大分子蛋白质被水解成不同分子量的肽段，α-葡萄糖苷酶抑制率出现降低。当酶添加量为4%时，α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值为68.67%。因此优先选择4%为下一步优化的基础。

（3）酶解时间对酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响：

选取料液比1：20，90℃加热10 min后300MPa高压6min，酶添加量为3％，在pH10酶解温度为55℃的条件下，酶解1、2、3、4、5h，待酶解结束后测定酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率。

由图5可知，随着酶解时间的延长，多肽得率逐渐升高，α-葡萄糖苷酶抑制率出现先升高后降低的趋势，这是因为具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的有效肽段随着水解的继续进行，被酶解成无抑制活性的小肽，从而活性抑制率降低，当酶解时间为3 h时，α-葡萄糖苷酶活性抑制率达到最大值63.03%。因此优先选择3h为下一步优化的基础。

（4）高压压力对酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响：

选取料液比1：20，90℃加热10 min后分别在100、200、300、400、500MPa高压6min，酶添加量为3％，在pH10酶解温度为55℃的条件下，酶解3h，待酶解结束后测定酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率。

由图6可知，多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率都随高压压力的增大呈现先上升后下降的趋势，当高压压力为200MPa时，α-葡萄糖苷酶活性抑制率为最大值69.97%，但当高压压力继续升高时，甘薯蛋白结构被破坏，酶结合位点持续增多，大分子蛋白被酶解为更小的分子量的短肽，导致α-葡萄糖苷酶抑制率降低。因此优先选择200MPa为下一步优化的基础。

（5）高压时间对酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率的影响：

选取料液比1：20，90℃加热10 min后在300MPa高压分别作用2、4、6、8、10min，酶添加量为3％，在pH10酶解温度为55℃的条件下，酶解3h，待酶解结束后测定酶解产物的多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率。

由图7可知，高压压力一定时，随着高压时间的延长，多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制率都呈现出先上升后平缓的趋势，当高压时间为6 min 时，多肽得率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率达到最大值，分别为62.08%和66.93%。因此优先选择6 min为下一步优化的基础。

4.甘薯肽酶解工艺的Plackett-burman试验优化和响应面实验：

（1）在单因素试验的基础上，以α-葡萄糖苷酶抑制活性和多肽得率为指标，设计Plackett-burman试验和三因素三水平响应面试验，对SPP的工艺条件进行优化，Plackett-burman试验和三因素三水平设计因素与水平排列见表1和表2。

表1 Plackett-burman试验设计因素与水平：

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表2 响应面三因素三水平试验设计：

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（2）由表3、表4可知，料液比、加酶量、高压压力的ｐ值都小于0.05，表明这３个因素对肽得率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率有显著影响。因此，为提高肽得率和α-葡萄糖苷酶活性抑制率可选择料液比、加酶量、高压压力进行进一步的响应面实验。

表3 Plackett-burman试验结果分析：

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表4 Plackett-burman试验结果影响分析：

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（3）在plackett-burman试验的基础上，采用Box-Behnken设计进一步优化了SPP的最佳α-葡萄糖苷酶抑制率:料液比、酶底物比和高压压力。设计矩阵包括17个实验（表5）。所得多肽产率和α-葡萄糖苷酶抑制率分别为67.7% ~ 78.1%和54.76% ~ 71.7%。得到二次回归模型如下，其中A、B、C分别为料液比、酶含量和高压压力；Y1和Y2分别代表多肽产量和α-葡萄糖苷酶抑制率。

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对实验数据进行方差分析，以估计二阶多项式方程的显著性（表6、7）。二次回归模型具有显著性(p <0.05)，验证了该模型对多肽得率和α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定是可靠的。此外，失拟项不显著(p >0.05)，进一步支持模型的有效性。多肽产率和α-葡萄糖苷酶抑制率的R2分别为0.9937和0.9961，表明该模型具有较好的准确性。校正后的R²分别为0.9856和0.9911，实验值与预测值吻合较好。变异系数(CV)小于5%，结果精确、可重复性好。这些结果验证了优化提取条件的模型的充分性、准确性和可靠性，以提高甘薯中α-葡萄糖苷酶抑制肽的含量。由F值可知，酶含量对多肽产量的影响最大，高压压力对α-葡萄糖苷酶抑制率的影响最大。不同因素之间的交互作用以响应面图可视化，如图8所示。酶含量和高压压力的相互作用对肽产率有显著影响，料液比和高压压力对α-葡萄糖苷酶抑制率有显著影响。

表5 响应面试验结果：

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表6 α-glucosidase抑制率拟合方差分析：

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表7 多肽得率拟合方差分析：

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利用Design Expert 8.0.6软件对所得回归方程进行逐步回归，得出热高压辅助酶解制备SPP的最佳工艺条件：料液比1:20.16 w/v，酶含量4.02%，高压压强192.31 MPa。预测α-葡萄糖苷酶抑制率为71.13%，多肽产率为77.77%。为验证该模型所预测的最优酶解条件，结合生产实际操作，将最佳工艺条件调整为：料液比1:20 w/v，酶含量4%，高压压强200MPa，在此条件下α-葡萄糖苷酶抑制率为70.93%，多肽得率为76.89%，比较接近预测值，证明本实验的优化结果较为可靠。

甘薯肽纯化、结构鉴定、稳定性及体内活性验证：

1.α-葡萄糖苷酶抑制率研究：

收集实施例1-3得到的SPP、SPP-1、SPP-2、SPP-3组分冷冻干燥并测定α-葡萄糖苷酶抑制率。

结果如图9所示，SPP-1、SPP-2和SPP-3三个组分，其中SPP-1组分α-葡萄糖苷酶抑制率最高，显著优于SPP、SPP-2和SPP-3。如图10所示，多肽浓度为5 mg/mL时，SPP-1 α-葡萄糖苷酶抑制率为77.65 ± 0.74%，其IC₅₀值为6.139mg/mL，说明SPP-1在实验中显示较强α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.SPP-1结构分析：

除盐后多肽样品经离心干燥后，重新溶解于Nano-LC 流动相A（0.1%甲酸/水）中进行在线LC-MS分析。溶解后的样品上样至nanoViper C18预柱（3 μm，100Å），随后20 ul体积冲洗脱盐。样品在预柱上脱盐保留后再经C18反相色谱柱（75 μm × 25 cm）分离，60 min内流动相B（80%乙腈，0.1%甲酸）由5%升高至38%。质谱采用ThermoFisher Q Exactive plus系统结合纳升喷雾Nano Flex离子源，喷雾电压为1.9 kV。质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式（DDA），一级质谱扫描范围350-1500 m/z，最大注入时间100 ms。每次DDA循环下最多采集20个电荷为2+到5+的二级图谱，二级质谱离子最大注入时间50 ms。

质谱采集的原始raw数据文件，采用PEAKS Studio 8.5 (BioinformaticsSolutions Inc.Waterloo, Canada)软件进行加工处理和检索分析。数据库为NCBI下载的Haematococcus pluvialis蛋白数据库，检索参数设置如下：一级质谱质量容差为10 ppm，二级质谱为0.03 Da，非酶切；可变修饰：蛋白质N端乙酰化（ (Protein N-term)），天冬酰胺/谷氨酰胺脱氨化（Deamidation (NQ)），甲硫氨酸氧化（Oxidation (M)），谷氨酸焦谷氨酸化（Pyro-glu），谷氨酰胺焦谷氨酰环化（Pyro-Gln)。

SPP-1组分经LC-MS/MS鉴定得到1204条肽段，Mw<3 kDa，肽段长度为6-21氨基酸。随后，通过用PeptideRanker网站对生物活性肽进行活性预测，若某肽段的评分大于0.5，将被视为具有潜在生物活性。实验为避免出现假阳性的结果，选取评分大于0.8的肽段（共34条），如表8所示。研究表明α-葡萄糖苷酶抑制肽的结构特点，包括：1）链长3～8；2）N端含OH（Ser、Tyr、Thr）或碱性氨基酸（Lys、Arg、His）；3）C端出现Ala或Met；4）Pro靠近C端，最好位于倒数第二位；5）在pH 7.0时净电荷为0或＋1；6）以氢键、静电相互作用为主。筛选出的肽基本符合其中的两条或者一条，例如，筛选出大多数的肽链长3～8；GDNMLPF、AGPDPW、IGGGPW、PAPLPPK等Pro靠近C端，并位于倒数第二位；RFHDPLM、AGWGVM、RFHDPM的C端出现Met；SGPDIGGF、SNSPFVF、SNTPFVF等N端含OH（Ser）。说明筛选出的肽都具有抑制α-葡萄糖苷酶的潜力。

表8 PeptideRanker网站预测前34条肽段：

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3.稳定性研究：

（1）热稳定性：称取SPP-1冻干粉配制成5 mg/mL 溶液，分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃水浴中保温处理2 h，冷却至室温后测定α-葡萄糖苷酶抑制率。

（2）pH稳定性：称取SPP-1冻干粉配制成5 mg/mL 溶液，将样品溶液pH分别调至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，室温静置2 h后测定α-葡萄糖苷酶抑制率。

（3）口腔以及胃肠道消化稳定性：称取SPP-1冻干粉配制成5 mg/mL 溶液，加入等体积的人工胃液（1g胃蛋白酶加入100 mL蒸馏水中，用1 mol/L HCl将pH调至2.0），置于37℃水浴中孵育2 h，每30 min取一次酶解液，灭酶后测定α-葡萄糖苷酶抑制率。模拟胃消化反应结束后，将酶解液用NaOH调pH至7.5，加入胰蛋白酶（酶/样品= 1：25，w/w）37℃水浴中消化2 h，每30 min取一次酶解液，灭酶后测定α-葡萄糖苷酶抑制率。

结果如图11-图13所示，SPP-1在温度为20-80℃、pH为3-11时α-葡萄糖苷酶抑制率均无显著性变化，且经体外模拟口腔、胃肠道消化处理5 h后，其α-葡萄糖苷酶抑制率仍保持较高水平，结果表明SPP-1具有较高的热稳定性、酸碱稳定性和胃肠道消化稳定性。

4.甘薯蛋白α-葡萄糖苷酶抑制肽对餐后血糖的影响：

准备SPF级昆明雄性小鼠50只（周龄在6-8周），分为五个组（n=10），第一组灌淀粉溶液（1 g/ kg·bw）；第二组给予淀粉和阿卡波糖作为阳性对照（20 g/ kg·bw）；第三、四、五组分别灌胃淀粉和不同剂量SPP-1，剂量分别为100、200、400mg/ kg·bw。小鼠禁食10 h后，灌胃多肽或阿卡波糖，10 min后给予糊化淀粉溶液，随后使用血糖仪在0、30、60、90、120和180 min时取小鼠尾静脉的血样测定，绘制血糖曲线并计算曲线下面积。

准备SPF级昆明雄性小鼠50只（周龄在6-8周），分为五个组（n=10），第一组只给蒸馏水作为空白；第二组灌麦芽糖溶液（2 g/ kg·bw）；第三组给予麦芽糖溶液和阿卡波糖作为阳性对照（20 g/ kg·bw）；第四、五、六组分别灌胃麦芽糖溶液和不同剂量SPP-1，剂量分别为100、200、400mg/ kg·bw。小鼠禁食10 h后，灌胃多肽或阿卡波糖，10 min后给予麦芽糖溶液，随后使用血糖仪在0、30、60、90、120和180 min时取小鼠尾静脉的血样测定，绘制血糖曲线并计算曲线下面积。

将小鼠灌胃SPP-1和淀粉或麦芽糖后分析餐后3小时内的血糖水平。图14A结果显示，小鼠的餐后血糖首先升高，并在0.5 h内达到最大值（图14A-B）。血糖浓度随时间降低，并在3 h内恢复至初始水平。灌胃淀粉后，SPP-1组分可以抑制餐后血糖含量的增加；与对照组相比，SPP-1组分显著降低了血糖曲线下面积（p<0.05）（图14C-D），且成浓度依赖性下降。灌胃麦芽糖呈现的趋势和淀粉相同。

最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）甘薯清洗去皮，加入甘薯4～5倍体积量的水粉碎和浸提，浸提液静置6h～8h后采用纱布过滤，得到上清液；将上清液调节pH值为4，静置沉淀后离心，得到沉淀物，沉淀物冷冻干燥，即得到甘薯粗蛋白；

（2）称取适量甘薯粗蛋白，以1：15~1：30（w/v）的比例加入蒸馏水，90℃加热10min后再超高压处理，再调节pH为10，加入碱性蛋白酶水解；酶解结束后离心取上清，获得抑制α-葡萄糖苷酶活性的甘薯肽SPP。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中高压处理的参数为：100 ~400MPa高压处理4~10min。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）酶解条件为2~5%（w/w）碱性蛋白酶后于55℃恒温水浴锅内水解2~5h。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）酶解结束后100℃灭酶10～15min后在4℃下离心取上清液。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）离心的参数为10000r/min，离心15min。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将步骤（2）获得的甘薯肽SPP用微孔滤膜进行过滤，然后在超滤系统中经过分子量Mw截留值为3 kDa的超滤膜处理，得到得Mw＜3kDa的甘薯肽SPP-1。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述微孔滤膜孔径为0.22μm。

8.权利要求1-7任一方法制备得到的甘薯肽。

9.权利要求8所述的甘薯肽在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性制品中的应用。