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CN118813538A - 一种用于sp2/0细胞培养的无血清培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于sp2/0细胞培养的无血清培养基及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118813538A CN202411233801.2A CN202411233801A CN118813538A CN 118813538 A CN118813538 A CN 118813538A CN 202411233801 A CN202411233801 A CN 202411233801A CN 118813538 A CN118813538 A CN 118813538A
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Abstract

本申请涉及动物细胞培养基的领域，具体公开一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基及制备方法和应用。该用于SP2/0细胞培养的无血清培养基按每1L计算，其制备所用原料包括10.15g含核苷的MEM‑α干粉、50‑1000μg肝素钠、200‑4000mg重组人血清白蛋白和相应量的花生四烯酸、生育酚乙酸酯、Pluronic F‑68、转铁蛋白、重组人胰岛素、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、氢化可的松等，余量为细胞培养用水。本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基可以满足SP2/0细胞不经驯化即可在无血清条件下稳定悬浮培养，SP2/0细胞培养过程中，在达高密度时，细胞不聚团，且倍增稳定。

Description

一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基及其制备方法和 应用
技术领域
本申请涉及动物细胞培养基的领域，尤其是涉及一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基及其制备方法和应用。
背景技术
SP2/0细胞是小鼠的骨髓瘤细胞，SP2/0细胞用于一般鼠源性单抗的制备，也是目前单抗制备过程中的常用方法。但是，SP2/0细胞本身不能分泌抗体，只有和分泌阳性抗体的B淋巴细胞融合后并成功建株的杂交瘤细胞才能分泌抗体。
相关技术中，SP2/0细胞在体外扩增培养时，使用的培养基需要添加一定浓度的血清。血清是由诸多成分组成的高度复杂的混合物，这些成分包括生长因子、激素、微量元素以及粘附和伸展因子等，它们发挥着多种生物学活性。但是血清培养基中由于含动物血清成分，容易引起外源性的污染、细胞形态变异等问题，且存在携带病原体的潜在安全隐患以及不同批次间差异较大的问题，增加了后续生产工艺的难度。
近年来，商业化SP2/0细胞无血清培养基SP2/0细胞高密度培养时，易产生细胞聚团、倍增不稳定等问题。
发明内容
本申请的目的为了解决上述的技术问题而提供一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基及其制备方法和应用。该用于SP2/0细胞培养的无血清培养基可以满足SP2/0细胞在无血清条件下稳定悬浮培养，SP2/0细胞培养过程中达高密度时，细胞不聚团，且倍增稳定，同时降低用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的大规模制备时的生产成本。
本申请的技术方案
第一方面，本申请提供一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，采用如下的技术方案：
一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，按每1L计算，其制备所用的各原料组成及含量如下：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸0.2-3μg、亚油酸1-25μg、亚麻酸1-25μg、肉豆蔻酸1-25μg、油酸1-25μg、棕榈酸1-25μg、硬脂酸1-25μg、胆固醇0.1-2mg、吐温800.2-8mg、生育酚乙酸酯1-25mg、Pluronic F-68 1-30mg、肝素钠50-1000μg、转铁蛋白1-15mg、重组人胰岛素1-15mg、重组人血清白蛋白200-4000mg、亚硒酸钠0.1-1.5nmol、乙醇胺10-150μmol、抗坏血酸1-12mg、氢化可的松0.0005-0.01mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水；
所述的Pluronic F-68，货号为P7061，生产厂家为Sigma-Aldrich。
通过采用上述技术方案，上述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，以MEM-α培养基为基础，花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、胆固醇、转铁蛋白、重组人胰岛素和重组人血清白蛋白促进细胞代谢，能够提供SP2/0细胞生长的基础成分；亚硒酸钠和乙醇胺能够刺激SP2/0细胞的生长增殖，加快细胞生长增殖速度；抗坏血酸和生育酚乙酸酯能够为SP2/0细胞提供抗氧化的保护措施；肝素钠可以减少细胞高密度生长情况下聚团情况；再配合吐温80、Pluronic F-68、氢化可的松等原料组分，使得用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，能够实现高密度培养即细胞密度达到1.3×106cells/mL-3.6×106cells/mL、且细胞活率均大于80%的同时，具有细胞抗聚团效果好和倍增稳定性好的特点，其细胞结团率均低于6%，在传代五次时SP2/0细胞的细胞密度仍可增长1倍以上。
优选的，上述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基所用的原料组分中，每1L用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中，肝素钠的含量为100-200μg。
通过采用上述技术方案，用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，能够实现高密度培养即细胞密度达到2.0×106cells/mL以上、且细胞活率均大于80%的同时，具有细胞抗聚团效果好和倍增稳定性好的特点，其细胞结团率均低于3%，在传代五次时SP2/0细胞的细胞密度仍可增长1倍以上。
优选的，上述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基所用的原料组分中，每1L用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中，重组人血清白蛋白的含量为1000-4000mg。
通过采用上述技术方案，用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，能够实现高密度培养即细胞密度达到2.8×106cells/mL-3.6×106cells/mL、且细胞活率可达到92.1-93.0%的同时，具有细胞抗聚团效果好和倍增稳定性好的特点，其细胞结团率均低于2.1%，在传代四次时SP2/0细胞的细胞密度仍可增长1.25倍以上。
优选的，上述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，按每1L计算，其制备所用的各原料组成及含量如下：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸0.5-2μg、亚油酸5-10μg、亚麻酸5-10μg、肉豆蔻酸5-10μg、油酸5-10μg、棕榈酸5-10μg、硬脂酸5-10μg、胆固醇0.15-0.22mg、吐温80 0.5-2.2mg、生育酚乙酸酯5-7mg、Pluronic F-68 5-10mg、肝素钠100-200μg、转铁蛋白3-5mg、重组人胰岛素2-5mg、重组人血清白蛋白1000-4000mg、亚硒酸钠0.3-0.5nmol、乙醇胺20-50μmol、抗坏血酸5-10mg、氢化可的松0.0005-0.001mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水。
通过采用上述技术方案，用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，能够实现高密度培养即细胞密度达到2.9×106cells/mL-3.6×106cells/mL，比采用对比例1的用于SP2/0细胞的含血清培养基和对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）进行培养时所得的细胞密度相对提高了7.4%-33.3%、11.5%-38.5%；细胞活率均大于90%，细胞结团率为1.6-2.1%。
优选的，上述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，按每1L计算，其制备所用的各原料组成及含量如下：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸2μg、亚油酸10μg、亚麻酸10μg、肉豆蔻酸10μg、油酸10μg、棕榈酸10μg、硬脂酸10μg、胆固醇0.22mg、吐温802.2mg、生育酚乙酸酯7mg、Pluronic F-68 10mg、肝素钠100μg、转铁蛋白5mg、重组人胰岛素5mg、重组人血清白蛋白1000mg、亚硒酸钠0.5nmol、乙醇胺50μmol、抗坏血酸10mg、氢化可的松0.001mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水。
通过采用上述的技术方案，用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，能够实现高密度培养即细胞密度达到3.6×106cells/mL、且细胞活率大于92%的同时，具有细胞抗聚团效果好和倍增稳定性好的特点，其细胞结团率为1.6%，在传代五次时SP2/0细胞的细胞密度仍可增长1.25倍以上。
第二方面，本申请提供一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备方法，采用如下的技术方案：
上述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备方法，具体包括如下制备步骤：
S1：分别将转铁蛋白、重组人胰岛素、亚硒酸钠和乙醇胺用细胞培养用水溶解配制，得到100x转铁蛋白浓缩母液、100x重组人胰岛素浓缩母液、100x亚硒酸钠浓缩母液和100x乙醇胺浓缩母液；
S2：将花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、胆固醇、吐温80、生育酚乙酸酯和Pluronic F-68依次溶解至细胞培养用水中，得到母液Ⅰ；
S3：将重组人血清白蛋白、抗坏血酸和氢化可的松用细胞培养用水溶解，得到浓度为100mg/mL的重组人血清白蛋白溶液、浓度为0.1mg/L的抗坏血酸溶液和浓度为100mg/mL的氢化可的松溶液；
S4：将含核苷的MEM-α干粉加入到细胞培养用水，进行搅拌至含核苷的MEM-α干粉彻底溶解，得到MEM-α培养基；
MEM-α培养基配制中所述的细胞培养用水的量与待配制的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的总量，按体积比计算为70-80：100；
S5：在S4所得的MEM-α培养基中，依次加入S1所得的100x转铁蛋白浓缩母液、100x重组人胰岛素浓缩母液、100x亚硒酸钠浓缩母液和100x乙醇胺浓缩母液，以及S3所得的浓度为100mg/mL的重组人血清白蛋白溶液、浓度为0.1mg/L的抗坏血酸溶液和浓度为100mg/mL的氢化可的松溶液，搅拌至完全澄清，得到混合物Ⅰ；
S6：在S5所得的混合物Ⅰ中加入S2所得的母液Ⅰ，搅拌至完全澄清，得到混合物Ⅱ；
S7：在S6所得的混合物Ⅱ中加入碳酸氢钠，搅拌至完全溶解，得到混合物Ⅲ；
S8：在S7所得的混合物Ⅲ中加入细胞培养用水，精确定容至100%待配制的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的体积，得到用于SP2/0细胞培养的无血清培养基粗品；
S9：将S8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基粗品过滤除菌，控制细菌内毒素≤10EU/mL，得到用于SP2/0细胞培养的无血清培养基；
上述的过滤除菌采用滤膜为0.22μm针头式过滤器；
上述的S1中所得的100x转铁蛋白浓缩母液、100x重组人胰岛素浓缩母液、100x亚硒酸钠浓缩母液和100x乙醇胺浓缩母液配制好后放置于-20℃保存；
上述的S2中所得的母液I放置于-20℃保存；
上述的S3中所得的浓度为100mg/mL的重组人血清白蛋白溶液放置于-20℃保存。
上述用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备过程中要注意以下事项：
第一、要保证含核苷的MEM-α干粉彻底溶解，即搅拌时间不能过短，若含核苷的MEM-α干粉溶解不彻底会影响用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的使用效果；
第二、要确保制备过程中的操作顺序，严格按照制备步骤的先后顺序进行，否则可能会出现用于SP2/0细胞培养的无血清培养基浑浊不溶的现象。
通过采用上述技术方案，本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备方法，其制备工艺简单、操作方便，配制效率高，便于规模化配制，同时严格按照制备过程的操作顺序进行，可保证每批次配制的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的一致性和稳定性。
第三方面，本申请提供一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基在SP2/0细胞培养中的应用，采用如下的技术方案：
一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基在SP2/0细胞培养中的应用，具体包括如下步骤：
S1：用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的配制
按照上述的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备方法进行配制完成后，所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基经检测，pH为6.8-7.5、渗透压为280-350mOsm/L，可满足SP2/0细胞的培养；
S2：SP2/0细胞的复苏
将含有SP2/0细胞的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，将含有SP2/0细胞的解冻液中加入到S1所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中混合均匀，含有SP2/0细胞的解冻液与用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的混合体积比为1：9，离心弃去上清液，加入用于SP2/0细胞培养的无血清培养基1-2mL吹打混匀，得到细胞悬液I；
将得到的细胞悬液I加入10cm的培养皿中，再加入8mL用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，置于37℃、CO2体积百分比为5%的细胞培养箱培养16h后，换液，得到细胞悬液II；
S3：SP2/0细胞的扩大培养
将S2中所得的细胞悬液II加入到S1所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中，然后在CO2的体积百分比浓度为5%，温度为37℃的条件下，控制转速为80-130r/min进行悬浮培养至5-7天时培养结束；
上述细胞悬液II的用量按每mL用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中加入SP2/0细胞的细胞数量为2×105cells进行计算。
通过采用上述技术方案，采用用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，SP2/0细胞不需要驯化培养可直接从有血清培养基转至用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中进行培养，并且能够实现高密度培养即细胞密度达到1.3×106cells/mL-3.6×106cells/mL、且细胞活率均大于80%的同时，具有细胞抗聚团效果好和倍增稳定性好的特点，其细胞结团率均低于6%，在传代五次时SP2/0细胞的细胞密度仍可增长1倍以上。
本申请的有益技术效果
本申请的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，可实现SP2/0细胞不需要驯化培养，即直接从有血清培养基转至本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中进行培养；
进一步，本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，可实现SP2/0细胞的高密度培养，在SP2/0细胞培养时，最高细胞密度可达到3.6×106cells/mL，且高密度培养时细胞活率均大于80%；
进一步，本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，在高密度培养SP2/0细胞的过程中，细胞抗聚团的效果好，其细胞结团率均低于6%；
进一步，本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，在SP2/0细胞的培养过程中倍增稳定性好，在传代五次时SP2/0细胞的细胞密度仍可增长1倍以上；
进一步，本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其生产成本较低，特别是用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的大规模制备时，其生产成本会进一步降低。
附图说明
图1是实施例1-8、对比例1-2的细胞密度图；
图2是实施例1-8、对比例1-2的细胞活率图；
图3是实施例1-8、对比例1-2的细胞结团率图；
图4是实施例1-8、对比例1-2的倍增稳定性测试图；
图5是实施例1、实施例9-11、对比例3的细胞密度图；
图6是实施例1、实施例9-11、对比例3的细胞活率图；
图7是实施例1、实施例9-11、对比例3的细胞结团率图；
图8a是实施例1的细胞形态图；
图8b是实施例9的细胞形态图；
图8c是实施例10的细胞形态图；
图8d是实施例11的细胞形态图；
图8e是对比例3的细胞形态图；
图9是实施例1、实施例12-14、对比例4的细胞密度图；
图10是实施例1、实施例12-14、对比例4的细胞活率图；
图11是实施例1、实施例12-14、对比例4的细胞结团率图；
图12是实施例1、实施例12-14、对比例4的倍增稳定性测试图。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明，但并不限制本申请。
本申请的各实施例中使用的各种原料除下表中列出的特殊原料外，其他均为市售，且均要求为细胞培养级（细菌内毒素≤10EU/mL）；
原料名称 货号 生产厂家或供应商
含核苷的MEM-α干粉 PM150421P 武汉普诺赛生命科技有限公司
Pluronic F-68 P7061 Sigma-Aldrich
肝素钠 H104201 上海阿拉丁生化科技股份有限公司
转铁蛋白 T8010 北京索莱宝科技有限公司
重组人胰岛素 P3378 碧云天生物技术有限公司
重组人血清白蛋白 R283928 上海阿拉丁生化科技股份有限公司
澳洲血清 CY103 上海雅酶生物医药科技有限公司
各实施例中使用的原料：含核苷的MEM-α干粉、亚硒酸钠、乙醇胺、抗坏血酸、氢化可的松、肝素钠、花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、吐温80、生育酚乙酸酯，0-8℃保存；
转铁蛋白，4℃保存；
重组人胰岛素、重组人血清白蛋白、胆固醇，-20℃保存。
本申请中各实施例中所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基用于SP2/0细胞培养后：
1、SP2/0细胞的细胞密度、细胞活率和细胞结团率的测试方法：
取10μL SP2/0细胞扩大培养过程中的培养液和10μL台盼蓝染色液吹打混匀，得到混合液，然后将混合液转移至Countstar计数板中，将Countstar计数板放入全自动细胞分析仪中，进行细胞密度、细胞活率和细胞结团率的测量；
上述的全自动细胞分析仪，型号为Countstar Mira BF，上海睿钰生物科技有限公司生产；
上述的Countstar计数板，规格75.5mm×25.5mm（L×W），上海睿钰生物科技有限公司生产；
2、SP2/0细胞的倍增稳定性测试方法
从SP2/0细胞的扩大培养开始，进行SP2/0细胞周期性培养，比较每一次传代培养2天后的细胞密度与初始细胞量2×105cells/mL的差异；
所述的SP2/0细胞周期性培养，即SP2/0细胞的初始细胞量为2×105cells/mL，培养总体积20mL，培养2天后，得到细胞悬液I，取样测定细胞悬液I的细胞密度；
第一次传代，将细胞悬液I用新鲜的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基换液，至细胞密度为2×105cells/mL，培养总体积20mL，培养2天后，得到细胞悬液II，取样测定细胞悬液II的细胞密度；
第二次传代，将细胞悬液II用新鲜的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基换液，至细胞密度为2×105cells/mL，培养总体积20mL，培养2天后，得到细胞悬液III，取样测定细胞悬液III的细胞密度；
第三次传代，将细胞悬液III用新鲜的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基换液，至细胞密度为2×105cells/mL，培养总体积20mL，培养2天后，得到细胞悬液IV，取样测定细胞悬液IV的细胞密度；
重复上述的传代过程，直至SP2/0细胞的细胞密度的倍增量低于1倍时结束传代。
3、pH值测试
采用pH计进行测量，具体的pH值测量方法如下：
（1）、打开pH计，用酸碱指示剂进行校准；
（2）、将待测用于SP2/0细胞培养的无血清培养基放在磁力搅拌器上，使用于SP2/0细胞培养的无血清培养基均一；
（3）、将电极放入用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中，按下测量按钮；
（4）、将电极保持在溶液中1-2min，以确保准确的读数可以进行；
（5）、记录pH值，清洗pH计电极，关闭仪器；
上述的pH计，型号为pH计 FE28-Standard，梅特勒-托利多生产；
4、渗透压测试
取200μL用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，利用冰点渗透压仪进行用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的渗透压测试，具体的渗透压测试方法如下：
（1）、将冰点渗透压仪放置在平稳的桌面上，并确保仪器处于水平状态；
（2）、打开电源开关，待仪器预热一段时间后开始使用；
（3）、将待测用于SP2/0细胞培养的无血清培养基倒入样品池中，注意不要超过标识线；
（4）、调节温度控制装置，使温度逐渐下降；
（5）、当溶液开始结冰时，仪器会自动检测到冰点降低的温度；
（6）、读取显示屏上的温度数值，并利用计算功能得到用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的渗透压数值；
上述的冰点渗透压仪，型号为BS100，上海精密仪器仪表有限公司生产；
5、细菌内毒素测试
采用内毒素检测试剂盒（鲎试剂显色法）（碧云天生物技术有限公司，货号：C0276S）进行检测；
检测标准：细菌内毒素≤10EU/mL时，符合用于SP2/0细胞培养的无血清培养基配制的要求；
如果细菌内毒素检测不符合标准，需重新过滤，然后再检测细菌内毒素，直至符合用于SP2/0细胞培养的无血清培养基配制的要求。
实施例
实施例1-8
一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，按每1L计算，其制备所用的各原料组份及含量如下：
上述的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备方法，包括如下制备步骤：
S1：分别将转铁蛋白、重组人胰岛素、亚硒酸钠和乙醇胺用细胞培养用水溶解配制，得到100x转铁蛋白浓缩母液、100x重组人胰岛素浓缩母液、100x亚硒酸钠浓缩母液和100x乙醇胺浓缩母液；
S2：将花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、胆固醇、吐温80、生育酚乙酸酯和Pluronic F-68依次溶解至细胞培养用水中，得到母液Ⅰ；
S3：将重组人血清白蛋白、抗坏血酸和氢化可的松用细胞培养用水溶解配制，得到浓度为100mg/mL的重组人血清白蛋白溶液、浓度为0.1mg/L的抗坏血酸溶液和浓度为100mg/mL的氢化可的松溶液；
S4：将含核苷的MEM-α干粉加入到细胞培养用水，进行搅拌至含核苷的MEM-α干粉彻底溶解，得到MEM-α培养基；
S5：在S4所得的MEM-α培养基中，依次加入S1所得的100x转铁蛋白浓缩母液、100x重组人胰岛素浓缩母液、100x亚硒酸钠浓缩母液和100x乙醇胺浓缩母液，以及S3所得的浓度为100mg/mL的重组人血清白蛋白溶液、浓度为0.1mg/L的抗坏血酸溶液和浓度为100mg/mL的氢化可的松溶液，搅拌至完全澄清，得到混合物Ⅰ；
S6：在S5所得的混合物Ⅰ中加入S2所得的母液Ⅰ，搅拌至完全澄清，得到混合物Ⅱ；
S7：在S6所得的混合物Ⅱ中加入碳酸氢钠，搅拌至完全溶解，得到混合物Ⅲ；
S8：在S7所得的混合物Ⅲ中加入细胞培养用水，精确定容至100%待配制的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的体积，得到用于SP2/0细胞培养的无血清培养基粗品；
S9：将S8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基粗品过滤除菌，控制细菌内毒素≤10EU/mL，即得到用于SP2/0细胞培养的无血清培养基；
上述的过滤除菌采用滤膜为0.22μm针头式过滤器；
上述的S1中所得的100x转铁蛋白浓缩母液、100x重组人胰岛素浓缩母液、100x亚硒酸钠浓缩母液和100x乙醇胺浓缩母液配制好后放置于-20℃保存；
上述的S2中所得的母液I放置于-20℃保存；
上述的S3中所得的浓度为100mg/mL的重组人血清白蛋白溶液放置于-20℃保存。
上述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基在SP2/0细胞培养中的应用，具体包括如下步骤：
S1：用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的配制
按照上述的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备方法进行配制完成后所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基经检测，pH均在6.8-7.5之间、渗透压菌株280-350mOsm/L之间，满足SP2/0细胞的培养要求；
S2：SP2/0细胞的复苏
将含有SP2/0细胞的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，将含有SP2/0细胞的解冻液中加入用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中混合均匀，含有SP2/0细胞的解冻液与用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的混合比例为1：9，离心弃去上清液，加入用于SP2/0细胞培养的无血清培养基1-2mL吹打混匀，得到细胞悬液I；
将得到的细胞悬液I加入10cm的培养皿中，再加入8mL用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，置于37℃、CO2体积百分比为5%细胞培养箱培养16h后，换液并检查细胞密度、细胞活率，得到细胞悬液II；
上述含有SP2/0细胞的冻存管来源于中国科学院细胞库；
S3：SP2/0细胞的扩大培养
将S2中所得的细胞悬液II加入到S1所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的中，然后在CO2的体积百分比浓度为5%，温度为37℃的条件下，控制转速为80-130r/min进行批培养至7天时结束；
上述细胞悬液III的用量按每mL用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中加入SP2/0细胞的细胞数量为2×105cells进行计算。
对比例1
一种用于SP2/0细胞的含血清培养基，其原料组分为MEM-α培养基中添加体积百分比为10%的澳洲血清；
所述的MEM-α培养基为含核苷的MEM-α干粉加入到细胞培养用水中，进行搅拌至含核苷的MEM-α干粉彻底溶解；
上述含核苷的MEM-α干粉与按细胞培养用水的比例为10.15g：1L。
上述的用于SP2/0细胞的含血清培养基在SP2/0细胞培养中的应用，具体包括如下步骤：
S1：含血清培养基的配制
含核苷的MEM-α干粉加入到细胞培养用水中，进行搅拌至含核苷的MEM-α干粉彻底溶解，得到MEM-α培养基；
上述含核苷的MEM-α干粉与按细胞培养用水的比例为10.15g：1L；
将澳洲血清与上述所得的MEM-α培养基按照体积比10：90的比例进行混合，得到用于SP2/0细胞的含血清培养基；
S2：SP2/0细胞的复苏
同实施例1在SP2/0细胞培养中的应用步骤的S2；
S3：SP2/0细胞的扩大培养
同实施例1在SP2/0细胞培养中的应用步骤的S3。
对比例2
一种用于SP2/0细胞培养的SFM无血清培养基，其选用SFM无血清培养基（Gibco生产）；
上述的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）在SP2/0细胞培养中的应用，具体包括如下步骤：
S1：SP2/0细胞的复苏
同实施例1在SP2/0细胞培养中的应用步骤的S2；
S2：SP2/0细胞的扩大培养
同实施例1在SP2/0细胞培养中的应用步骤的S3。
分别使用实施例1-8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基、对比例1中的用于SP2/0细胞的含血清培养基和对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）对SP2/0细胞进行培养，在SP2/0细胞的扩大培养过程每天取样测定细胞密度和细胞活率，所得的细胞密度和细胞活率图分别如图1、图2所示，图中横坐标为培养时间，纵坐标为细胞密度、细胞活率；
从图1的细胞密度图中可以看出，使用实施例1-8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，培养5天时细胞密度达到峰值，为2.2×106cells/mL-3.6×106cells/mL，在第5天之后细胞密度开始下降；对比例1的用于SP2/0细胞的含血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，培养5天后细胞密度为2.7×106cells/mL；对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）对SP2/0细胞进行培养时，培养5天后细胞密度为2.6×106cells/mL。由此表明，本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基可用于SP2/0细胞的高密度培养。
特别是采用实施例1所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，培养5天所得的细胞密度比采用对比例1的用于SP2/0细胞的含血清培养基和对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）进行培养时所得的细胞密度分别相对提高了33.3%、38.5%。
从图2的细胞活率图中可以看出，分别使用实施例1-8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基、对比例1的用于SP2/0细胞的含血清培养基、对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）对SP2/0细胞进行培养时，SP2/0细胞培养过程都很稳定，培养至第一天结束时SP2/0细胞活率均为95%以上；培养至第5天时，SP2/0细胞活率均大于80%；培养至第7天时，SP2/0细胞活率均降至80%以下。
使用实施例1-8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，以及对比例1的用于SP2/0细胞的含血清培养基和对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）进行SP2/0细胞培养，培养至第5天时取样测定细胞结团率，测试结果如图3所示；
从图3的细胞结团率图中可以看出，使用实施例1-8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，SP2/0细胞抗聚团效果好，其细胞结团率均低于6%。使用对比例1的用于SP2/0细胞的含血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，SP2/0细胞的细胞结团率为8%；使用对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）对SP2/0细胞进行培养时，SP2/0细胞的细胞结团率为3%。由此表明，采用本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，具有较好的细胞抗聚团效果。
使用实施例1-8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，以及对比例1中用于SP2/0细胞的含血清培养基和对比例2中用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）分别对SP2/0细胞进行培养，分别在SP2/0细胞扩大培养过程中对SP2/0细胞进行倍增稳定性测试，测试结果如图4所示，图中横坐标为培养时间，纵坐标为细胞密度；
从图4的倍增稳定性测试图中可以看出，使用实施例1-8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，以及对比例1的用于SP2/0细胞的含血清培养基和对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）对SP2/0细胞进行培养时，SP2/0细胞倍增稳定性好，在传代五次时SP2/0细胞的细胞密度仍可增长1倍以上。由此表明，采用本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基进行SP2/0细胞培养时，倍增稳定性好。
综合上述实施例1-8的细胞密度、细胞活率和细胞结团率测试结果可以得出：
当用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的原料组成及含量为：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸0.5-2μg、亚油酸5-10μg、亚麻酸5-10μg、肉豆蔻酸5-10μg、油酸5-10μg、棕榈酸5-10μg、硬脂酸5-10μg、胆固醇0.15-0.22mg、吐温80 0.5-2.2mg、生育酚乙酸酯5-7mg、Pluronic F-68 5-10mg、肝素钠100-200μg、转铁蛋白3-5mg、重组人胰岛素2-5mg、重组人血清白蛋白1000-4000mg、亚硒酸钠0.3-0.5nmol、乙醇胺20-50μmol、抗坏血酸5-10mg、氢化可的松0.0005-0.001mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水时：
在培养至第5天，细胞密度达到2.9×106cells/mL-3.6×106cells/mL，比采用对比例1的用于SP2/0细胞的含血清培养基和对比例2的用于SP2/0细胞的SFM无血清培养基（Gibco生产）进行培养时所得的细胞密度相对提高了7.4%-33.3%、11.5%-38.5%；细胞活率为90%以上，细胞结团率为1.6-2.1%。
实施例9-11
一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其制备所用的原料组分中，除肝素钠含量与实施例1不同外，其它均与实施例1相同，肝素钠的含量具体见下表：
原料组分 实施例1 实施例9 实施例10 实施例11
肝素钠（μg） 100 1000 200 500
对比例3
一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其制备所用的原料组分中，除肝素钠含量为0μg，其它均与实施例1相同。
使用实施例1、实施例9-11、对比例3所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养，在SP2/0细胞的扩大培养过程每天取样测定细胞密度和细胞活率，所得的细胞密度和细胞活率图分别如图5、图6所示，图中横坐标为培养时间，纵坐标为细胞密度、细胞活率；
从图5和图6中可以看出，添加肝素钠和没有添加肝素钠的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，在培养至5天后细胞密度均可达2.0×106cells/mL以上，细胞活率均高于80%。
使用本申请实施例1、实施例9-11、对比例3所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养，在SP2/0细胞的扩大培养至第5天时取样测定细胞结团率，测试结果如图7所示；
从图7的细胞结团率图中可以看出，实施例1、实施例9-11在用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中添加肝素钠，可以显著改善细胞团聚的情况，细胞结团率为6%以下，而没有添加肝素钠的对比例3中的细胞结团率为8%。分析其原因可能是由于肝素钠是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，具有负电荷，能够通过改变细胞表面的电荷来促进单个SP2/0细胞的悬浮，减少细胞结团率；并且肝素钠的抗凝血特性也有助于维持细胞培养过程中的细胞分散状态，减少细胞团聚的现象。
由全自动细胞分析仪导出对应实施例1、实施例9、实施例10、实施例11、对比例3培养至第5天的SP2/0细胞的细胞形态图，具体依次见图8a、8b、8c、8d、8e；
从图8a、8b、8c、8d对比中可以看出，肝素钠的添加量为100-1000μg时SP2/0细胞抗团聚效果均较好，与图7中对应的各实施例的细胞结团率数据结论一致。特别是在肝素钠的添加量为100-200μg时，SP2/0细胞的细胞结团率最低，为3%以下。
从图8a、图8e对比可以看出，没有添加肝素钠的，细胞结团率为8.0%，即明显的细胞团聚现象出现，而添加了肝素钠的，可以明显改善细胞团聚的情况，细胞结团率为1.6%，即细胞结团率下降了80%。
实施例12-14
一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其制备所用的原料组分中，除重组人血清白蛋白的含量与实施例1不同外，其它均与实施例1相同，重组人血清白蛋白的含量具体见下表：
原料组份 实施例1 实施例12 实施例13 实施例14
重组人血清白蛋白（mg） 1000 4000 200 500
对比例4
一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其制备所用的原料组分中，除重组人血清白蛋白含量为0μg，其它均与实施例1相同。
使用实施例1、实施例12-14、对比例4所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养，在SP2/0细胞的扩大培养过程每天取样测定细胞密度和细胞活率，所得的细胞密度和细胞活率图分别如图9、图10所示，图中横坐标为培养时间，纵坐标为细胞密度、细胞活率；
从图9的细胞密度图中可以看出，每1L的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中：
不含有重组人血清白蛋白，培养5天时，SP2/0细胞的细胞密度为8×105cells/mL；
重组人血清白蛋白为200-4000mg，培养5天时，SP2/0细胞的细胞密度可达到1.3×106cells/mL-3.6×106cells/mL，比初始细胞密度（2.0×105cells/mL）增加了6.5-18倍；
重组人血清白蛋白为200-500mg，培养5天时，SP2/0细胞的细胞密度可达到1.3×106cells/mL-1.7×106cells/mL，比初始细胞密度（2.0×105cells/mL）增加了6.5-8.5倍；
重组人血清白蛋白为1000-4000mg，培养5天时，SP2/0细胞的细胞密度可达到2.8×106cells/mL-3.6×106cells/mL，比初始细胞密度（2.0×105cells/mL）增加了14-18倍；
从图10的细胞活率图中可以看出，每1L的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中：
不含有重组人血清白蛋白，培养5天时，SP2/0细胞的细胞活率为65.0%；
重组人血清白蛋白为200-4000mg，培养5天时，SP2/0细胞的细胞活率均大于84.0%；
重组人血清白蛋白为1000-4000mg，培养5天时，SP2/0细胞的细胞活率可达到92.1-93.0%。
使用实施例1、实施例12-14和对比例4所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养，在SP2/0细胞的扩大培养至第5天时取样测定细胞结团率，测试结果如图11所示；
从图11中可以看出，使用实施例1、实施例12-14和对比例4所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，SP2/0细胞抗聚团效果好，其细胞结团率均低于2.1%。由此表明，重组人血清白蛋白的含量对细胞团聚影响较小。
使用实施例1、实施例12-14、对比例4所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，在SP2/0细胞扩大培养过程中对SP2/0细胞进行倍增稳定性测试，测试结果如图12所示，图中横坐标为培养时间，纵坐标为细胞密度；
从图12中可以看出，使用实施例1、实施例12-14所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，在传代四次时SP2/0细胞的细胞密度仍可增长1.25倍以上；而使用对比例4所得的不含重组人血清白蛋白的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基对SP2/0细胞进行培养时，SP2/0细胞倍增缓慢，在传代一次时SP2/0细胞的细胞密度仅为初始细胞量的1倍。由此表明，本申请的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基由于重组人血清白蛋白的添加，增加SP2/0细胞培养时的倍增稳定性。
综上所述，本申请的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，可实现SP2/0细胞不需要驯化培养，即直接从有血清培养基转至本申请的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中进行高密度培养，且由于重组人血清白蛋白和肝素钠的协同作用，使得SP2/0细胞在实现高密度培养过程中，细胞抗聚团的效果好，倍增稳定性好。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其特征在于，按每1L计算，其制备所用的各原料组成及含量如下：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸0.2-3μg、亚油酸1-25μg、亚麻酸1-25μg、肉豆蔻酸1-25μg、油酸1-25μg、棕榈酸1-25μg、硬脂酸1-25μg、胆固醇0.1-2mg、吐温80 0.2-8mg、生育酚乙酸酯1-25mg、Pluronic F-68 1-30mg、肝素钠50-1000μg、转铁蛋白1-15mg、重组人胰岛素1-15mg、重组人血清白蛋白200-4000mg、亚硒酸钠0.1-1.5nmol、乙醇胺10-150μmol、抗坏血酸1-12mg、氢化可的松0.0005-0.01mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水；
所述的Pluronic F-68，货号为P7061，生产厂家为Sigma-Aldrich。
2.如权利要求1所述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其特征在于，按每1L计算，其制备所用的各原料组成及含量如下：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸0.2-3μg、亚油酸1-25μg、亚麻酸1-25μg、肉豆蔻酸1-25μg、油酸1-25μg、棕榈酸1-25μg、硬脂酸1-25μg、胆固醇0.1-2mg、吐温80 0.2-8mg、生育酚乙酸酯1-25mg、Pluronic F-68 1-30mg、肝素钠100-200μg、转铁蛋白1-15mg、重组人胰岛素1-15mg、重组人血清白蛋白200-4000mg、亚硒酸钠0.1-1.5nmol、乙醇胺10-150μmol、抗坏血酸1-12mg、氢化可的松0.0005-0.01mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水。
3.如权利要求1所述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其特征在于，按每1L计算，其制备所用的各原料组成及含量如下：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸0.2-3μg、亚油酸1-25μg、亚麻酸1-25μg、肉豆蔻酸1-25μg、油酸1-25μg、棕榈酸1-25μg、硬脂酸1-25μg、胆固醇0.1-2mg、吐温80 0.2-8mg、生育酚乙酸酯1-25mg、Pluronic F-68 1-30mg、肝素钠50-1000μg、转铁蛋白1-15mg、重组人胰岛素1-15mg、重组人血清白蛋白1000-4000mg、亚硒酸钠0.1-1.5nmol、乙醇胺10-150μmol、抗坏血酸1-12mg、氢化可的松0.0005-0.01mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水。
4.如权利要求1所述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其特征在于，按每1L计算，其制备所用的各原料组成及含量如下：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸0.5-2μg、亚油酸5-10μg、亚麻酸5-10μg、肉豆蔻酸5-10μg、油酸5-10μg、棕榈酸5-10μg、硬脂酸5-10μg、胆固醇0.15-0.22mg、吐温80 0.5-2.2mg、生育酚乙酸酯5-7mg、Pluronic F-68 5-10mg、肝素钠100-200μg、转铁蛋白3-5mg、重组人胰岛素2-5mg、重组人血清白蛋白1000-4000mg、亚硒酸钠0.3-0.5nmol、乙醇胺20-50μmol、抗坏血酸5-10mg、氢化可的松0.0005-0.001mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水。
5.如权利要求4所述的一种用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，其特征在于，按每1L计算，其制备所用的各原料组成及含量如下：含核苷的MEM-α干粉10.15g、花生四烯酸2μg、亚油酸10μg、亚麻酸10μg、肉豆蔻酸10μg、油酸10μg、棕榈酸10μg、硬脂酸10μg、胆固醇0.22mg、吐温80 2.2mg、生育酚乙酸酯7mg、Pluronic F-68 10mg、肝素钠100μg、转铁蛋白5mg、重组人胰岛素5mg、重组人血清白蛋白1000mg、亚硒酸钠0.5nmol、乙醇胺50μmol、抗坏血酸10mg、氢化可的松0.001mg、碳酸氢钠2.2g，余量为细胞培养用水。
6.一种如权利要求1-5任一所述的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
S1：分别将转铁蛋白、重组人胰岛素、亚硒酸钠和乙醇胺用细胞培养用水溶解配制，得到100x转铁蛋白浓缩母液、100x重组人胰岛素浓缩母液、100x亚硒酸钠浓缩母液和100x乙醇胺浓缩母液；
S2：将花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、胆固醇、吐温80、生育酚乙酸酯和Pluronic F-68依次溶解至细胞培养用水中，得到母液Ⅰ；
S3：将重组人血清白蛋白、抗坏血酸和氢化可的松用细胞培养用水溶解，得到浓度为100mg/mL的重组人血清白蛋白溶液、浓度为0.1mg/L的抗坏血酸溶液和浓度为100mg/mL的氢化可的松溶液；
S4：将含核苷的MEM-α干粉加入到细胞培养用水，进行搅拌至含核苷的MEM-α干粉彻底溶解，得到MEM-α培养基；
MEM-α培养基配制中所述的细胞培养用水的量与待配制的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的总量，按体积比计算为70-80：100；
S5：在S4所得的MEM-α培养基中，依次加入S1所得的100x转铁蛋白浓缩母液、100x重组人胰岛素浓缩母液、100x亚硒酸钠浓缩母液和100x乙醇胺浓缩母液，以及S3所得的浓度为100mg/mL的重组人血清白蛋白溶液、浓度为0.1mg/L的抗坏血酸溶液和浓度为100mg/mL的氢化可的松溶液，搅拌至完全澄清，得到混合物Ⅰ；
S6：在S5所得的混合物Ⅰ中加入S2所得的母液Ⅰ，搅拌至完全澄清，得到混合物Ⅱ；
S7：在S6所得的混合物Ⅱ中加入碳酸氢钠，搅拌至完全溶解，得到混合物Ⅲ；
S8：在S7所得的混合物Ⅲ中加入细胞培养用水，精确定容至100%待配制的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的体积，得到用于SP2/0细胞培养的无血清培养基粗品；
S9：将S8所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基粗品过滤除菌，控制细菌内毒素≤10EU/mL，得到用于SP2/0细胞培养的无血清培养基。
7.如权利要求1-5任一所述的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基在SP2/0细胞培养中的应用。
8.如权利要求7所述的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基在SP2/0细胞培养中的应用，其特征在于具体步骤如下：
S1：采用如权利要求6的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的制备方法配制用于SP2/0细胞培养的无血清培养基；
S2：SP2/0细胞的复苏
将含有SP2/0细胞的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，将含有SP2/0细胞的解冻液中加入到S1所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中混合均匀，含有SP2/0细胞的解冻液与用于SP2/0细胞培养的无血清培养基的混合体积比为1：9，离心弃去上清液，加入用于SP2/0细胞培养的无血清培养基1-2mL吹打混匀，得到细胞悬液I；
将得到的细胞悬液I加入10cm的培养皿中，再加入8mL用于SP2/0细胞培养的无血清培养基，置于37℃、CO2体积百分比为5%的细胞培养箱培养16h后，换液，得到细胞悬液II；
S3：SP2/0细胞的扩大培养
将S2中所得的细胞悬液II加入到S1所得的用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中，然后在CO2的体积百分比浓度为5%，温度为37℃的条件下，控制转速为80-130r/min进行悬浮培养至5-7天时培养结束；
上述细胞悬液II的用量按每mL用于SP2/0细胞培养的无血清培养基中加入SP2/0细胞的细胞数量为2×105cells进行计算。
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