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CN102653729B - 一种用于中国仓鼠卵巢细胞的培养基 - Google Patents

一种用于中国仓鼠卵巢细胞的培养基 Download PDF

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CN102653729B
CN102653729B CN201110051952.2A CN201110051952A CN102653729B CN 102653729 B CN102653729 B CN 102653729B CN 201110051952 A CN201110051952 A CN 201110051952A CN 102653729 B CN102653729 B CN 102653729B
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Abstract

本发明公开了一种用于中国仓鼠卵巢细胞的基础培养基，以所述基础培养基的总体积计，所述基础培养基含有以下基本成份：6-6.5g/L氯化钠、0.5-0.5g/L氯化钾、0.462-1g/L丙酮酸钠、0.288-0.4g/L硝酸钙、1.464-2g/L碳酸氢钠、5.16-15g/L D-葡萄糖、和0.156-0.7g/L磷酸氢二钠。本发明还公开了一种用于中国仓鼠卵巢细胞的补料培养基及中国仓鼠卵巢细胞的培养方法。

Description

一种用于中国仓鼠卵巢细胞的培养基
技术领域
本发明涉及细胞培养领域。更具体地，本发明涉及用于中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）细胞培养的培养基和相应的培养方法。
背景技术
真核细胞中CHO（Chinese Hamster Ovary,中国仓鼠卵巢细胞）细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点。目前已有越来越多的药用蛋白在CHO细胞中获得了高效表达，其中许多CHO表达的药物已投放市场，例如EPO、Enbrel等。
目前在CHO细胞培养中广泛使用的是无血清培养基，因为含有动物血清的培养基有多种不利因素。由于无血清培养基对于细胞的生长、表达的促进功能有限，所以补料技术现在已经成为各大生物制药企业竞争的重点之一。
CHO细胞常用的培养模式有分批培养、流加培养、连续培养和灌注培养，操作模式的选取对产物的表达有重要的影响。一般在反应器操作中可根据目的产品的特性和要求以及细胞株的特点来选择不同的操作模式。早期生物反应器大规模培养CHO细胞时常采用的方法是分批培养。目前，药物蛋白生产广泛采用的是流加式培养（Fed-batch culture）。流加式培养是在分批培养基础之上改进的，先将一定量的培养液装入反应器，接种细胞进行培养，在细胞不断生长过程营养物质不断消耗，代谢产物的不断堆积，在对数生长期的一定时机向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。目前已获FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是流加或灌注培养。
国际和国内有很多人开发了各种CHO培养基和补料配方，如：国内华东理工大学张立、张元兴等人发明的CHO培养基（专利申请号：200410018258.0）。国际上有商业出售的培养基，如JRH Biosciences公司是专业从事细胞培养基产品（cell culture media）的公司，是美国FDA指定生物医药企业专用培养基。Invitrogen公司也出品无血清培养基，但是大规模的进行抗体药物蛋白质表达需要的培养基量很大，费用昂贵，比如JRH基础培养基的价格在每升100元人民币以上，在成本中占很大比例，在我国，蛋白药物厂家也面临着培养基的巨额费用的问题，而且同时蛋白产量低也是一个很大的问题。
因此，本领域迫切需要开发新的适合CHO细胞培养的、高蛋白产量的无血清培养基。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的培养CHO细胞的培养基，也提供了一种CHO细胞的培养方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于中国仓鼠卵巢细胞的基础培养基，以所述基础培养基的总体积计，所述基础培养基含有以下基本成份：
6-6.5g/L氯化钠；
0.5-0.5g/L氯化钾；
0.462-1g/L丙酮酸钠；
0.288-0.4g/L硝酸钙；
1.464-2g/L碳酸氢钠；
5.16-15g/L D-葡萄糖；和
0.156-0.7g/L磷酸氢二钠。
在另一优选例中，所述的基础培养基还含有10-54g/L氨基酸、1.2-7.0g/L微量元素、0.3-1.6g/L维生素、和3-10g/L酵母抽提物；所述的微量元素包括Cu、Fe、Zn、Mg、Mn、Ni、Na、Se、V、Mo、Sn、和Si；所述的维生素包括氯化胆碱、乙醇胺、DL-α-硫辛酸、I-肌醇、核黄素、硫胺、氰钴胺素、D-泛酸盐、D-生物素、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、腐胺、和吡哆醇。
在另一优选例中，在本发明提供的基础培养基中，所述的氨基酸（g/L）是：
在另一优选例中，在本发明提供的基础培养基中，所述的微量元素（g/L）是：
在另一优选例中，在本发明提供的基础培养基中，所述的维生素（g/L）是：
在另一优选例中，所述的基础培养基中还含有以下物质（g/L）：
在本发明的第二方面，提供了一种用于中国仓鼠卵巢细胞的补料培养基，以所述的补料培养基的总体积计，所述补料培养基含有以下基本成份：
5.67-10.773g/L氯化钠；
4.32-8.208g/L硝酸钙；
100-190g/L D-葡萄糖；和
3.24-6.156g/L磷酸氢二钠。
在另一优选例中，所述的补料培养基还含有153-300g/L氨基酸、10-19g/L微量元素、5.5-11g/L维生素、和30-100g/L酵母抽提物；所述的微量元素包括Cu、Fe、Zn、Mg、Mn、Ni、Na、Se、V、Mo、Sn、和Si；所述的维生素包括氯化胆碱、乙醇胺、DL-α-硫辛酸、I-肌醇、核黄素、硫胺、氰钴胺素、D-泛酸盐、D-生物素、叶酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、腐胺、和吡哆醇。
在另一优选例中，在本发明提供的补料培养基中，所述的氨基酸（g/L）是：
在另一优选例中，在本发明提供的补料培养基中，所述的微量元素（g/L）是：
在另一优选例中，在本发明提供的补料培养基，所述的维生素（g/L）是：
在另一优选例中，所述的补料培养基中还含有以下物质（g/L）：
亚油酸       0.005292-0.0100548
酵母抽提物   30-100。
在本发明的第三方面，提供了本发明提供的上述基础培养基的用途，用于培养中国仓鼠卵巢细胞。
在另一优选例中，所述基础培养基适用于二氢叶酸还原酶(DHFR)系统的中国仓鼠卵巢细胞。
在本发明的第四方面，提供了本发明提供的上述补料培养基的用途，用于培养中国仓鼠卵巢细胞。
在另一优选例中，所述补料培养基适用于二氢叶酸还原酶(DHFR)系统的中国仓鼠卵巢细胞。
在本发明的第五方面，提供了一种中国仓鼠卵巢细胞的培养方法，所述的方法包括步骤：
（a）在如上所述的本发明提供的基础培养基中培养中国仓鼠卵巢细胞；和
（b）在细胞生长到对数生长期加入如上所述的本发明提供的补料培养基培养中国仓鼠卵巢细胞。
在另一优选例中，所述中国仓鼠卵巢细胞是中国仓鼠卵巢悬浮细胞。
在本发明提供的上述培养方法的步骤（a）中，以0.5x106密度起始培养中；在步骤（b）中，在培养第3－5天细胞密度4－7x106时给予补料。
在另一优选例中，本发明的基础培养基和补料培养基，都适用于从摇瓶、WAVE反应器到发酵罐等的逐级扩增过程。
据此，本发明提供了一种新的适合CHO细胞培养的、高蛋白产量的无血清培养基。
附图说明
图1显示了赛金基础培养基培养CHO细胞的实验结果；其中某抗体滴度（Titer）为0.4g/L；并且菱形为活细胞密度（VCD），方块为存活率，下同。
图2显示了JRH基础培养基培养CHO细胞的实验结果；其中滴度（Titer）为0.2g/L。
图3显示了赛金补料培养基培养CHO细胞的实验结果；其中滴度（Titer）为1.7g/L,补4%体积的补料。
图4显示了JRH补料培养基培养CHO细胞的实验结果；其中滴度（Titer）为0.8g/L,补10%体积的补料。
图5显示了Invitrogen补料培养基培养CHO细胞的实验结果；其中滴度（Titer）为0.6g/L,补4%体积的补料。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种新的CHO细胞的无血清培养基，其中含有少量酵母抽提物（DMV USA,Inc.(La Crosse,WI)），并且不含谷氨酰胺，即对此没有特别的要求。并且在培养过程中进行流加培养，在细胞生长到对数生长期加入本发明提供的补料培养基，可以使细胞生长得更好。在此基础上完成了本发明。
本发明的目的是研制一种新的用于培养CHO细胞的培养基，其培养效果、蛋白表达量都要达到工业级大规模培养的要求，适应于中国生物制药业的发展。本发明提供的培养基培养的CHO细胞生长旺盛、细胞密度可达107cells/ml以上，细胞活性很好。
本发明提供的培养基中含有所有必需的物质，仅仅加入少量酵母提取物，蛋白量极少，有利于分离纯化，适用于大规模的培养CHO细胞以表达药物蛋白。
为了解决细胞在无血清培养基中生长的问题，本发明提供的基础培养基除了含有基本成份，还添加了氨基酸、微量元素、维生素和其它成份（如脂类等）。
（1）氨基酸：添加了通过严格实验确定的最佳配比的每一种氨基酸，确使得细胞利用的必需氨基酸和非必需氨基酸具有合适的比例。
（2）微量元素：包括镁铁铜锰镍硅钒钼硒锡锌等，这些微量元素具有广泛的调节能量代谢、蛋白合成等多种细胞生命过程，是培养基不可缺少的一部分，但其合理的范围也需要实验的确定。如Mg:对ATP酶、激酶等起活化作用。铁是酶和血红素的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分；Cu是超氧化物歧化酶的辅基，是线粒体中呼吸链的组成部分。硒：谷胱甘肽过氧化酶的组成部分，以硒代半胱氨酸的形式存在于多肤链中。Zn是一些酶的辅基。
（3）维生素：主要扮演辅酶辅基的角色，必不可少。胆碱和乙醇胺是构成细胞膜的重要成份，腐胺能够有效地促进CHO细胞生长。叶酸是合成四氢叶酸的重要原料，四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用。生物素是一些特异羧化酶的组成部分，参与糖代谢和脂肪酸的合成过程。
（4）其它成份：脂肪酸对细胞生长有促进作用。酵母提取物含有多肽和氨基酸，对细胞生长有利。
此外，在本发明的培养基外，配置培养基时还要添加以下成份：
胰岛素：促进葡萄糖和氨基酸通过细胞膜，以利于细胞的吸收和代谢；促进脂质和蛋白质的合成及代谢中间体的磷酸化。胰岛素在细胞分裂过程中和维持细胞在健康的生理代谢状态方面起重要作用。
谷氨酰胺：谷氨酰胺所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，谷氨酰胺也作为能源及碳源被细胞利用。培养基不含此物,但使用之前必须添加。
葡萄糖：细胞能量的主要来源，按需要补加。
本发明提供的基础培养基的成份：
第一部份：基础成份
成份 含量：g/L培养基
氯化钠 6－6.5
氯化钾 0.5－0.5
丙酮酸钠 0.462－1
硝酸钙 0.288－0.4
碳酸氢钠 1.464－2
D-葡萄糖 5.16－15
磷酸氢二钠 0.156－0.7
第二部份：氨基酸
成份 含量：g/L培养基
Ｌ-丙氨酸 0.03738－0.218673
甘氨酸 0.0495－0.289575
Ｌ-异亮氨酸 0.3978－2.32713
Ｌ-色氨酸 0.090648－0.5302908
L-亮氨酸 0.58992－3.451032
L-天冬酰胺 0.62244－3.641274
Ｌ-苯丙氨酸 0.060432－0.3535272
Ｌ-酪氨酸 0.2328－1.36188
Ｌ-天冬氨酸 0.558－3.2643
Ｌ-谷氨酸 0.06174－0.361179
L-精氨酸 0.7734－4.52439
L-半胱氨酸 0.14748－0.862758
L-组氨酸 0.113232－0.6624072
Ｌ-脯氨酸 0.14496－0.848016
Ｌ-赖氨酸 2.4084－14.08914
Ｌ-丝氨酸 0.6684－3.91014
Ｌ-苏氨酸 0.9－5.265
Ｌ-蛋氨酸 0.1842－1.07757
Ｌ-缬氨酸 0.5268－3.08178
羟基Ｌ-脯氨酸 0.5－2.925
第三部份：微量元素：
成份 含量：g/L培养基
硫酸镁 0.2748－1.60758
硫酸铁 0.516－3.0186
硫酸铜 0.00144－0.008424
氯化锰MnCl2 0.0000050.00002925
硫酸镍,NiSO4 0.00000033－1.9305E-06
硅酸钠Na2SiO3 0.000284－0.0016614
偏钒酸钠NaVO3 0.00000146－0.000008541
钼酸钠NaMoO4 0.00000242－0.000014157
亚硒酸钠Na2SeO3 0.0000173－0.000101205
氯化亚锡SnCl2 0.00000028－0.000001638
硫酸锌ZnSO4 0.39564－2.314494
第四部份：维生素：
第五部份：其它成份：
成份 含量：g/L培养基
4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 4－6
普卢兰尼克F-68F（Pluronic F-68） 1－2
亚油酸 0.0003528－0.00206388
酵母抽提物(DMV) 3－10
本发明提供的补料培养基的成份：
第一部份：基本成份
成份 含量：g/L培养基
丙酮酸钠 5.67－10.773
硝酸钙 4.32－8.208
D-葡萄糖 100－190
磷酸氢二钠 3.24－6.156
第二部分：氨基酸
成份 含量：g/L培养基
Ｌ-丙氨酸 0.5607－1.06533
甘氨酸 0.7425－1.41075
Ｌ-异亮氨酸 7.5－14.25
Ｌ-色氨酸 1.93－3.667
L-亮氨酸 8.8488－16.81272
L-天冬酰胺 9.3366－17.73954
Ｌ-苯丙氨酸 1.3－2.47
Ｌ-酪氨酸 4.3－8.17
Ｌ-天冬氨酸 8.3715.903
Ｌ-谷氨酸 0.9261－1.75959
L-精氨酸 9－17.1
L-半胱氨酸 3－5.7
L-组氨酸 1.69848－3.227112
Ｌ-脯氨酸 1.2－2.28
Ｌ-赖氨酸 36.126－68.6394
Ｌ-丝氨酸 8－15.2
Ｌ-苏氨酸 13.5－25.65
Ｌ-蛋氨酸 4－7.6
Ｌ-缬氨酸 17－32.3
羟基Ｌ-脯氨酸 15－28.5
第三部分：微量元素
成份 含量：g/L培养基
硫酸镁 0.423－0.8037
硫酸铁 3.5－6.65
硫酸铜 0.0216－0.04104
氯化锰MnCl2 0.000075－0.0001425
硫酸镍NiSO4 0.00000495－0.000009405
硅酸钠Na2SiO3 0.00426－0.008094
偏钒酸钠NaVO3 0.0000219－0.00004161
钼酸钠NaMoO4 0.0000363－0.00006897
亚硒酸钠Na2SeO3 0.0002595－0.00049305
氯化亚锡SnCl2 0.0000042－0.00000798
硫酸锌ZnSO4 5.9346－11.27574
第四部分：维生素
第五部分：其它成份
成份 含量：g/L培养基
亚油酸 0.005292－0.0100548
酵母抽提物 30－100
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的主要优点在于：
1、本发明提供的专用于CHO细胞的无血清基础培养基，其培养的CHO细胞密度超过国际上通用的JRH培养基。
2、在大规模培养中，发明人通过在合适的时间给与CHO细胞特制的补料，使得CHO细胞的密度和表达量大幅度增加，发酵液中药物蛋白含量达到了1.7克/L的水平。
3、本发明提供的无血清培养基及其补料不以任何商品培养基作为蓝本进行添加，具有极高的应用和经济价值，对提高中国国内大规模动物细胞培养技术的水平有重要意义。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明实施例中使用的JRH培养基购自Sigma(St Louis,MO,USA),为Excel325无血清培养基(目录号24340C)；Invitrogen培养基购自Invitrogen(Grand Island,NY,USA),为CD-CHO无血清培养基(目录号10743-029)。JRH补料培养基购自Sigma(St Louis,MO,USA),为CHO反应器补料培养基(目录号C1615)；Invitrogen补料培养基购自Invitrogen(GrandIsland,NY,USA),为CD-CHO50X补料培养基(目录号001-0042CD-CHO50X酸性补液,001-0084CD-CHO50X碱性补液)。
实施例1
配制用于CHO细胞的基础培养基
一、配制基础培养基：
1.成份
赛金基础CHO培养基（按表一配制）
NaHCO3 1.6g/L
L-谷氨酰胺0.4344g/L
葡萄糖6.4g/L
胰岛素（10mg/ml）50ul即：0.5mg/L
2.滤器准备
超纯水：制水机终点电阻值〉17兆欧姆以上，确认天平正常工作，平衡气泡已调节。
根据培养基体积选择滤器，适合的过滤材质：筒式亲水滤芯或平板滤膜。
筒式滤芯：0.22um，大小适合套筒，作完整性检测
平板滤膜：0.45um，0.22um各一片，充分湿润
滤器灭菌：122℃，30分钟
3.配制
加赛金基础CHO培养基、葡萄糖及Glutamine用终体积90％的超纯水溶解，充分搅拌半小时，加NaHCO3，加后再保持搅拌1小时，加胰岛素，定容至所需终体积并保持搅拌10—15分钟。
除菌过滤，按筒式过滤器或平板过滤器标准操作程序进行。
表一赛金基础培养基的成分
实施例2
配制用于CHO细胞的补料培养基
一、配制流加培养基：
1.成份
赛金补料培养基（按表二的比例配制）
葡萄糖24.4g/L
2.滤器准备
超纯水：制水机终点电阻值〉17兆欧姆以上，确认天平正常工作，平衡气泡已调节。
根据培养基体积选择滤器，适合的过滤材质：筒式亲水滤芯或平板滤膜。
筒式滤芯：0.22um，大小适合套筒，作完整性检测
平板滤膜：0.45um，0.22um各一片，充分湿润
滤器灭菌：122℃，30分钟
3.配制
加赛金补料培养基及葡萄糖用终体积90％的超纯水溶解，充分搅拌半小时，定容至所需终体积并保持搅拌10—15分钟。
除菌过滤，按筒式过滤器或平板过滤器标准操作程序进行。
表二赛金补料培养基配制
实施例3
基础培养基培养CHO细胞
试验方式：批培养（不进行补料）
试验程序：在这个培养验证中，不进行补料，接种后，细胞存活率降低到50%左右为培养终点。
培养环境：37℃，5％二氧化碳
摇瓶培养过程：在超净台内分别向两个125ml摇瓶内加入过滤好的实施例1的基础培养基和JRH培养基。接入种子（计为第0天），使得细胞的终密度为0.5x106，总体积30ml。细胞进入平台期中期后开始降温，使细胞由生长状态转为表达蛋白。
培养结果：在用赛金培养基培养的第七天，细胞密度达到最高：5.3x106，存活率99.1%。而用JRH基础培养基培养的细胞密度为3.9x106，存活率97.5%，JRH基础培养基在第十天达到最高密度4.1x106，存活率93.5%。
比较项目 实施例1的基础培养基 JRH基础培养基
最高细胞密度（细胞/ml） 5.3x106 3.9x106
最高细胞密度时活性 99.1% 97.5%
蛋白滴度（g/L） 0.4 0.2
实施例4
对CHO细胞培养液进行流加培养（加入补料培养基）：
试验方式：流加培养（加入补料培养基）
试验程序：在这个培养试验中，在细胞生长到对数生长期中期的进行补料，细胞在平台期的中期进行降温操作开始表达蛋白，存活率降低到50%左右为培养终点。
培养环境：37℃，5％二氧化碳
摇瓶培养过程：在超净台内分别向三个125ml摇瓶内加入过滤好的实施例1的基础培养基、JRH和Invitrogen培养基，接种后使得细胞总体积为30ml，接种时细胞密度皆为：0.5x106细胞/ml。在细胞生长到对数生长期中期（第七天）进行补料，加入浓缩的实施例2的补料培养基750μl左右，细胞培养液体积没有太大变化（取样和蒸发会损失一点体积）。细胞进入平台期中期后开始降温，使细胞由生长状态转为表达蛋白。
结果
1.基础培养基：
本发明的基础培养基培养CHO细胞的结果表明，细胞生长旺盛、迅速，细胞活性高，在培养中可以达到很高的细胞密度，在发明人的实验中最高的细胞密度超过了国内常用的JRH培养基36%，蛋白滴度超过JRH培养基一倍，所以本发明提供的基础培养基的配方比JRH更加合理，在培养中更能促进细胞的生长。
2.补料培养基
本发明的补料培养基加入对数生长期中期的CHO培养液后，细胞可达到更高的细胞密度，在极高的细胞密度时，还可以保持很高的活性，为下一步的降温表达蛋白提供了很好的保障。
通过实验比较，赛金补料培养基比JRH、Invitrogen能达到更高的细胞密度，比JRH提高74%，比Invitrogen高76%，表达的蛋白量比JRH高212.5%，比Invitrogen高283.3%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (6)

1.一种用于中国仓鼠卵巢细胞的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基含有以下基本成份：
6-6.5g/L氯化钠；
0.5-0.5g/L氯化钾；
0.462-1g/L丙酮酸钠；
0.288-0.4g/L硝酸钙；
1.464-2g/L碳酸氢钠；
5.16-15g/L D-葡萄糖；和
0.156-0.7g/L磷酸氢二钠，以所述基础培养基的总体积计；
所述的基础培养基还含有10-54g/L氨基酸、1.2-7.0g/L微量元素、0.3-1.6g/L维生素、和3-10g/L酵母抽提物；
所述的氨基酸（g/L）是：
所述的微量元素（g/L）是：
所述的维生素（g/L）是：
2.一种用于中国仓鼠卵巢细胞的补料培养基，其特征在于，所述补料培养基含有以下基本成份：
5.67-10.773g/L丙酮酸钠；
4.32-8.208g/L硝酸钙；
100-190g/L D-葡萄糖；和
3.24-6.156g/L磷酸氢二钠，以所述的补料培养基的总体积计；
所述的补料培养基还含有153-300g/L氨基酸、10-19g/L微量元素、5.5-11g/L维生素、和30-100g/L酵母抽提物；
所述的氨基酸（g/L）是：
所述的微量元素（g/L）是：
所述的维生素（g/L）是：
3.权利要求1所述的基础培养基的用途，其特征在于，用于培养中国仓鼠卵巢细胞。
4.权利要求2所述的补料培养基的用途，其特征在于，用于培养中国仓鼠卵巢细胞。
5.一种中国仓鼠卵巢细胞的培养方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
（a）在如权利要求1所述的基础培养基中培养中国仓鼠卵巢细胞；和
（b）在细胞生长到对数生长期加入如权利要求2所述的补料培养基培养中国仓鼠卵巢细胞。
6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤（a）中，以0.5x106密度起始培养中；步骤（b）中，在培养第3－5天细胞密度4－7x106时给予补料。
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