CN110438066B - 一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293 c18p及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293 C18P及其制备方法和应用，哺乳动物细胞系293 C18P保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201913；由293 c18细胞株(
CRL‑10852TM)驯化至无血清悬浮培养，达到了在短期内可获得大量转染细胞和培养上清大大提高了重组单克隆抗体开发的效率降低了成本；因此可用于重组蛋白和单克隆抗体工业化生产和大规模开发。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293 C18P，还涉及该细胞系的制备方法和应用。
背景技术
重组蛋白技术自发明以来为生命科学研究做出了巨大的贡献，尤其是近年来在蛋白质组学、生物制药领域得以广泛的应用，极大地促进了现代医学和人类健康的发展。
重组蛋白的制备和生产技术一般使用原核细胞表达和真核细胞表达两大技术平台，而真核细胞表达技术的代表就是哺乳动物细胞表达技术平台。原核细胞表达技术平台具有速度快、产量高、成本低的优势，但是原核细胞表达出来的蛋白由于缺乏必要的翻译后修饰，无法进行糖基化或者无法形成正确的空间构象，从而不具有生物活性，无法进一步在蛋白质组学和生物制药中广泛应用。而哺乳动物细胞由于是高等动物细胞，具有完善的翻译后修饰功能，因此哺乳动物细胞能够进行复杂的翻译后加工修饰使蛋白产物更接近天然蛋白折叠和聚合，具备活性蛋白所必须的空间结构和修饰。因此，用哺乳动物细胞系统表达重组蛋白是目前最为先进的活性蛋白的表达方式。但一般的哺乳动物细胞，如293c18为贴壁细胞，在单位培养体积内细胞量少，蛋白产量低，所需设备占用空间大不利于工业化大规模制备和生产。因此，迫切需要寻求这种哺乳动物细胞系体外大规模培养的方法，而使科研和生产活动更加高效和可靠。
哺乳动物细胞系体外悬浮培养方式可以提高单位体积内细胞密度、延长细胞生长时间，因此在短时间内获得大量细胞和培养上清，显著提高重组蛋白的生产效率。
上世纪70年代小鼠单克隆抗体的出现使得发现新蛋白靶点、研究蛋白功能简便易行，并为抗体药物研发奠定了基础。但由于利用小鼠腹水制备抗体存在很多现实缺陷，如需要较大的动物饲养空间，腹水内存在大量不确定的动物源性病毒或其他生物因子，产量低、稳定性差等，无法满足科研和临床对诊断类抗体试剂质量要求。
因此，急需一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系，解决现有哺乳动物细胞系在单位培养体积内细胞量少，蛋白产量低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293 C18P，具体方案如下：
一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293C18P，所述哺乳动物细胞系293 C18P由293c18细胞株(
CRL-10852TM)驯化至可稳定地悬浮培养。
作为本发明优选的技术方案，所述哺乳动物细胞系293C18P保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201913。
本发明的目的之二在于提供所述哺乳动物细胞系293C18P的制备方法。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
所述哺乳动物细胞系293 C18P的制备方法，包括如下步骤：将贴壁生长的293 c18细胞株
CRL-10852TM接种于培养液中，按培养液体积70％至1％梯度降低加入条件培养基悬浮培养1～5天，传代前再按培养液体积20％至1％梯度降低加入质量分数为0.25％的Trypsin-EDTA使细胞分散成单个细胞，然后离心去除质量分数为0.25％的Trypsin-EDTA，细胞用培养液重悬，接着按重悬培养液体积20％至1％梯度降低加入质量分数为0.25％的Trypsin-EDTA悬浮培养细胞，取消0.25％的Trypsin-EDTA和条件培养基的添加量，直至293c18细胞可稳定地悬浮培养。
优选的，所述293c18细胞株
CRL-10852TM按104/ml～107/ml的细胞量接种。
优选的，所述条件培养基的组分为293细胞培养后的培养液上清；所述培养液的各组分浓度为FreeStyleTM293 Expression Medium、
293S无血清培养基或
CD 293M无血清培养基中添加G-418和Pluronic F-68至终浓度分别为5μg/L～100μg/L和0.05％～0.5％，v/v。
本发明的目的之三在于提供所述的哺乳动物细胞系293 C18P通过悬浮培养方式制备重组蛋白中的应用，为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
所述的哺乳动物细胞系293 C18P在通过悬浮培养制备重组蛋白中的应用。
本发明的目的之四在于提供所述的哺乳动物细胞系293 C18P在通过悬浮培养制备重组单克隆抗体中的应用，为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
所述的哺乳动物细胞系293 C18P通过悬浮培养方式制备重组单克隆抗体中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293 C18P，通过驯化贴壁细胞至无血清悬浮培养，与应用于一般的科研和工业生产小鼠腹水或者哺乳动物细胞稳定转染相比(因为这两者样品个数少，单一样品需求量大在时间、场地、成本上限制没有很高，并不适用于如此丰富的重组单克隆抗体测试筛选)，达到了在短期内可获得大量转染细胞和培养上清大大提高了重组单克隆抗体开发的效率降低了成本。经过统计使用了293 C18P细胞转染的3个项目表达量比原来293 c18细胞产量平均提高17倍，在生产相同抗体量成本约为贴壁细胞的1/17。极大的提高了效率并节省了人力和物料成本，使整个重组单克隆抗体开发工艺更加稳定和成熟。与公开号为CN106350485A的发明《一种快速高效分离单个抗原特异性B细胞的方法》分离得到的B细胞结合可高效地、大规模的制备和生产用于科研、诊断和治疗的重组单克隆抗体。对抗体或重组蛋白的大规模生产具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为显微镜下293c18细胞株状态(400×)；
图2为显微镜下293C18P细胞状态；
图3为293c18染色体数量分析。
图4为293C18P染色体数量分析。
图5为293C18P细胞免疫荧光成像(IF)。
图6为相同细胞接种量的抗体量比较。
图7为相同培养上清产量比较。
保藏说明
本发明的293 C18P细胞株由贴壁细胞293c18细胞株(
CRL-10852TM)驯化至可稳定的悬浮培养，293 C18P保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201913，保藏日为2019年1月30日，保藏地址为中国武汉武汉大学，分类命名为人胚肾转化细胞系293 C18P。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明实施例中所涉及到的培养液包括但不限于DMEM、RPMI-1640、
FreeStyleTM293 Expression Medium、
293S无血清培养基、
CD 293M无血清培养基，含GlutaMax-I、CD 293 TGE Medium、Xell HEK TF、Xell HEK GM等；涉及到的补料添加剂包含但不限于
293瞬转表达用补料，25～100X、5％～40％氨基酸添加剂、KT-Feed(50X)等；涉及到的转染方法包括但不限于电转、化学转染、脂质体转染等；涉及到的转染试剂包括但不限于
3000、
T202、
2000、PEI等；所涉及到的蛋白表达应用包括但不限于：重组单克隆抗体表达、重组蛋白表达、抗原表达等；所涉及到的其他方面应用包括但不限于：制备细胞裂解液、活细胞流式、免疫细胞荧光、免疫细胞化学等。
实施例1、细胞驯化和筛选
293 c18细胞贴壁生长不利于快速获得大量细胞和培养上清生产单克隆抗体以及其他重组蛋白这一实际问题，因此通过细胞驯化至可稳定传代的悬浮培养状态，以达到体外大规模培养细胞，快速大量制备重组单克隆抗体，细胞驯化和筛选的具体方法如下：
(1)将贴壁生长的293c18细胞(
CRL-10852TM)按照104/ml～107/ml的细胞量接种于培养液中，然后依次用加有相当于培养液体积70％、50％、30％、10％和1％条件培养基的混合培养基传代并悬浮培养1～5天；
(2)细胞传代前依次加入相当于混合培养基体积20％、15％、10％、6％、3％和1％的质量分数为0.25％的Trypsin-EDTA使成团细胞分离成单个细胞，离心除去含质量分数为0.25％的Trypsin-EDTA后用培养液重悬，计算细胞数量和活率；
(3)将步骤(2)收集的悬浮细胞用培养液悬浮，依次用含有相当于重悬液体积20％、15％、10％、6％、3％和1％的质量分数为0.25％的Trypsin-EDTA混合物培养基悬浮培养细胞，并分别在1天、2天、3天、4天和5天进行传代培养，最后取消质量分数为0.25％的Trypsin-EDTA和条件培养基，直至293c18细胞可稳定地悬浮培养；
(4)扩大细胞并冻存部分作备份，其余细胞继续传代培养待确定细胞可稳定多次传代达到悬浮培养状态，确保驯化完成后扩大冻存，命名为293C18P；
(5)寄送中国培养物保藏中心保藏，获得保藏号为C201913。
显微镜下观察293 C18P悬浮细胞和293 c18贴壁细胞株状态，结果如图1和图2所示。结果显示293 c18细胞株贴壁生长，驯化后293 C18P细胞株可悬浮培养。
本实施例中，条件培养基的组分为293细胞培养后的培养液上清；所述培养液的各组分浓度为FreeStyleTM293 Expression Medium、
293S无血清培养基或
CD 293M无血清培养基中添加G-418和Pluronic F-68至终浓度分别为5μg/L～100μg/L和0.05％～0.5％(v/v)。
实施例2、细胞染色体分析
细胞染色体分析方法如下：
(1)取对数生长期的细胞，加入秋水仙素到培养液内使终浓度为0.4μg/ml，37℃温箱中继续培养2.5～3小时；
(2)倾出秋水仙素处理液，收集细胞，1600rpm离心10min；
(3)将细胞沉淀用1ml、37℃的浓度为0.075mol/L的KCL低渗溶液悬浮，混匀后置37℃温育20～35min，使细胞肿胀，染色体分散；
(4)加入新配置的固定液(甲醇：冰乙酸＝3：1)1ml，混匀，1600rpm离心10min，弃上清，再加入固定液1ml轻轻混匀，静置20～30min，1600rpm离心10min，弃上清；再次加入固定液1ml，轻轻混匀，静置20～30min或4℃过夜，1600rpm离心10min，弃上清液；
(5)每管加入1ml固定液，混匀；吸取20μl细胞悬液，1.5米以上竖直滴加在预冷的干净载玻片上，使细胞悬液铺展于载玻片上，室温下自然干燥(在显微镜下观察，如果细胞均匀地铺开，细胞不重叠则用同样细胞浓度制备细胞样品，否则要进一步稀释细胞悬液，以达到满意的铺片效果)；
(6)用10％Giemsa染液染10～15min，流水冲洗，自然干燥；
(7)将载玻片置显微镜油镜下观察计数，结果如图3和图4所示；
统计结果显示293 c18染色体数为22(-2，+2)，293 C18P染色体数为22(-2，+2)。两者遗传物质数量一致，证明悬浮驯化仅改变了细胞的培养方式，未改变细胞的生物学本质。
实施例3、细胞转染
细胞转染具体步骤如下：
(1)用母代细胞株293 c18和悬浮驯化细胞株293 C18P同时调整到转染试剂对应的推荐量接种到培养瓶中；
(2)按照每1M细胞对应0.5μg或1μg或2μg DNA和1μl或2μl或4μl转染试剂。转染试剂可以是
3000、
2000、PEI等脂质体转染试剂或化学转染试剂或通过电转化转染；
(3)将上述DNA和转染试剂分别稀释到50μl的Opti-MEM或者培养基或者PBS或者无菌水中，混匀后室温放置5min；将上述转染试剂溶液滴加到DNA溶液中，轻轻混匀后室温下放置10min或者15min或者20min，将上述混合物均匀滴加到细胞培养瓶内，轻轻摇匀；
(4)根据需要可在第2天或第3天加入补料添加剂；
(5)根据生长状态在第3天或第4天或第5天或第6天或第7天或第8天或第9天或第10天后收集细胞或上清；
(6)细胞可以用于FCM流式细胞术或ICC免疫细胞化学或IF免疫荧光或用于制备细胞裂解液等实验；其中训化293 C18P细胞系免疫荧光成像结果如图5所示。结果显示，训化293 C18P细胞系的细胞产量高。
将培养的细胞株293 c18和悬浮驯化细胞株293 C18P分别回收抗体，同时回收上清中抗体，结果如图6和图7所示。
结果显示，293C18P细胞转染的3个项目表达量比原来293c18细胞产量平均提高17倍，在生产相同抗体量成本约为贴壁细胞的1/17。极大的提高了效率并节省了人力和物料成本，使整个重组单克隆抗体开发工艺更加稳定和成熟。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (3)
1.一种可稳定传代的可悬浮培养的哺乳动物细胞系293 C18P，其特征在于：所述哺乳动物细胞系293 C18P由293 c18细胞株ATCC® CRL-10852™驯化至可稳定地无血清悬浮培养，所述哺乳动物细胞系293 C18P保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201913。
2.权利要求1所述的哺乳动物细胞系293 C18P在通过悬浮培养制备重组蛋白中的应用。
3.权利要求1所述的哺乳动物细胞系293 C18P在通过悬浮培养制备重组单克隆抗体中的应用。
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