CN118726202A - 一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及培养基技术领域，具体涉及一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法，其包括以下组分：海洋鱼粉15‑20重量份、豌豆浸汁液25‑30重量份、活性炭0.01‑0.03重量份、乳糖5‑7重量份、麦芽糊精6‑9重量份、酵母浸出粉4‑6重量份、大豆油2‑5重量份、苯丙氨酸0.4‑0.8重量份和无机盐10‑15重量份，其中，豌豆浸汁液为新鲜豌豆经蒸煮后，经胰蛋白酶酶解，再过滤得到，该培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、消泡剂和促进剂，并在原有基础上增添了快速氮源豌豆浸汁液和抗营养因子吸附剂活性炭，从而提高培养过程的效率和抗生素的产率。

Description

一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵 方法

技术领域

本发明涉及培养基技术领域，具体地说，涉及一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法。

背景技术

海洋鱼粉一种通过将海洋鱼类(通常是小型海洋鱼类或鱼类副产品)经过蒸煮、去油、干燥和磨碎等过程加工而成的高蛋白质产品，它主要作为动物饲料的添加剂，但在微生物学和生物技术领域，海洋鱼粉也被用作培养基的成分之一，海洋鱼粉的蛋白质含量通常在50％到70％之间，且蛋白质质量高，含有所有必需氨基酸，富含B族维生素、钙、磷等，且比例适宜，因此用海洋鱼粉制作培养基，可以为微生物提供了丰富的氮源，以及必需的维生素和矿物质，能够满足微生物的生长需求，并且由于海洋鱼粉价格低廉，还能降低成本。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中分离到的1株对多种植物病原菌具有抑制作用的拮抗链霉菌，通过研究发现，该菌及其次生代谢产物对不同致病力的棉花黄萎病菌都有很强的抑制作用，可以导致黄萎病菌菌丝变形，并伴随有溶菌作，温室及大田试验结果表明，其发酵液对棉花黄萎病有较好的田间防效用，其显著的生物防治效果和潜在的抗生素生产能力，使得玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63成为植物病害生物防治领域的一个重要研究对象，然而现有培养基的抗生素发酵产率偏低，鉴于此，我们提出一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种海洋鱼粉培养基，包括以下组分：海洋鱼粉15-20重量份、豌豆浸汁液25-30重量份、活性炭0.01-0.03重量份、乳糖5-7重量份、麦芽糊精6-9重量份、酵母浸出粉4-6重量份、大豆油2-5重量份、苯丙氨酸0.4-0.8重量份和无机盐10-15重量份，其中，无机盐为磷酸二氢钾1-3重量份、七水硫酸镁2-3重量份、碳酸钙1-2重量份和二氯化锰4-6重量份，其中，豌豆浸汁液为新鲜豌豆经蒸煮后，经胰蛋白酶酶解，再过滤得到。

以海洋鱼粉作为培养基的复杂氮源，海洋鱼粉是由鱼或其他海洋生物的残余物经过加工制成的粉末，含有大量的蛋白质、脂肪、矿物质和维生素，是优质的氮源，但是蛋白质在鱼粉中以复杂的多肽和蛋白质形式存在，需要微生物分泌的蛋白酶和肽酶将其分解成较小的肽段和氨基酸才能被吸收利用，因此作为复杂氮源，持续稳定的为微生物提供碳源。

豌豆浸汁液作为培养基的简单氮源，由于豌豆中富含蛋白质，通过浸提过程，蛋白质被水解成肽和游离氨基酸，这些氨基酸和肽是微生物生长的理想氮源，可以直接被微生物吸收利用，促进其快速生长和代谢活动，促进菌体的快速生长和细胞分裂，氨基酸和营养素的充足供应可以激活或加速抗生素合成的代谢途径，提高抗生素的产量。

活性炭用于吸附培养基中的色素、杂质和抑制剂，为微生物创造一个更清洁的生长环境，减少对微生物的毒性影响，提高抗生素的产率和产品的纯度。

乳糖作为简单碳源，易于微生物代谢，提供快速的能量来源，促进微生物的初始生长；麦芽糊精作为复杂碳源，需要通过微生物自身的酶系统水解成单糖，能够为微生物提供持续的能量供应，支持菌体的生长和代谢活动，因此适合且充足的碳源是抗生素合成的物质基础。

酵母浸出粉可以作为生长因子，富含B族维生素，如维生素B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9和B12，这些维生素是辅酶和辅基的组成部分，参与了能量代谢、氨基酸代谢、核酸合成等广泛的生物化学反应，且酵母浸出粉中的核苷酸是DNA和RNA合成的前体，对细胞的复制和遗传信息的传递至关重要，因此酵母浸出粉的添加，可以优化微生物的生长条件，促进微生物的生长和代谢，提高目标产物的产率和质量。

大豆油可以作为培养基发酵生产的消泡剂，在发酵过程中，由于机械搅拌、气体通入或代谢过程产生的二氧化碳，培养基中会形成大量泡沫，这些泡沫不仅降低了发酵罐的有效容积，还可能引起发酵液溢出，导致原料浪费和微生物污染，同时影响氧气的传递效率，从而影响发酵效率和产物的质量，由于大豆油是疏水性的，当它被引入到泡沫中时，会扩散到泡沫界面，降低水相和空气相之间的表面张力。这种表面张力的降低破坏了泡沫的稳定性，导致泡沫膜变薄，进而破裂，另外添加少量的大豆油，由于它在液面上形成了一个连续的油层，减少了空气的捕获，从而降低了泡沫形成的概率，进而抑制新泡沫的形成。

苯丙氨酸作为一种必须氨基酸，是微生物蛋白质合成的直接前体，补充苯丙氨酸可以增加氨基酸池，促进蛋白质的合成，从而加快微生物的生长和代谢活动，苯丙氨酸还会参与一些抗生素的合成途径，影响抗生素的结构和产量，是微生物合成代谢抗生素产物的前体，对于抗生素等次级代谢产物的生物合成尤为重要，因此可以作为参与代谢途径的促进剂。

由于磷是微生物生长代谢活动中的重要元素，磷和钾是细胞膜、核酸、ATP等重要生物分子的组成部分，对细胞分裂和代谢过程至关重要，充足的磷、钾供应可以优化抗生素的合成途径，提高产量，因此添加磷酸二氢钾为微生物提供磷和钾元素，并作为缓冲剂帮助维持培养基pH值的稳定；Ca²⁺主要参与调节细胞的生理状态，能够降低细胞膜的通透性、维持细胞的胶体状态等，有研究表明CaCO₃是多数菌种发酵培养基中不可缺少的一种成分，由于CaCO₃对发酵后的菌量有较大的影响，因此加入CaCO₃促进抗生素的形成，并调节培养基pH值，中和酸性代谢产物，防止pH值下降，维持pH值的稳定，防止pH波动对菌种生长的不利影响；镁离子对维持细胞内酶的活性至关重要，由于镁是多种酶的辅助因子，参与核酸和蛋白质的合成，以及能量代谢过程，镁离子的充足供应可以促进与抗生素合成相关的酶的活性，从而可能提高抗生素的产量，同时硫酸镁还可以调节渗透压，因此在培养基中添加了七水硫酸镁，以调节渗透压并促进抗生素的生产；锰参与抗氧化防御系统，对于细胞的抗氧化能力和代谢过程有重要作用，可以保护菌种免受氧化损伤、维持正常的代谢功能，适当的锰离子浓度可以增强细胞的抗氧化能力，减少自由基的损害。

作为优选，所述豌豆浸汁液的制备方法如下：

选择新鲜的豌豆加水，加热至沸，再降低火力继续加热，直到豌豆变软，加热时间30-50min，使用筛网将豌豆和水分离，轻轻挤压豌豆，以帮助释放更多的汁液和营养物质，然后加入3-5重量份胰蛋白酶，将过滤后的浸汁液倒入无菌容器中，然后使用高压蒸汽灭菌器在120-125℃下灭菌20-30min，灭菌后，让浸汁液自然冷却至室温，得到豌豆浸汁液。

作为优选，所述新鲜豌豆和水的质量比为1：3～4。

作为优选，所述胰蛋白酶的添加量为新鲜豌豆质量的0.5-0.8％。

胰蛋白酶能针对性的分解抗营养因子如胰蛋白酶抑制因子，这些因子能够抑制胰蛋白酶的活性，影响蛋白质的消化，通过胰蛋白酶的作用，可以释放更多小分子肽和氨基酸，提高豌豆蛋白质的消化率和营养可利用性，此外，胰蛋白酶还能促进豌豆中其他营养成分的释放，如维生素和矿物质，从而增强豌豆浸取液作为培养基的营养价值。

作为优选，所述一种海洋鱼粉培养基的制备方法如下：

在容器中先加入100-110重量份蒸馏水，依次加入酵母浸出粉、乳糖、麦芽糊精、磷酸氢二钾，七水硫酸镁，二氯化锰和苯丙氨酸，搅拌直至完全溶解，然后加入豌豆浸汁液和大豆油，再添加海洋鱼粉和活性炭，充分搅拌至完全分散，最后加入碳酸钙调节pH值，将制备好的培养基分装到发酵罐，密封容器，使用高压蒸汽灭菌器在120-125℃下灭菌20-30min，自然冷却至室温，一种海洋鱼粉培养基制备完成。

作为优选，所述活性炭在热水中煮沸3min后过滤干燥得到。

作为优选，所述碳酸钙用于调节培养基的初始pH值至6.8-7.2。

培养基的初始pH值是确保微生物正常繁殖、代谢的重要参数，最佳初始pH值对不同种类微生物发酵后目的产物的产量及质量影响较大，其主要原因在于，第一，pH值影响微生物细胞原生质膜的电荷，进而影响微生物的生长和新陈代谢的正常进行；第二，pH值直接影响微生物细胞内的酶活性，从而影响微生物的生长繁殖和新陈代谢；第三，pH值影响培养基中某些重要的营养物质和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的吸收和利用。

本发明提供了一种海洋鱼粉培养基发酵方法，基于上述中任意一项所述的一种海洋鱼粉培养基，包括如下步骤：

制备一级种子液：

用接种环挑选一环抗生素生产发酵菌接种于一级种子培养基中，24-25℃，200-220rpm摇瓶培养5-8h；

制备二级种子液：

取一级种子液按1-3％接种量接种于二级种子培养基中，24-25℃，200-220rpm摇瓶培养18-22h；

发酵培养：

将二级种子按10-12％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，24-25℃，装液量为50-55％(v/v)，通气量0.8-1vvm，初始pH值为6.8-7.2，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％-40％，维持菌体生长，当发酵时间为15-16h时，控制溶氧25-27％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

作为优选，所述一级种子培养基的组分为葡萄糖1-2重量份、蛋白胨2-4重量份、酵母粉0.3-0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0-7.2；二级种子培养基的组分为葡萄糖15-18重量份，酵母粉4-6重量份，磷酸氢二钾3-5重量份，硫酸铵2-3重量份，硫酸镁0.1-0.3重量份，pH值为6.7-6.9；发酵培养基的组分为海洋鱼粉15-20重量份、豌豆浸汁液25-30重量份、活性炭0.01-0.03重量份、乳糖5-7重量份、麦芽糊精6-9重量份、酵母浸出粉4-6重量份、无机盐10-15重量份、大豆油2-5重量份、苯丙氨酸0.4-0.8重量份，pH值为6.8-7.2。

温度对发酵的影响主要表现在直接效应和间接效应两个方面，直接效应包括影响微生物的生长速率、酶活性、细胞组成和营养需求等，间接效应包括影响溶质分子的溶解性、离子的运输和扩散、细胞膜的渗透压及表面张力等，高温会使微生物细胞内的蛋白质发生变性或凝固，同时还破坏了微生物细胞内的酶活性，从而杀死微生物，而低温又会抑制微生物的生长。

溶氧指发酵液中溶解的氧气量，它是菌体进行有氧代谢的基础，是发酵中的另一重要因素，溶氧不仅影响次生代谢产物的合成途径，也会影响代谢的合成速度，在发酵过程中，由于菌体密度高，发酵过程摄氧量大，因此需要保证溶氧在一定范围内，溶氧浓度不足会抑制菌体的生长和次级代谢产物的合成，导致产物产量下降，但是当通气量过大时，会导致溶解氧过量，菌体出现自溶现象，不利于抗生素的生产。

接种量是指初始投入的菌体数量，过低的接种量会导致延迟期延长，增加污染的风险，而过高的接种量可能导致营养物质的快速消耗，造成菌体过早进入稳定期或衰亡期，影响产物的产量和质量，因此适当的接种量有助于快速启动发酵过程，缩短延迟期，使菌体能更快进入对数生长期。

装液量是指发酵罐内培养基的体积，它影响着发酵罐内的液体动力学特性，如混合效果、传质和传热效率，装液量过高会降低氧气的溶解度和传递效率，限制菌体的生长和产物的形成，过低则可能导致营养物质分布不均，同样影响发酵效率。

通气量指单位时间内向发酵罐中供给的空气或无菌气体的体积，影响发酵体系中的氧气供应，充足的通气量保证了菌体的有氧呼吸，促进生长和次级代谢产物的合成，但通气不足会导致菌体缺氧，进入厌氧代谢状态，抑制抗生素等需要氧气参与合成的产物的产生。

本发明还提供了一种海洋鱼粉培养基在抗生素发酵生产中的应用，基于上述中任意一项所述的一种海洋鱼粉培养基发酵方法，包括如下步骤：

S1.1、取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养6h，其中一级种子培养基的组分为葡萄糖1重量份，酵母粉4重量份，磷酸氢二钾3重量份，硫酸铵2重量份，硫酸镁0.1重量份，pH值为6.8；

S1.2、取一级种子液按1-3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm培养18h，其中二级种子培养基的组分为葡萄糖15重量份，酵母粉7重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.9；

S1.3、将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，在25℃下，装液量为55％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧35％，维持菌体生长，当发酵时间为16h时，控制溶氧27％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵，其中发酵培养基的组分为海洋鱼粉18重量份、豌豆浸汁液26重量份、活性炭0.01重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精9重量份、酵母浸出粉4重量份、无机盐12重量份、大豆油1重量份、苯丙氨酸0.7重量份，pH值为7.1；

S1.4、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

该一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法中，一种海洋鱼粉培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、促进剂、消泡剂和抗营养因子吸附剂，利用海洋鱼粉作为复杂氮源为微生物的生长提供稳定的氮源，豌豆浸汁液作为简单氮源，为微生物提供快速可用的氮源，在微生物培养的初期，缩短延迟期，使微生物更快地进入对数生长期，从而提高整个培养过程的效率，并添加活性炭为抗营养因子吸附剂，吸附培养基中的色素、杂质和抑制剂，减少对微生物的毒性影响，从而提高抗生素的产率和产品的纯度。

附图说明

图1为本发明抗生素标准曲线的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的一种海洋鱼粉培养基，包括以下组分：海洋鱼粉15-20重量份、豌豆浸汁液25-30重量份、活性炭0.01-0.03重量份、乳糖5-7重量份、麦芽糊精6-9重量份、酵母浸出粉4-6重量份、大豆油2-5重量份、苯丙氨酸0.4-0.8重量份和无机盐10-15重量份，其中，无机盐为磷酸二氢钾1-3重量份、七水硫酸镁2-3重量份、碳酸钙1-2重量份和二氯化锰4-6重量份，其中，豌豆浸汁液为新鲜豌豆经蒸煮后，经胰蛋白酶酶解，再过滤得到。

实施例1

一种海洋鱼粉培养基的发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖1重量份、蛋白胨2重量份、酵母粉0.3重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖15重量份，酵母粉4重量份，磷酸氢二钾3重量份，硫酸铵2重量份，硫酸镁0.1重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液25重量份、活性炭0.01重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为7.0；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

实施例2

一种海洋鱼粉培养基的发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖1.5重量份、蛋白胨3重量份、酵母粉0.4重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖16重量份，酵母粉5重量份，磷酸氢二钾4重量份，硫酸铵2.5重量份，硫酸镁0.2重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液25重量份、活性炭0.01重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为7.0；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

实施例3

一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖2重量份、蛋白胨4重量份、酵母粉0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖18重量份，酵母粉6重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液25重量份、活性炭0.01重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为7.0；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

实施例4

一种海洋鱼粉培养基的发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖2重量份、蛋白胨4重量份、酵母粉0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖18重量份，酵母粉6重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液28重量份、活性炭0.01重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为7.0；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

实施例5

一种海洋鱼粉培养基的发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖2重量份、蛋白胨4重量份、酵母粉0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖18重量份，酵母粉6重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液30重量份、活性炭0.01重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为7.0；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

实施例6

一种海洋鱼粉培养基的发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖2重量份、蛋白胨4重量份、酵母粉0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖18重量份，酵母粉6重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液30重量份、活性炭0.02重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为7.0；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

实施例7

一种海洋鱼粉培养基的发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖2重量份、蛋白胨4重量份、酵母粉0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖18重量份，酵母粉6重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液30重量份、活性炭0.03重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为7.0；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

实施例8

一种海洋鱼粉培养基的发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖2重量份、蛋白胨4重量份、酵母粉0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖18重量份，酵母粉6重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液30重量份、活性炭0.02重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为6.8；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

实施例9

一种海洋鱼粉培养基的发酵方法，包括如下步骤：

S3.1、一级种子培养基：葡萄糖2重量份、蛋白胨4重量份、酵母粉0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0；

S3.2、二级种子培养基：葡萄糖18重量份，酵母粉6重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.7；

S3.3、发酵培养基：海洋鱼粉15重量份、豌豆浸汁液30重量份、活性炭0.03重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精6重量份、酵母浸出粉4重量份、磷酸二氢钾1重量份、七水硫酸镁2重量份、碳酸钙1重量份、二氯化锰4重量份、大豆油2重量份、苯丙氨酸0.4重量份，pH值为7.2；

S3.4、制备一级种子液：取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养5h；

S3.5、制备二级种子液：取一级种子液按3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养20h；

S3.6、发酵培养：将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，25℃，装液量为50％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％，维持菌体生长，当发酵时间为15h时，控制溶氧25％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

S3.7、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。

对比例1

采用实施例6的方法，不添加豌豆浸汁液。

对比例2

采用实施例6的方法，不使用活性炭。

对比例3

采用实施例6的方法，未对新鲜豌豆酶解。

本发明通过采用海洋鱼粉培养基的快速氮源和抗营养因子吸附剂成分制备的一种海洋鱼粉培养基，其中，一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法的性能指标检验项目与检验标准如下：

抗生素含量测定，首先建立标准曲线，准确称取0.0100g抗生素标准品，加80％乙醇溶解，容量瓶中定容至50mL，得浓度为0.200mg/mL的抗生素溶液，梯度稀释8、10、12、14、16、32、64倍至浓度分别为0.0250、0.0200、0.0167、0.0143、0.0125、0.0063、0.0031mg/mL，测定不同浓度溶液在363nm处的吸光度，绘制标准曲线，由于玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63所产生的抗生素不溶于水，即存在于发酵液的沉淀中，将发酵液摇匀，取5mL发酵液，加入20mL乙醇，振荡混匀，此时抗生素即溶于液相(含有80％乙醇)中，12000r/min离心3min，将上清液稀释40倍，紫外分光光度计测其在363nm处的吸光度，即为响应值，代入标准曲线中计算浓度。

通过上述标准，对上述实施例1-9和对比例1-3制备的一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法进行测试，得到的数据如表1所示：

表1实施例1-9和对比例1-3的性能数据

以上数据，充分地显示了实施例1-9相比于对比例1-3，可以充分看出海洋鱼粉培养基的快速氮源和抗营养因子吸附剂成分对一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法在提高抗生素产率方面的作用。

由于本发明采用海洋鱼粉培养基的快速氮源和抗营养因子吸附剂成分制备一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法，通过有效成分大大提高了抗生素的产率，具体如下：

通过实施例1-3可以看出，随着一级种子培养基和种子培养基的成分，对抗生素产率的影响较小，这是因为微生物在一级种子培养基和种子培养基上的生长主要起到的是启动和扩增的作用，即从少量菌种开始培养，直到获得足够数量的健康菌体用于大规模发酵，因此微生物在一级种子培养基和种子培养基上具有通用性，而发酵培养基的成分对于抗生素的合成至关重要，它提供了微生物生长和代谢所需的所有营养物质，包括碳源、氮源、微量元素、维生素等，发酵培养基的成分直接决定了微生物的生长速率、代谢途径和抗生素的合成效率，因此也间接的反应了发酵培养基的主导作用，一级种子培养基和种子培养基的辅助性。

通过实施例3-5可以看出，随着豌豆浸汁液含量的增加，抗生素产率大大增加，这是因为豌豆浸汁液富含氨基酸和肽，这些小分子氮源可以被微生物快速吸收和利用，为蛋白质和核酸的合成提供直接的原料，这种快速可用的氮源可以加速微生物的生长，特别是在生长初期，有助于缩短延迟期，促进微生物快速进入对数生长期，从而提高抗生素的合成速率，豌豆浸汁液中除了氮源之外，还含有其他营养成分，如碳水化合物、维生素和微量元素，这些成分可以支持微生物的全面生长和代谢活动，这种综合性的营养补充有助于提高微生物的代谢效率和抗生素的合成能力，因此抗生素的产量大大增加。

通过实施例5-7可以看出，随着抗营养因子吸附剂活性炭含量的增加，抗生素产率先增加后下降，这是因为活性炭能够有效吸附发酵液中的抗营养因子，这些抗营养因子的存在会抑制微生物的生长和代谢活性，影响抗生素的合成，当活性炭含量较低时，它可以有效地去除这些抑制剂，从而改善发酵环境，提高抗生素的产率，然而，当活性炭的含量过高时，它不仅会吸附抗营养因子，还会吸附发酵液中的营养物质，包括微生物生长和抗生素合成所必需的氨基酸、肽、维生素和微量元素等，这种过度吸附会导致发酵液中营养成分的缺乏，从而抑制微生物的生长和抗生素的合成，最终导致抗生素产率的下降。

通过实施例7-9可以看出，发酵培养基的初始pH值，对抗生素产率具有显著的影响，这是因为pH值是微生物生长和代谢活动中一个极其重要的环境参数，pH值的适宜与否直接影响到微生物的生理状态、代谢途径的活性以及抗生素的合成，由于每种酶都有一个最适pH范围，在此范围内，酶的活性最高，如果培养基的pH值偏离了这个范围，参与抗生素合成的酶，其活性会下降，从而影响抗生素的合成效率，另外pH值影响细胞膜的电荷状态和通透性，影响营养物质和代谢产物的跨膜运输，不适宜的pH值，会导致菌种对营养物质的吸收减少，代谢产物(包括抗生素)的排泄受阻，从而影响抗生素的产量，因此应该选择适宜的pH值。

根据上述测试实验可知，根据实施例6制备的一种海洋鱼粉培养基及其在抗生素发酵生产中的应用及发酵方法具有最优性能，则将实施例6作为最优实施例；

通过实施例6与对比例1-3对比可以看出：

对比例1不添加豌豆浸汁液，抗生素产率大幅的下降，这是因为豌豆浸汁液含有丰富的游离氨基酸和小肽，这些氮源可以被微生物迅速吸收和利用，不需要经过复杂的分解过程，直接用于蛋白质和核酸的合成，从而加速微生物的生长和繁殖，而对比例1不添加豌豆浸汁液，由于缺乏快速可用的氮源和其他营养成分的支持，导致微生物生长缓慢，代谢途径的激活受限，最终导致抗生素产率的大幅下降。

对比例2不使用抗营养因子吸附剂活性炭，抗生素产率大幅的下降，这是因为抗营养因子吸附剂活性炭可以吸附发酵液中的悬浮颗粒、色素和其他杂质，提高发酵液的澄清度，不仅有利于后续的产物提取和纯化过程，还能减少对微生物的不良影响，促进抗生素的合成，同时，活性炭具有高度的吸附能力，可以有效吸附并去除这些抗营养因子，而抗营养因子是一类能够干扰微生物正常生长和代谢的物质，因此添加抗营养因子吸附剂，使得抗生素产量的提高，当不使用活性炭时，抗营养因子和其他不利因素的存在会抑制微生物的生长和抗生素的合成，导致产率下降。

对比例3未对新鲜豌豆酶解，抗生素产率大幅的下降，这是因为胰蛋白酶能够分解豌豆中的蛋白质，将其转化为更小的肽段和氨基酸，这些是微生物生长和抗生素合成所必需的，缺少了胰蛋白酶的酶解作用，一些蛋白质不能被有效分解，从而减少了可利用的氨基酸和肽段的量，微生物可直接利用的营养成分减少，无法加速微生物的生长，缩短生长周期，因而导致抗生素产量下降。

综上所述，通过添加快速氮源豌豆浸汁液，加速微生物的生长，缩短延迟期，促进微生物进入对数生长期，合理使用抗营养因子吸附剂活性炭，改善发酵环境，控制好发酵条件，是提高抗生素产率的关键策略。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (10)

1.一种海洋鱼粉培养基，其特征在于：包括以下组分：海洋鱼粉15-20重量份、豌豆浸汁液25-30重量份、活性炭0.01-0.03重量份、乳糖5-7重量份、麦芽糊精6-9重量份、酵母浸出粉4-6重量份、大豆油2-5重量份、苯丙氨酸0.4-0.8重量份和无机盐10-15重量份；

其中，无机盐为磷酸二氢钾1-3重量份、七水硫酸镁2-3重量份、碳酸钙1-2重量份和二氯化锰4-6重量份；

其中，豌豆浸汁液为新鲜豌豆经蒸煮后，经胰蛋白酶酶解，再过滤得到。

2.根据权利要求1所述的一种海洋鱼粉培养基，其特征在于：所述豌豆浸汁液的制备方法如下：

选择新鲜的豌豆加水，加热至沸，再降低火力继续加热，直到豌豆变软，加热时间30-50min，使用筛网将豌豆和水分离，轻轻挤压豌豆，以帮助释放更多的汁液和营养物质，然后加入3-5重量份胰蛋白酶，将过滤后的浸汁液倒入无菌容器中，然后使用高压蒸汽灭菌器在120-125℃下灭菌20-30min，灭菌后，让浸汁液自然冷却至室温，得到豌豆浸汁液。

3.根据权利要求2所述的一种海洋鱼粉培养基，其特征在于：所述新鲜豌豆和水的质量比为1：3～4。

4.根据权利要求2所述的一种海洋鱼粉培养基，其特征在于：所述胰蛋白酶的添加量为新鲜豌豆质量的0.5-0.8％。

5.根据权利要求1所述的一种海洋鱼粉培养基，其特征在于：所述海洋鱼粉培养基的制备方法如下：

在容器中先加入100-110重量份蒸馏水，依次加入酵母浸出粉、乳糖、麦芽糊精、磷酸氢二钾，七水硫酸镁，二氯化锰和苯丙氨酸，搅拌直至完全溶解，然后加入豌豆浸汁液和大豆油，再添加海洋鱼粉和活性炭，充分搅拌至完全分散，最后加入碳酸钙调节pH值，将制备好的培养基分装到发酵罐，密封容器，使用高压蒸汽灭菌器在120-125℃下灭菌20-30min，自然冷却至室温，一种海洋鱼粉培养基制备完成。

6.根据权利要求5所述的一种海洋鱼粉培养基，其特征在于：所述活性炭在热水中煮沸3min后过滤干燥得到。

7.根据权利要求1所述的一种海洋鱼粉培养基，其特征在于：所述碳酸钙用于调节培养基的初始pH值至6.8-7.2。

8.一种海洋鱼粉培养基发酵方法，基于权利要求1-7中任意一项所述的一种海洋鱼粉培养基，其特征在于：包括如下步骤：

制备一级种子液：

用接种环挑选一环抗生素生产发酵菌接种于一级种子培养基中，24-25℃，200-220rpm摇瓶培养5-8h；

制备二级种子液：

取一级种子液按1-3％接种量接种于二级种子培养基中，24-25℃，200-220rpm摇瓶培养18-22h；

发酵培养：

将二级种子按10-12％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，24-25℃，装液量为50-55％(v/v)，通气量0.8-1vvm，初始pH值为6.8-7.2，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧30％-40％，维持菌体生长，当发酵时间为15-16h时，控制溶氧25-27％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵。

9.根据权利要求8所述的一种海洋鱼粉培养基发酵方法，其特征在于：一级种子培养基的组分为葡萄糖1-2重量份、蛋白胨2-4重量份、酵母粉0.3-0.5重量份，加入100mL水，调节pH值为7.0-7.2；二级种子培养基的组分为葡萄糖15-18重量份，酵母粉4-6重量份，磷酸氢二钾3-5重量份，硫酸铵2-3重量份，硫酸镁0.1-0.3重量份，pH值为6.7-6.9；发酵培养基的组分为海洋鱼粉15-20重量份、豌豆浸汁液25-30重量份、活性炭0.01-0.03重量份、乳糖5-7重量份、麦芽糊精6-9重量份、酵母浸出粉4-6重量份、无机盐10-15重量份、大豆油2-5重量份、苯丙氨酸0.4-0.8重量份，pH值为6.8-7.2。

10.一种海洋鱼粉培养基在抗生素发酵生产中的应用，基于权利要求8-9中任意一项所述的一种海洋鱼粉培养基发酵方法，其特征在于：

S1.1、取玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活化，用接种环挑选一环接种于一级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养6h，其中一级种子培养基的组分为葡萄糖1重量份，酵母粉4重量份，磷酸氢二钾3重量份，硫酸铵2重量份，硫酸镁0.1重量份，pH值为6.8；

S1.2、取一级种子液按1-3％接种量接种于二级种子培养基中，25℃，220rpm摇瓶培养18h，其中二级种子培养基的组分为葡萄糖15重量份，酵母粉7重量份，磷酸氢二钾5重量份，硫酸铵3重量份，硫酸镁0.3重量份，pH值为6.9；

S1.3、将二级种子按10％(v/v)接种量接种于5L发酵罐中的发酵培养基中，在25℃下，装液量为55％(v/v)，通气量1vvm，初始pH值为6.8，用氨水和醋酸调控pH，发酵开始0-14h，控制溶氧35％，维持菌体生长，当发酵时间为16h时，控制溶氧27％，当发酵时间24h时，停止补料，待底物消耗完毕，停止发酵，其中发酵培养基的组分为海洋鱼粉18重量份、豌豆浸汁液26重量份、活性炭0.01重量份、乳糖5重量份、麦芽糊精9重量份、酵母浸出粉4重量份、无机盐12重量份、大豆油1重量份、苯丙氨酸0.7重量份，pH值为7.1；

S1.4、发酵结束后，通过高速离心机12000r/min离心3min，去除上清液，洗涤沉淀，得到抗生素。