CN102732467B

CN102732467B - 一种戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵方法

Info

Publication number: CN102732467B
Application number: CN201210233896.9A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 冀志霞; 石娜娜; 祁高富; 马昕
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: CN102732467A

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体公开了一种戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵方法，适用于戊糖片球菌的高密度发酵生产。发酵工艺包括种子液制备和发酵罐培养。发酵罐培养阶段包括发酵过程中pH的调节和葡萄糖补料发酵。在发酵过程中通过注入一定浓度的NaOH溶液调节发酵液pH在5.0～6.5范围内，发酵4~6h后间歇补加葡萄糖，培养20~25h结束发酵，此时有效活菌数可以达到90亿/mL。采用本发明的戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵工艺，使戊糖片球菌的菌体量有大幅度提高。

Description

一种戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种戊糖片球菌高密度发酵培养基及发酵方法，适用于戊糖片球菌的高密度发酵生产。

背景技术

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus，P.p）是一种常见的乳酸菌，细胞圆球形，不形成芽孢，不运动，兼性厌氧，发酵葡萄糖，不产气，发酵阿拉伯糖、核糖、麦芽糖等，接触酶阳性，属于革兰氏阳性细菌（凌代文，1999，乳酸细菌分类鉴定及实验方法.中国轻工业出版社）。

戊糖片球菌被认为是动物体内的益生菌，可直接应用于动物喂食、动物饲料和青贮饲料中。天然乳酸菌饲料添加剂用于秸杆青贮的优势：缩短发酵周期，快速降低pH值；抑制腐败细菌的生长繁殖，解决饲料的腐败问题；降解纤维素并转化为乳酸，提高饲料的利用率；保持饲料的鲜嫩汁液和营养成分，提高饲料的适口性和消化率；明显减少流出物，降低饲料干物质的损失(Anastasiadou,Growthand metabolism of a meat isolated strain of Pediococcus pentosaceus in submergedfermentation Purification,characterization and properties of the produced pediocinSM-1.Enzyme and Microbial Technology,2008)。在发酵肉制品中，戊糖片球菌一直是商业发酵剂中的必要成员，可用于各种香肠发酵，并能满足加工过程中的许多要求，具有较高的竞争性和较好的环境适应性，作为肉制品发酵剂使用时，从开始接种到产品消费，其均为优势微生物（Hammes，Starters in the processing ofmeat products.Meat Scienc,1994）。戊糖片球菌可以利用碳水化合物产酸，从而使肉制品的pH下降，赋予其特有的风味；另外戊糖片球菌产生的蛋白酶、脂酶及过氧化氢酶等，可使肉中的蛋白质分解为人体易吸收的物质，分解肉中的脂肪酸为短链挥发性脂肪酸和酯类物质，同时产生大量风味物质，提高产品的营养价值（杨华，发酵剂及抗氧化剂对鲶鱼发酵香肠品质的影响，食品与发酵工业，2010）。此外在酸性条件下，病原菌和腐败菌的生长得以抑制，大大提高了发酵肉制品的安全性。此外，戊糖片球菌也是酱油发酵过程中的主要细菌，对酱油独特风味的形成具有重要作用（Onda，Analysis of lactic acid bacterial flora duringMiso fermentation.Food Science and Technology Research,2003）。

目前对戊糖片球菌的研究主要集中在生产应用当中，如动物饲料、青贮饲料、食品等方面，但是对戊糖片球菌发酵工艺方面的研究却少之又少，尚未有文献报道，均用传统的MRS培养基进行发酵，但传统的MRS培养基成本较高，最后得到的活菌数较少，一般活菌数在10亿/mL。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于提供了一种工艺配方设计合理，且能够提高菌体生物量的戊糖片球菌高密度发酵培养基。

本发明的第二个目的在于提供了一种上述培养基的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供了一种利用上述培养基对戊糖片球菌进行高密度发酵的方法。

为实现本发明的第一个目的，本发明采取的技术方案为：

一种戊糖片球菌高密度发酵培养基，其原料配方如下：

蛋白胨1~20g，

酵母粉1~10g，

柠檬酸钠（C₆H₅O₇Na₃·2H₂O）0.5~5g，

葡萄糖（C₆H₁₂O₆）10~50g，

乙酸钠（CH₃COONa）1~6g，

磷酸氢二钾（K₂HPO₄·3H₂O）1~6g，

硫酸镁（MgS0₄·7H₂O）0.1~2g，

玉米浆2~30g，

用蒸馏水定容至1000mL。

为了实现本发明的第二个目的，本发明采取的技术方案为：

上述一种戊糖片球菌高密度发酵培养基，其制备方法如下：

1、将蛋白胨1~20g、酵母粉1~10g、柠檬酸钠0.5~5g、乙酸钠1~6g、磷酸氢二钾1~6g、硫酸镁0.1~2g、玉米浆2~30g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L的NaOH和5~8mol/L盐酸调整pH到6.2~6.8，在103.4kPa压力、115~121℃温度下灭菌20~30min得培养基；

2、称取葡萄糖10~50g，加蒸馏水溶解并定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、115~121℃温度下灭菌20~30min，得葡萄糖溶液；

3、将步骤2得到的葡萄糖溶液加入到灭过菌的步骤1的培养基中，得到改良的MRS液体培养基，称为戊糖片球菌高密度发酵培养基。

为了实现本发明的第三个目的，本发明采取的技术方案为：

一种利用上述培养基对戊糖片球菌进行高密度发酵的方法，其步骤如下：

1、将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有30~50mL MRS培养基（葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；柠檬酸氢二铵2g/L；乙酸钠5g/L；磷酸氢二钾2g/L；硫酸镁0.58g/L；硫酸锰0.25g/L）的250mL三角瓶中，在28~40℃条件下，150~200rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液；

2、称取葡萄糖35~40g，加蒸馏水溶解并定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、110~115℃温度下灭菌20~30min得补料用葡萄糖溶液；

3、将发酵种子液按0.5%~5%的接种量接种于本发明的戊糖片球菌高密度发酵培养基中，发酵罐装液量50%~80%，控制罐温28~40℃，转速120~300rpm，通风比0.1~1.0VVM。在此发酵条件下培养4~10h后，通过滴加5~8mol/LNaOH溶液使发酵液pH保持在5.0～6.5范围内，直至发酵结束。当发酵至4~10h时开始补料，之后每隔2h进行一次补料，共补料3次，补料完成后继续发酵至20~25h结束发酵。

补料成分为步骤2制得的补料用葡萄糖溶液，每次加入量为6~12g/L，使发酵体系中葡萄糖浓度为10~25g/L，发酵结束后葡萄糖终浓度为0.5~3g/L。

本发明提供的上述戊糖片球菌高密度发酵的方法，得到了一种戊糖片球菌高密度发酵培养基，以及其高密度发酵工艺。

由于戊糖片球菌自身的特点，在菌体生长过程能利用葡萄糖代谢产生乳酸，使发酵液pH值迅速降低，从而抑制菌体生长，但戊糖片球菌能够耐受12%的高盐，因而可以在发酵过程中用一定浓度的NaOH调节发酵液pH值保持在5.0~6.5范围内，以促进菌体生长。通过在发酵过程中定时取样测定pH值、OD₆₀₀和残糖含量，为补料发酵提供更及时、更准确的指导，给出了更有利于积累菌体的工艺技术参数。本发明最终菌体生物量OD₆₀₀可达14.0，菌数为90亿/ml。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

1、本发明提供了一种戊糖片球菌高密度发酵培养基，降低了培养基的生产成本；

2、采用控制发酵液pH值的方法进行发酵，促进了菌体的积累；

3、NaOH溶液调节pH值过程中产生的高盐浓度能有效降低杂菌的污染，在菌剂生产过程中能得到高纯度的菌体；

4、采用葡萄糖补料的方法进行发酵，延长了对数期的时间，促进了菌体的积累。

附图说明

图1为戊糖片球菌CICIM B1241在MRS培养基中的种子液生长曲线；

图2为发酵过程中发酵液的pH调节或不调节时菌体生长情况比较图。

图中：■-发酵过程控制发酵液pH时菌体生物量；

●-发酵过程不控制发酵液pH时菌体生物量；

▲-发酵过程控制发酵液pH时残糖含量；

-发酵过程不控制发酵液pH时残糖含量。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明的技术方案做详细的阐述，但以下内容不在任何意义上解释为对本发明请求保护范围的限制。实施例中使用的戊糖片球菌均为戊糖片球菌CICIM B1241。

实施例1：

1、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备

（1）按下列配方备料

将蛋白胨15g、酵母粉8g、柠檬酸钠3g、乙酸钠2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.4g、玉米浆（工业级玉米浆，购自宜昌华诚生物发酵原料有限公司，蛋白含量≥45%、酸度≤14%、亚硫酸盐≤0.3%、灰分≤10%）20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.2，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌30min得培养基；

（2）称取葡萄糖10g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、110℃下灭菌30min得葡萄糖溶液；

（3）将步骤（2）的葡萄糖溶液加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到戊糖片球菌高密度发酵培养基。

2、3L发酵罐高密度发酵

A、发酵种子液的培养

将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有30mLMRS培养基（葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；柠檬酸氢二铵2g/L；乙酸钠5g/L；磷酸氢二钾2g/L；硫酸镁0.58g/L；硫酸锰0.25g/L）的250mL三角瓶中，在35℃条件下，180rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液（戊糖片球菌在MRS培养基中的种子液生长曲线见图1）。

B、补料用葡萄糖溶液的配制

称取葡萄糖40g，加蒸馏水溶解并定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、110℃下蒸汽灭菌30min得补料用葡萄糖溶液；

C、接种

将发酵种子液按1%的接种量接入装有1.5L步骤1制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温28℃，转速120rpm，通风比0.1VVM，进行发酵培养。

D、发酵液pH值调节及补料发酵

戊糖片球菌发酵培养至4h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH溶液使pH值保持在5.0～5.5范围内，直至发酵结束。在发酵培养至4h时开始补料，向发酵罐中一次补入15mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2h进行一次补料，共补料3次，发酵至20h结束发酵，此时戊糖片球菌的有效活菌数为50亿/mL，菌体OD₆₀₀是9.0~9.5。

实施例2：

1、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备

（1）按下列配方备料

将蛋白胨10g、酵母粉5g、柠檬酸钠1g、乙酸钠1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、玉米浆（工业级玉米浆，购自宜昌华诚生物发酵原料有限公司，蛋白含量≥45%、酸度≤14%、亚硫酸盐≤0.3%、灰分≤10%）20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.4，在103.4kPa蒸汽压力、118℃下灭菌25min得培养基；

（2）称取葡萄糖25g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，103.4kPa蒸汽压力、113℃下灭菌25min得葡萄糖溶液；

2、发酵罐高密度发酵

A、发酵种子液的培养

将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有40mL MRS培养基（葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；柠檬酸氢二铵2g/L；乙酸钠5g/L；磷酸氢二钾2g/L；硫酸镁0.58g/L；硫酸锰0.25g/L）的250mL三角瓶中，在40℃条件下，200rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液。

B、补料用葡萄糖溶液的配制

称取葡萄糖40g，加蒸馏水溶解并定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、113℃下灭菌25min得补料用葡萄糖溶液；

C、接种

将发酵种子液按4%的接种量接入装液量为1.8L步骤1制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温32℃，转速200rpm，通风比0.4VVM，进行发酵培养。

D、发酵液pH值调节及补料

戊糖片球菌发酵培养至8h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH溶液使pH保持在5.5～6.0范围内，直至发酵结束。在发酵培养至6h时开始补料，向发酵罐中一次补入12mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2h进行一次补料，共补料3次，发酵至22h结束发酵，此时戊糖片球菌有效活菌数为80亿/mL，此时菌体OD₆₀₀是12.0~12.5。

实施例3：

1、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备

（1）按下列配方备料

将蛋白胨10g、酵母粉10g、柠檬酸钠3g、乙酸钠1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、玉米浆（工业级玉米浆，购自宜昌华诚生物发酵原料有限公司，蛋白含量≥45%、酸度≤14%、亚硫酸盐≤0.3%、灰分≤10%）20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.6，在103.4kPa蒸汽压力、121℃下灭菌20min得培养基；

（2）称取葡萄糖40g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌20min得葡萄糖溶液；

2、发酵罐高密度发酵

A、发酵种子液的培养

将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有50mLMRS培养基（葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉5g/L；柠檬酸氢二铵2g/L；乙酸钠5g/L；磷酸氢二钾2g/L；硫酸镁0.58g/L；硫酸锰0.25g/L）的250mL三角瓶中，在30℃条件下，150rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液。

B、补料用葡萄糖溶液的配制

称取葡萄糖35g，加蒸馏水溶解并定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌20min得补料用葡萄糖溶液；

C、接种

将发酵种子液按5%的接种量接入装液量为2.4L步骤1制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3L发酵罐中，控制罐温37℃，转速300rpm，通风比0.8VVM，进行发酵培养。

D、发酵液pH值调节及补料

戊糖片球菌发酵培养至10h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH使pH保持在6.0～6.5范围内，直至发酵结束。在发酵培养至8h时开始补料，向发酵罐中一次补入10mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2h进行一次补料，共补料3次，发酵至25h结束发酵，此时戊糖片球菌有效活菌数为90亿/mL，此时菌体OD₆₀₀是13.5~14.0。

本实施例中控制发酵液pH值与不控制发酵液pH值条件下发酵过程的生长曲线及残糖含量，如图2所示。

Claims

1.一种利用戊糖片球菌高密度发酵培养基对戊糖片球菌进行高密度发酵的方法，通过方案一、方案二或者方案三完成；

所述方案一的步骤如下：

（一）、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备

（1）按下列配方备料

将蛋白胨15 g、酵母粉8 g、柠檬酸钠3 g、乙酸钠2 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.4 g、玉米浆20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.2，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌30 min得培养基；

（2）称取葡萄糖10 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，在103.4kPa蒸汽压力、110℃下灭菌30 min得葡萄糖溶液；

（3）将步骤（2）的葡萄糖溶液加入到灭过菌的步骤（1）的培养基中，得到戊糖片球菌高密度发酵培养基；

（二）、3L发酵罐高密度发酵

A、发酵种子液的培养

将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有30mL MRS培养基的250mL三角瓶中，在35℃条件下，180 rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液，所述MRS培养基组成如下：葡萄糖20 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；柠檬酸氢二铵2 g/L；乙酸钠5 g/L；磷酸氢二钾2 g/L；硫酸镁0.58 g/L；硫酸锰0.25 g/L；

B、补料用葡萄糖溶液的配制

称取葡萄糖40 g，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，在103.4kPa蒸汽压力、110℃下蒸汽灭菌30 min得补料用葡萄糖溶液；

C、接种

将发酵种子液按1%的接种量接入装有1.5 L步骤（一）制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3 L发酵罐中，控制罐温28℃，转速120 rpm，通风比0.1 VVM，进行发酵培养；

D、发酵液pH值调节及补料发酵

戊糖片球菌发酵培养至4 h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH溶液使pH值保持在5.0～5.5范围内，直至发酵结束；在发酵培养至4 h时开始补料，向发酵罐中一次补入15 mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2 h进行一次补料，共补料3次，发酵至20 h结束发酵，此时戊糖片球菌的有效活菌数为50亿/mL，菌体OD₆₀₀是9.0~9.5；

所述方案二的步骤如下：

（一）、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备

（1）按下列配方备料

将蛋白胨10 g、酵母粉5 g、柠檬酸钠1 g、乙酸钠1 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.58 g、玉米浆20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.4，在103.4kPa蒸汽压力、118℃下灭菌25 min得培养基；

（2）称取葡萄糖25 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，103.4kPa蒸汽压力、113℃下灭菌25 min得葡萄糖溶液；

（二）、发酵罐高密度发酵

A、发酵种子液的培养

将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有40mL MRS培养基的250mL三角瓶中，在40℃条件下，200 rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液，所述MRS培养基组成如下：葡萄糖20 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；柠檬酸氢二铵2 g/L；乙酸钠5 g/L；磷酸氢二钾2 g/L；硫酸镁0.58 g/L；硫酸锰0.25 g/L；

B、补料用葡萄糖溶液的配制

称取葡萄糖40 g，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，在103.4kPa蒸汽压力、113℃下灭菌25 min得补料用葡萄糖溶液；

C、接种

将发酵种子液按4%的接种量接入装液量为1.8 L步骤（一）制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3 L发酵罐中，控制罐温32℃，转速200 rpm，通风比0.4 VVM，进行发酵培养；

D、发酵液pH值调节及补料

戊糖片球菌发酵培养至8 h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH溶液使pH保持在5.5～6.0范围内，直至发酵结束；在发酵培养至6 h时开始补料，向发酵罐中一次补入12 mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2 h进行一次补料，共补料3次，发酵至22 h结束发酵，此时戊糖片球菌有效活菌数为80亿/mL，此时菌体OD₆₀₀是12.0~12.5；

所述方案三的步骤如下：

（一）、戊糖片球菌高密度发酵培养基的制备

（1）按下列配方备料

将蛋白胨10 g、酵母粉10 g、柠檬酸钠3 g、乙酸钠1 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸镁0.58 g、玉米浆20g混合，用蒸馏水将固体全部溶解并定容至900mL，用5~8mol/L氢氧化钠和5~8mol/L盐酸调整pH到6.6，在103.4kPa蒸汽压力、121℃下灭菌20 min得培养基；

（2）称取葡萄糖40 g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌20 min得葡萄糖溶液；

（二）、发酵罐高密度发酵

A、发酵种子液的培养

将斜面保存的戊糖片球菌用接种环取一环，接入装有50mL MRS培养基的250mL三角瓶中，在30℃条件下，150 rpm下震荡培养，当菌体OD₆₀₀达到2.0~3.0时即得发酵种子液，所述MRS培养基组成如下：葡萄糖20 g/L；蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；柠檬酸氢二铵2 g/L；乙酸钠5 g/L；磷酸氢二钾2 g/L；硫酸镁0.58 g/L；硫酸锰0.25 g/L；

B、补料用葡萄糖溶液的配制

称取葡萄糖35 g，加蒸馏水溶解并定容至100 mL，在103.4kPa蒸汽压力、115℃下灭菌20 min得补料用葡萄糖溶液；

C、接种

将发酵种子液按5%的接种量接入装液量为2.4 L步骤（一）制备的戊糖片球菌高密度发酵培养基的3 L发酵罐中，控制罐温37℃，转速300 rpm，通风比0.8 VVM，进行发酵培养；

D、发酵液pH值调节及补料

戊糖片球菌发酵培养至10 h后，开始通过级联控制滴加5~8mol/L的NaOH使pH保持在6.0～6.5范围内，直至发酵结束；在发酵培养至8 h时开始补料，向发酵罐中一次补入10 mL补料用葡萄糖溶液，之后每隔2 h进行一次补料，共补料3次，发酵至25 h结束发酵，此时戊糖片球菌有效活菌数为90亿/mL，此时菌体OD₆₀₀是13.5~14.0。