CN109182397B - 一种提高罗伊氏菌素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
罗伊氏菌素因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生耐药性等原因，在医药工业上有着广阔的应用前景。本发明公开一种提高罗伊氏乳杆菌产罗伊氏菌素产量的方法，属于微生物技术领域。该方法包括罗伊氏乳杆菌种子液的制备，罗伊氏乳杆菌微胶囊的制备及分批补料高密度发酵工艺，应用本发明所述的制备方法和发酵工艺，可以使罗伊氏菌素的产量从常规发酵的27.4 mM提高到512 mM，具有很大的产业化前景。
Description
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一种提高罗伊氏乳杆菌产罗伊氏菌素产量的方法。
背景技术：
众所周知，中国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国。据估计，我国每年生产的抗生素原料大约为21万吨，出口3万吨，其余自用（包括医疗与农业使用），人均年消费量138克左右（美国仅13克）。专家推算中国每年生产的大约21万吨抗生素原料中，有9.7万吨用于畜牧养殖业，占年总产量的46.1%。自20世纪50年代发现饲料中低浓度的抗生素不但可以预防动物疾病还可以促进畜禽生长以来，各种抗生素就广泛添加于饲料中。抗生素在动物养殖上的滥用，使肉、蛋和奶等农畜产品中蓄积抗生素，通过食物链进入人体内，耐药菌的产生使得疾病治疗难度大大增加。因此，禁止饲用抗生素在饲料中的添加是大势所趋。
罗伊氏乳杆菌能合成罗伊氏菌素（3-羟基丙醛），是一种低分子量、中性、非蛋白质类广谱抗菌物质，水溶性好，可有效抑制有害菌的生长，包括：埃希氏菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属，变形杆菌属，假单胞菌属，梭菌属和葡萄球菌属。研究表明，罗伊氏菌素浓度在15～30μg /mL，可抑制革兰氏阳性菌和阴性菌、酵母、真菌及原生动物的生长。大多数乳酸菌所产生的细菌素或类细菌素为多肽或蛋白质类物质，它们的抗菌特性通常受到蛋白酶的破坏，而罗伊氏菌素是由小分子水溶性中性物质组成的混合物，活性不会被蛋白酶破坏，具有更强的稳定性，因而罗伊氏菌素作为抗菌物质的优越性已引起人们越来越多的关注，也因其独特的生化特性及对人和动物安全无毒而具有十分广阔的应用前景。
已有相关三个专利分别为：专利号CN107974424A，名称为 “空间罗伊氏乳杆菌Fullarton-9-25及应用”、专利号CN104053766B名称为 “产生罗伊氏菌素的短乳杆菌”、专利号CN102026644B 名称为“罗伊氏乳杆菌的罗伊氏菌素生产机制的控制活化”，只有专利号为CN102026644B提到在发酵过程结束时添加甘油有利于罗伊氏菌素的生成，但未对罗伊氏乳杆菌深度摸索并进行优化限制了罗伊氏菌素的产量。本专利通过将罗伊氏乳杆菌微囊化时添加生长因子和发酵时特殊的补料技术使微环境中的罗伊氏乳杆菌始终处于高密度生长状态，同时减少了代谢物对菌体的抑制，使罗伊氏菌素浓度从27.4 mM提高到512 mM，为目前已报道的最高产量。
发明内容：
（一）发明目的：
本发明的目的是提高罗伊氏乳杆菌产罗伊氏菌素的产量。
（二）技术方案：
本发明的目的通过如下方案获得实现：
1.本发明提供了一种提高罗伊氏乳杆菌产罗伊氏菌素产量的方法，包括以下步骤：（a）菌种制备、（b）微胶囊制备、（c）微胶囊的发酵。
2. 本发明提供菌种制备方法为：将罗伊氏乳杆菌接种于含0.1%维生素C的MRS 液体培养基，并调初始pH为6.0～6.5，37℃静置培养12-15 h，作为种子液。
3.微胶囊制备步骤如下：
将5 L食用植物油用加入10 L发酵罐中，115℃，20 min灭菌，降温后备用。
将1 L罗伊氏乳杆菌种子液与辅助生长因子均匀混合制成菌悬液，然后以1mL/s速度流加入灭菌的植物油中（搅拌速度300 r/min）；
将20%的氯化钙溶液100mL以1 mL/s速度流加入植物油中；
将10%的海藻酸钠溶液500 mL以2 mL/s速度流加入植物油中，静置30 min；
无菌环境中过滤，得到罗伊氏乳杆菌微胶囊。所述的辅助生长因子为：谷氨酰胺、S-硫代半胱氨酸、硫辛酸、复合维生素B、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙等的三种或三种以上。
4.本发明提供的罗伊氏乳杆菌微胶囊发酵产罗伊氏菌素的方法如下：
（1）培养基配方：
a.发酵培养基：玉米浆粉20 g/L、麦芽糖25 g/L、柠檬酸铵1 g/L、磷酸氢二钾 2.0g/L、七水硫酸镁 0.58 g/L、七水硫酸锰 0.05 g/L， pH6.5。115℃灭菌20min。
b.补料培养基：葡萄糖200～400 g/L，甘油20～100 g/L，辅助生长因子5～50 g/L。115℃，20 min灭菌。
(2)发酵流程：
在50 L发酵罐中加入30 L发酵培养基，0.07 MPa灭菌20 min。接种微胶囊前调整温度为37 ℃，转速50 r/min，减小进气量，当发酵罐罐压降低至0.01MPa，打开接种口，将300 g罗伊氏乳杆菌微胶囊在火焰保护中倒入发酵罐。确认发酵罐密封后。通气保压，不开排气，保持罐压0.05 MPa。
(3)发酵过程中若pH低于5.0时，自动加入氨水调至pH 5.0，当菌密度达到10 g/L（WCW）后，开始分阶段变速流加的方式流加补料培养基，补料体积8.5 L，发酵周期为14 h。
(4)继续培养2 h，降温至15～20℃，发酵结束，检测罗伊氏菌素含量备用。
本发明的意义：
目前，所有的常规抗生素都出现了相应的耐药性菌株，致病菌的耐药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。罗伊氏菌素因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生耐药性等原因，在医药工业上有着广阔的应用前景。本发明通过罗伊氏乳杆菌微胶囊保护和分批补料高密度发酵提高罗伊氏菌素产量，降低产品制造成本，有利于加快罗伊氏菌素的产业化。
附图说明
图1为不同初始pH值对罗伊氏菌素产量的影响。
图2为不同发酵温度对罗伊氏菌素产量的影响。
图3为不同碳源对罗伊氏菌素产量的影响。
图4为不同氮源对罗伊氏菌素产量的影响。
图5为分批培养条件下罗伊氏乳杆菌微胶囊的生长曲线（补料点选择如图所示）。
图6为在不同初始菌密度条件下补料对罗伊氏菌素产量的影响。
图7为不同补料方式的补料量变化。
图8为不同补料方式对罗伊氏菌素产量的影响。
图9为游离菌体分批发酵与微胶囊分批补料发酵对罗伊氏菌素产量的影响（50L发酵罐）。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。
实验案例一、菌种及微胶囊的制备
将罗伊氏乳杆菌接种于含0.1%维生素C的MRS 液体培养基，并调初始pH为6.0～6.5，37℃静置培养12-15 h，作为种子液。
取5 L食用植物油加入10 L发酵罐中，115℃，20 min灭菌，降温后备用。将1 L罗伊氏乳杆菌种子液与200 mL辅助生长因子均匀混合制成菌悬液，然后以1 mL/s速度流加入灭菌的植物油中（搅拌速度300 r/min）；将20%的氯化钙溶液100 mL,以1 ml/s速度流加入植物油中；将10%的海藻酸钠溶液500 mL,以2 ml/s速度流加入植物油中，静置30 min。无菌环境中过滤，得到罗伊氏乳杆菌微胶囊。
实验案例二、罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素最适发酵条件的优化
1.最适初始pH值的优化
考察不同初始pH值对罗伊氏乳杆菌微胶囊的生长影响。在无菌环境中，每组取1g罗伊氏乳杆菌微胶囊分别接于装有100 mL液体初始培养基(蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母浸出粉 5 g/L、柠檬酸铵1 g/L、磷酸氢二钾 2.0 g/L、七水硫酸镁 0.58 g/L、七水硫酸锰 0.05 g/L)的250 mL三角瓶中，各组初始pH值分别为5.5，6.5 ,7.5，培养温度37℃，50r/min振荡培养18 h，培养过程中分别于2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、14 h、16 h、18 h取样测定罗伊氏菌素含量。结果见图1，优化结果表明罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素最适的生长初始pH值为6.5。
2.最适发酵温度的优化
考察发酵温度对罗伊氏乳杆菌微胶囊的生长影响。在无菌环境中，每组取1 g罗伊氏乳杆菌微胶囊分别接于装有100 mL液体初始培养基的250 mL三角瓶中，初始pH6.5，各组培养温度分别为32℃、37℃ 、42℃，50 r/min振荡培养18 h，培养过程中分别于2 h、4 h、6h、8 h、12 h、14 h、16 h、18 h取样测定罗伊氏菌素含量。结果见图2，优化结果表明罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素最适的生长发酵温度为37℃。
实施例三、罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素的最适发酵培养基组分的优化
1. 最适碳源的优化
采用上述最适生长条件，考察罗伊氏乳杆菌微胶囊对单一碳源，包括葡萄糖、糖蜜、麦芽糖等碳源的利用情况。采用上述相同的接种方法，以初始培养基为基础，将葡萄糖分别替换成等质量的蔗糖、糖蜜、麦芽糖等。初始pH为6.5，培养温度37℃，50 r/min振荡培养18 h，培养过程中分别于2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、14 h、16 h、18 h取样测定罗伊氏菌素含量。结果见图3，优化结果表明罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素最适的碳源为麦芽糖。
2. 最适氮源的优化
采用上述最适生长条件，考察罗伊氏乳杆菌微胶囊对单一氮源，包括蛋白胨、酵母膏、玉米浆粉等氮源的利用情况。采用上述相同的接种方法，以初始培养基为基础，将葡萄糖替换成等质量的麦芽糖，将复合氮源替换成单一的蛋白胨、酵母膏、玉米浆粉等（含量按照每种氮源的含氮量与初始培养基中的含氮量一致的原则进行）。初始pH为6.5，培养温度37℃，50 r/min振荡培养18 h，培养过程中分别于2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、14 h、16 h、18 h取样测定罗伊氏菌素含量。结果见图4，优化结果表明罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素最适的氮源为玉米浆粉。
实施例四、罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素的最适补料条件的优化
1.补料时机的优化
采用上述最适生长条件和优化后的培养基，考察罗伊氏乳杆菌微胶囊发酵过程中最佳的补料初始菌密度。首先，绘制了50 L发酵罐最适分批培养条件下罗伊氏乳杆菌微胶囊的生长曲线，见图5，在此基础上，分别于湿细胞密度（WCW）达到 5g/L、10g/L、15g/L时，开始以545 mL/h匀速补料，补料培养基为：葡萄糖300 g/L，甘油50 g/L，辅助生长因子30 g/L，补料体积为8.5 L。初始pH为6.5，培养温度37℃，50 r/min振荡培养14 h，培养结束时分别取样，测定罗伊氏菌素含量。结果见图6，优化结果表明罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素最优的补料初始菌密度为10g/L。
2.补料方式的优化
采用上述最优条件，考察罗伊氏乳杆菌微胶囊发酵过程中最佳的补料方式。当湿细胞密度（WCW）达到 10g/L时，采用匀速流加、指数流加、分阶段变速流加方式进行，不同补料方式的补料量变化见图7，补料体积8.5 L。初始pH为6.5，培养温度37℃，50 r/min振荡培养14 h，培养结束时分别取样，测定罗伊氏菌素含量。结果见图8，优化结果表明罗伊氏乳杆菌微胶囊产罗伊氏菌素最优补料方式为分阶段变速流加。
实施例五、游离罗伊氏乳杆菌分批发酵和微胶囊分批补料发酵对罗伊氏菌素产量的影响
罗伊氏乳杆菌种子液的制备如实施例一。
游离罗伊氏乳杆菌分批发酵流程如下：50L发酵罐条件，发酵培养基初始装液量为30 L。灭菌条件为115℃，20 min，接种前调整温度37℃，转速50 r/min，在火焰保护下接种300ml罗伊氏乳杆菌种子液，初始pH值调至6.5，培养14 h后,取样测定罗伊氏菌素含量。
罗伊氏乳杆菌微胶囊的制备如实施例一。
微胶囊分批补料发酵流程如下：50L发酵罐条件，发酵培养基初始装液量为30 L。灭菌条件为115℃，20 min，接种前调整温度37℃，转速50 r/min，在火焰保护下接种300 g罗伊氏乳杆菌微胶囊，初始pH值调至6.5，发酵过程用氨水控制pH为5.0。当湿细胞密度（WCW）达到 10 g/L时，采用分阶段变速流加方式流加补料培养基，补料体积8.5 L，发酵周期为14 h，然后继续培养2 h后，降温至15～20℃，发酵结束，取样测定罗伊氏菌素含量。
结果见图9，比较试验的结果表明，游离罗伊氏乳杆菌分批发酵条件下罗伊氏菌素的产量为27.4 mM，采用微胶囊分批补料工艺发酵的罗伊氏菌素产量为512 mM，提高了18.69倍。
Claims (4)
1.一种提高罗伊氏菌素产量的方法，其具体步骤如下：a）菌种制备；b）微胶囊制备；c）微胶囊的发酵，
所述菌种制备步骤如下：将5 L食用植物油加入10 L发酵罐中，115℃，20 min灭菌，降温后备用；将1 L罗伊氏乳杆菌种子液与200mL辅助生长因子均匀混合制成菌悬液，然后以1mL/s速度流加入灭菌的植物油中，搅拌速度300 r/min； 将20%的氯化钙溶液100 mL以1mL/s速度流加入植物油中；将10%的海藻酸钠溶液500 mL以2 mL/s速度流加入植物油中，静置30 min；无菌环境中过滤，得到罗伊氏乳杆菌微胶囊，
发酵过程中若pH低于5.0时自动加入氨水调至pH 5.0，当菌密度达到10 g/L后，开始以分阶段变速流加的方式流加补料培养基，补料体积8.5 L，发酵周期为14 h，
补料培养基配方为：葡萄糖200～400 g/L，甘油20～100 g/L，辅助生长因子5～50 g/L，115℃，20 min灭菌，
其中，所述辅助生长因子为：谷氨酰胺、S-硫代半胱氨酸、硫辛酸、复合维生素B、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、碳酸钙中的三种或三种以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种制备是在MRS 液体培养基中加入0.1%维生素C，并调节初始pH为6.0～6.5，37℃静置培养12-15 h，作为种子液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微胶囊的发酵使用发酵培养基配方为：玉米浆粉20 g/L、麦芽糖25 g/L、柠檬酸铵1 g/L、磷酸氢二钾 2.0 g/L、七水硫酸镁0.58 g/L、七水硫酸锰 0.05 g/L， pH6.5，115℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微胶囊的发酵制备步骤如下：
在50 L发酵罐中加入30 L发酵培养基，0.07 MPa灭菌20 min，接种微胶囊前调整温度为37 ℃，转速50 r/min，减小进气量，当发酵罐罐压降低至0.01MPa，打开接种口，将300 g罗伊氏乳杆菌微胶囊在火焰保护中倒入发酵罐,确认发酵罐密封后,通气保压，不开排气，保持罐压0.05 MPa；
继续培养2 h，降温至15～20℃，发酵结束，检测罗伊氏菌素含量备用。
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