CN109666599B - 一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基及发酵方法、应用 - Google Patents
一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基及发酵方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域,为解决传统罗伊氏乳杆菌培养基发酵后有典型的不良风味的问题,提供了一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基及发酵方法、应用,每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中包括:麦芽糖10~50g,大豆胨20~80g和麦芽浸粉30~100g。本发明发酵后风味中的酮类,脂类等芳香物质含量明显提高,活菌数提高43倍,发酵过程中无需调节pH,有利于大规模工业化生产;所得的活菌发酵液无需高能耗的冷冻干燥工艺,可直接添加到发酵酸奶中,没有引起产品的不良风味。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域,尤其涉及一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基及发酵方法。
背景技术
罗伊氏乳杆菌是一类普遍定植于人和动物肠道的益生菌,具有提高免疫力,调节肠道菌群,改善婴儿肠绞痛等的益生作用。罗伊氏乳杆菌WHH1689,具有添加到乳制品中室温下长保质期的特征,同时对肠应激综合征有明显的改善效果。
目前,国内外培养罗伊氏乳杆菌的培养基基本采用传统的MRS培养基,活菌数一般在1~5×109cfu/ml,且发酵后有典型的不良风味。现有的乳酸菌生物制品都最终以冻干菌粉的形式呈现,以降低发酵液不良风味在菌粉中的影响。然而,对乳酸菌生物制品依赖冻干工艺存在着产品外观要求苛刻,工艺中易出现喷瓶、掉底、产品干燥不彻底、含水量过高等问题,需要使用冻干保护剂或工艺条件的严格控制来提高合格率,无形中增加了乳酸菌生物制品的生产成本,加大了工艺的复杂程度,且具有高能耗的缺点。
中国专利文献上公开了“促进罗伊氏乳杆菌生长天然添加剂的制备方法”,其公告号为CN101709287A,该发明利用中药提取物蒺藜,槐花,牛蒡的提取液作为天然添加剂,提高罗伊氏乳杆菌发酵活菌数最高至5.67×109cfu/ml;中国专利文献上公开了“一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法”,其公告号为CN107739747A,该发明通过罗伊氏乳杆菌培养代谢产生罗伊特林素;中国专利文献上公开了“一种罗伊氏乳杆菌专用发酵床”,其公告号为CN205710701U;中国专利文献上公开了“一种富硒罗伊氏乳杆菌高密度发酵方法”,其公告号为CN108048363A,该发明通过罗伊氏乳杆菌发酵得到兼具完全有机硒和高活菌数的发酵液。但是上述专利文献并没有从根本上有效解决传统罗伊氏乳杆菌培养基发酵后有典型的不良风味的问题。
发明内容
本发明为了克服传统罗伊氏乳杆菌培养基发酵后有典型的不良风味的问题,提供了一种能够同时改善发酵风味、提高发酵的活菌数的罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基。
本发明还提供了一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵方法,发酵过程中无需调节pH,条件易于控制,所得发酵液无需高能耗的冻干工艺即可直接添加入生物制品中,生产成本低,有利于大规模工业化生产。
本发明还提供了一种利用罗伊氏乳杆菌高密度发酵方法制得的活菌发酵液在罗伊氏乳杆菌发酵生物制品中的应用。为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基,其特征在于,每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中包括:麦芽糖10~50g,大豆胨20~80g和麦芽浸粉30~100g。
本发明通过测定罗伊氏乳杆菌的基因组序列,分析罗伊乳杆菌的糖代谢路径,发现麦芽糖的利用明显优于葡萄糖和蔗糖。此外,动物蛋白胨及微生物蛋白胨都具有各自典型的特殊不良风味,通过优选的具有大豆清香味的大豆胨替代动物蛋白胨,包括胰蛋白胨,牛肉膏,及部分酵母粉,培养基风味得到明显改善,从而达到改善发酵液风味的效果。麦芽浸粉具有生物活性的生长因子,可以显著地增殖微生物的生长和强化代谢物的分泌,通过添加麦芽浸粉,从而达到提高罗伊氏乳杆菌发酵后活菌数的效果。
作为优选,每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中还包括:酵母粉5~15g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g,乙酸钠10g和吐温1g。
作为优选,每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中包括以下原料:麦芽糖30g,大豆胨80g,麦芽浸粉65g,酵母粉5~15g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80 1g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g。
作为优选,所述罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的pH为6.0~6.5。
一种利用上述罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基进行罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法,包括以下步骤:
(1)将罗伊氏乳杆菌菌株接种于种子培养基中,37℃厌氧培养12~18h,培养得到种子液;所述种子培养基为传统的MRS培养基,每升种子培养基中包括:葡萄糖20g,胰蛋白胨5g,牛肉膏10g,酵母粉50g,大豆胨5g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80 0.1g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g;
(2)将种子液接种于罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中,于35~38℃条件下,厌氧搅拌条件下进行发酵培养,发酵完成后得到活菌发酵液;发酵过程中无需特别调节体系的pH值。
本发明所述罗伊氏乳杆菌菌株的分类命名为罗伊氏乳杆菌LactobacillusReuteri WHH1689,已于2016年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号为CGMCC No.13122。
本发明罗伊氏乳杆菌高密度发酵方法,采用改善后含麦芽糖和麦芽浸粉的发酵培养基获得高密度发酵的罗伊氏乳杆菌,在改善发酵风味的同时,提高了发酵的活菌数。发酵后,风味中的酮类,脂类等芳香物质含量明显提高,活菌数提高43倍至1.17×1010cfu/ml。
作为优选,步骤(2)中,所述种子液在罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中的接种量为1~10%(v/v);发酵培养工艺条件为:通入CO2,搅拌速度控制在100~130rpm,优选120rpm;发酵时间控制在16~24h。
作为优选,所述活菌发酵液中活菌数为(0.3~1.17)×1010cfu/ml。采用本发明的发酵方法,可使得最终菌体浓度比普通MRS培养基获得的菌体浓度提高43倍,降低生产成本。
作为优选,发酵过程中,所述罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的初始pH值为6.0~6.5,发酵完成后,所述罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的终点pH值为3.0~3.7。
传统的乳酸菌发酵,需要对培养过程中产生的代谢产物乳酸,进行添加碱液中和,控制pH值接近中性,从而促进乳酸菌的进一步生长。本发明的发酵工艺全程无需调节发酵体系的pH值,在发酵过程中,体系由发酵培养基初始的偏中性条件(6.0~6.5)逐步变为酸性条件(3.0~3.7),简化工艺流程,且所得活菌发酵液的活菌数远高于通过不断添加碱液调节pH的传统发酵工艺。
一种如上述方法制备的活菌发酵液在罗伊氏乳杆菌发酵生物制品中的应用,将活菌发酵液按照0.1~1%(w/v,g/L)的添加比例添加到生物制品中,即得罗伊氏乳杆菌发酵生物制品,所述罗伊氏乳杆菌发酵生物制品包括发酵液,菌泥和菌粉。将发酵液直接添加到发酵酸奶中,没有引起产品的不良风味。因此,应用本发明获得的乳酸菌制品,可以不经过高能耗的冻干,直接在产品中添加。
因此,本发明具有如下有益效果:
(1)通过麦芽糖替代葡萄糖、蔗糖,植物蛋白大豆胨替代动物蛋白胨,同时添加麦芽浸粉改善发酵液的风味,制得了能够同时改善发酵风味、提高发酵的活菌数的罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基;
(2)提供了一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵方法,发酵后风味中的酮类,脂类等芳香物质含量明显提高,活菌数提高43倍,发酵过程中无需调节pH,有利于大规模工业化生产;
(3)本发明制得的活菌发酵液无需高能耗的冷冻干燥工艺,可直接添加到发酵酸奶中,没有引起产品的不良风味。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
在本发明中,若非特指,所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的,下述实施例中的方法,如无特别说明,均为本领域常规方法。
以下实施例所用罗伊氏乳杆菌菌株的分类命名为Lactobacillus ReuteriWHH1689,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号为13122。
实施例1
(1)将罗伊氏乳杆菌菌株接种于种子培养基中,37℃厌氧培养16h,培养得到种子液;所述种子培养基为传统的MRS培养基,每升种子培养基中包括:葡萄糖20g,胰蛋白胨5g,牛肉膏10g,酵母粉50g,大豆胨5g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80 0.1g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g;
(2)将种子液以5%(v/v)的接种量接种于6L罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基(容量10L的发酵罐)中,于37℃条件下,通入CO2,搅拌速度控制在120rpm,厌氧搅拌条件下进行发酵培养20h;每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中包括以下原料:麦芽糖30g,大豆胨80g,麦芽浸粉65g,酵母粉5~15g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80 1g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g;罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的初始pH值为6.0,发酵过程中无需特别调节体系的pH值,发酵完成后得到活菌发酵液,所得活菌发酵液的pH值为3.7(罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的终点pH值)。
实施例2
(1)将罗伊氏乳杆菌菌株接种于种子培养基中,37℃厌氧培养15h,培养得到种子液;所述种子培养基为传统的MRS培养基,每升种子培养基中包括:葡萄糖20g,胰蛋白胨5g,牛肉膏10g,酵母粉50g,大豆胨5g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80 0.1g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g;
(2)将种子液以1%(v/v)的接种量接种于80ml罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基(容量100ml的蓝盖瓶)中,于35℃条件下,通入CO2,搅拌速度控制在130rpm,厌氧搅拌条件下进行发酵培养24h;每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中包括以下原料:麦芽糖10g,大豆胨20g,麦芽浸粉100g,酵母粉5g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80 1g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g;罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的初始pH值为6.5,发酵过程中无需特别调节体系的pH值,发酵完成后得到活菌发酵液,所得活菌发酵液的pH值为3.0(罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的终点pH值)。
实施例3
(1)将罗伊氏乳杆菌菌株接种于种子培养基中,37℃厌氧培养12h,培养得到种子液;所述种子培养基为传统的MRS培养基,每升种子培养基中包括:葡萄糖20g,胰蛋白胨5g,牛肉膏10g,酵母粉50g,大豆胨5g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80 0.1g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g;
(2)将种子液以10%(v/v)的接种量接种于罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中,于38℃条件下,通入CO2,搅拌速度控制在100rpm,厌氧搅拌条件下进行发酵培养16h;每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中包括以下原料:麦芽糖50g,大豆胨60g,麦芽浸粉30g,酵母粉15g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80 1g,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠檬酸氢二胺2g和乙酸钠10g;罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的初始pH值为6.3,发酵过程中无需特别调节体系的pH值,发酵完成后得到活菌发酵液,所得活菌发酵液的pH值为3.5(罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的终点pH值)。
实施例4~16
实施例4~16与实施例1的区别在于:步骤(2)中,罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基主原料不同,具体参见表1,其余工艺条件完全相同。
测试各实施例的罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的活菌数,结果如表1所示:
表1.测试结果
编号 | 麦芽糖(g/L) | 大豆胨(g/L) | 麦芽浸粉(g/L) | 活菌数(cfu/ml) |
实施例1 | 30 | 80 | 65 | 6.90×10<sup>9</sup> |
实施例2 | 10 | 20 | 100 | 1.37×10<sup>9</sup> |
实施例3 | 50 | 60 | 30 | 2.56×10<sup>9</sup> |
实施例4 | 30 | 70 | 60 | 4.85×10<sup>9</sup> |
实施例5 | 20 | 60 | 70 | 4.75×10<sup>9</sup> |
实施例6 | 30 | 70 | 70 | 3.80×10<sup>9</sup> |
实施例7 | 20 | 70 | 65 | 4.60×10<sup>9</sup> |
实施例8 | 10 | 70 | 60 | 4.66×10<sup>9</sup> |
实施例9 | 10 | 70 | 70 | 5.25×10<sup>9</sup> |
实施例10 | 20 | 80 | 60 | 3.50×10<sup>9</sup> |
实施例11 | 10 | 80 | 65 | 3.65×10<sup>9</sup> |
实施例12 | 10 | 60 | 65 | 4.20×10<sup>9</sup> |
实施例13 | 20 | 60 | 60 | 3.25×10<sup>9</sup> |
实施例14 | 20 | 70 | 65 | 6.00×10<sup>9</sup> |
实施例15 | 20 | 80 | 70 | 4.25×10<sup>9</sup> |
实施例16 | 30 | 60 | 45 | 5.40×10<sup>9</sup> |
由表1可以看出,实施例1所用罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基发酵所得的活菌数最高,其配方为最优配方。
对比例1
对比例1与实施例1的区别在于:步骤(2)采用传统的MRS培养基进行发酵培养,其余工艺条件完全相同。
对比例2
对比例2与实施例1的区别在于:步骤(2)中,罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中麦芽糖替换为相同添加量的葡萄糖,其余工艺条件完全相同。
对比例3
对比例3与实施例1的区别在于:步骤(2)中,罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中麦芽糖替换为相同添加量的蔗糖,其余工艺条件完全相同。
对比例4
对比例4与实施例1的区别在于:步骤(2)中,发酵过程中持续调节罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的pH值为5.5,其余工艺条件完全相同。
对比例5
对比例5与实施例1的区别在于:步骤(2)中,发酵过程中持续调节罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的pH值为6.0,其余工艺条件完全相同。
分别测定实施例1和对比例1所得的活菌发酵液的活菌数及风味评价,测定结果如表2所示:
表2.不同发酵培养基对活菌发酵液的活菌数及风味评价结果
由表2可以看出,采用本发明罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基进行发酵所得的活菌发酵液相对于传统MRS培养基发酵所得活菌发酵液的活菌数明显增多,且风味成分中酮类,脂类等芳香物质含量明显提高,说明本发明的罗伊氏乳杆菌高密度发酵方法能够同时改善发酵风味、提高发酵的活菌数,有效避免了不良风味的产生。
测定实施例1及对比例2、3所得的活菌发酵液的活菌数及风味评价,测定结果如表3所示:
表3.不同碳源发酵培养基所得活菌发酵液的活菌数
编号 | 碳源 | 活菌数(cfu/ml) |
实施例1 | 麦芽糖 | 1.14×10<sup>9</sup> |
对比例2 | 葡萄糖 | 5.94×10<sup>8</sup> |
对比例3 | 蔗糖 | 6.25×10<sup>8</sup> |
由表3可以看出,采用麦芽糖作为罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的碳源,所得的活菌发酵液的活菌数远高于葡萄糖、蔗糖。
测定实施例1及对比例4、5所得的活菌发酵液的活菌数及风味评价,测定结果如表4所示:
表4.不同发酵条件所得活菌发酵液的活菌数
编号 | 发酵培养基pH值 | 活菌数(cfu/ml) |
实施例1 | 不调节(6.0~3.7) | 1.17×10<sup>10</sup> |
对比例4 | 5.5 | 6.98×10<sup>9</sup> |
对比例5 | 6.0 | 7.70×10<sup>9</sup> |
由表4可以看出,在发酵过程中不调节pH值,所得的活菌发酵液的活菌数远远高于控制发酵培养基pH值为5.5~6.0的活菌数。
在娃哈哈奶酪酸奶产品中,直接加入1%(w/v,g/L)的实施例1制得的活菌发酵液,摇匀后,进行口味测评,测试结果发现无任何不良风味或不好的体验。
本发明提出的罗伊氏乳杆菌高密度发酵方法,在改善发酵风味的同时,提高了发酵的活菌数。发酵后,风味中的酮类,脂类等芳香物质含量明显提高,活菌数提高43倍至1.17×1010cfu/ml。将发酵液直接添加到发酵酸奶中,没有引起产品的不良风味。因此,应用本发明获得的乳酸菌制品,可以不经过高能耗的冻干,直接在产品中添加。
所述仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明作任何形式上的限制,在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (7)
1.一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基,其特征在于,每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中包括:麦芽糖10~50g、大豆胨20~80g、麦芽浸粉30~100g、酵母粉5~15g、硫酸锰0.58g、硫酸镁0.28g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二胺2g、乙酸钠10g以及吐温80 1g;
利用所述的罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基进行罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法,包括以下步骤:
(1)将罗伊氏乳杆菌菌株接种于种子培养基中,培养得到种子液;
(2)将种子液接种于罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中,于35~38℃条件下,厌氧搅拌条件下进行发酵培养,发酵完成后得到活菌发酵液;所述种子液在罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中的接种量为1~10% v/v;发酵培养工艺条件为:通入CO2,搅拌速度控制在100~130rpm,发酵时间控制在16~24h;所述活菌发酵液中活菌数为(0.3~1.17)×1010 cfu/ml。
2.根据权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基,其特征在于,每升罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中包括以下原料:麦芽糖30g、大豆胨80g、麦芽浸粉65g、酵母粉5~15g、硫酸锰0.58g、硫酸镁0.28g、吐温80 1g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、磷酸氢二钾2g、柠檬酸氢二胺2g以及乙酸钠10g。
3.根据权利要求1所述的一种罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基,其特征在于,所述罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的pH为6.0~6.5。
4.一种利用权利要求1-3中任一权利要求所述的罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基进行罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将罗伊氏乳杆菌菌株接种于种子培养基中,培养得到种子液;
(2)将种子液接种于罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中,于35~38℃条件下,厌氧搅拌条件下进行发酵培养,发酵完成后得到活菌发酵液。
5.根据权利要求4所述的罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法,其特征在于,步骤(2)中,所述种子液在罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基中的接种量为1~10% v/v;发酵培养工艺条件为:通入CO2,搅拌速度控制在100~130rpm,发酵时间控制在16~24h。
6.根据权利要求4所述的罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法,其特征在于,所述活菌发酵液中活菌数为(0.3~1.17)×1010 cfu/ml。
7.根据权利要求4所述的罗伊氏乳杆菌高密度发酵的方法,其特征在于,发酵过程中,所述罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的初始pH值为6.0~6.5,发酵完成后,所述罗伊氏乳杆菌高密度发酵培养基的终点pH值为3.0~3.7。
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