CN103571782A - 一株融合乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株融合乳杆菌及其应用，属于发酵技术领域。该Weissella confuse已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8321，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株具有较高的耐渗透压能力，将该菌株应用于蚕豆酱传统发酵生产过程，具有耐高盐、缩短蚕豆酱发酵周期的特点。

Description

一株融合乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株融合乳杆菌及其应用，属于发酵技术领域。

背景技术

乳酸菌是指一群可以发酵碳水化合物，产生大量乳酸的细菌总称。这一类细菌在自然界和食品中广泛存在，是最早被人类用于食品加工和食品储藏的微生物之一。乳酸菌能赋予食品柔和的酸味和香气，改进食品的品质和营养，提高食品的保藏性能，促进乳制品、发酵香肠、泡菜、甜酱等发酵食品的成熟。

乳杆菌即是乳酸杆菌，制作酸乳常用菌之一，耐酸性强，革兰氏染色成阳性，为人体有益菌，有帮助消化之功效。乳杆菌耐酸，最适pH值为5.5～5.8，甚至更低。包括乳杆菌在内的乳酸菌广泛分布于含有碳水化合物的动植物发酵产品中，在植物体表、乳制品、肉制品、啤酒、葡萄酒、果汁、麦芽汁、发酵面团、污水以及人畜粪便中，均可分离到。中国传统的食品，如泡菜、榨菜、腌菜和酿酒等的制作保藏技术就是利用了乳酸菌的这一作用。

融合乳杆菌革兰氏阳性，不形成芽孢，兼性厌氧或微需氧，不能利用鼠李糖，能利用大多数碳源，利用精氨酸，不产氨气，接触酶阴性，分解葡萄糖产生CO₂。融合乳杆菌已被广泛应用于多种传统发酵食品和饮料的生产中，常用于发酵豆奶的研究。

蚕豆酱是以蚕豆等为原料发酵酿制而成的保持蚕豆酱原形的半流动粘稠体或半固态调味品。蚕豆酱在我国有着悠久的历史，营养丰富，味道鲜美，有助消化，增进食欲，因此深受广大消费者的欢迎。本发明涉及的融合乳杆菌从蚕豆酱传统发酵酱醅中筛选，明显缩短了传统发酵豆瓣酱的发酵周期。

发明内容

本发明提供了一株Weissella confuse。所述Weissella confuse，已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8321，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述的W.confuse（融合乳杆菌）分离自安徽某知名酱品的传统方法酿制的酱醅，该菌株具有典型特征的M13-PCR指纹，即菌株转移性的特征指纹，如图1所示；测序分析，其16S rDNA序列基因型如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上BLAST搜索，与一株融合乳杆菌（序列ID:dbj|AB854267.1|）有最高匹配度。

所述W.confuse能抑制豆瓣酱传统发酵过程中好氧菌的生长、缩短豆瓣酱的发酵周期、耐受20%NaCl。

所述融合乳杆菌（W.confuse）为从风味口感较佳的传统方法酿制的豆瓣酱酱醅中筛选所得，平板菌落计数达到3×10⁴CFU/g。其保藏条件如下：从MRS培养基厌氧管中取少量生长良好的菌液移入新鲜的MRS培养基中，37℃厌氧静置培养24h，取0.75mL移入盛有0.25mL无菌甘油40%（v/v）的甘油管中，放-70℃冰箱保存。

所述MRS培养基为：Tryptone10g L^-1，Yeast Extract5g L^-1，牛肉膏10g L^-1，葡萄糖20g L^-1，乙酸钠5g L^-1，柠檬酸氢二铵2g L^-1，硫酸镁0.58g L^-1，硫酸锰0.25g L^-1，吐温-80 0.1g L^-1，pH6.2～6.6。

所述融合乳杆菌培养条件为：将甘油管保藏的融合乳杆菌接入MRS液体培养基中，在37℃厌氧静置培养24h至对数中后期，作为种子液。以2%（v/v）接种量将种子液转接至新鲜的MRS培养基中，37℃厌氧静置培养8h至对数期。

本发明还提供了一种所述融合乳杆菌的应用，将培养良好的融合乳杆菌在豆瓣酱传统发酵过程的中前期添加入酱醅，抑制枯草芽孢杆菌等好氧菌的生长，缩短豆瓣酱的发酵周期。

本发明提供了一株融合乳杆菌，可应用于高盐浓度传统发酵豆瓣酱，抑制某些好氧菌的生长，改善豆瓣酱的风味，缩短豆瓣酱的发酵周期。

生物材料保藏

本发明所提供的Weissella confuse，已于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8321，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1Rep-PCR(M13-PCR)扩增指纹图谱，M：DS5000，1：样品。

图2融合乳杆菌盐度耐受性柱形图。

具体实施方式

实施例1融合乳杆菌的筛选

从传统发酵豆瓣酱30天至50天酱醅中取1g样品加入到9mL无菌水中，轻微振荡制成悬浊液，将悬浊液梯度稀释，涂布于MRS平板，32℃厌氧培养60h。挑取乳白色单菌落反复进行平板划线分离，重复三次得到纯化的单菌落，供下一步鉴定用。

鉴定主要通过：1)菌落特征观察：用肉眼直接观察，挑选菌落直径在1-1.5mm之间，圆形，表面光滑，乳白色等符合乳杆菌菌落特征的菌株。2)个体形态观察：用光学显微镜革兰氏染色观察。挑选革兰氏阳性、无芽孢的菌株。将满足鉴定条件的菌株挑出甘油管保藏。

以2%接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃厌氧静置培养24h。取适量培养液离心2min（4000rpm，4℃），弃尽上清液，得到适量菌体，用天根的细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取基因组DNA。用细菌通用引物对上游引物27F(序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物L1401R（5’-GCGTGTGTACAAGACCC-3’）扩增基因组DNA，反应条件为：94℃预变性3min后进入以下循环：94℃变性40s，56℃退火35s，72℃延伸80s，30个循环；72℃延伸10min。经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将扩增产物寄送上海华大基因测序，如SEQ ID NO.1所示，在NCBI网站上进行BLAST序列比对，确定为融合乳杆菌。

实施例2NaCl耐受性实验

融合乳杆菌NaCl耐受性实验所使用的培养基为不同NaCl终浓度的MRS培养基。MRS培养基为：Tryptone10g L^-1，Yeast Extract5g L^-1，牛肉膏10g L^-1，葡萄糖20g L^-1，乙酸钠5g L^-1，柠檬酸氢二铵2g L^-1，硫酸镁0.58g L^-1，硫酸锰0.25g L^-1，吐温-800.1g L^-1，pH6.2～6.6。NaCl浓度分别为：10%、12%、14%、16%、18%、20%。厌氧管装液量均为15mL每管。培养基灭菌条件为115℃，15min。

以2%接种量取-70℃甘油贮存液接种于MRS培养基中，37℃厌氧静置培养24h。以10%接种量转接至不同NaCl终浓度的MRS培养基中，37℃厌氧管静置培养20天，如图2所示，融合乳杆菌在NaCl终浓度10%、12%、14%、16%、18%、20%（%：g/100mL）条件下均能生长，其中NaCl终浓度10%条件下生长速度相对较快，其余条件生长很缓慢。

实施例3应用于高盐浓度传统发酵蚕豆酱

CGMCC No.8321Weissella confuse菌株在MRS液体培养基中厌氧培养2天，作为种子液。将种子液接种至盐度为14%的酱醅，对照为未接种种子液的盐度为14%的酱醅，发酵周期有较明显的变化，未接种融合乳杆菌的酱体在约110天后成熟，而接种融合乳杆菌的酱体在约85天后成熟，且好氧杂菌从10⁸CFU/g（未接种融合乳杆菌）降至10⁷CFU/g（接种融合乳杆菌）。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一株Weissella confuse，于2013年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8321，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的W.confuse，其特征在于抑制豆瓣酱传统发酵过程中好氧菌的生长。

3.权利要求1所述的W.confuse，其特征在于缩短豆瓣酱的发酵周期。

4.权利要求1所述的W.confuse，其特征在于耐受20%NaCl。

5.权利要求1-4任一所述W.confuse的培养方法，是将甘油管保藏的W.confuse接入MRS液体培养基中，在37℃厌氧静置培养24h至对数中后期，作为种子液。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述MRS培养基为：Tryptone10g L^-1，Yeast Extract5g L^-1，牛肉膏10g L^-1，葡萄糖20g L^-1，乙酸钠5g L^-1，柠檬酸氢二铵2g L^-1，硫酸镁0.58g L^-1，硫酸锰0.25g L^-1，吐温-800.1g L^-1，pH6.2～6.6。

7.应用权利要求1-4任一所述W.confuse于传统豆瓣酱发酵，是将W.confuse种子液在豆瓣酱传统发酵过程的中前期添加入到酱醅中。

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