CN118599741B - 具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物 - Google Patents
具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物，所述动物双歧杆菌命名为YRK‑12，该菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏编号为CGMCC NO.28597，保藏日期为2023年10月9日。该菌株通过增加粪便粒数、粪便含水量、减少排便时间，以及提高小肠推进率，可以用于改善或治疗功能性便秘；进一步本申请开发了一种全新的益生菌复配方式，通过将动物双歧杆菌YRK‑12和火麻仁提取物的复配，发现两者存在潜在的相互作用，能够相互配合，在治疗和/或改善动物的功能性便秘中具有协同功效。
Description
技术领域
本发明属于微生物新应用技术领域，特别涉及具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物。
背景技术
便秘是一种临床常见的以排便困难、低频率或不完全为主要特征的胃肠道疾病，对患者的生活质量有较大的影响，全球范围内大约有12-14%的人患有便秘。在亚洲，随着环境的变化、精神压力的增加和久坐时间的延长，某些人群中便秘的患病率甚至高达20%。慢性便秘还提高了人们的医疗开销，加重了人民的经济负担。便秘形成的原因有很多，病因繁杂，长期的便秘会破坏肠屏障，提高肠上皮细胞的通透性，有害物质更易通过受损后的屏障，从而导致有毒有害物质在体内发生扩散，引发多种疾病，其对于人民群众的身体健康的危害不容小觑。便秘还会带来严重的炎症反应，加重便秘程度。
目前，治疗便秘的方法主要为：（1）膳食改善。通过摄入更多的粗纤维可以改善结肠运输正常和肛门直肠功能正常。主要适用于饮食习惯导致的便秘。（2）药物治疗。临床常用的药物有泻剂、促分泌剂和肠动力提升剂。但长时间服用存在耐药性以及伴随头痛、恶心、腹痛和腹泻等不良反应。（3）手术治疗。慢传输型便秘，可以选择切除结肠并将回直肠接合的方式进行治疗，但是患者也不得不承受其严重的副作用，例如排便失调。
随着便秘发病率的提高和各种治疗手段的限制性与副作用的显现，寻找新的有效手段治疗尤为重要。益生菌作为肠道中的“定居者”，通过调节微生物组成，改善肠道微环境对便秘起到缓解作用。双歧杆菌已被证实能够通过参与宿主的代谢，起到缓解便秘的作用。同时，中医药作为我国的瑰宝，对便秘的防治源远流长，而且防治的方式也不拘一格。而现有研究缺乏对双歧杆菌与中药成分复配的相关研究。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于筛选得到具有良好防治便秘功效的益生菌，并对其与中药成分的协同治疗效果进行挖掘，提供具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物。以求为益生菌、中药提取物复配组合物的工业化生产提供参考指标，也为益生菌、中药提取物复配组合物在防治功能性便秘领域的推广应用提供理论依据和数据支持。
由于中药提取物成分复杂，在帮助改善便秘症状中的起效原因并不清楚，导致不同益生菌与不同中药提取物复配后，合用效应可能表现为拮抗、协同或相加三种不同结果。因此，发明人对此进行了研究，期望发现与本申请所述动物双歧杆菌YRK-12合用，达到协同增效的中药提取物。研究前期筛选的药食同源类材料包括：桑葚、蜂蜜、火麻仁和莱菔子。但通过实验发现，上述四种物质单独干预，均可改善便秘症状，但在动物双歧杆菌YRK-12复配后，YRK-12+桑葚提取物形成的组合物对干预便秘小鼠起到抑制效果；YRK-12+蜂蜜的组合物对干预便秘小鼠基本呈现相加的合用效应。火麻仁、莱菔子两者提取物分别与动物双歧杆菌YRK-12合用，则呈现出明显的协同效应。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一方面，提供了一种动物双歧杆菌，命名为YRK-12，该菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏编号为CGMCC NO.28597，保藏日期为2023年10月9日。
本发明的另一方面，提供了一种具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物，所述组合物包括动物双歧杆菌和火麻仁提取物；
所述动物双歧杆菌命名为YRK-12，该菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏编号为CGMCCNO.28597，保藏日期为2023年10月9日；
所述组合物中，动物双歧杆菌YRK-12的最终治疗剂量为活菌数不低于1.0×1010CFU/d/kg体重。
进一步的，所述火麻仁提取物为水提物，火麻仁水提物的提取方法为：
火麻仁经粉碎机粉碎成粉末，加入8~15倍重量的水进行煎煮2~5次，每次0.5~1.5小时，煎煮后过滤，合滤液，过滤后，45~55℃旋蒸至药材：水=1：1~2，冻干成粉末，即得到火麻仁水提物。
进一步的，所述组合物中，动物双歧杆菌YRK-12的最终治疗剂量为活菌数为1.0~3.0×1010CFU/d/kg。
进一步的，所述组合物中，火麻仁提取物的最终治疗剂量为0.167~0.667g/d/kg体重。
进一步的，所述组合物的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
本发明的另一方面，提供了上述动物双歧杆菌，或动物双歧杆菌、火麻仁组合物在制备防治功能性便秘的产品中的应用。
进一步的，所述产品为食品、保健品、药品或饲料中的任意一种。
进一步的，所述应用为以下的一种或多种：
（1）所述应用能够减少排便时间；
（2）所述应用能够增加粪便粒数；
（3）所述应用能够增加粪便含水量；
（4）所述应用能够提高小肠推进率。
本发明的另一方面，提供了一种益生菌组合物，其中包含上述动物双歧杆菌，或上述具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物。
菌种保藏信息：
动物双歧杆菌命名为YRK-12，该菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏编号为CGMCC NO.28597，保藏日期为2023年10月9日。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本申请筛选获得一株能够防治功能性便秘的益生菌，该菌株经保藏鉴定为动物双歧杆菌，保藏编号为CGMCC NO.28597，分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis。
2、本申请发现，采用动物双歧杆菌YRK-12能够有效增加粪便粒数和粪便含水量、减少排便时间，以及提高小肠推进率从而实现治疗功能性便秘，其作用效果由于目前已经开发上市的动物双歧杆菌BB-12。具体来说相比阳性对照菌BB-12，动物双歧杆菌YRK-12可使宿主的粪便含水量显著增加7%，首粒排红时间显著减少72min。
3、本申请所述的动物双歧杆菌YRK-12与火麻仁水提取物形成的组合物，对改善小鼠便秘的干预效果优于动物双歧杆菌YRK-12、火麻仁水提取物单一个物质干预效果，达到药物干预水平，这对于开发高效的功能性便秘药物具有重要的实际意义。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
图1示出测试例1所述功能性便秘小鼠造模成功结果；其中，A为首粒排红时间，B为6小时粪便粒数，C为粪便含水量；
图2示出测试例1不同组治疗功能性便秘小鼠的对比结果；其中，A为首粒排红时间，B为6小时粪便粒数，C为粪便含水量；
图3示出动物双歧杆菌YRK-12与火麻仁水提取物按照1~3×1010CFU/d/kg和0.333g/d/kg组合后治疗治疗功能性便秘小鼠结果；其中，A为首粒排红时间，B为6小时粪便粒数，C为粪便含水量，D为肠道推进率；
图4示出动物双歧杆菌与火麻仁水提取物按照1~3×1010CFU/d/kg和0.333 g/d/kg组合后协同增效结果（组合式归一化等值全息图）；其中，A为动物双歧杆菌YRK-12，B为动物双歧杆菌BB-12。
具体实施方式
本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。若无特别指明，实施例采用的方法为本领域通用技术。
对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下实施例中，动物双歧杆菌YRK-12由陕西易瑞康生物科技有限公司提供，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。菌株来源于人体肠道。BB-12菌株来源于丹麦科汉森公司。其他采用的化学试剂均购自正规化学试剂供应商，纯度为分析纯。
以下实施例中，涉及的培养基配方包括：
所述改良的MRS液体培养基，其配方为：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸二铵2 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，无水乙酸钠5 g，吐温80 1 mL，半胱氨酸盐酸盐0.5 g，蒸馏水定容至1 L，调pH至6.5，121℃灭菌15min。
实施例1：微生物培养准备
1）动物双歧杆菌YRK-12菌体制备：
通过分离人肠道菌群，获得一株益生菌，经鉴定为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.28597，保藏日期为2023年10月9日。
将分离获得的动物双歧杆菌YRK-12在改良的MRS液体培养基中传代两次后，按照2%接种量接种于改良的MRS液体培养基中，在37± 1℃条件和0%氧浓度下培养12h。离心（4000 rpm，10 min）去除上清液，用PBS清洗菌体两次后，灌胃时，以0.9%生理盐水重悬浮并调整其菌悬液浓度为1~3×1010CFU/g。
2）动物双歧杆菌BB-12菌体制备：
动物双歧杆菌BB-12在改良的MRS液体培养基中传代两次后，按照2%接种量接种于改良的MRS液体培养基中，在37± 1℃条件和0%氧浓度下培养12h。离心（4000 rpm，10 min）去除上清液，用PBS清洗菌体两次后，灌胃时，以0.9%生理盐水重悬浮并调整其菌悬液浓度为1~3×1010CFU/g。
实施例2：火麻仁水提取物的制备
本实施例提供了火麻仁水提物的制备方法，具体步骤包括：
火麻仁经粉碎机粉碎成粉末，加入10倍重量的水进行煎煮3次，每次1小时，合并3次滤液，8层纱布过滤，50℃旋蒸至药材：水=1：1（质量浓度为1g/mL），冻干成粉末，称重。
计算火麻仁提取物与火麻仁之间的浓缩倍数，灌胃时，以0.9%生理盐水重悬浮并调整其浓度为0.06g/mL、0.12g/mL和0.24g/mL。
实施例3：动物模型的准备及动物实验
实验动物选用SPF级BALB/c（6周龄，雌性）小鼠，购自于北京华阜康生物科技股份有限公司。动物实验分为2批次进行。
第一批次动物实验进行火麻仁提取物剂量筛选，共分为8组，分别是空白组、模型组、药物组、火麻仁提取物高剂量组、火麻仁提取物中剂量组、火麻仁提取物低剂量组、动物双歧杆菌YRK-12组、动物双歧杆菌BB-12组。每组8只小鼠，共64只。
第二批次动物实验进行动物双歧杆菌YRK-12和莱菔子提取物的组合物协同评价，共分为7组，分别是空白组、模型组、药物组、动物双歧杆菌YRK-12组、动物双歧杆菌BB-12组、动物双歧杆菌YRK-12及火麻仁提取物中剂量混合组和动物双歧杆菌BB-12及火麻仁提取物中剂量混合组。每组8只小鼠，共56只。
小鼠饲养条件：温度24℃，控制光照12h，黑暗12h，每三天更换一次垫料。适应性饲养一周后，每只小鼠每天灌胃15mg/kg b.w的盐酸洛哌丁胺，每周称重1次。
空白组一直灌胃0.9%生理盐水，直至实验结束；
模型组及各干预组：先灌胃0.1mL 15mg/kg b.w的盐酸洛哌丁胺，直至模型成功（7-14天）。造模成功后模型组及干预组，隔天灌胃0.1mL 15mg/kg b.w的盐酸洛哌丁胺直至实验结束；同时药物组灌胃聚乙二醇4000散，各干预组灌胃低、中、高剂量的火麻仁提取物（低剂量0.167g/d/kg、中剂量0.333g/d/kg、高剂量0.667g/d/kg）、1~3×1010CFU/d/kg的动物双歧杆菌YRK-12、1~3×1010CFU/d/kg的动物双歧杆菌BB-12、1~3×1010CFU/d/kg的动物双歧杆菌YRK-12和火麻仁（0.333g/d/kg）混合组和1~3×1010CFU/d/kg的动物双歧杆菌BB-12和火麻仁（0.333g/d/kg）混合组，灌胃量为0.1 mL，灌胃2-3周。
测试例1：粪便含水量、6小时内排便粒数和首粒排红时间的检测
本测试例分别测定实施例3各组实验动物的粪便含水量、6小时内排便粒数和首粒排红时间进行检测。具体方法及结果如下：
粪便含水量测定：在第29天，灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，收集粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照公式（1）计算粪便含水量：；
6小时内排便粒数：第30天，空白组给予0.1mL 0.9%生理盐水、模型组和干预组均给予0.1mL盐酸洛哌丁胺溶液（15mg/kg b.w)，1h后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼盒中，每隔30分钟收集一次粪便，共收集6小时。
首粒排红时间：第30天，空白组给予0.1 mL 0.9%生理盐水、模型组和干预组均给予0.1mL盐酸洛哌丁胺溶液（15mg/kg b.w)，1 h后，各组均灌胃0.1mL 0.6%（m：v）胭脂红，从灌胃胭脂红开始，记录每一只小鼠排首粒红便的时间。
如图1结果所示，在造模7天后，模型组小鼠的首粒排红时间、粪便粒数和粪便含水量分别是空白组的2.5倍、2.7倍和1.4倍，且均存在显著差异，表明便秘模型造模成功。
干预组的表现与模型组相比，如图2结果所示，在不同剂量火麻仁干预14天后，火麻仁提取物低剂量（0.167g/d/kg）、火麻仁提取物中剂量（0.333g/d/kg）、火麻仁提取物高剂量（0.667g/d/kg）、动物双歧杆菌YRK-12和动物双歧杆菌BB-12在首粒排红时间、粪便粒数和粪便含水量均有所改善。其中以火麻仁提取物中剂量（0.333g/d/kg）的干预效果最佳，与模型组相比，首粒排红时间显著减少了130分钟（图2中A）；粪便粒数显著增加了13粒（图2中B）和显著增加了23%的粪便含水量（图2中C）。动物双歧杆菌YRK-12比动物双歧杆菌BB-12在首粒排红时间上显著减少了72分钟（图2中A）；粪便粒数增加了3粒（图2中B）和显著增加了7%的粪便含水量（图2中C）。表明动物双歧杆菌YRK-12改善小鼠便秘效果显著优于动物双歧杆菌BB-12，同时以火麻仁提取物中剂量（0.333g/d/kg）对改善小鼠便秘效果最佳。
如图3结果所示，动物双歧杆菌YRK-12和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）共同干预便秘小鼠14天后，显著改善了小鼠便秘症状。与模型组相比，首粒排红时间显著减少了110分钟（图3中A）；粪便粒数显著增加了28粒（图3中B）和显著增加了29%的粪便含水量（图3中C），且效果与药物干预组无显著差异。动物双歧杆菌BB-12和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）共同干预便秘小鼠14天后，同样可显著改善了小鼠便秘症状。与模型组相比，首粒排红时间显著减少了94分钟（图3中A）；粪便粒数显著增加了21粒（图3中B）和显著增加了15%的粪便含水量（图3中C），干预效果未达到药物组干预效果。表明动物双歧杆菌YRK-12与火麻仁水提取物（0.333g/d/kg）组合改善小鼠便秘效果优于动物双歧杆菌BB-12与火麻仁水提取物（0.333g/d/kg）组合。
测试例2：小鼠小肠推进率实验的测定
本测试例进一步测定了实施例3各组实验动物的小肠推进率，具体方法及结果如下：
第30天，各组小鼠禁食不禁水过夜。第31天上午8点空白组给予0.1mL 0.9%的生理盐水溶液、模型组和灌菌组均给予0.1mL盐酸洛哌丁胺溶液（15mg/kg b.w)，30min后，空白组和模型组灌胃0.6%（m：v）胭脂红，灌菌组灌胃含有各自灌胃内容物的胭脂红，30min后处死小鼠，打开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到胭脂红前沿为“胭脂红推进长度”，按照公式（2）计算小肠推进率：；
如图3中D结果所示，动物双歧杆菌YRK-12干预便秘小鼠14天后，与模型组相比，显著改善了小鼠小肠推进率（增加了1.7倍），并显著优于动物双歧杆菌BB-12的1.4倍。与模型组相比，动物双歧杆菌YRK-12和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）组合物显著改善了小鼠小肠推进率（增加了2.1倍），与空白组无差异。动物双歧杆菌YRK-12和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）组合物的推进率显著高于动物双歧杆菌YRK-12、火麻仁水提取物单一个物质的推进率。同时，动物双歧杆菌YRK-12和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）组合物的推进率显著高于动物双歧杆菌BB-12和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）组合物的推进率。
以Median-effect Principle（中效原理或Chou-Talalay联合指数法）为评价基础，应用CompuSyn统计软件绘制不同效应下的合用指数曲线，从两种物质合用的效应与合用指数的关系定量评价两种物质之间是否存在协同效应。
合用指数CI = D1/DX1 + D2/DX2；其中 D1、D2分别为两种物质单用时产生X效应时两物质各自的浓度，DX1、DX2分别为两种物质合用时产生X效应时两物质各自的浓度。所得CI大于1时表示抑制（即两种物质合用效应为拮抗）；CI=1表示两种物质合用效应为相加；CI小于1时表示促进（即两种物质合用效应为协同），且数值越小，表明协同效应越强。
如图4结果所示，利用CompuSyn软件对动物双歧杆菌YRK-12、动物双歧杆菌BB-12及火麻仁提取物单独及共同干预便秘小鼠的排红时间进行分析。动物双歧杆菌YRK-12（1~3×1010CFU/d/kg）和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）组合物的CI=0.1577（图4中A），而动物双歧杆菌BB-12（1~3×1010CFU/d/kg）和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）组合物的CI=1.0117（图4中B）。结果表明，动物双歧杆菌YRK-12和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）组合物对干预便秘小鼠起到促进效果，而动物双歧杆菌BB-12和火麻仁提取物（0.333g/d/kg）组合物对干预便秘小鼠起到抑制效果。
综上所述，动物双歧杆菌YRK-12、火麻仁水提取物以及动物双歧杆菌YRK-12与火麻仁水提取物组合后均可以通过增加粪便粒数和粪便含水量，减少排便时间，以及提高小肠推进率来实验治疗功能性便秘。动物双歧杆菌YRK-12改善小鼠便秘的干预效果显著优于动物双歧杆菌BB-12。动物双歧杆菌YRK-12与火麻仁水提取物组合后改善小鼠便秘的干预效果优于动物双歧杆菌YRK-12、火麻仁水提取物单一个物质干预效果，并起到了协同增效的效果。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (9)
1.一种动物双歧杆菌，其特征在于，命名为YRK-12，该菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏编号为CGMCC NO.28597，保藏日期为2023年10月9日。
2.一种具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物，其特征在于，所述组合物的活性成分为动物双歧杆菌和火麻仁提取物；
所述动物双歧杆菌命名为YRK-12，该菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，分类命名为动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis，保藏编号为CGMCCNO.28597，保藏日期为2023年10月9日；
所述组合物中，动物双歧杆菌YRK-12的最终治疗剂量为活菌数不低于1.0×1010CFU/d/kg体重。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述火麻仁提取物为水提物，火麻仁水提物的提取方法为：
火麻仁经粉碎机粉碎成粉末，加入8~15倍重量的水进行煎煮2~5次，每次0.5~1.5小时，煎煮后过滤，合滤液，过滤后，45~55℃旋蒸至药材：水=1：1~2，冻干成粉末，即得到火麻仁水提物。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，动物双歧杆菌YRK-12的最终治疗剂量为活菌数为1.0~3.0×1010CFU/d/kg体重。
5.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，火麻仁提取物的最终治疗剂量为0.167~0.667/d/kg体重。
6.根据权利要求2~5任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂或颗粒剂。
7.一种如权利要求1所述动物双歧杆菌、或如权利要求2~6任一项所述的组合物在制备防治功能性便秘的产品中的应用，所述产品为药品。
8.根据权利要求7中的应用，其特征在于，所述药品为以下的一种或多种：
（1）所述药品能够减少排便时间；
（2）所述药品能够增加粪便粒数；
（3）所述药品能够增加粪便含水量；
（4）所述药品能够提高小肠推进率。
9.一种益生菌组合物，其特征在于，包含权利要求1所述动物双歧杆菌、或如权利要求2~6任一项所述的具有协同防治功能性便秘的动物双歧杆菌、火麻仁组合物。
Priority Applications (1)
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