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CN118591393A - 具有可水解的马来酰亚胺接头的抗体缀合化学降解诱导物及其方法 - Google Patents

具有可水解的马来酰亚胺接头的抗体缀合化学降解诱导物及其方法 Download PDF

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CN118591393A
CN118591393A CN202380018416.3A CN202380018416A CN118591393A CN 118591393 A CN118591393 A CN 118591393A CN 202380018416 A CN202380018416 A CN 202380018416A CN 118591393 A CN118591393 A CN 118591393A
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cide
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alkyl
conjugate
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D·张
S·A·贝克-道克瑞
P·S·德拉戈维奇
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Genentech Inc
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Abstract

本文所述的主题一般地涉及用作接头以将化学降解诱导物与抗体共价结合的可水解的含马来酰亚胺分子且涉及从其所产生的缀合物以及它们治疗病症的用途，并且涉及所述缀合物在治疗其中靶向蛋白降解为有益的疾病和病症中的用途。

Description

具有可水解的马来酰亚胺接头的抗体缀合化学降解诱导物及 其方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年1月26日提交的美国临时专利申请第63/303,447号的权益，该临时专利申请的公开内容全文通过引用整体并入本文。
技术领域
本文所述的主题一般地涉及用作接头以将化学降解诱导物与抗体共价结合的可水解的含有马来酰亚胺的分子且涉及从其所产生的缀合物。
背景技术
细胞维持和正常功能需要细胞蛋白质的受控降解。例如，调节蛋白质的降解会触发细胞周期中的事件，例如DNA复制，染色体分离等。因此，这种蛋白质降解会影响细胞的增殖、分化和死亡。
虽然蛋白质的抑制剂可以阻断或降低细胞中的蛋白质活性，但细胞中的蛋白质降解也可降低活性或完全去除靶蛋白。因此，利用细胞的蛋白质降解途径可以提供降低或去除蛋白质活性的手段。细胞的主要降解途径中的一者已知是泛素-蛋白酶体系统。在该系统中，通过泛素化蛋白质来标记，蛋白质被蛋白酶体降解。蛋白质的泛素化是通过与蛋白质结合并将泛素分子添加到蛋白质的E3泛素连接酶完成的。E3泛素连接酶是包括E1和E2泛素连接酶的途径的一部分，这使E3泛素连接酶可将泛素添加到蛋白质中。
为了利用这种降解途径，称为化学降解诱导物(CIDE)的分子构建体将E3泛素连接酶与待降解的蛋白质结合在一起。为了促进蛋白酶体降解蛋白质，CIDE由与E3泛素连接酶结合的基团和与待降解的蛋白质靶标结合的基团组成。这些基团通常与接头连接。该CIDE可以使E3泛素连接酶与蛋白质接近，从而使其泛素化并标记用于降解。然而，CIDE相对较大的尺寸可能给靶向递送造成问题，并且会导致不良特性，例如快速代谢/清除、短半衰期和低生物利用度。
本领域持续需要改善CIDE，包括增强CIDE向包含蛋白质靶标的细胞的靶向递送。本文所述的主题解决了本领域中的这个和其他缺点。
发明内容
在某些实施例中，本公开涉及可水解的含有马来酰亚胺的接头，其可用于将CIDE与Ab-缀合的CIDE中的抗体共价结合以形成Ab-L1-CIDE。
在某些实施例中，本公开涉及与可水解的含有马来酰亚胺的接头共价结合的CIDE。
在某些实施例中，本公开涉及Ab-L1-CIDE，其中L1为与Ab以及与CIDE共价结合的可水解的含有马来酰亚胺的接头。
在某些实施例中，可水解的含有马来酰亚胺的接头具有式I、I-A、I-B、I-C或I-G的结构。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的Ab-L1-CIDE和一种或多种药用赋形剂。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及如本文所述的Ab-L1-CIDE在治疗病症和疾病的方法中的用途，其通过向受试者施用包含Ab-L1-CIDE的药物组合物来实现。
在某些实施例中，本文所述的主题为一种制备Ab-L1-CIDE的方法。
在某些实施例中，本文所述的主题的涉及一种制品，其包含药物组合物(包含Ab-L1-CIDE)、容器以及包装说明书或标签，该包装说明书或标签指示该药物组合物可用于治疗疾病或病症。
其他实施例也在本文中得到全面描述。
附图说明
图1为Ab-L1-CIDE的可能的缀合、水解和裂解途径的机制表示。
具体实施方式
本文公开可水解的含有马来酰亚胺的接头(在实施例中称为L1、L1、LX或LZ)。接头可用于将降解剂，也称为PROTAC或CIDE(“化学降解诱导物”)，与抗体共价结合。可水解的含有马来酰亚胺的接头为Ab缀合的CIDE(“抗体缀合的CIDE”、“Ab-L1-CIDE”或“Ab-CIDE”)中的一个组分，其中可水解的含有马来酰亚胺的接头与CIDE以及与抗体共价结合。这些缀合物可用于靶向的蛋白质降解。
本文所述的主题利用能够以稳定方式共价结合的可水解的含有马来酰亚胺的接头以提供增加数量的与抗体结合的接头。因此，可以以稳定方式增加每个抗体的CIDE数量。抗体上具有相对较多数量的稳定结合的接头是有利的，这些接头又可用于缀合至CIDE。与传统的高细胞毒性有效载荷相比，更高的DAR可实现更低效力、靶向的有效载荷。这些效力较低的有效载荷的使用增加了治疗窗口。相较于低DAR缀合物，高DAR缀合物的剂量也可以降低。
本文所述的主题利用抗体将CIDE靶向或引导至靶细胞或组织。如本文所述，通过将抗体与CIDE连接以形成Ab-CIDE，改善了CIDE向靶细胞或组织的递送。如本文所示，例如在实例中，表达抗原的细胞可由Ab-CIDE的抗原特异性抗体所靶向，从而将Ab-CIDE递送至表达此类抗原的靶细胞，且将Ab-CIDE的CIDE部分在细胞内递送至靶细胞。
因此，本文所述的主题涉及导致靶蛋白泛素化和随后蛋白质降解的Ab-CIDE组合物。该组合物包含与可水解的接头1(L1)共价连接的抗体，该接头在任何可用的连接点处与CIDE共价连接。CIDE包含E3泛素连接酶结合(E3LB)部分(其中该E3LB部分辨识E3泛素连接酶蛋白，即VHL)、将E3LB部分与蛋白质结合部分(PB)共价连接的接头2(L2)，该蛋白质结合部分为识别靶蛋白的部分。本文所述的主题用于降解并因此调节蛋白质活性以及治疗与蛋白质活性相关的疾病和病症。
现在将在下文中更全面地描述本发明所公开的主题。然而，对于当前公开的主题所涉及的本领域技术人员而言，在受益于本文提出的教导的情况下，可以想到本文阐述的当前公开的主题的变型例(modification)和其他实施例。因此，应当理解的是，当前公开的主题不限于所公开的特定实施例，并且变型例和其他实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。换言之，本文所描述的主题涵盖所有备选方案、变型方案和等同方案。如果所合并文献、专利和类似材料中的一者或多者与本申请不同或矛盾，包括但不限于定义的术语、术语用法、描述的技术或类似内容，以本申请为准。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本领域普通技术人员通常理解的含义相同。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。
I.定义
术语“可水解的”是指含有在生理条件下可诱导硫代取代的琥珀酰亚胺水解的部分的接头，其在马来酰亚胺通过硫醚键缀合至抗体时形成。
术语“CIDE”是指化学降解诱导物，其为蛋白水解靶向嵌合体分子，通常具有三种组分，E3泛素连接酶结合基团(E3LB)、接头2(L2)和蛋白质结合基团(PB)。
术语“残基”、“部分”、“组成部分”或“基团”是指与另一组分共价结合或连接的组分。术语“组分”在本文中也用于描述此类残基、部分、组成部分或基团。举例而言，化合物的残基将具有化合物的一个或多个原子(诸如氢或羟基)被共价键替代，从而使残基与CIDE、L1-CIDE或Ab-CIDE的另一组分结合。例如，“CIDE的残基”是指与一个或多个基团(诸如接头L2)共价连接的CIDE，其本身可任选地进一步连接至抗体。
术语“共价结合”或“共价连接”是指通过共享一对或多对电子而形成的化学键。
术语“蛋白质结合基团”或“PB”是指能够与靶蛋白或其他目标多肽靶标结合的小分子或其他化合物的残基。在本文所述的缀合物分子中，PB与靶标结合，其将靶标放置在泛素连接酶附近，使得可能发生通过泛素连接酶进行的蛋白质或多肽的降解。因此，本文所述的缀合物可以包括任何PB，只要它与L2共价结合并且与目标靶标相互作用或结合。小分子靶蛋白结合部分的非限制性实例包括结合BRM(BRAHMA)的化合物、Hsp90抑制剂、Tau和雄激素受体(AR)、激酶抑制剂(诸如BRG1、AKT、HPK1和IRE1)、MDM2抑制剂、靶向含有人类BET溴结构域的蛋白质的化合物、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂(诸如KDM5)、血管生成抑制剂、免疫抑制化合物以及靶向芳基烃受体(AHR)的化合物等等。在某些实施例中，本文所述的CIDE和缀合的CIDE不限于PB的类型。在某些实施例中，本文所述的CIDE和缀合的CIDE不限于PB的类型，其中PB与L2共价结合；并且缀合的CIDE包含可水解的接头。
术语“E3连接酶结合(E3LB)配体”是指能够结合Von Hippel-Lindau(VHL)E3泛素连接酶的分子。术语“VCB E3泛素连接酶”、“Von Hippel-Lindau(或VHL)E3泛素连接酶”、“VHL”和“泛素连接酶”全部一般地描述用于本文所述的缀合物的E3LB部分的靶标酶结合位点。VCB E3是一种与E2泛素结合酶组合可引起泛素与靶标蛋白上的赖氨酸结合的蛋白质；E3泛素连接酶靶向特定的蛋白质底物，以被蛋白酶体降解。因此，单独的E3泛素连接酶或与E2泛素结合酶复合的E3泛素连接酶负责将泛素转移至靶标蛋白。在某些实施例中，本文所述的CIDE和缀合的CIDE不限于E3LB的类型。在某些实施例中，本文所述的CIDE和缀合的CIDE不限于E3LB的类型，其中E3LB与L2共价结合；并且缀合的CIDE进一步共价连接至可水解的接头。
如本文所使用的术语“接头”、“接头单元”或“连接子”是指包含将CIDE部分共价连接至抗体或将CIDE的残基、组成部分、部分、基团或组分连接至CIDE的另一残基、组成部分、部分、基团或组分的一个或多个原子的链的化学部分。在各种实施例中，接头为二价基团，将其指定为接头1、接头2、L1、L1、L2或L2等。
如本文所使用的术语“拟肽”是指非肽化学部分。肽是由肽(酰胺)键(当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时形成的共价化学键)连接的氨基酸单体的短链。最短的肽是二肽，其由单个肽键所连接的2个氨基酸组成，其次是三肽、四肽等。拟肽化学部分包括非氨基酸化学部分。拟肽化学部分还可包括由一个或多个非氨基酸化学单元隔开的一个或多个氨基酸。拟肽化学部分在其化学结构的任何部分中不包含由肽键连接的两个或更多个相邻氨基酸。“拟肽接头”为分子的与CIDE以及与抗体结合的部分。有用的拟肽物接头为本领域中已知的并且其他如本文所公开。拟肽接头可为诸如那些在WO2015/095227、WO2015/095124或WO2015/095223中所述的接头，其各自通过引用整体并入本文。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性(Miller等人(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或衍生自其他物种的抗体。抗体是由免疫系统产生的能够识别并结合特定抗原的蛋白质。(Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immuno Biology，第5版，Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有多个结合位点，也称为表位，被多个抗体上的CDR(互补决定区)识别。与不同表位特异性结合的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有多于一种的相应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特异性结合目标靶标的抗原或其一部分的抗原结合位点的分子，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫性抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任何物种。然而，一方面，免疫球蛋白是人、鼠或兔来源的免疫球蛋白。
如本文所使用的术语“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；直链抗体；微抗体(Olafsen等人(2004)Protein Eng.Design&Sel.17(4):315-323)、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体、CDR(互补决定区)和上述中的任一者(其免疫特异性地结合至癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的表位结合片段、单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
本文所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群中获得的抗体，即，除了可能存在的少量天然存在的突变，该抗体群包含的单个抗体是相同的。单克隆抗体对单个抗原位点具有高特异性。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除特异性以外，单克隆抗体的优势还在于它们可以在不受其他抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本文所述主题使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人(1975)Nature,256:495描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见例如：US 4816567、US 5807715)。还可使用例如Clackson等人(1991)Nature,352:624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。
本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列以及这些抗体的片段相同或同源，只要它们表现出期望的生物学活性即可(US 4816567；以及Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。本文中的目标嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含来源于非人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变结构域抗原结合序列以及人恒定区序列。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在该抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别命名为α、δ、ε、γ和μ。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。在某些实施例中，如本文所述的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤5nm、≤4nM、≤3nM、≤2nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低、例如，10-8M至10- 13M、例如，10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
如本文所使用的术语“游离半胱氨酸氨基酸”是指已被工程改造到亲本抗体中，具有硫醇官能团(-SH)并且不配对为分子内或分子间二硫键的半胱氨酸氨基酸残基。如本文所使用的术语“氨基酸”是指甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或瓜氨酸。
“患者”或“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施例中，该患者或个体或受试者为人。在一些实施例中，患者可以为“癌症患者”，即患有一种或多种癌症症状或处于患有一种或多种癌症症状的风险的患者。
“患者人群”是指一组癌症患者。这样的人群可用于证明统计学上显著的药物功效和/或安全性。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长/增殖不受控制为特征的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。癌症的实例在本文其他地方提供。
如本文所使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程期间进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本文所述主题的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现期望治疗或预防结果的量。例如，药物的治疗癌症有效量可减少癌细胞的数量；减少肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓和优选地停止)癌细胞浸润周围器官；抑制(即，在一定程度上减缓和优选地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；以及/或在一定程度上缓解与癌症相关的症状中的一者或多者。在某种程度上，药物可阻止生长和/或杀死既存癌细胞，它可以抑制细胞生长和/或具有细胞毒性。有效量可以延长无进展存活期(例如，如根据实体瘤的应答评估标准，RECIST或CA-125改变来衡量)，导致客观应答(包括部分应答，PR或完全应答，CR)，增加总存活时间，以及/或改善一种或多种癌症症状(例如，如通过FOSI评定)。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应受试者相比导致治疗疾病、病症或副作用，或降低疾病或病症的进展率的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。为了用于治疗，可以将治疗有效量的Ab-CIDE及其盐作为原料化学品施用。另外，活性成分可以作为药物组合物存在。
术语“药物制剂”是指处于允许包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对于将被施用制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外组分的制剂。
“药用赋形剂”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药用赋形剂包括但不限于缓冲剂、载体、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，短语“药用盐”是指分子的药用有机或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、盐酸盐、溴酸盐、碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸酯、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐和巴莫酸盐(即，1,1’-亚甲基-二-(2-羟基-3-萘甲酸))盐。药用盐可包括包含另一种分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，药用盐在其结构中可以具有一个以上的带电原子。其中多个带电原子是药用盐的一部分的实例可以具有多个抗衡离子。因此，药用盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
其他非药用盐可用于制备本文所述的化合物，并且应将其视为形成本主题的另一方面。这些盐，例如草酸或三氟乙酸盐，虽然本身不是药用，但可用于制备用于获得本文所述化合物及其药用盐的中间体的盐。
如本文所使用的术语“烷基”是指具有一至五个碳原子的任何长度的饱和直链或支链单价烃基(C1-C5)，其中烷基可以任选地被一个或多个取代基独立地取代。在另一实施例中，烷基为一个、两个、三个、四个或五个碳原子。烷基基团的实例包括但不限于甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、二级丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)等。应理解，在每一端共价结合的烷基链可以形成如下所述的亚烷基链。
“卤素”或“卤代”是指占据元素周期表第VIIA族的原子，诸如氟、氯、溴或碘。
“卤代烷基”是指如上文中所定义的支化或非支化烷基基团，其中一个或多个(例如，1个至6个、或1个至3个)氢原子被卤素替代。例如，当残基被多于一个卤素取代时，其可以通过使用与所连接的卤素部分的数量相对应的前缀来指代。二卤代烷基和三卤代烷基是指经两个(“二”)或三个(“三”)卤代基团取代的烷基，该卤代基团可以是但不一定是相同的卤素。卤代烷基的实例包括例如三氟甲基、二氟甲基、氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。此外，“卤代-C1-C3烷基”是指其中至少一个氢原子被卤素替代的1至3个碳的烷基基团。此外，“卤代-C1-C6烷基”是指其中至少一个氢原子被卤素替代的1至6个碳的烷基基团。
如本文所使用的术语“亚烷基”是指具有一至十二个碳原子的任何长度的饱和直链或支链二价烃基(C1-C12)，其中亚烷基基团可以任选地独立地被下文所述的一个或多个取代基取代。在另一实施例中，亚烷基基团为一至八个碳原子(C1-C8)或一至六个碳原子(C1-C6)。亚烷基基团的实例包括但不限于亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)等。
术语“碳环”、“碳环基”、“碳环类环”和“环烷基”是指具有3至5个碳原子(C3-C5)作为单价非芳族、饱和或部分不饱和环。单环碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基等。碳环基基团可以任选地被一个或多个烷基基团独立地取代。
“芳基”是指具有单个环(例如，单环)或多个环(例如，双环或三环)(包括稠合系统)的芳族碳环基团。如本文所用，芳基具有6至20个环碳原子(即，C6-C20芳基)、6至12个碳环原子(即，C6-C12芳基)或6至10个碳环原子(即，C6-C10芳基)。芳基基团的实例包括例如苯基、萘基、芴基和蒽基。
“杂芳基”是指具有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的环杂原子的具有单个环、多个环或多个稠合环的芳族基团。如本文所用，杂芳基包括1至20个环碳原子(即，C1-C20杂芳基)、3至12个环碳原子(即，C3-C12杂芳基)或3至8个碳环原子(即，C3-C8杂芳基)，以及独立地选自氮、氧和硫的1至5个环杂原子、1至4个环杂原子、1至3个环杂原子、1至2个环杂原子或1个环杂原子。在某些情况下，杂芳基包括9元至10元环系统、6元至10元环系统、5元至10元环系统、5元至7元环系统或5元至6元环系统，各系统独立地具有独立地选自氮、氧和硫的1至4个环杂原子、1至3个环杂原子、1至2个环杂原子或1个环杂原子。杂芳基基团的实例包括例如吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻吩基(benzothienyl/benzothiophenyl)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并苯硫基、呋喃基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、异喹啉基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、噁唑基、1-氧代吡啶基、1-氧代嘧啶基、1-氧代吡嗪基、1-氧代哒嗪基、吩嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基和三嗪基。稠合杂芳环的实例包括但不限于苯并[d]噻唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并[b]噻吩基、吲唑基、苯并[d]咪唑基、吡唑并[1,5-a]吡啶基和咪唑并[1,5-a]吡啶基，其中杂芳基可以经由稠合体系的任一环连接。任何具有单个或多个稠合环且含有至少一个杂原子的芳族基团均被认为是杂芳基，无论其与分子的其余部分的连接(即，通过稠合环中的任一者)如何。杂芳基不涵盖如上定义的芳基或与如上定义的芳基重叠。
“杂环”、“杂环的”、“杂环烷基”或“杂环基”是指具有单环或多个稠环的饱和或部分不饱和基团，包括稠合、桥接或螺环系统，并且具有3至20个环原子，包括1至10个杂原子。这些环原子选自由碳、氮、硫或氧组成的组，其中，在稠合环系统中，环中的一个或多个可以是环烷基、芳基或杂芳基，条件是连接点通过非芳香环。在某些实施例中，杂环基团的氮和/或硫原子任选地被氧化以提供N-氧化物、-S(O)-或-SO2-部分。杂环的实例包括但不限于氮杂环丁烷、二氢吲哚、吲唑、喹嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、二氢吲哚、1,2,3,4-四氢异喹啉、噻唑烷、吗啉基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)(也称为硫代吗啉基(thiamorpholinyl))、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。杂环基基团可如WO2014/100762中所述被取代。
术语“手性”是指具有与镜像配偶体不重叠性的分子，而术语“非手性”是指与其镜像配偶体可重叠的分子。
术语“立体异构体”是指具有相同化学组成，但原子或基团在空间的排列不同的化合物。
“非对映异构体”表示具有两个或更多个手性中心并且其分子并非彼此镜像的立体异构体。非对映体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱特性和反应性。非对映异构体的混合物可以在高分辨率分析程序(诸如电泳和色谱法)下分离。
“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，所述两种立体异构体是彼此不可重叠的镜像。
本文中所用的立体化学定义和约定大致遵循：S.P.Parker编辑，McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；以及Eliel,E.和Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley&Sons,Inc.,New York。许多有机化合物以旋光活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光平面的能力。在描述光学活性化合物时，前缀D和L或R和S用于表示分子围绕其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的符号，其中(-)或1表示该化合物是左旋的。带有(+)或d前缀的化合物是右旋的。对于既定化学结构，这些立体异构体除了互为镜像外，是完全相同的。特定的立体异构体也可以被称为对映异构体，并且此类异构体的混合物通常被称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可能在化学反应或过程中没有立体选择或立体特异性的情况下发生。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种无旋光活性的对映体种类的等摩尔混合物。
本文中的其他术语、定义和缩写包括：野生型("WT")；半胱氨酸改造的突变抗体("thio")；轻链("LC")；重链("HC")；6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)；马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)；缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)，丙氨酸-苯丙氨酸苯丙氨酸(“ala-phe”)，对氨基苄基(“PAB”)和对氨基苄氧基羰基(“PABC”)；重链的A118C(EU编号)＝A121C(顺序编号)＝A114C(Kabat编号)轻链的K149C(Kabat编号)。
本文其他地方提供了其他定义和缩写。
II.可水解的接头
在实施例中，本文所述的主题涉及包含可水解的部分的拟肽接头，其中接头与CIDE或抗体和CIDE共价结合。在实施例中，拟肽接头的马来酰亚胺部分的可水解的部分包含具有式I的结构：
其中，
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基、苯基或苄基；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；并且
其中Q1为氢、其中R2为氢、卤代(C1-6)烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为拟肽接头的其余部分。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及具有以下结构的化合物：
L1-D
其中，
D为CIDE；
L1为与D共价连接且具有式I的结构的接头：
其中，
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基、苯基、苄基；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中，
t为0、1、2、3或4；并且
Q1为氢、其中R2为氢、卤代(C1-6)烷基或C1-6烷基；
并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2和–NH-C(NH)-NH2，其中，Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
在实施例中，L1-D选自由以下项组成的组：
并且
在某些实施例中，本文所述的主题涉及具有以下结构的抗体-CIDE缀合物：
Ab-(L1-D)j
其中，
Ab为抗体；
j为1至16；
D为CIDE；
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A的结构的接头：
其中，
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基、苯基、苄基；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代(C1-6)烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2和–NH-C(＝NH)-NH2，其中，Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及具有以下结构的抗体-CIDE缀合物：
Ab-((LX)-D)j
其中
Ab为抗体；
j为1至16；
D为CIDE；
LX选自由以下项组成的组：L1和L1h，其中LX的至少一个实例中存在L1h：
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A的结构的接头-1：
并且
L1h为与D共价结合且具有式I-B的结构的接头：
其中#指示位置a或b处的连接点；
在L1和L1h中，指示与抗体的连接点；
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基、苯基、苄基；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代(C1-6)烷基或C1-6烷基；
并且，
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2和-NH-C(＝NH)-NH2，其中，Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
在某些实施例中，Ab-((LX)-D)j为如上所述的Ab-CIDE，其包含至少一个与抗体共价结合且具有式I-B的结构的接头。
在某些实施例中，Ab-((LX)-D)j缀合物为Ab-(L1-D)j的完全或部分水解的产物。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及具有以下结构的抗体-接头缀合物：
Ab-(LZ)j
其中，
Ab为抗体；
j为1至16；
LZ选自由以下项组成的组：LX1和Lx-D，其中LZ的至少一个实例中存在LX1：
LX1与Ab共价结合且具有式I-G的结构：
并且，
Lx-D，其中LX选自由以下项组成的组：L1和L1h：
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A或式I-C的结构的接头-1：
并且，
L1h为与Ab以及与D共价结合且具有式I-B的结构的接头-1：
其中，#指示位置a或b处的连接点；
指示与抗体的连接点；
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基、苯基、苄基；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2和–NH-C(＝NH)-NH2，其中，Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
在某些实施例中，Ab-((Lz)j为如上所述的Ab-CIDE，其包含至少一个与抗体共价结合且具有式I-G的结构的接头。
在某些实施例中，Ab-((Lz)j缀合物为Ab-(L1-D)j的部分或完全裂解和/或部分或完全水解的产物。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，Q为：
其中，q为1、2、3或4。在某些实施例中，q为1、2或3。在某些实施例中，q为2。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，Q为：
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，R2为氢或C1-6烷基。在某些实施例中，R2为甲基、乙基、丙基或丁基。在某些实施例中，R2为甲基。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，Q1为：
在这些实施例的某些方面中，R2为氢或甲基。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，Q1为：
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，t为0。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，根据权利要求1所述的化合物，其中Z为-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4、5或6。在这些实施例的方面中，p为4、5或6。在这些实施例的方面中，p为5。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，Z为-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6。在这些实施例的方面中，p为1、2或3。在这些实施例的方面中，p为1。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，RA为氢或C1-6烷基。在这些实施例的方面中，RA为氢或甲基。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，RA为–(CH2)v-Ar，其中Ar为任选地经取代的芳基。在某些实施例中，Ar为C6-10芳基。在某些实施例中，Ar为C6芳基。在某些实施例中，v为0或1。在某些实施例中，芳基任选地被羟基或C1-3烷基取代一次或两次。在某些实施例中，RA为苯基或苄基。
在L1-A的某些实施例中，指示与D的PB的连接点。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，R7和R8各自为氢。
在式I、I-A、I-B、I-C和I-G的某些实施例中，RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基。在这些实施例的方面中，C3-6环烷基为环丁烷。
在某些实施例中，当w为0时，J为C1-5烷基，诸如甲基，并且L1、L1、LX或者LZ包含：
在某些实施例中，K为–CH(R)–，其中R为氢、C1-3亚烷基、-CH2O(CO)-、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与其所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基。在这些实施例的方面中，R为氢或C1-3烷基。在这些实施例的方面中，R为氢。在某些实施例中，K选自由以下项组成的组：
在实施例中，
Z为-(CH2)p-，其中p为2或5；
RA为氢或C1-6烷基；
Q为其中，q为2；
w为2或3；
J选自由以下项组成的组：C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自为C1-3烷基和–NH-C(O)-NH2；
K为C1-3亚烷基或–CH2-O-C(O)–；
RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自为氢。
在实施例中，
Z为-(CH2)p-，其中p为2或5；
RA为氢或C1-6烷基；
Q为其中t为0，并且Q1为其中R2为氢或C1-6烷基；
w为3；
J选自由以下项组成的组：C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自为C1-3烷基；
K为C1-3亚烷基或–CH2-O-C(O)–；
RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自为氢。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及具有以下结构的式II化合物：
其中
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1至24的整数；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，其中v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代(C1-6)烷基或C1-6烷基。
在式II的某些实施例中，Q为：
其中，q为1、2、3或4。在式II的某些实施例中，q为2。
在式II的某些实施例中，根据权利要求26所述的化合物，其中Q为：
其中t为0、1、2、3或4；Q1为氢、
其中，R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基。在式II的某些实施例中，R2为氢或C1-6烷基。在这些实施例的某些方面中，C1-6烷基为甲基。
在式II的某些实施例中，Q1为：
在式II的某些实施例中，R2为氢或甲基。
在式II的某些实施例中，Q1为：
在式II的某些实施例中，t为0。
在式II的某些实施例中，Z为-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4、5或6。在这些实施例的某些方面中，p为4、5或6。在这些实施例的某些方面中，p为5。
在式II的某些实施例中，Z为-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6。在这些实施例的某些方面中，p为1、2或3；或者p为1。
在式II的某些实施例中，RA为氢或C1-6烷基。在这些实施例的某些方面中，RA为氢或甲基。
在式II的某些实施例中，RA为苯基或苄基。
在某些实施例中，式II不包括其中：Q为-CH2CH2-，RA为氢且Z为-CH2CH2-的化合物；并且其中Q为–(CH2)3-，RA为氢且Z为-(CH2)3-的化合物；并且其中Q为-CH2CH2-，RA为甲基且Z为-CH2CH2-的化合物。
III.与可水解的接头共价结合的CIDE
化学降解诱导物(CIDE)分子与本文所述的可水解的含有马来酰亚胺的接头共价结合。在某些实施例中，CIDE包括降解剂，其为双功能分子，具有与蛋白质靶向部分连接的泛素结合部分，诸如在WO2017/201449、WO 2020/086858、US 7,208,157、US2014/0356322、US 2015/0291562、WO2017/030814、US2017/0008904、US 9,938,264、US 2019/300521、US2020/0038378、WO2021/067606和WO2021/207291中描述的那些。鉴于本文公开的主题，本领域技术人员将理解，可水解的接头与CIDE的连接点可以变化，并且可为CIDE上任何可用的连接点。
在某些实施例中，CIDE包括具有以下组分的那些：
a.E3泛素连接酶结合基团(E3LB)
E3泛素连接酶(在人中已知有600多种)赋予泛素化底物特异性。存在与这些连接酶结合的已知配体。如本文所述，E3泛素连接酶结合基团为可结合作为von Hippel-Lindau(VHL)的E3泛素连接酶的肽或小分子。
特定的E3泛素连接酶是von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制因子，它是E3连接酶复合物VCB的底物识别亚基，它也由延伸蛋白B和C、Cul2和Rbxl组成。VHL的主要底物是低氧诱导因子lα(HIF-lα)，这是一种转录因子，其可响应低氧水平上调基因，诸如促血管生成生长因子VEGF和红细胞诱导的细胞因子促红细胞生成素。
在某些实施例中，CIDE的E3LB部分可为任何已知的E3LB配体。在某些实施例中，本文所述的CIDE和缀合的CIDE不限于E3LB的类型，其中CIDE与如本文所述的可水解的接头共价连接。
E3LB部分的至少一端包含与L2部分共价连接或能够与该L2部分共价连接的部分，并且至少一端包含与L1部分共价连接或能够与该L1部分共价连接的部分。例如，E3LB部分终止于–NHCOOH部分，该–NHCOOH部分可通过酰胺键与L2部分共价连接。
在本文所述的任何方面或实施例中，如本文所述的E3LB可为其药用盐、对映体、非对映体、溶剂化物或多晶型物。此外，在本文所述的任何方面或实施例中，如本文所述的E3LB可经由键或通过化学接头直接偶联至PB。
在某些实施例中，E3LB包括包含如WO 2020/086858、WO2013/106643和WO2013/106646中所述的羟基脯氨酸部分的化合物，其各自通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，本文的主题涉及包含羟基脯氨酸的残基的E3LB部分：
其中，在全部实施例和子结构中，羟基可以任选地被另一基团诸如磷酸酯部分替代。
在某些实施例中，E3LB包含：
在某些实施例中，E3LB包含：
其中，A为与L2共价结合的基团。
在某些实施例中，E3LB包含：
其中，为与L2的连接点，并且
RA1、RA2和RA3各自独立地为氢或C1-5烷基；或者RA1、RA2和RA3中的两者与各自所连接的碳一起形成C1-5环烷基。
在某些实施例中，E3LB包含：
其中，
R2为氢或C1-5烷基；
Y1和Y2各自为-CH，或者Y1和Y2中的一者为-CH，且另一者为N；并且
R3为氰基、
在某些实施例中，E3LB包含：
在某些实施例中，E3LB包含：
在某些实施例中，E3LB具有其中R3为氰基的结构。
在某些实施例中，E3LB具有其中R3为的结构。
在某些实施例中，E3LB具有其中R3为的结构。
在某些实施例中，E3LB具有其中R3为的结构。
在某些实施例中，E3LB具有其中R2为氢、甲基、乙基或丙基的结构。
在某些实施例中，E3LB具有其中R2为甲基的结构。
在某些实施例中，E3LB具有其中R2为的结构。
在某些实施例中，E3LB的羟基脯氨酸部分具有以下结构：
E3LB部分的至少一个末端具有与L2部分共价连接或能够与该L2部分共价连接的部分，并且至少一个末端具有与L1部分共价连接或能够与该L1部分共价连接的部分。例如，E3LB部分终止于可通过酰胺键与L2部分共价连接的–NHCOOH部分。
在本文所述的任何方面或实施例中，如本文所述的E3LB可为其药用盐、对映体、非对映体、溶剂化物或多晶型物。
b.蛋白质结合基团(PB)
“蛋白质结合基团”或“PB”是指能够与靶蛋白或其他目标多肽靶标结合的小分子或其他化合物的残基。PB与靶标结合或以其他方式与靶标相互作用，其将靶标置于泛素连接酶附近，使得可能发生通过泛素连接酶进行的蛋白质或多肽的降解。PB可为任何分子，只要它与L2共价结合并且与目标靶标相互作用或结合。小分子靶蛋白结合部分的非限制性实例包括结合BRM(BRAHMA)的化合物、Hsp90抑制剂、Tau和雄激素受体(AR)、激酶抑制剂(诸如BRG1、AKT、HPK1和IRE1)、MDM2抑制剂、靶向含有人类BET溴结构域的蛋白质的化合物、HDAC抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂(诸如KDM5)、血管生成抑制剂、免疫抑制化合物以及靶向芳基烃受体(AHR)的化合物等等。在某些实施例中，本文所述的CIDE和缀合的CIDE不限于PB的类型。在某些实施例中，本文所述的CIDE和缀合的CIDE不限于PB的类型，其中CIDE与本文所述的可水解的接头共价连接。
在某些实施例中，CIDE的PB部分为与BRM(包括BRM的全部变体、突变、剪接变体、插入/缺失和融合物)结合的小分子部分。BRM也称为亚家族A、成员2、SMARCA2和BRAHMA。这样的小分子靶蛋白结合部分还包括这些组合物的药用盐、对映体、溶剂化物和多晶型物以及可靶向目标蛋白的其他小分子。本文所述的CIDE可包含已知的BRM结合化合物的任何残基，此类结合化合物包括WO2019/195201中所公开的那些，该专利全文通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，BRM结合化合物为式I化合物：
或其立体异构体或互变异构体，或前述任一者的药用盐，其中：选自由以下项组成的组：
(a)
(b)
(c)
(d)并且
(e)
其中，对于(a)至(e)，*表示与[X]的连接点，或者，如果[X]不存在，*表示与[Y]的连接点且**表示与苯环的连接点；并且其中：
(i)[X]为3元至15元杂环基或5元至20元杂芳基，
条件是，当为(a)时，则[X]不是 其中#表示与的连接点且##表示与L2的连接点，
[Y]不存在，并且
[Z]不存在；或者
(ii)[X]为3元至15元杂环基或5元至20元杂芳基，其中[X]的3元至15元杂环基任选地被一个或多个-OH或C1-6烷基取代，
[Y]不存在，并且
[Z]为3元至15元杂环基或5元至20元杂芳基，
条件是，当为(a)且[X]为时，其中&表示与的连接点且&&表示与[Z]的连接点，则[Z]不是 其中#表示与[X]的连接点且##表示与L2的连接点；或者
(iii)[X]为3元至15元杂环基或5元至20元杂芳基，
[Y]为亚甲基，其中[Y]的亚甲基任选地被一个或多个甲基基团取代，并且
[Z]为3元至15元杂环基；或者
(iv)[X]不存在，
[Y]为亚乙烯基，其中[Y]的亚乙烯基任选地被一个或多个卤代取代，并且
[Z]为5元至20元杂芳基，
条件是，为(a)、(b)、(d)或(e)；或者
(v)[X]不存在，
[Y]为亚乙炔基，并且
[Z]为5元至20元杂芳基，
条件是，为(a)、(b)、(d)或(e)；或者
(vi)[X]不存在，
[Y]为环丙基或环丁基，并且
[Z]为5元至20元杂芳基，
条件是，为(a)、(b)、(d)或(e)。
在某些实施例中，BRM结合化合物为式(I-A)化合物：
或其立体异构体或互变异构体，或前述任一者的药用盐，其中[X]、[Y]和[Z]如上文针对式(I)化合物所定义。
在某些实施例中，BRM结合化合物为式(I-B)化合物：
或其立体异构体或互变异构体，或前述任一者的药用盐，其中[X]、[Y]和[Z]如上文针对式(I)化合物所定义。
在某些实施例中，BRM结合化合物为式(I-C)化合物：
或其立体异构体或互变异构体，或前述任一者的药用盐，其中[X]、[Y]和[Z]如上文针对式(I)化合物所定义。
在某些实施例中，BRM结合化合物为式(I-M)化合物：
或其立体异构体或互变异构体，或前述任一者的药用盐，其中[X]、[Y]和[Z]如上文针对式(I)化合物所定义。
在某些实施例中，BRM结合化合物为式(I-E)化合物：
或其立体异构体或互变异构体，或前述任一者的药用盐，其中[X]、[Y]和[Z]如上文针对式(I)化合物所定义。
在某些实施例中，CIDE的PB(BRM)部分具有以下结构：
其中，为与L2的共价连接点。
c.接头L2
如本文所述的CIDE的E3LB和PB部分可以与接头(L2、接头L2、接头-2)连接。在某些实施例中，接头L2与E3LB部分共价结合并与PB部分共价结合，从而构成CIDE。
在某些实施例中，L2部分可以选自WO2019/195201中公开的接头，该专利全文通过引用整体并入本文。
尽管E3LB基团和PB基团可以通过对接头的化学性质合适和稳定的任何基团与接头共价连接，在某些方面，L2通过酰胺、酯、硫酯、酮基、氨基甲酸酯(尿烷)或醚独立地与E3LB基团和PB基团共价键合，每个基团都可以插入E3LB基团和PB基团上的任何位置，以使E3LB基团与泛素连接酶结合，而PB基团与待降解的BRM靶蛋白质结合。换言之，如本文所示，接头可以设计并连接至E3LB和PB，以调控E3LB和PB与它们各自的结合配偶体的结合。
在某些实施例中，L2为与E3LB和PB共价结合的接头，该L2具有下式：
其中，
R4为氢或甲基，
其中，
z为一或零，
G为或—C(O)NH—；并且
为与PB的连接点。
在L2a的某些实施例中，R4为氢。
在L2a的某些实施例中，R4为甲基。
在L2a的某些实施例中，R4为甲基，使得甲基相对于其所连接的哌嗪取向如下：
在L2c的某些实施例中，z为零。
在L2c的某些实施例中，z为一。
IV.与可水解的接头共价结合的抗体
现在提及抗体-可水解的接头缀合物和抗体-可水解的接头-CIDE缀合物，此类缀合物可包含单个抗体，其中该单个抗体可具有超过一个可水解的接头和/或可水解的接头-CIDE。抗体与可水解的接头(L1、LX或LZ)共价结合。缀合物选自如本文别处所述的以下式：
Ab-(L1-D)j；
Ab-((Lx)-D)j；以及，
Ab-(Lz)j。
如本文所述，抗体(例如单克隆抗体(mAB))用于将CIDE递送至靶细胞，例如表达由抗体靶向的特定蛋白质的细胞。Ab-CIDE的抗体部分可靶向表达抗原的细胞，从而通常通过内吞作用将抗原特异性Ab-CIDE经胞内递送至靶细胞。在一些情况下，胞饮作用或类似的非特异性摄取途径可能导致抗原表达或非表达细胞内对Ab-CIDE的一般细胞摄取。本文所述的Ab-CIDE及其使用方法有利地利用细胞表面的抗体识别和/或Ab-CIDE的内吞作用将CIDE部分递送到细胞内。抗体在WO2020/086858中有所描述，其通过引用整体并入本文。
在特定实施例中，抗体可以经突变以降低效应子功能。调控Fc效应子功能的突变的实例包括LALAPG突变和NG2LH突变。
在特定实施例中，该抗体为如先前在WO2016/04856中描述的THIOMABTM。此外，考虑到组合，使得任何抗体靶标可以与THIOMABTM突变与或不与包括LALAPG或NG2LH突变的任何Fc效应子调控的任何适合的组合组合。
该抗体可为人抗体，例如，如van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368--74(2001)；以及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中一般地描述。抗体可为文库衍生的抗体。本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有期望结合特征的抗体。此类方法综述于，例如，Hoogenboom等人in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等人编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2001)并进一步描述于，例如，McCafferty等人，Nature 348:552-554；Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury,in Methods in Molecular Biology 248:161-175(Lo编辑,HumanPress,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
抗体可为嵌合抗体和人源化抗体。人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619--1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36:25-34(2005)(描述了SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面再塑”)；Dall'Acqua等人，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人，Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“指导选择”方法)中。
抗体可为多特异性抗体，例如双特异性抗体。如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含具有多表位特异性的抗原结合结构域的抗体(即，能够结合一个分子上的两个或更多个不同表位，或能够结合两个或更多个不同分子上的表位)。如本文所用，术语“双特异性抗体”是包含抗原结合结构域的多特异性抗体，其能够特异性结合一个生物分子上的两个不同表位或能够特异性结合两个不同生物分子上的表位。双特异性抗体在本文中也可以被称为具有“双重特异性”或为“双重特异性的”。示例性的双特异性抗体可以结合蛋白质和任何其他抗原。制备多特异性抗体的技术包括但不限于，具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983),WO 93/08829和Traunecker等人，EMBO J.10:3655(1991))，和“杵臼结构”工程改造(参见例如，美国专利号5,731,168、WO2009/089004、US2009/0182127、US2011/0287009，Marvin和Zhu,ActaPharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658，以及Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.,26:1-9)。还可以通过工程改造静电操纵效应来制备多特异性抗体，以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见，例如，美国专利号4,676,980，以及Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见，例如，Kostelny等人，J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见，例如，Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见，例如Gruber等人，J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备如例如在Tutt等人，J.Immunol.147:60(1991)中所述的三特异性抗体。本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的改造的抗体，包括“章鱼抗体”或“双可变结构域免疫球蛋白”(DVD)(参见，例如，US2006/0025576A1和Wu等人NatureBiotechnology(2007))。)。本文抗体或片段也包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含与靶蛋白和另一不同抗原结合的抗原结合位点(参见，例如，US2008/0069820)。
抗体可为抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、和scFv片段，以及下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见，例如，Pluckthün,in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，(Springer-Verlag,New York)，第269-315页(1994)；另见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。对于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab片段和F(ab')2片段的讨论，参阅美国专利号5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价或双特异性的。参见，例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体也在Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中进行了描述。单结构域抗体为包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，美国专利号6,248,516B1)。抗体片段可通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及由重组宿主细胞产生。
抗体可为抗体变体。在某些实施例中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内残基的缺失、和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以实现最终构建体，前提条件是最终构建体具有期望特征，例如,抗原结合。
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在美国专利号4,816,567中所述。现在参考抗体亲和力，在实施例中，抗体与一个或多个肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合。
在某些实施例中，肿瘤相关抗原或细胞表面抗原选自CD71、Trop2、MSLN、NaPi2b、Ly6E、EpCAM和CD22。因此，在某些实施例中，Ab-CIDE可包含选自以下的抗体或片段：抗Ly6E抗体、抗NaPi2b抗体、抗CD22抗体、抗CD71抗体、抗Trop2抗体、抗MSLN抗体、抗EpCAM抗体、抗Steap1抗体、抗CD33抗体和抗HER2抗体。
特定抗体包括但不限于：
i.抗Ly6E抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE可包含抗Ly6E抗体：Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物、基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；NP_002337.1；NM_002346.2；de Nooij-van Dalen,A.G.等人(2003)Int.J.Cancer 103(6),768-774；Zammit,D.J.等人(2002)Mol.Cell.Biol.22(3):946-952；WO 2013/17705。
Ly6E为一种GPI连接的、长度为131个氨基酸、约8.4kDa的功能未知的蛋白质，无已知的结合配偶体。其最初被鉴定为在小鼠的未成熟胸腺细胞，胸腺髓质上皮细胞中表达的转录物(Mao等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:5910-5914)。在一些实施例中，本文所述的主题提供一种Ab-CIDE，其包含在PCT公开号WO 2013/177055中描述的抗Ly6E抗体。
ii.抗NaPi2b抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE包含抗NaPi2b抗体：Napi2b(Napi3b，NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，第II型钠依赖性磷酸盐转运子3b，Genbank登录号NM_006424)J.Biol.Chem.277(22):19665-19672(2002)，Genomics 62(2):281-284(1999)，Feild，J.A.等人(1999)Biochem.Biophys.Res.Commun.258(3):578-582)；WO2004022778(权利要求2)；EP1394274(实例11)；WO2002102235(权利要求13；第326页)；EP875569(权利要求1；第17-19页)；WO200157188(权利要求20；第329页)；WO2004032842(实例IV)；WO200175177(权利要求24；第139-140页)；交叉引用：MIM:604217；NP_006415.1；NM_006424_1。
iii.抗CD22抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE可包含抗CD22抗体：CD22(B细胞受体CD22-B同种型，BL-CAM，Lyb-8，Lyb8，SIGLEC-2，FLJ22814，Genbank登录号AK026467)；Wilson等人(1991)J.Exp.Med.173:137-146；WO2003072036(权利要求1；图1)；交叉引用：MIM:107266；NP_001762.1；NM_001771_1。
iv.抗CD71抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE可包含抗CD71抗体。CD71(转铁蛋白受体)是一种完整的膜糖蛋白，在细胞摄取铁中起重要作用。众所周知，它是细胞增殖和活化的标志物。虽然造血系统中的所有增殖细胞都表达CD71，但是，CD71已被认为是一种有用的红细胞相关抗原。在一个实施例中，抗CD71抗体描述于以下文献中：WO2016081643，其通过引用整体并入本文。
v.抗Trop2抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE可包含抗Trop2抗体。Trop2(滋养细胞抗原2)是一种跨膜糖蛋白，是一种在多种癌症中存在表达差异的细胞内钙信号转导蛋白。它向细胞发出自我更新、增殖、侵袭和存活的信号。Trop 2又成为细胞表面糖蛋白Trop-2/Trop2、胃肠道肿瘤相关抗原GA7331、胰腺癌标志物蛋白GA733-1/GA733、膜成分染色体1表面标志物1M1S1、上皮糖蛋白-1、EGP-1、CAA1、胶滴状角膜营养不良GDLD和TTD2。在以上实施例中的任一项中，Ab-CIDE的抗Trop2抗体是人源化的。在一个实施例中，抗Trop2抗体描述于US-2014/0377287和US-2015/0366988中，其各自通过引用整体并入本文。
vi.抗MSLN抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE可包含抗MSLN抗体。MSLN(间皮素)是一种糖基磷脂酰肌醇锚定细胞表面蛋白，可用作细胞粘附蛋白。MSLN也称为CAK1和MPF。这种蛋白质在上皮间皮瘤、卵巢癌和特定鳞状细胞癌中过度表达。在上述实施例中的任一项中，Ab-CIDE的抗MSLN抗体经人源化。在一个实施例中，抗MSLN抗体为Scales,S.J.等人，Mol.CancerTher.2014,13(11),2630-2640中所述的h7D9.v3，其通过引用整体并入本文。
vii.抗EpCAM抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE可包含抗EpCAM抗体。在一个方面中，Ab-CIDE的抗体可以是针对在多种细胞或组织类型上发现的蛋白质的抗体。此类抗体的实例包括EpCAM。上皮细胞粘附分子(EpCAM)是一种跨膜糖蛋白，其介导上皮细胞中不依赖Ca2+的同型细胞间粘附(Litvinov,S.等人(1994)Journal of Cell Biology 125(2):437–46)。也称为DIAR5、EGP-2、EGP314、EGP40、ESA、HNPCC8、KS1/4、KSA、M4S1、MIC18、MK-1、TACSTD1、TROP1，EpCAM也参与细胞信号传导(Maetzel,D.等人(2009)Nature Cell Biology 11(2):162–71)、迁移(Osta,WA；等人(2004)Cancer Res.64(16):5818–24)、增殖和分化(Litvinov,S.等人(1996)Am JPathol.148(3):865–75)。另外，EpCAM通过上调c-myc、e-fabp和细胞周期蛋白A和E的能力而具有致癌能力(Munz,M.等人(2004)Oncogene23(34):5748–58)。由于EpCAM仅在上皮和上皮来源的赘生物中表达，因此EpCAM可以用作各种癌症的诊断标记。换言之，Ab-CIDE可用于将CIDE递送至许多细胞或组织，而不是像使用靶向抗体那样将CIDE递送至特定细胞类型或组织类型。
viii.抗Steap1抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE包含抗STEAP1抗体。STEAP1(前列腺六跨膜上皮抗原，Genbank登录号NM_0 12449)Cancer Res.6 1(15),5857-5860(2001)，Hubert,R.S.,等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96(25):14523-14528)；W02004065577(权利要求6)；W02004027049(图1L)；EP1394274(实例11)；W02004016225(权利要求2)；W02003042661(权利要求12)；US2003 157089(实例5)；US2003185830(实例5)；US2003064397(图2)；WO200289747(实例5；第618-619页)；W02003022995(实例9；图13A，实例53；第173页，实例2；图2A)。
viii.抗Steap2抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE包含抗STEAP2抗体。STEAP2(HGNC 8639、IPCA-l、PCANAP1、STAMPl、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺的六跨膜上皮抗原2、六跨膜前列腺蛋白、Genbank登录号AF455138)Lab.Invest.82(11):1573 1582(2002))；W02003087306；US2003064397(权利要求1；图1)；WO200272596(权利要求13；第54-55页)；WO200172962(权利要求1；图4B)；W02003 104270(权利要求11)；W02003 104270(权利要求16)；US2004005598(权利要求22)；W02003042661(权利要求12)；US2003060612(权利要求12；图10)；WO200226822(权利要求23；图2)；WO200216429(权利要求12；图10)；交叉引用：GF22655488；AAN04080.1；AF455l38_I。
x.抗Her2抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE包含抗HER2抗体。在一个实施例中，Ab-CIDE的抗HER2抗体包含人源化抗HER2抗体。在一些实施例中，Ab-CIDE包含人源化HER2抗体，也称为曲妥珠单抗(trastuzumab)，可在商品名下商购获得。在另一实施例中，Ab-CIDE的抗HER2抗体包含人源化抗HER2抗体，例如，人源化2C4，如US7862817中所述。示例性人源化2C4抗体为帕妥珠单抗(pertuzumab)，可在商品名下商购获得。
x.抗CD33抗体
在某些实施例中，Ab-CIDE包含抗CD33抗体。CD33为唾液酸结合、免疫球蛋白样凝集素家族的成员，为一种67kDa糖基化跨膜蛋白。除了定型的骨髓单核细胞和红系祖细胞外，CD33还可以在大多数髓样和单核细胞白血病细胞上表达。在最早的多能干细胞、成熟的粒细胞、淋巴样细胞或非造血细胞上未发现它(Sabbath等人，(1985).Clin.Invest.75:756-56；Andrews等人，(1986)Blood 68:1030-5)。CD33在其胞质尾上包含两个酪氨酸残基，每个残基后面都是疏水残基，类似于在许多抑制受体中看到的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。
具体参考抗体-可水解的接头-CIDE(D)缀合物，“CIDE载量”(CIDE/抗体比率、“DAR”或j，如上所述)为每个抗体的CIDE部分的平均数量。CIDE载量可在每个抗体(Ab)1至20个CIDE(D)的范围内。换言之，在Ab-CIDE式Ab―(L1―D)j中，j表示与抗体连接的CIDE的数量且具有约1至约20、约1至约16、约1至约10、约2至约8或约4至约7的值。在实施例中，j为约6。在实施例中，m为约13或14。通过接头L1与抗体共价连接的每个CIDE可以是相同或不同的CIDE，并且可以具有与任何其他共价连接至抗体的L1相同或不同类型的接头。在某些实施例中，Ab为半胱氨酸工程改造的抗体。
通过缀合反应得到的Ab-CIDE制剂中每个抗体的CIDE的平均数量可通过常规方法诸如质谱、ELISA测定、电泳和HPLC进行表征。也可以测定以j表示的Ab-CIDE的定量分布。通过ELISA，可以确定Ab-CIDE的特定制剂中j的平均值(Hamblett等人(2004)Clin.CancerRes.10:7063-7070；Sanderson等人(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852)。然而，通过抗体-抗原结合和ELISA的检测限制不能辨别j值的分布。同样，用于检测Ab-CIDE的ELISA测定不能确定CIDE部分在何处与抗体连接，例如重链或轻链片段或特定的氨基酸残基。在一些情况下，在其中j为由具有其他CIDE载量的Ab-CIDE得到的特定值的同质Ab-CIDE的分离、纯化和表征可通过诸如反相HPLC或电泳的方法实现。
对于一些Ab-CIDE，j可能受抗体上连接位点数量的限制。例如，抗体可仅具有一个或几个半胱氨酸硫醇基，或者可仅具有一个或几个具有足够高的反应性的硫醇基团，通过这些基团可连接接头。Ab上连接L1-D的另一个反应位点是赖氨酸残基的胺官能团。
通常，在缀合反应过程中，少于理论最大值的CIDE部分与抗体缀合。例如，抗体可包含许多不与接头L1-CIDE基(L1-D)或接头试剂反应的赖氨酸残基。仅反应性最强的赖氨酸基团才可与胺反应性接头试剂反应。另外，仅反应性最强的半胱氨酸硫醇基团才可与硫醇反应性接头试剂或接头L1-CIDE基团反应。通常，抗体不包含许多(如果有的话)可与CIDE部分连接的游离和反应性半胱氨酸硫醇基团。化合物的抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫键形式存在，且必须在部分或完全还原条件下用还原剂(诸如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP)还原。然而，可以通过数种不同的方式控制CIDE载量，包括：(i)限制接头L1-CIDE基团或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，以及(iii)针对半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。
现在参考如本文所述的Ab-CIDE和L1-CIDE化合物，它们可以固体或液体形式存在。在固态下，它可以以结晶或非结晶形式或其混合物形式存在。技术人员将理解，可以形成用于结晶或非结晶化合物的药用溶剂化物。在结晶溶剂化物中，在结晶过程中将溶剂分子掺入到晶格中。溶剂化物可以涉及非水溶剂，例如但不限于乙醇、异丙醇、DMSO、乙酸、乙醇胺或乙酸乙酯，或者它们可以涉及水作为掺入到晶格中的溶剂。其中水为掺入到晶格中的溶剂的溶剂化物通常称为“水合物”。水合物包括化学计量的水合物以及含有可变量的水的组合物。本文所述的主题包括所有这样的溶剂化物。
本领域技术人员将进一步理解，本文所述的某些以结晶形式存在的化合物和Ab-CIDE，包括其各种溶剂化物，可表现出多态性(即在不同晶体结构中发生的能力)。这些不同的晶体形式通常称为“多晶型物”。本文公开的主题包括所有这样的多晶型物。多晶型物具有相同的化学组成，但在堆积、几何排列和结晶固态的其它描述性性质有所不同。因此，多晶型物可具有不同的物理性质，例如形状、密度、硬度、可变形性、稳定性和溶解性质。多晶型物通常表现出不同的熔点，IR光谱和X射线粉末衍射图，可用于鉴定。本领域技术人员将理解，例如可以通过改变或调节用于制备化合物的反应条件或试剂来产生不同的多晶型物。例如，温度、压力或溶剂的变化可以导致多晶型物。另外，在某些条件下，一种多晶型物可自发转化为另一种多晶型物。
本文所述的化合物和Ab-CIDE或其盐可以以立体异构体形式存在(例如，其含有一个或多个不对称碳原子)。各种立体异构体(对映异构体和非对映异构体)及其混合物包括在本文所公开的主题范围内。同样，应当理解，式(I)化合物或盐可以除式中所示的结构以外的互变异构形式存在，并且也包括在本文所公开的主题范围内。应当理解，本文公开的主题包括本文所述的特定组的所有组合和子集。本文所公开的主题范围包括立体异构体的混合物以及纯化的对映异构体或对映体/非对映体富集的混合物。应当理解，本文公开的主题包括本文上述定义的特定组的所有组合和子集。
本文所公开的主题还包括本文所述的化合物的同位素标记的形式，但事实上，一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子所取代。可掺入本文所述的化合物及其药用盐的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如2H、3H、11C、13C、14C、15N、17O、18O、31P、32P、35S、18F、36Cl、123I和125I。
包含前述同位素和/或其他原子的其他同位素的如本文公开的化合物和Ab-CIDE及其药用盐在本文公开的主题的范围内。本文公开了同位素标记的化合物，例如其中掺入有放射性同位素(例如3H、14C)的那些化合物，可用于药物和/或底物组织分布测定。常用氚化(即3H)和碳-14(即14C)同位素，因为它们易于制备和检测。11C和18F同位素可用于PET(正电子发射断层扫描)，而125I同位素可用于SPECT(单光子发射计算机断层扫描)，所有这些都可用于脑成像。进一步地，用较重的同位素诸如氘(即，2H)取代可以提供由于代谢稳定性更高(例如，体内半衰期增加或剂量减少要求)而带来的某些治疗优势，因此在某些情况下是优选的。同位素标记的化合物通常可以通过执行以下方案和/或实例中公开的程序(通过将非同位素标记的试剂替换为容易获得的同位素标记的试剂)来制备。
本文公开的主题包括以下非限制性实施例：
1.一种化合物，其具有以下结构：
L1-D
其中，
D为CIDE；
L1为与D共价结合且具有式I的结构的接头-1：
其中，
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1至24的整数；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，其中，v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中，q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：-C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2和–NH-C(＝NH)-NH2，其中，Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
2.根据实施例1所述的化合物，其中Q为：
其中q为1、2、3或4。
3.根据实施例1或2所述的化合物，其中q为2。
4.根据实施例1所述的化合物，其中Q为：
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基。
5.根据实施例4所述的化合物，其中R2为氢或C1-6烷基。
6.根据实施例5所述的化合物，其中C1-6烷基为甲基。
7.根据实施例4所述的化合物，其中Q1为：
8.根据实施例4所述的化合物，其中R2为氢或甲基。
9.根据实施例权利要求8所述的化合物，其中Q1为：
10.根据实施例4至9中任一项所述的化合物，其中t为0。
11.根据实施例1至10中任一项所述的化合物，其中Z为-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4、5或6。
12.根据实施例11所述的化合物，其中p为4、5或6。
13.根据实施例11所述的化合物，其中p为5。
14.根据实施例1至10中任一项所述的化合物，其中Z为-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6。
15.根据实施例14所述的化合物，其中p为1、2或3。
16.根据实施例14所述的化合物，其中p为1。
17.根据实施例1至16中任一项所述的化合物，其中RA为氢或C1-6烷基。
18.根据实施例17所述的化合物，其中RA为氢或甲基。
19.根据实施例1至16中任一项所述的化合物，其中RA为苯基或苄基。
20.根据实施例1至19中任一项所述的化合物，其中R7和R8各自为氢。
21.根据实施例1至20中任一项所述的化合物，其中RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中C3-6环烷基为环丁烷。
23.根据实施例1至22中任一项所述的化合物，其中K为–CH(R)–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基。
24.根据实施例23所述的化合物，其中R为氢或C1-3烷基。
25.根据实施例24所述的化合物，其中R为氢。
26.一种抗体-CIDE缀合物，其具有以下结构：
Ab-(L1-D)j
其中，
Ab为抗体；
j为1至16；
D为CIDE；
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A的结构的接头-1：
其中，
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1至24的整数；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，其中v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2和–NH-C(＝NH)(NH2)，其中，Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
27.根据实施例26所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q为：
其中q为1、2、3或4。
28.根据实施例26或27所述的抗体-CIDE缀合物，其中q为2。
29.根据权利要求26所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q为：
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基。
30.根据实施例29所述的抗体-CIDE缀合物，其中R2为氢或C1-6烷基。
31.根据实施例30所述的抗体-CIDE缀合物，其中C1-6烷基为甲基。
32.根据实施例29所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q1为：
33.根据实施例29所述的抗体-CIDE缀合物，其中R2为氢或甲基。
34.根据实施例33所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q1为：
35.根据实施例29至34中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中t为0。
36.根据实施例26至35中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中Z为-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4、5或6。
37.根据实施例36所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为4、5或6。
38.根据实施例36所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为5。
39.根据实施例26至35中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中Z为-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6。
40.根据实施例39所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为1、2或3。
41.根据实施例39所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为1。
42.根据实施例26至41中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为氢或C1-6烷基。
43.根据实施例42所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为氢或甲基。
44.根据实施例26至41中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为苯基或苄基。
45.根据实施例26至44中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中R7和R8各自为氢。
46.根据实施例26至45中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基。
47.根据实施例46所述的抗体-CIDE缀合物，其中C3-6环烷基为环丁烷。
48.根据实施例26至47中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中K为–CH(R)-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基。
49.根据实施例48所述的抗体-CIDE缀合物，其中R为氢或C1-3烷基。
50.根据实施例49所述的抗体-CIDE缀合物，其中R为氢。
51.一种药物组合物，其包含根据实施例26至50中任一项所述的缀合物以及一种或多种药用赋形剂。
52.一种治疗有此需要的人的疾病的方法，该方法包括向所述人施用有效量的根据实施例26至50或57至108中任一项所述的缀合物(或其组合物)或根据实施例51所述的组合物；或者，根据实施例26至50或57至108中任一项所述的缀合物(或其组合物)或根据实施例51所述的组合物，其用于治疗有此需要的人的疾病；或者，根据实施例26至50或57至108中任一项所述的缀合物(或其组合物)或根据实施例51所述的药物组合物用于制备的用途，该药物用于治疗有此需要的人的疾病。
53.根据实施例52所述的方法，其中所述疾病为癌症。
54.根据实施例53所述的方法，其中所述癌症具有BRM依赖性。
55.根据实施例54所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌。
56.一种降低受试者的靶蛋白质的水平的方法，该方法包括：
向所述受试者施用根据实施例26至50或58至108中任一项所述的缀合物(或其组合物)或根据实施例51所述的组合物，其中所述D结合所述靶蛋白，其中泛素连接酶实现所述结合的靶蛋白的降解，其中所述靶蛋白的水平降低。
58.一种抗体-CIDE缀合物，其具有以下结构：
Ab-((LX)-D)j
其中，
Ab为抗体；
j为1至16；
D为CIDE；
LX选自由以下项组成的组：L1和L1h，其中LX的至少一个实例中存在L1h：
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A的结构的接头-1：
并且，
L1h为与D共价结合且具有式I-B的结构的接头-1：
其中，#指示位置a或b处的连接点；
在L1和L1h中，指示与抗体的连接点；
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，其中v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：-C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2、–NH-C(＝NH)-NH2，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
59.根据实施例58所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q为：
其中q为1、2、3或4。
60.根据实施例58或59所述的抗体-CIDE缀合物，其中q为2。
61.根据实施例58所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q为：
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基。
62.根据实施例61所述的抗体-CIDE缀合物，其中R2为氢或C1-6烷基。
63.根据实施例62所述的抗体-CIDE缀合物，其中C1-6烷基为甲基。
64.根据实施例61所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q1为：
65.根据实施例61所述的抗体-CIDE缀合物，其中R2为氢或甲基。
66.根据实施例权利要求65所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q1为：
67.根据实施例61至66中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中t为0。
68.根据实施例58至67中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中Z为-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4、5或6。
69.根据实施例68所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为4、5或6。
70.根据实施例68所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为5。
71.根据实施例58至67中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中Z为-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6。
72.根据实施例71所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为1、2或3。
73.根据实施例71所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为1。
74.根据实施例58至73中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为氢或C1-6烷基。
75.根据实施例74所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为氢或甲基。
76.根据实施例58至73中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为苯基或苄基。
77.根据实施例58至76中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中R7和R8各自为氢。
78.根据实施例58至77中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基。
79.根据权利要求78所述的抗体-CIDE缀合物，其中C3-6环烷基为环丁烷。
80.根据实施例58至79中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中K为–CH(R)–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基。
81.根据实施例80所述的抗体-CIDE缀合物，其中R为氢或C1-3烷基。
82.根据实施例81所述的抗体-CIDE缀合物，其中R为氢。
83.一种抗体-缀合物，其具有以下结构：
Ab-(LZ)j
其中，
Ab为抗体；
j为1至16；
LZ选自由以下项组成的组：LX1和Lx-D，其中LZ的至少一个实例中存在LX1：
LX1与Ab共价结合且具有式I-G的结构：
并且，
Lx-D，其中LX选自由以下项组成的组：L1和L1h：
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A或式I-C的结构的接头-1：
并且
L1h为与D共价结合且具有式I-B的结构的接头-1：
其中，#指示位置a或b处的连接点；
指示与抗体的连接点；
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，其中，v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：-C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2、–NH-C(＝NH)-NH2，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
85.根据实施例84所述的抗体-缀合物，其中Q为：
其中q为1、2、3或4。
86.根据实施例84或85所述的抗体-缀合物，其中q为2。
87.根据实施例84所述的抗体-缀合物，其中Q为：
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基。
88.根据实施例87所述的抗体-缀合物，其中R2为氢或C1-6烷基。
89.根据实施例88所述的抗体-缀合物，其中C1-6烷基为甲基。
90.根据实施例87所述的抗体-缀合物，其中Q1为：
91.根据实施例87所述的抗体-缀合物，其中R2为氢或甲基。
92.根据实施例91所述的抗体-缀合物，其中Q1为：
93.根据实施例87至92中任一项所述的抗体-缀合物，其中t为0。
94.根据实施例84至93中任一项所述的抗体-缀合物，其中Z为-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4、5或6。
95.根据实施例94所述的抗体-缀合物，其中p为4、5或6。
96.根据实施例94所述的抗体-缀合物，其中p为5。
97.根据实施例84至93中任一项所述的抗体-缀合物，其中Z为-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6。
98.根据实施例87所述的抗体-缀合物，其中p为1、2或3。
99.根据实施例87所述的抗体-缀合物，其中p为1。
100.根据实施例84至99中任一项所述的抗体-缀合物，其中RA为氢或C1-6烷基。
101.根据实施例100所述的抗体-缀合物，其中RA为氢或甲基。
102.根据实施例84至99中任一项所述的抗体-缀合物，其中RA为苯基或苄基。
103.根据实施例84至102中任一项所述的抗体-缀合物，其中R7和R8各自为氢。
104.根据实施例84至103中任一项所述的抗体-缀合物，其中RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基。
105.根据权利要求104所述的抗体-缀合物，其中C3-6环烷基为环丁烷。
106.根据实施例84至105中任一项所述的抗体-缀合物，其中K为–CH(R)–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基。
107.根据实施例106所述的抗体-缀合物，其中R为氢或C1-3烷基。
108.根据实施例107所述的抗体-缀合物，其中R为氢。
109.一种制备包含至少6的DAR的Ab缀合物的方法，该方法包括：
使式IA、式IC或式II化合物与抗体接触以制备包含至少6的DAR的Ab-缀合物。
110.根据实施例109所述的方法，其中DAR为约6至约16，或约8至约14，或6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。
具有结构L1-D的非限制性示例性化合物为：
具有结构Ab-((LX)-D)j的非限制性示例性化合物为：
具有结构Ab-(LZ)j的非限制性示例性化合物为：
式II化合物的非限制性实例为
在某些实施例中，本文所述的主题包括以下L1-CIDE，其残基可包括在某些Ab-Hy-B-CIDE中：
V.制剂
可制备如本文所述的治疗性Ab-CIDE的药物制剂用于肠胃外施用，例如与药用肠胃外载体一起并且可以单位剂量注射形式推注、静脉内、肿瘤内注射。具有期望纯度的Ab-CIDE任选地与一种或多种药用赋形剂(Remington's Pharmaceutical Sciences(1980)，第16版，Osol,A.编辑)，以用于重构的冻干制剂形式或水溶液的形式混合。
Ab-CIDE可根据标准药学实践配制为药物组合物。根据该方面，提供了一种药物组合物，其包含与一种或多种药用赋形剂结合的Ab-CIDE。
通过将Ab-CIDE与赋形剂(诸如载体和/或稀释剂)混合来制备典型的制剂。合适的载体、稀释剂和其它赋形剂是本领域技术人员众所周知的，并且包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或可溶胀聚合物的材料、亲水或疏水材料、明胶、油、溶剂，水等。所使用的特定载体、稀释剂或其他赋形剂将取决于Ab-CIDE被施用的方式和目的。通常基于本领域技术人员公认对哺乳动物施用安全的溶剂(GRAS)来选择溶剂。
通常，安全溶剂是无毒的水性溶剂，例如水和其他可溶于水或与水混溶的无毒溶剂。合适的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如PEG 400、PEG 300)等及其混合物。可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在使用的剂量和浓度下对受体无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
制剂还可包含一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、加香剂、调味剂和其他已知的添加剂，以提供美观的Ab-CIDE展示或有助于药物产品的制备。可使用常规的溶解和混合程序来制备制剂。
可通过在环境温度下以适当的pH值和期望的纯度与生理上可接受的载体(即，在所采用的剂量和浓度下对受体无毒的载体)混合以进行配制。制剂的pH主要取决于化合物的具体用途和浓度，但是可在约3至约8的范围内。在pH 5的乙酸盐缓冲液中的制剂是合适的实施方案。
Ab-CIDE制剂可为无菌的。特别地，待用于体内施用的制剂必须为无菌的。此类灭菌通过无菌过滤膜过滤很容易实现。
Ab-CIDE通常可作为固体组合物、冻干制剂或作为水溶液储存。
包含Ab-CIDE的药物组合物可按符合良好医疗实践的方式，即用量、浓度、时间表、疗程、媒介物和施用途径来配制、给药和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。待施用的化合物的“治疗有效量”将受此类考虑因素的约束，并且是预防、改善或治疗凝血因子介导的病症所需的最小量。该量优选地低于对宿主有毒或使宿主显著地更易出血的量。
Ab-CIDE可配制成药物剂型，以提供易于控制的药物剂量并使患者能够遵循处方。根据用于施用药物的方法，可以以多种方式包装用于施用的药物组合物(或制剂)。通常，用于分配的物品包括其中以适当形式沉积有药物制剂的容器。合适的容器是本领域技术人员熟知的，并且包括诸如瓶(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒等之类的材料。容器还可以包括干预防护组件，以防止不慎接触包装的内容物。另外，容器上设置有描述容器内容物的标签。标签上还可能包括适当的警告。
药物组合物可为无菌注射制剂的形式，诸如无菌注射水性或油质悬浮液。该悬浮液可根据已知技术使用上面已经提到的那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是无菌注射液或悬浮液，其处于非毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂(诸如1,3-丁二醇)中。无菌可注射制剂还可制备为冻干粉末。可采用的可接受的媒介物和溶剂为水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的固定油传统上可用作溶剂或悬浮介质。对于这一目的，可采用任何温和的固定油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸诸如油酸可同样用于制备可注射物。
可与载体物质组合以产生单一剂型的Ab-CIDE的量将根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。例如，用于人口服施用的延时释放制剂可含有大约1至1000mg与适当和方便量的载体物质复配的活性物质，该载体物质可占总组合物的约5％至约95％(重量：重量)。可以制备药物组合物以提供易于测量的施用量。例如，用于静脉内输注的水溶液可以每毫升溶液包含约3μg至500μg的活性成分，以便可以约30mL/hr的速率输注合适的体积。
适于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，从而使制剂与预期接受者的血液等渗，以及水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。
制剂可以包装在单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前添加注射用无菌液体载体，例如水。临时注射溶液和悬浮液由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选的单位剂量制剂是含有如本文上文所述的每日剂量或单位每日亚剂量的，或其适当分数的活性成分的那些。
本发明的主题进一步提供了兽用组合物，其包含至少一种如上定义的活性成分以及兽用载体。兽用载体是可用于施用组合物的材料，可以为固态、液态或气态材料，这些材料在兽医领域是惰性的或可接受的，并且与活性成分相容。这些兽用组合物可以肠胃外或通过任何其他预期途径施用。
VI.适应症和治疗方法
预期本文公开的Ab-CIDE可用于治疗涉及或牵涉靶蛋白诸如BRM的各种疾病或疾患。本文还提供了用于治疗的Ab-CIDE或包含Ab-CIDE的组合物。在一些实施例中，本文提供了用于治疗或预防如本文公开的疾病和疾患的Ab-CIDE或包含Ab-CIDE的组合物。本文还提供了Ab-CIDE或包含Ab-CIDE的组合物在治疗中的用途。在一些实施例中，本文提供了Ab-CIDE用于治疗或预防如本文公开的疾病和疾患的用途。本文还提供了Ab-CIDE或包含Ab-CIDE的组合物在制备用于治疗或预防本文所公开的疾病和病症的药物中的用途。
通常，待治疗的疾病或疾患为靶蛋白依赖性疾病或疾患，诸如BRM依赖性疾病或疾患。例如，靶蛋白依赖性疾病或疾患可为过度增殖性疾病，诸如癌症。本文中待治疗的癌症的实例包括BRM依赖性癌症。在某些实施例中，癌症为非小细胞肺癌。
在某些实施例中，本文所述的主题涉及降低受试者的靶蛋白的水平的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的Ab-CIDE或包含如本文所述的Ab-CIDE的组合物，其中PB部分结合靶蛋白，其中泛素连接酶影响结合的靶蛋白的降解，其中靶蛋白的水平降低。
在某些实施例中，包含抗体(诸如上文所述的那些)的Ab-CIDE在治疗癌症(诸如实性瘤)的方法中使用。
Ab-CIDE可通过适合于待治疗病症的任何途径施用。Ab-CIDE通常以胃肠外施用，即输注、皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外施用。
Ab-CIDE可以在治疗中单独使用或与其他药剂组合使用。例如，Ab-CIDE可与至少一种另外的治疗剂共同施用。上述此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包含在同一组合物或单独的制剂中)以及单独施用，在单独施用的情况下，Ab-CIDE的施用可以在施用附加治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后发生。Ab-CIDE也可与放射疗法组合使用。
Ab-CIDE(和任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则可以采用病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
为了预防或治疗疾病，Ab-CIDE的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他药物组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型、Ab-CIDE的类型、疾病的严重程度和病程、施用Ab-CIDE用于预防还是治疗目的、先前的治疗、患者的病史和对Ab-CIDE的应答以及主治医师的酌处权。Ab-CIDE适当地一次或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的Ab-CIDE可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用于患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。Ab-CIDE的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
本文所述的方法包括降解靶蛋白的方法。在某些实施例中，方法包括向受试者施用Ab-CIDE，其中靶蛋白质被降解。蛋白质的降解水平可为约1％至约5％；或约1％至约10％；或约1％至约15％；或约1％至约20％；约1％至约30％；或约1％至约40％；约1％至约50％；或约10％至约20％；或约10％至约30％；或约10％至约40％；或约10％至约50％；或至少约1％；或至少约10％；或至少约20％；或至少约30％；或至少约40％；或至少约50％；或至少约60％；或至少约70％；或至少约80％；或至少约90％；或至少约95％；或至少约99％。
本文所述的方法包括减少肿瘤组织(例如非小细胞肺癌)增殖的方法。在某些实施例中，方法包括向受试者施用Ab-CIDE，其中肿瘤组织的增殖降低。降低的水平可为约1％至约5％；或约1％至约10％；或约1％至约15％；或约1％至约20％；约1％至约30％；或约1％至约40％；约1％至约50％；或约10％至约20％；或约10％至约30％；或约10％至约40％；或约10％至约50％；或至少约1％；或至少约10％；或至少约20％；或至少约30％；或至少约40％；或至少约50％；或至少约60％；或至少约70％；或至少约80％；或至少约90％；或至少约95％；或至少约99％。
VI.制品
在另一方面，本文描述的是制品，例如提供了含有可用于治疗上述疾病和疾患的材料的“试剂盒”。该试剂盒包含容器，该容器包含Ab-CIDE。该试剂盒可进一步包含在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息。
合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等。“小瓶”是适合于容纳液体或冻干制剂的容器。在一个实施例中，小瓶是一次性小瓶，例如带塞子的20cc一次性小瓶。容器可以由多种材料形成诸如玻璃或塑料。容器可以容纳对病症治疗有效的Ab-CIDE或其制剂，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是具有可通过皮下注射针头穿孔的塞子的静脉输液袋或小瓶)。
组合物中的至少一种活性剂是Ab-CIDE。标签或包装插页表明化合物用于治疗所选择的病症，诸如癌症。另外，标签或包装说明书可以指示要治疗的患者是患有诸如过度增殖性疾患、动脉粥样硬化、神经变性、心脏肥大、疼痛、偏头痛或神经外伤性疾患或事件的疾患的患者。在一个实施例中，标签或包装说明书指示包含Ab-CIDE的组合物可用于治疗由异常细胞生长引起的疾患。标签或包装说明书也可表明该组合物可用于治疗其他疾病。可替代地或另外地，制品可进一步包括第二容器，该第二容器盛有药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品可进一步包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
试剂盒可进一步包含Ab-CIDE和第二药物制剂(如果存在)的施用说明。例如，如果试剂盒包括包含Ab-CIDE的第一组合物和第二药物制剂，则试剂盒可以进一步包含向有此需要的患者同时、按顺序或单独施用第一药物组合物和第二药物组合物的说明。
在另一实施例中，试剂盒适用于递送固体口服形式的Ab-CIDE，诸如片剂或胶囊剂。此类试剂盒优选地包括许多单位剂量。此类试剂盒可包括具有按照其预期用途的次序定向的剂量的卡。此类试剂盒的实例是泡罩包装。泡罩包装在包装工业中是众所周知的，并广泛用于包装药物单位剂型。如果需要，可例如以数字、字母或其他标记的形式或用指定治疗时间表中可以施用剂量的日期的日历插入事件提供记忆辅助。
根据一个实施例，试剂盒可包含(a)其中装有Ab-CIDE的第一容器；以及任选的(b)其中装有第二药物制剂的第二容器，其中第二药物制剂包含具有抗过度增殖活性的第二化合物。可替代地或另外地，试剂盒可进一步包括第三容器，该第三容器盛有药用缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。制品可进一步包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
在其中试剂盒包含Ab-CIDE和第二治疗剂的某些其他实施例中，该试剂盒可以包含用于容纳单独的组合物的容器(例如分开的瓶子或分开的箔包装)，然而，单独的组合物也可以容纳在单个不分开的容器中。通常，试剂盒包括用于施用单独组分的说明。当单独的组分优选地以不同的剂型(例如，口服和肠胃外)施用时，以不同的剂量间隔施用时，或者当处方医师希望滴定组合的各种组分时，试剂盒形式是特别有利的。
VII.制备缀合物的方法
一般合成途径
本文所述的主题还涉及由L1-CIDE制备CIDE、L1-CIDE和Ab-L1-CIDE的方法。通常，该方法包括使抗体或其变体、突变、剪接变体、插入/缺失和融合物与L1-CIDE在其中抗体与L1-CIDE上任何可用连接点共价结合的条件下接触，其中制备了Ab-L1-CIDE。本文所述的主题还涉及由与L1共价连接的Ab-L1部分(即抗体或其变体、突变、剪接变体、插入/缺失和融合物)制备Ab-L1-CIDE的方法，该方法包括使CIDE与Ab-L1在其中CIDE与Ab-L1上任何可用连接点共价结合的条件下接触，其中制备了Ab-L1-CIDE。该方法可进一步包括Ab-L1-CIDE的常规分离和纯化。
CIDE、L1-CIDE和Ab-L1-CIDE和本文所述的其他化合物可通过以下合成途径合成，该合成途径包括(特别是鉴于本文所包含的描述)与化学领域众所周知的工艺类似的工艺，以及以下描述的用于其他杂环的那些工艺：Comprehensive Heterocyclic Chemistry II，Katritzky和Rees,Elsevier编辑,1997,例如第3卷；Liebigs Annalen der Chemie,(9):1910-16,(1985)；Helvetica Chimica Acta,41:1052-60,(1958)；Arzneimittel-Forschung,40(12):1328-31,(1990)。起始材料通常可从商业来源获得，诸如AldrichChemicals(Milwaukee,WI)，或易于使用本领域技术人员众所周知的方法制备(例如，通过以下通常所述的方法进行制备：Louis F.Fieser和Mary Fieser,Reagents for OrganicSynthesis,v.1-23,Wiley,N.Y。(1967-2006编辑)，或Beilsteins Handbuch derorganischen Chemie,4,Aufl.编辑Springer-Verlag,Berlin，包括增刊(还通过Beilstein在线数据库获得))。
可用于合成如本文所述的CIDE、L1-CIDE和Ab-L1-CIDE和其他化合物的合成化学转化和保护基方法(保护和脱保护)以及必要的试剂和中间体是本领域已知的，并且包括例如以下文献中所描述的那些：R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCHPublishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis,第3版，John Wiley和Sons(1999)；和L.Paquette编辑，Encyclopedia ofReagents for Organic Synthesis,John Wiley和Sons(1995)及其后续版本中描述的那些。在制备CIDE、L1-CIDE和Ab-CIDE和其他化合物时，可能需要保护中间体的远端官能团(例如，伯胺或仲胺)。此类保护的需求将根据远端官能度的性质以及制备方法的条件而有所不同。合适的氨基保护基团包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(CBz或CBZ)和9-芴基亚甲基氧羰基(Fmoc)。对于是否需要这种保护是本领域技术人员容易确定的。有关保护基团及其用途的常规说明，参见T.W.Greene,Protective Groups inOrganic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991。
一般程序和实例提供了制备本文所述的CIDE、L1-CIDE和Ab-L1-CIDE以及其他化合物的示例性方法。本领域技术人员应当理解，可以使用其他合成途径以合成Ab-L1-CIDE和化合物。尽管在方案、一般程序、实例中描述和讨论了特定的起始材料和试剂，但是可容易替代为其他起始材料和试剂以提供各种衍生物和/或反应条件。此外，根据本公开，可使用本领域的技术人员熟知的常规化学方法进一步修饰通过所述方法制备的许多示例性化合物。
通常，可以根据WO 2013/055987、WO 2015/023355、WO 2010/009124、WO 2015/095227的程序，通过将CIDE与L1接头剂连接来制备Ab-L1-CIDE，以制备L1-CIDE，并使L1-CIDE与本文所述的任何抗体或其变体、突变、剪接变体、插入/缺失和融合体(包括半胱氨酸工程改造的抗体)缀合。可替代地，可以通过首先将本文所述的抗体或变体、突变、剪接变体、插入/缺失和融合体(包括半胱氨酸工程改造的抗体)与L1接头试剂连接，并使其与任何CIDE缀合来制备Ab-CIDE。
以下合成途径描述了制备CIDE、L1-CIDE和Ab-L1-CIDE以及其其他化合物和组分的示例性方法。本文其他地方公开了用于制备CIDE、L1-CIDE和Ab-L1-CIDE以及其其他化合物和组分的其它合成途径。
方案1中描述一种用于制备Ab-CIDE的非限制性一般合成途径。
1.半胱氨酸工程改造的抗体
半胱氨酸工程改造的抗体(THIOMABsTM)可以使用标准方法重组表达和纯化，且一般可以如下通过还原和再氧化制备以用于缀合。
重组表达的全长半胱氨酸工程改造的单克隆抗体(THIOMABTM抗体)带有半胱氨酸加合物(胱氨酸)，或由于细胞培养条件而在经改造半胱氨酸上被谷胱甘肽化。如此，从标准哺乳动物细胞系中纯化的THIOMABTM抗体不能与Cys反应性接头L1-CIDE中间体缀合。通过用还原剂，诸如DTT(Cleland试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐；Getz等人(1999)Anal.Biochem.第273卷：73-80；Soltec Ventures,Beverly,MA)进行处理，接着用温和的氧化剂(诸如脱氢抗坏血酸)重新形成链间二硫键(再氧化)，使半胱氨酸工程改造的抗体具有反应性，以与本文所述的L1-CIDE中间体缀合。将在CHO细胞中表达的全长半胱氨酸工程改造的单克隆抗体(THIOMABTM抗体)(Gomez等人(2010)Biotechnology andBioeng.105(4):748-760；Gomez等人(2010)Biotechnol.Prog.26:1438-1445)还原，例如在室温在50mM Tris(pH 8.0)与2mM EDTA中过夜，用约50倍过量的DTT还原，这可以除去Cys和谷胱甘肽加合物以及减少抗体的链间二硫键。使用PLRP-S色谱柱通过反相LCMS监测加合物的去除。
去除Cys和谷胱甘肽加合物后，可通过本领域中已知的常用方法纯化THIOMABTM抗体，包括此处详细说明的阳离子交换色谱法。可通过添加至少四倍体积的10mM琥珀酸盐(pH5)和/或用10％乙酸滴定直至pH为大约五，对经还原的THIOMABsTM进行稀释和酸化。随后可将pH降低且经稀释的THIOMABTM抗体加载到HiTrap S阳离子交换柱上，用几倍柱体积的10mM乙酸钠(pH 5)洗涤，并用50mM Tris(pH 8.0)、150mM氯化钠洗脱。通过进行再氧化，可在亲本Mab中存在的半胱氨酸残基之间重建二硫键。可将上述洗脱的经还原的THIOMABTM抗体用15X脱氢抗坏血酸(DHAA)处理约3小时，或可替代地，用200nM至2mM硫酸铜水溶液(CuSO4)在室温处理过夜。可使用本领域中已知的其他氧化剂(即氧化试剂)和氧化条件。周围空气氧化也可能是有效的。这种温和的、部分再氧化步骤以高保真度有效地形成链内二硫化物。可使用PLRP-S色谱柱通过反相LCMS监测再氧化。然后，可将经再氧化的THIOMABTM抗体用琥珀酸盐缓冲剂稀释(如上所述)以使pH达到大约5，接着如上所述在S柱上进行纯化，不同之处在于用10mM琥珀酸盐(pH 5)、300mM氯化钠(缓冲剂B)和10mM琥珀酸盐(pH 5)(缓冲剂A)的梯度进行洗脱。可向洗脱的ThiomabTM抗体中添加EDTA至2mM的最终浓度。如有必要，可将THIOMABTM浓缩以达到超过5mg/mL的最终浓度。准备缀合的所得THIOMABTM抗体可储存在-20℃或-80℃。液相色谱法/质谱分析可在6200系列TOF或QTOF Agilent LC/MS上进行。样品在加热至80℃的1000A微孔柱(50mm×2.1mm,Polymer Laboratories,Shropshire,UK)上进行色谱分离。可使用30％-40％ B(溶剂A：0.05％ TFA在水中，溶剂B：0.04％ TFA在乙腈中)的线性梯度，并且使用电喷雾源直接离子化洗脱液。采集数据，并通过MassHunter软件(Agilent)进行去卷积。在LC/MS分析之前，可将抗体(50微克)用PNGaseF(2单位/ml；PROzyme,San Leandro,CA)在37℃处理2小时以去除N-连接的碳水化合物。
可替代地，可将抗体用LysC(每50μg(微克)抗体0.25μg)在37℃部分消化15分钟，以得到Fab和Fc片段，用于通过LCMS分析
2.接头L1-CIDE基团与抗体的缀合
在将接头L1-CIDE化合物与抗体缀合的一种方法中，经上述还原和再氧化程序后，将半胱氨酸工程改造的抗体(THIOMABTM抗体)在10mM琥珀酸盐(pH 5)、150mM NaCl、2mMEDTA中用1M Tris将pH调节至pH 7.5-8.5。将过量的约3摩尔至20当量的具有硫醇反应性基团的接头-CIDE中间体(例如，马来酰亚胺或4-硝基吡啶基二硫化物或甲烷硫代磺酰基(MTS)二硫化物)溶于具有或不具有丙二醇的DMF或DMA中，然后添加至经还原的、再氧化的和pH调节的抗体中。反应在室温或37℃孵育并监测直至完成(1小时至约24小时)，如通过反应混合物的LC-MS分析所确定的。反应完成后，通过一种或几种方法的任意组合纯化缀合物，目的是去除剩余的未反应L1-CIDE中间体和聚集蛋白(如果以显著的水平存在)。例如，可将缀合物用10mM组氨酸-乙酸盐(pH 5.5)稀释，直到最终pH值为大约5.5，然后通过S阳离子交换色谱法使用连接至Akta纯化系统(GE Healthcare)的HiTrap S柱或S maxi离心柱(Pierce)进行纯化。可替代地，可通过凝胶过滤色谱法使用连接至Akta纯化系统的S200柱或Zeba离心柱纯化缀合物。可替代地，透析可用于去除未反应的或过量的接头药物。使用凝胶过滤或透析法，可将THIOMABTM抗体CIDE缀合物配制到20mM His/醋酸盐(pH 5)，240mM蔗糖中。可通过离心超滤法浓缩纯化的缀合物，和/或在无菌条件下通过0.2-μm过滤器过滤，然后冷冻储存。通过BCA测定表征Ab-L1-CIDE以确定蛋白质浓度，通过分析型SEC(尺寸排阻色谱法)进行聚集分析，并用赖氨酸C内肽酶(LysC)处理或使用标准程序还原后进行LC-MS分析以计算DAR。
使用Shodex KW802.5色谱柱，以0.75ml/分钟流速的具有0.25mM氯化钾和15％IPA的0.2M磷酸钾(pH 6.2)对缀合物进行尺寸排阻色谱分析。通过积分在280nm处洗脱的峰面积吸光度来确定缀合物的聚集状态。
可使用Agilent QTOF 6520 ESI仪器对Ab-L1-CIDE进行LC-MS分析。例如，将Ab-L1-CIDE用含1:500w/w胞内蛋白酶Lys C(Promega)的Tris(pH 7.5)在37℃处理30分钟。将所得的裂解片段加载到加热至80℃的(埃),8μm(微米)PLRP-S(高度交联聚苯乙烯)色谱柱上，并在5分钟内用30％ B至40％ B的梯度洗脱。流动相A为含0.05％ TFA的H2O，并且流动相B为含0.04％ TFA的乙腈。流速为0.5ml/分钟。在电喷雾离子化和MS分析之前，通过在280nm处的UV吸光度检测来监测蛋白质洗脱。通常可以实现未缀合Fc片段、残留的未缀合Fab和药物化Fab的色谱分辨。用Mass HunterTM软件(Agilent Technologies)对获得的m/z光谱进行解卷积，以计算抗体片段的质量。可去卷积的LCMS光谱中的峰被指定并定量。通过计算对应于CIDE-缀合抗体的一个或多个峰相对于观察到的所有峰的强度比值，计算出CIDE与抗体的比率(DAR)。
3.将L2偶联至E3LB以制备E3LB-L2中间体的一般合成偶联
在某些实施例中，首先使L2与第一合适的溶剂、第一碱和第一偶联试剂接触以制备第一溶液。在某些实施例中，将L2与第一合适的溶剂、第一碱和第一偶联试剂的接触在室温(约25℃)进行约15分钟。然后将E3LB与所述第一溶液接触。
在某些实施例中，将E3LB与第一溶液的接触在室温(约25℃)进行1小时。然后将溶液浓缩并任选地纯化。
在某些实施例中，L2与第一碱与第一偶联试剂的摩尔比为约1:4:1.19。在某些实施例中，L2与第一碱与第一偶联试剂的摩尔比为约1:2:0.5、约1:3:1、约1:4:2、约1:5:3或约1:6:4。
在某些实施例中，L2与E3LB的摩尔比为约1:1。在某些实施例中，L2与E3LB的摩尔比为约1:0.5、约1:0.75、约1:2或约0.5:1。
4.用于将E3LB-L2中间体偶联至PB的通用合成方法
在某些实施例中，将E3LB-L2中间体偶联至PB以制备CIDE。在某些实施例中，首先使PB与第二合适的溶剂、第二碱和第二偶联试剂接触。在某些实施例中，所述接触在室温(约25℃)进行约10分钟。然后使溶液与E3LB-L2中间体接触。在某些实施例中，第二溶液与E3LB-L2中间体的接触在室温(约25℃)进行约1小时。然后将溶液浓缩并任选地纯化以制备CIDE。
在某些实施例中，PB与第二碱与第二偶联试剂的摩尔比为约1:4:1.2。在某些实施例中，PB与第二碱与第二偶联试剂的摩尔比为约1:3:0.75、约1:5:1、约1:3:2或约1:5:3。
在某些实施例中，PB与E3LB-L2中间体的摩尔比为约1:1。在某些实施例中，PB与E3LB-L2中间体的摩尔比为约1:0.5、约1:0.75、约1:2或约0.5:1。
5.用于将CIDE偶联至L1以制备L1-CIDE的一般合成方法
在某些实施例中，将CIDE与L1和第三碱在第三合适的溶剂中接触以制备溶液。在某些实施例中，所述接触在约(约25℃)进行约2小时。然后可任选地将溶液纯化以制备L1-CIDE。
在某些实施例中，CIDE与L1的摩尔比为约1:4。在某些实施例中，CIDE与L1的摩尔比为约1:1、1:2、1:3、1:5、1:6、1:7或约1:8。
6.用于将L1-CIDE偶联至抗体的一般合成方法
在某些实施例中，使L1-CIDE与硫醇和第四合适的溶剂接触以形成第四溶液。然后使该溶液与抗体接触以制备缀合物。在某些实施例中，
在某些实施例中，硫醇为马来酰亚胺或4-硝基吡啶基二硫化物。在某些实施例中，合适的溶剂选自由二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和丙二醇组成的组。
在某些实施例中，L1-CIDE与硫醇反应性基团的摩尔比为约3:1至约20:1。
在某些实施例中，将包含L1-CIDE、硫醇反应性基团和合适的溶剂的溶液与抗体接触持续约1至约24小时。在某些实施例中，使包含L1-CIDE的溶液、硫醇反应性基团和合适的溶剂与抗体的接触在约室温(约25℃)至约37℃下进行。
在上述一般方法的某些实施例中，合适的溶剂为极性非质子溶剂，其选自由以下项组成的组：二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二甲基亚砜和碳酸亚丙酯。
在上述一般方法的某些实施例中，碱选自由以下项组成的组：N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、三乙胺和2,2,2,6,6-四甲基哌啶。在某些实施例中，偶联试剂选自由以下项组成的组：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐(HATU)、(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)、(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷磷六氟磷酸盐(PyAOP)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HCTU)、O-(N-琥珀酰亚胺基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU)、O-(5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚氨基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TNTU)、O-(1,2-二氢-2-氧代-1-吡啶基-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐(TPTU)和羰基二咪唑(CDI)。
在上述一般方法的某些实施例中，接触持续约30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、180分钟、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、20小时、40小时、60小时或72小时。
在上述一般方法的某些实施例中，接触在约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃进行。
以下实例仅以说明而非限制的方式提供。
实例
实例1
可水解的接头和PB的部分的合成
中间体1：(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-氧代-1-((4-((2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
步骤1：N2-(叔丁氧基羰基)-N6,N6-二甲基-L-赖氨酸
在氢气(3atm)下，将(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸(20.0g,81.2mmol)、37％ CH2O水溶液(12.2g,150mmol)和10％ Pd/C(2.00g)在甲醇(100mL)中的溶液在室温搅拌4小时。过滤后，将滤液在减压下浓缩。将残余物用Et2O洗涤。通过过滤收集固体，以得到20.6g(产率92％)白色固体状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝275。
步骤2：1-溴-2-((4-硝基苄基)氧基)苯
将2-溴苯酚(52.6g,304mmol)、1-(溴甲基)-4-硝基苯(65.7g,304mmol)和K2CO3(83.9g,608mmol)在DMF(700mL)中的溶液在室温搅拌1小时。添加EtOAc并使用水洗涤三次。有机层经无水Na2SO4干燥，并在真空下浓缩，以得到73.8g(产率78％)黄色固体状标题化合物。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.34–8.24(m,2H),7.81–7.70(m,2H),7.62(dd,J＝7.9,1.6Hz,1H),7.36(ddd,J＝8.3,7.3,1.6Hz,1H),7.20(dd,J＝8.3,1.5Hz,1H),6.94(td,J＝7.6,1.4Hz,1H),5.39(s,2H)。
步骤3：4-((2-溴苯氧基)甲基)苯胺
在氮气下，在0℃向1-溴-2-((4-硝基苄基)氧基)苯(43.0g,139.5mmol)和K2CO3(115g,837mmol)在乙腈(800mL)和水(400mL)中的溶液中分批添加Na2S2O4(242g,1395mmol)。将混合物在室温搅拌6小时。用EtOAc萃取产物一次。有机层经无水Na2SO4干燥并在真空下浓缩，以得到35g(粗品)黄色固体状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝278。
步骤4：(S)-(1-((4-((2-溴苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯
在氮气下，在-25℃向N2-(叔丁氧基羰基)-N6,N6-二甲基-L-赖氨酸(13.3g,48.4mmol)和NMM(10.3g,96.9mmol)在四氢呋喃(200mL)中的溶液中逐滴添加氯甲酸异丁酯(7.91g,58.1mmol)。将反应在-25℃搅拌0.5小时。然后在-25℃添加4-((2-溴苯氧基)甲基)苯胺(16.1g，粗品)在四氢呋喃(120mL)中的溶液。将反应在室温搅拌4小时。将溶剂在真空下浓缩。添加DCM并用水洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥，并且在真空中浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-9％ MeOH/DCM)纯化，以得到6.70g(产率25％)白色固体状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝534。
步骤5：(S)-2-氨基-N-(4-((2-溴苯氧基)甲基)苯基)-6-(二甲基氨基)己酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
将(S)-(1-((4-((2-溴苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(4.00g,7.48mmol)在5％ TFA/HFIP(50mL)中的溶液在室温搅拌3小时。将溶剂在真空下浓缩，并将其直接用于下一步骤。LCMS(ESI)[M+H]+＝434。
步骤6：(S)-1-((1-((4-((2-溴苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
在0℃向(S)-2-氨基-N-(4-((2-溴苯氧基)甲基)苯基)-6-(二甲基氨基)己酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)(来自步骤5的粗品)、1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酸(1.55g,8.98mmol)和DIPEA(9.65g,74.8mmol)在DMF(20mL)中的溶液中添加HATU(3.41g,8.98mmol)。将混合物在室温搅拌0.5小时。粗品通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ MeOH(0.05％NH4HCO3))纯化，以得到2.70g(产率61％)红色固体状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝588。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ9.87(s,1H),7.72(d,J＝7.9Hz,1H),7.54–7.42(m,3H),7.30(d,J＝8.6Hz,2H),7.21(ddd,J＝8.8,7.3,1.6Hz,1H),7.07(dd,J＝8.4,1.5Hz,1H),6.77(td,J＝7.6,1.4Hz,1H),5.02(s,2H),4.30(q,J＝8.0Hz,1H),4.00(q,J＝7.1Hz,2H),2.35–2.21(m,2H),2.03(t,J＝6.8Hz,2H),1.96(s,6H),1.80-1.41(m,4H),1.30-1.14(m,6H),1.06(t,J＝7.1Hz,3H)。
步骤7：(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-氧代-1-((4-((2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
在氮气下，将(S)-1-((1-((4-((2-溴苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯(500mg,0.852mmol)、B2Pin2(649mg,2.55mmol)、Pd(dppf)Cl2(124mg,0.170mmol)和KOAc(250mg,2.55mmol)在1,4-二噁烷(5mL)中的溶液在80℃搅拌2小时。反应用DCM稀释并用水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(梯度：0％-20％ MeOH/DCM(含0.3％7M NH3/MeOH))纯化，以得到390mg(产率72％)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝636。
实例 2
E3LB 的部分的合成
中间体2：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯啶-2-甲酰胺
步骤1：(S)-(1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
在氮气下，将(S)-(1-(4-溴苯基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(5.00g,16.7mmol)、氰锌(2.32g,20.1mmol)和Pd(PPh3)4(184mg,0.159mmol)在DMF(50mL)中的溶液在80℃搅拌30分钟。然后将反应混合物倒入水中，并通过过滤收集固体并用水洗涤。将固体通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0％-30％ EtOAc/石油醚)纯化，以得到2.80g(产率68％)无色油状标题化合物。LCMS(ESI)：[M+H]+＝247。
步骤2：(S)-4-(1-氨基乙基)苯甲腈(氯化氢盐)
在氮气下，将(S)-(1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.80g,11.4mmol)在CH2Cl2(10mL)和4M HCl/二噁烷(20mL)在室温搅拌1小时。将所得混合物在真空下浓缩，以得到2.8g(粗品)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝147。
步骤3：(2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，将(S)-4-(1-氨基乙基)苯甲腈(2.35g,16.1mmol)、(2S,4R)-1-(叔丁氧基羰基)-4-羟基吡咯啶-2-甲酸(3.71g,16.1mmol)、HATU(7.34g,19.3mmol)和DIPEA(20.7g,161mmol)在DMF(20mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。将反应通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-60％ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到4.60g(产率50％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝360。
步骤4：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-4-羟基吡咯啶-2-甲酰胺(氯化氢盐)
在氮气下，将(2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-甲酸叔丁酯(3.50g,9.7mmol)在CH2Cl2(35mL)和4M HCl/二噁烷(70mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。将所得混合物在真空下浓缩，以得到3.1g(粗品)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝260。
步骤5：2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酸甲酯
将2-(3-羟基异噁唑-5-基)-3-甲基丁酸甲酯(10.0g,50.2mmol)、2-溴-1,1-二乙氧基乙烷(11.3mL,75.1mmol)和K2CO3(13.9g,101mmol)在DMF(150mL)中的溶液在70℃搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc稀释并用水洗涤。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到12.5g(产率79％)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝316。
步骤6：2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酸
将2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酸甲酯(12.5g,39.6mmol)和LiOH(4.75g,198mmol)在四氢呋喃(100mL)和水(100mL)中的溶液在室温搅拌4小时。用1M氯化氢将pH调节为4至5并用乙酸乙酯萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩，以得到13g(粗品)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+Na]+＝324。
步骤7：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-4-羟基吡咯啶-2-甲酰胺
将(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-4-羟基吡咯啶-2-甲酰胺(氯化氢盐)(3.00g，来自步骤4的粗品)、2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酸(3.00g,9.96mmol)、HATU(4.56g,12.0mmol)和DIPEA(3.85g,29.8mmol)在DMF(30mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。粗品通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％NH4HCO3))纯化，以得到4.3g两种异构体的黄色固体状混合物。将混合物通过制备型手性SFC用以下条件分离：柱：CHIRALPAK IG-3，3.0*50mm,3μm；流动相B：IPA(0.1％DEA)；流速：2mL/分钟；梯度：等度10％ B；波长：220nm，以得到2.14g(较快的峰，不需要的异构体)和2.6g(较慢的峰，所需异构体)，其为黄色固体。
对于较快的峰(不需要的异构体)：LC-MS:(ESI,m/z)：[M+Na]+＝565。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.35(8.95)(d,J＝7.6Hz,1H),7.85-7.70(m,2H),7.52-7.30(m,2H),6.08(6.16)(s,1H),5.10(d,J＝3.6Hz,1H),5.06–4.83(m,1H),4.79(td,J＝5.2,1.7Hz,1H),4.55–4.29(m,1H),4.27–4.19(m,1H),4.12-3.99(m,2H),3.73(d,J＝8.6Hz,1H),3.67–3.38(m,6H),2.34-2.15(m,1H),2.09–1.81(m,1H),1.78-1.60(m,1H),1.40-1.25(m,3H),1.19-1.05(m,6H),1.05-0.90(m,3H),0.85-0.70(m,3H)。
对于较慢的峰(所需异构体)，LC-MS：(ESI,m/z)：[M+Na]+＝565。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.46(8.85)(d,J＝7.4Hz,1H),7.83–7.72(m,2H),7.45(d,J＝8.5Hz,2H),6.13(5.92)(m,1H),5.09(d,J＝3.3Hz,1H),4.98-4.82(m,1H),4.79(td,J＝5.2,2.0Hz,1H),4.39–4.28(m,1H),4.24(s,1H),4.07(d,J＝5.2Hz,2H),3.80–3.59(m,4H),3.56–3.39(m,3H),2.29–2.13(m,1H),2.05–1.65(m,2H),1.45-1.25(m,3H),1.20-1.00(m,6H),0.93(t,J＝6.9Hz,3H),0.79(dd,J＝9.4,6.7Hz,3H)。
步骤8：(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯啶-2-甲酰胺
将(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-4-羟基吡咯啶-2-甲酰胺(300mg,0.550mmol)在四氢呋喃(3mL)和1M H2SO4(3mL)中的溶液在50℃搅拌2小时。将溶液冷却，并通过饱和碳酸氢钠溶液将pH调节为8。将产物用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥并在真空中浓缩，以得到250mg(粗品)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝469。
实例 3
E3LB 的部分的合成
中间体3：(2S,4R)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺
步骤1：(2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-甲酸叔丁酯
将(S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙烷-1-胺(盐酸盐)(10.0g,39.3mmol)、(2S,4R)-1-(叔丁氧基羰基)-4-羟基吡咯啶-2-甲酸(9.07g,39.2mmol)、HATU(17.9g,47.0mmol)和DIPEA(25.3g,195mmol)在DMF(100mL)中的溶液在室温搅拌1小时。反应用EtOAc稀释并用水洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到14.2g(产率83％)灰白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝432。
步骤2：(2S,4R)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺(盐酸盐)
将(2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-甲酸叔丁酯(6.89g,13.5mmol)在4M HCl/二噁烷(50mL)和二氯甲烷(100mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩，以得到5.8g(粗品)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝332。
步骤3：(2S,4R)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺
将2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酸(4.80g,15.9mmol)、(2S,4R)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺(5.78g,15.7mmol)、HATU(7.29g,19.2mmol)和DIPEA(6.19g,48.0mmol)在DMF(60mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。粗品通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％NH4HCO3))纯化，以得到7.8g两种异构体的黄色固体状混合物。将混合物通过制备型手性SFC用以下条件分离：柱：CHIRAL ART Amylose-SA，5×25cm，5μm；流动相A：CO2，流动相B：MeOH；流速：200mL/分钟；梯度：等度40％ B；柱温(℃)：35；反压(bar)：100；波长：220nm；RT1(分钟)：2.61；RT2(分钟)：3.63；样品溶剂：MeOH(0.1％2M NH3-MeOH)，以得到2.57g较快的峰(不需要的异构体)和3.00g较慢的峰(所需异构体)，其为黄色固体。
对于较快的峰(不需要的异构体)：LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝615；1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ9.02(s,1H),8.31(d,J＝7.8Hz,1H),7.58–7.29(m,4H),6.16(6.23)(s,1H),5.09(d,J＝3.6Hz,1H),5.05–4.71(m,2H),4.52–4.38(m,1H),4.25(s,1H),4.19-4.04(m,2H),3.83–3.39(m,7H),2.44(d,J＝3.4Hz,3H),2.32–1.74(m,3H),1.54-1.30(m,3H),1.23-1.09(m,6H),1.08-0.73(m,6H)。
对于较慢的峰(所需异构体)：LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝615；1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.97(d,J＝2.6Hz,1H),8.40(8.80)(d,J＝7.7Hz,1H),7.50–7.26(m,4H),6.12(5.94)(s,1H),5.08(d,J＝3.3Hz,1H),4.95-4.80(m,1H),4.79(t,J＝5.2Hz,1H),4.36(t,J＝7.8Hz,1H),4.26(s,1H),4.08(d,J＝5.2Hz,2H),3.73–3.36(m,7H),2.44(d,J＝1.5Hz,3H),2.29–1.96(m,2H),1.80-1.65(m,1H),1.50-1.30(m,3H),1.20-1.05(m,6H),1.05-0.90(m,3H),0.85-0.70(m,3H)。
步骤4：(2S,4R)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺
将(2S,4R)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺(300mg,0.490mmol)在四氢呋喃(3mL)和1M H2SO4(3mL)中的溶液在50℃搅拌2小时。将溶液冷却并通过饱和碳酸氢钠溶液将pH调节为8。将产物用乙酸乙酯萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩，以得到260mg(粗品)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝541。
实例4
可水解的接头的部分的合成
中间体4：1-(5-氨基戊基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸)
步骤1：(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
在氮气下，在0℃向(5-氨基戊基)氨基甲酸叔丁酯(2.60g,12.8mmol)在二噁烷(20mL)和饱和NaHCO3(64mL)中的溶液中添加2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯(2.00g,12.9mmol)。将溶液在0℃搅拌40分钟。然后将反应混合物在室温搅拌1小时。反应用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(梯度：0％-30％ EtOAc/石油醚)纯化，以得到2.00g(产率54％)棕色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝283。
步骤2：1-(5-氨基戊基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸)
在氮气下，将(5-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(200mg，0.709mmol)在TFA(0.5mL)和二氯甲烷(2mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。将所得混合物在真空下浓缩，以得到270mg(粗品)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝183。
实例5
可水解接头的部分的合成
中间体5：(S)-1-((6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
步骤1：N6-((烯丙氧基)羰基)-N2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-羰基)-L-赖氨酸
将N2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-N6-((烯丙氧基)羰基)-L-赖氨酸(900mg,1.98mmol)和DIPEA(1g,7.75mmol)在DCM(10mL)和DMF(10mL)中的溶液添加至2-氯三苯甲基氯树脂(2g)。将混合物在室温搅动(agitate)1小时。添加5mL MeOH并在室温搅拌0.5小时。用DMF洗涤树脂三次。添加哌啶(4mL)和DMF(16mL)的溶液并在室温搅动0.5小时。然后用DMF洗涤四次。然后，在0℃向1-乙氧基羰基环丁烷甲酸(514mg,2.98mmol)和DIPEA(771mg,5.97mmol)在DMF(15mL)中的溶液中添加HATU(1.1g,2.89mmol)和HOBt(454mg,2.98mmol)并在室温搅拌0.5小时。将该溶液添加至上述树脂中，并在室温搅拌1小时。使用DMF洗涤树脂三次，然后使用DCM洗涤。将树脂在HFIP(4mL)和DCM(16mL)的溶液中搅动1小时。将树脂过滤，并将滤液浓缩，以得到900mg(粗品)黄色油状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)[M+H]+＝385。
步骤2：(S)-1-((6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
将N6-((烯丙氧基)羰基)-N2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-羰基)-L-赖氨酸(4.2g,10.96mmol)、(4-氨基苯基)甲醇(1.48g,11.9mmol)、EEDQ(5.41g,21.8mmol)在DCM(40mL)和MeOH(20mL)中的溶液在30℃搅拌1小时。将溶剂蒸发，并且粗品通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：在DCM中的0-10％ MeOH)纯化，以得到2.6g(产率49％)黄色油状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)[M+H]+＝490。
实例6
接头L2的部分的合成
中间体6：4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-氯哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
步骤1：(1s,3s)-3-(苄氧基)环丁烷-1-醇
在氮气下，在0℃向3-(苄氧基)环丁烷-1-酮(10.0g,56.8mmol)在甲醇(100mL)中的溶液中添加NaBH4(2.15g,56.9mmol)。将所得溶液在0℃搅拌1小时。反应用水淬灭并用EtOAc萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化，以得到9.85g(产率97.4％)无色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝179。
步骤2：4-((1r,3r)-3-(苄氧基)环丁氧基)吡啶
在氮气下，在0℃向(1s,3s)-3-(苄氧基)环丁烷-1-醇(11.0g,61.7mmol)、吡啶-4-醇(8.80g,92.5mmol)和PPh3(19.4g,74.2mmol)在四氢呋喃(110mL)中的溶液中添加DIAD(14.9g,74.1mmol)。将反应在50℃搅拌2小时。将有机层在真空下浓缩。将所得溶液用水稀释，并用二氯甲烷萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-50％乙酸乙酯/石油醚)纯化，以得到15.0g(粗品)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝256。
步骤3：1-苄基-4-((1r,3r)-3-(苄氧基)环丁氧基)吡啶-1-鎓
在氮气下，将4-((1r,3r)-3-(苄氧基)环丁氧基)吡啶(7.00g,粗品)和BnBr(4.69g,27.4mmol)在甲苯(70mL)中的溶液在80℃搅拌过夜。将溶液在真空下浓缩。添加石油醚并搅拌溶液直至有白色固体沉淀。过滤后，收集固体，以得到7.86g白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M]+＝346。
步骤4：1-苄基-4-((1r,3r)-3-(苄氧基)环丁氧基)-1,2,3,6-四氢吡啶
在氮气下，在0℃向1-苄基-4-((1r,3r)-3-(苄氧基)环丁氧基)吡啶-1-鎓(7.50g,21.7mmol)在乙醇(75mL)中的溶液中添加NaBH4(4.90g,129mmol)。将所得溶液在室温搅拌1小时。所得溶液用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(梯度：0-100％乙酸乙酯/石油醚)纯化，以得到4.13g(产率55.1％)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝350。
步骤5：4-((1r,3r)-3-羟基环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氢气(3atm)下，将1-苄基-4-((1r,3r)-3-(苄氧基)环丁氧基)-1,2,3,6-四氢吡啶(4.00g,11.4mmol)、Boc2O(7.49g,34.3mmol)、20％ Pb(OH)2/C(800mg)和10％Pd/C(800mg)在甲醇(400mL)中的溶液在室温搅拌48小时。将反应混合物过滤，并在真空下浓缩滤液。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-100％乙酸乙酯/石油醚)纯化，以得到900mg(产率28.9％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝272。
步骤6：4-((1r,3r)-3-((4-溴吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，将4-((1r,3r)-3-羟基环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(3.27g,12.0mmol)、4-溴-2-氟-吡啶(3.92g,22.4mmol)和Cs2CO3(7.81g,24.0mmol)在ACN(150mL)中的溶液在90℃搅拌12小时。过滤固体，并在真空下浓缩滤液。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-30％乙酸乙酯/石油醚)纯化，以得到4.50g(产率87％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝427。
步骤7：8-(2-((1r,3r)-3-((1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸苄酯
在氮气下，将4-((1r,3r)-3-((4-溴吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.50g,10.5mmol)、3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸苄酯(3.23g,13.1mmol)、CS2CO3(16.7g,51.6mmol)和Ruphos Pd G2(1.73g,2.22mmol)在甲苯(300mL)中的溶液在90℃搅拌12小时。将溶液在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-30％乙酸乙酯/石油醚)纯化，以得到4.70g(产率75.2％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝593。
步骤8：4-((1r,3r)-3-((4-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)吡啶-1-甲酸叔丁酯
在氢气(3atm)下，将8-(2-((1r,3r)-3-((1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-甲酸苄酯(260mg,0.438mmol)、20％Pb(OH)2/C(61.6mg)在乙醇(40mL)和THF(40ml)中的溶液在60℃搅拌3小时。过滤后，收集滤液并在真空下浓缩，以得到220mg(粗品)黑色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝459。
步骤9：4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-氯哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，将4-溴-6-氯-哒嗪-3-胺(0.60g,2.98mmol)、4-((1r,3r)-3-((4-(3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.10g,2.40mmol)和DIPEA(3.10g,24.0mmol)在DMSO(15mL)中的溶液在130℃搅拌18小时。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％ NH3.H2O))纯化，以得到1.10g(产率78％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝586。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ7.76(d,J＝6.0Hz,1H),6.90(s,1H),6.50(dd,J＝6.1,2.1Hz,1H),6.12(d,J＝2.0Hz,1H),5.85(s,2H),5.26–5.12(m,1H),4.45(s,2H),4.31(p,J＝6.0Hz,1H),3.66(dt,J＝13.4,4.7Hz,2H),3.50-3.37(m,1H),3.18(d,J＝11.5Hz,2H),2.92(dd,J＝35.6,11.5Hz,4H),2.40–2.21(m,4H),2.13(d,J＝7.2Hz,2H),1.97–1.88(m,2H),1.80–1.70(m,2H),1.39(s,9H),1.33-1.20(m,2H)。
实例7
接头L2和PB的部分的合成
中间体7：(3R)-4-(2-((4-(3-(3-氨基-6-(2-(甲氧基甲氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
步骤1：(3R)-4-(2-((4-(3-(3-氨基-6-(2-(甲氧基甲氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，将(3R)-4-(2-((4-(3-(3-氨基-6-氯哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.00g，1.79mmol，由基因泰克公司提供)、(2-(甲氧基甲氧基)苯基)硼酸(391mg,2.15mmol)、Pd(PPh3)4(413mg,0.358mmol)和K2CO3(741mg,5.37mmol)在二噁烷(10mL)和水(2mL)中的溶液在100℃搅拌1小时。将反应用水稀释，并用二氯甲烷萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0％-10％ MeOH/DCM)纯化，以得到670mg(产率57％)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝661。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ7.76(d,J＝5.9Hz,1H),7.58(dd,J＝7.6,1.8Hz,1H),7.34(ddd,J＝9.0,7.3,1.8Hz,1H),7.18–7.01(m,3H),6.51(dd,J＝6.1,2.0Hz,1H),6.12(d,J＝2.0Hz,1H),5.72(s,2H),5.14(s,2H),4.47(s,2H),4.25(t,J＝6.1Hz,2H),3.53(d,J＝12.8Hz,2H),3.22(s,3H),3.14–2.67(m,8H),2.64-2.56(m,1H),2.46-2.36(m,1H),2.32-2.22(m,1H),2.22-2.13(m,2H),2.00-1.90(m,2H),1.38(s,9H),0.96(d,J＝6.2Hz,3H)。
实例8
可水解的接头、PB和接头L2的部分的合成
中间体8：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-2-甲基-4-(2-((5-((R)-3-甲基-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-(膦酰氧基)吡咯啶-1-基)-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
步骤1：(3R)-4-(2-((4-(3-(3-氨基-6-(2-((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在氮气下，将(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-氧代-1-((4-((2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯(316mg,0.570mmol)、(3R)-4-(2-((4-(3-(3-氨基-6-氯哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(538mg,0.850mmol)、K3PO4(240mg,1.13mmol)和Ad2nBuPPdG2(37.8mg,0.0600mmol)在1,4-二噁烷(4mL)和水(1mL)中的溶液在95℃搅拌3小时。添加水并使用EtOAc萃取三次。合并有机溶剂，并在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％NH4HCO3))纯化，以得到230mg(产率39％)红色固体状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝1032。
步骤2：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(叔丁氧基羰基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸锂
将(3R)-4-(2-((4-(3-(3-氨基-6-(2-((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(210mg,0.200mmol)和LiOH.H2O(25.6mg,0.610mmol)在四氢呋喃(3mL)和水(1mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩，以得到254mg(粗品)黄色固体状标题化合物。
步骤3：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
将1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(叔丁氧基羰基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸锂(254mg,0.250mmol)在5％ TFA/HFIP(20mL)中的溶液在室温搅拌3小时。将溶剂在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ MeOH(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到102mg(产率44％)红色固体状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)[M+H]+＝905。
步骤4：((3R,5S)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基)磷酸二叔丁酯
在氮气下，在0℃向(2S,4R)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺(500mg,0.81mmol)和1H-四唑(5.4mL，在ACN中的0.45M)在THF(5mL)中的溶液中逐滴添加二异丙基亚膦酰胺二叔丁酯(451mg,1.63mmol)。将反应在室温搅拌过夜。然后在-30℃添加tBuOOH(0.4mL，在癸烷中的5M)并在-30℃搅拌30分钟。然后将混合物在室温搅拌4小时。将反应用水性NaHSO3淬灭，并用EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-70％ ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到340mg(产率51％)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝807。
步骤5：(3R,5S)-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐
在氮气下，将((3R,5S)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基)磷酸二叔丁酯(150mg,0.185mmol)在HCOOH(0.5mL)和水(0.5mL)中的溶液在60℃搅拌1小时。将溶液在真空下浓缩，以得到121mg(粗品)固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝695。
步骤6：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-2-甲基-4-(2-((5-((R)-3-甲基-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-(膦酰氧基)吡咯啶-1-基)-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
将1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(100mg,0.110mmol)、(3R,5S)-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐(121mg,0.190mmol)和NaOAc(13.6mg,0.170mmol)在甲醇(1.2mL)和二氯甲烷(0.4mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(34.7mg,0.550mmol)并在室温搅拌0.5小时。添加水以淬灭反应。将溶剂在真空下浓缩。将产物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18ExRS，30*150mm，5μm；流动相A：水(10mmol/L NH4HCO3)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在9分钟内，36％ B至60％B，60％ B；波长：254/220nm；RT(分钟)：7.63)纯化，以得到30.0mg(产率18％)白色固体状标题化合物。LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝1509。
实例9
可水解接头的部分的合成
中间体9：(S)-1-((6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
步骤1：(S)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰胺基)-5-脲基戊酸
将Fmoc-CIT-OH(4.00g,10.0mmol)和DIPEA(5.20g,40.3mmol)在DCM(40mL)和DMF(40mL)中的溶液添加至2-氯三苯甲基氯树脂(10.0g)。将混合物搅动1小时。添加8mL MeOH并将所得溶液在室温搅拌0.5小时。使用DMF洗涤树脂三次。添加哌啶(15mL)和DMF(60mL)的溶液并在室温搅动0.5小时。然后用DMF洗涤四次。然后，在0℃向1-乙氧基羰基环丁烷甲酸(2.60g,15.1mmol)和DIPEA(3.90g,30.2mmol)在DMF(60mL)中的溶液中添加HATU(5.70g,15.0mmol)和HOBt(2.30g,15.1mmol)并将反应在室温搅拌0.5小时。将所得溶液添加至上述树脂中，在室温搅拌1小时。使用DMF洗涤树脂三次，然后使用DCM洗涤。将树脂在HFIP(15mL)和DCM(60mL)的溶液中搅动1小时。将树脂过滤，并将滤液浓缩，以得到3.7g(粗品)黄色油状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)[M+H]+＝329。
步骤2：(S)-1-((1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
将(S)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)-5-脲基戊酸(3.20g,9.73mmol)、(4-氨基苯基)甲醇(1.32g,10.6mmol)、EEDQ(4.81g,19.4mmol)在DCM(20mL)和MeOH(10mL)中的溶液在30℃搅拌2小时。将蒸溶剂发，并且将粗品通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-20％ MeOH/DCM)纯化，以得到1.75g棕色油状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝434。
实例10
可水解接头的部分的合成
中间体10：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
步骤1：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
将1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(102mg,0.110mmol)、(2S,4R)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺(61.0mg,0.110mmol)和CH3COOH(13.6mg,0.230mmol)在甲醇(1.2mL)和二氯甲烷(0.4mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(21.3mg,0.340mmol)并在室温搅拌0.5小时。添加水以淬灭反应。将溶剂在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％MeOH(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到80.0mg(产率49％)黄色固体状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)[M+H]+＝1429。
实例11
可水解接头的部分的合成
中间体11：(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
步骤1：(S)-(6-(二甲基氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯
在氮气下，将N2-(叔丁氧基羰基)-N6,N6-二甲基-L-赖氨酸(5.00g,18.2mmol)、(4-氨基苯基)甲醇(2.46g,20.1mmol)和2-乙氧基喹啉-1(2H)-甲酸乙酯(9.01g,36.5mmol)在MeOH(50mL)和DCM(20mL)中的溶液在30℃搅拌过夜。将溶剂在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-20％ EtOAc/石油醚)纯化，以得到2.32g(产率33％)白色固体状标题化合物。LCMS(ESI)：[M+H]+＝380。
步骤2：(S)-2-氨基-6-(二甲基氨基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)己酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
将(S)-(6-(二甲基氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2.20g,5.78mmol)在CH2Cl2(15mL)和TFA(5mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩，并且粗品直接用于下一步骤。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝280。
步骤3：环丁烷-1,1-二甲酸1-(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)1-乙酯
将1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酸(3.00g,17.4mmol)、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(2.21g,19.2mmol)和DCC(3.95g,19.2mmol)在THF(50mL)中的溶液在室温搅拌5小时。将反应混合物过滤，将滤液在真空下浓缩，以得到5.19g(粗品)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝270。
步骤4：(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
将(S)-2-氨基-6-(二甲基氨基)-N-(4-(羟基甲基)苯基)己酰胺(2.9g,10.4mmol)和NaHCO3(2.27g,83.2mmol)在H2O(30mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。然后，添加环丁烷-1,1-二甲酸1-(2,5-二氧代吡咯啶-1-基)1-乙酯(1.51g,15.5mmol)在DME(30mL)中的溶液并在室温搅拌过夜。将反应混合物过滤，并将滤液在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ MeOH(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到1.26g(产率49％)无色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝434。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ9.77(s,1H),7.73(d,J＝7.9Hz,1H),7.42(d,J＝8.2Hz,2H),7.12(d,J＝8.2Hz,2H),4.99(s,1H),4.36–4.22(m,3H),4.05–3.97(m,2H),2.34–2.19(m,4H),2.07(t,J＝6.9Hz,2H),1.99(s,6H),1.83–1.51(m,4H),1.37–1.16(m,4H),1.07(d,J＝7.0Hz,3H)。
实例12
可水解接头的部分的合成
中间体12：(S)-(5-(3-(叔丁氧基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
步骤1：(S)-(2,2,16,16-四甲基-4,12-二氧代-3,15-二氧杂-5,11-二氮杂十七烷-13-基)氨基甲酸苄酯
在氮气下，将N-((苄氧基)羰基)-O-(叔丁基)-L-丝氨酸(1.00g,3.39mmol)、(5-氨基戊基)氨基甲酸叔丁酯(684mg,3.39mmol)、HATU(1.67g,4.40mmol)和DIPEA(1.31g,10.1mmol)在DMF(10mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。将反应通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-60％ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到980mg(产率60％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝480。
步骤2：(S)-(5-(2-氨基-3-(叔丁氧基)丙酰氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
在氢气(3atm)下，将(S)-(2,2,16,16-四甲基-4,12-二氧代-3,15-二氧杂-5,11-二氮杂十七烷-13-基)氨基甲酸苄酯(980mg,2.046mmol)和10％ Pd/C(196mg)在MeOH(200mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将固体通过硅藻土垫过滤，并将滤液在减压下浓缩，以得到750mg(粗品)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝346。
步骤3：(S)-(5-(3-(叔-丁氧基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
在氮气下，在0℃向(S)-(5-(2-氨基-3-(叔丁氧基)丙酰氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(740mg,2.14mmol)和NaHCO3(540mg,6.43mmol)在二噁烷(5mL)和H2O(16mL)的溶液中添加2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲基(332mg,2.14mmol)。将溶液在0℃搅拌40分钟。然后将反应混合物在室温搅拌0.5小时。使用乙酸乙酯萃取三次。合并有机层，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(梯度：0％-60％EtOAc/石油醚)纯化，以得到540mg(产率59％)无色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝426。
实例13
Hy-B-CIDE-6的合成
N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：(5-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
将(5-氨基戊基)氨基甲酸叔丁酯(500mg,2.47mmol)和2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二氧代吡咯啶-1-酯(1.25g,4.94mmol)和NMM(476mg,4.45mmol)在DMF(3mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％TFA))纯化，且然后通过硅胶快速色谱法(梯度：0％-10％ MeOH/DCM)纯化，以得到343mg(产率41％)红色油状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝340。
步骤2：N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
将(5-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(30.0mg,0.0900mmol)在二氯甲烷(2mL)和2,2,2-三氟乙酸(0.5mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩，以得到32.0mg(粗品)黄色油状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝240。
步骤3：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(60.0mg,0.0400mmol)、N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)(30.0mg，粗品)和DIPEA(54.2mg,0.420mmol)在DMF(0.5mL)中的溶液中添加HATU(19.2mg,0.0500mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将粗品通过制备型HPLC(柱：Xselect CSH F-Phenyl OBD管柱，19×250mm，5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/分钟；梯度：在11分钟内，20％ B至27％B，27％ B；波长：254nm；RT1(分钟)：10.4)纯化，以得到31.5mg(产率45％)黄色固体状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝1650。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),9.51(s,1H),8.99(s,1H),8.38(d,J＝7.6Hz,1H),8.11(t,J＝5.4Hz,1H),7.95-7.80(m,3H),7.67(d,J＝8.3Hz,2H),7.58(td,J＝5.1,2.4Hz,2H),7.51–7.25(m,8H),7.23–7.03(m,5H),6.69(d,J＝6.5Hz,1H),6.32(s,1H),6.11(s,1H),5.10(s,2H),4.91(t,J＝7.3Hz,1H),4.55(s,2H),4.47(s,2H),4.43-4.20(m,5H),3.99(s,2H),3.50-3.30(m,7H),3.30-3.15(m,4H),3.15-3.05(m,6H),3.05-2.95(m,5H),2.75(d,J＝4.4Hz,6H),2.50-2.35(m,8H),2.23–1.60(m,13H),1.53–1.04(m,15H),1.05-0.90(m,3H),0.85-0.70(m,3H)。
实例14
Hy-B-CIDE-1的合成
N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：(S)-(2,2,16,16-四甲基-4,12-二氧代-3,15-二氧杂-5,11-二氮杂十七烷-13-基)氨基甲酸苄酯
在氮气下，将N-((苄氧基)羰基)-O-(叔丁基)-L-丝氨酸(1.0g,3.390mmol)、(5-氨基戊基)氨基甲酸叔丁酯(684mg,3.39mmol)、HATU(1.67g,4.40mmol)和DIPEA(1.31g,10.1mmol)在DMF(10mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。将反应通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-60％ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到980mg(产率60％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝480。
步骤2：(S)-(5-(2-氨基-3-(叔丁氧基)丙酰氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
在氢气(1atm)下，将(S)-(2,2,16,16-四甲基-4,12-二氧代-3,15-二氧杂-5,11-二氮杂十七烷-13-基)氨基甲酸苄酯(980mg,2.046mmol)和Pd/C(196mg)在MeOH(200mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将固体通过硅藻土垫过滤，并将滤液在减压下浓缩，以得到750mg(粗品)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝346。
步骤3：(S)-(5-(3-(叔-丁氧基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
在氮气下，在0℃向(S)-(5-(2-氨基-3-(叔丁氧基)丙酰氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(740mg,2.145mmol)和NaHCO3(540mg,6.43mmol)在二噁烷(5mL)和H2O(16mL)的溶液中添加2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲基(332mg,2.14mmol)。将溶液在0℃搅拌40分钟。然后将反应混合物在室温搅拌0.5小时。反应用乙酸乙酯萃取。合并有机层，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(梯度：0％-60％EtOAc/石油醚)纯化，以得到540mg(产率59％)无色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝426
步骤4：(S)-N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在氮气下，将(S)-(5-(3-(叔丁氧基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(15.0mg,0.035mmol)在TFA(0.5mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩，以得到20.0mg(粗品)无色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝270。
步骤5：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在氮气下，在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(30.0mg,0.021mmol)、(S)-N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)(20.0mg，粗品)、DIPEA(27.1mg,0.210mmol)在DMF(0.9mL)中的溶液中添加HATU(10.4mg,0.027mmol)。将所得溶液在室温搅拌10分钟。所得溶液通过制备型HPLC(XBridge Shield RP18 OBD柱，19x 250mm 10μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/分钟；梯度：在10分钟内由20％ B至35％ B；254/220nm；RT1：8.26)纯化，以得到22.6mg(产率64％)白色固体状HY-B-CIDE-1。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1680。1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.21(s,1H),9.45(br,1H),9.00(d,J＝1.7Hz,1H),8.40(d,J＝7.8Hz,1H),7.98–7.84(m,4H),7.67(d,J＝8.3Hz,2H),7.58(d,J＝7.4Hz,2H),7.52–7.28(m,8H),7.19–6.91(m,5H),6.69(s,1H),6.31(s,1H),6.13(s,1H),5.11(s,2H),4.95-4.80(m,1H),4.62-4.52(m,2H),4.52-4.45(m,3H),4.42-4.32(m,4H),4.32-4.25(m,2H),3.95–3.86(m,9H),3.50-3.40(m,3H),3.40-3.28(m,4H),3.15-3.05(m,5H),3.05-2.95(m,5H),2.75(d,J＝4.7Hz,6H),2.45-2.35(m,8H),2.25-2.10(m,1H),2.05–1.86(m,5H),1.84–1.52(m,7H),1.50–1.30(m,8H),1.30-1.10(m,6H),0.97(d,J＝6.4Hz,3H),0.88–0.76(m,3H)。
实例15
Hy-B-CIDE-2的合成
N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-甲氧基丙酰氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：(S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-甲氧基丙酸
在室温向2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯(500mg,3.22mmol)和NaHCO3(810mg,9.64mmol)在水(10mL)中的溶液中添加甲基O-甲基-L-丝氨酸(384mg,3.22mmol)。将反应在室温搅拌2小时。用KHSO4将pH调节为5。产物用二氯甲烷萃取四次。合并的有机层用盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将溶剂在真空下浓缩，以得到600mg(产率93％)白色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：M-＝198。
步骤2：(S)-(5-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-甲氧基丙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
将(5-氨基戊基)氨基甲酸叔丁酯(0.62mL,2.97mmol)、(S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-甲氧基丙酸(600mg,3.01mmol)、HATU(1.50g,3.94mmol)和DIPEA(1.20g,9.3mmol)在DMF(10mL)中的溶液在室温搅拌1小时。反应用EtOAc稀释并用水洗涤。将有机层合并，在真空下干燥，并在真空下浓缩。将粗品通过硅胶快速色谱法(梯度：0％-100％乙酸乙酯/石油醚)纯化，以得到150mg(产率13％)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝384。
步骤3：(S)-N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-甲氧基丙酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
将(S)-(5-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-甲氧基丙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(25.0mg,0.0700mmol)在二氯甲烷(3mL)和2,2,2-三氟乙酸(1mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩，以得到18mg(粗品)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝284。
步骤4：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-甲氧基丙酰氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(60.0mg,0.0400mmol)、(S)-N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-甲氧基丙酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)(18.0mg，粗品)和DIPEA(54.2mg,0.420mmol)在DMF(2mL)中的溶液中添加HATU(19.2mg,0.0500mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将残余物通过制备型HPLC(XBridgeShield RP18 OBD柱，30×150mm 5um；流动相A：水(10mmol/L NH4HCO3)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在12分钟内由6％ B增加至21％ B；254nm；RT1：14.45)纯化，以得到34mg(产率44％)白色固体状Hy-B-CIDE-2。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1694。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.22(s,1H),9.52(s,1H),8.99(d,J＝1.5Hz,1H),8.40(d,J＝7.7Hz,1H),8.03(t,J＝5.7Hz,1H),7.89(d,J＝6.6Hz,3H),7.68(d,J＝8.3Hz,2H),7.57(t,J＝7.4Hz,2H),7.50-7.28(m,8H),7.18–7.10(m,2H),7.10-6.90(m,3H),6.66(s,1H),6.28(s,1H),6.12(s,1H),5.10(s,3H),4.91(t,J＝7.2Hz,1H),4.71–4.66(m,1H),4.60-4.45(m,4H),4.40–4.27(m,5H),3.89–3.79(m,5H),3.70-3.65(m,4H),3.50-3.40(m,3H),3.17(s,4H),3.13-3.08(m,4H),3.06–2.96(m,6H),2.75(d,J＝4.5Hz,8H),2.47-2.43(m,5H),2.42-2.35(m,4H),2.25-2.15(m,1H),2.10-1.55(m,10H),1.52–1.27(m,9H),1.27-1.10(m,6H),0.97(dd,J＝6.5,3.7Hz,3H),0.88-0.75(m,3H)。
实例16
Hy-B-CIDE-5的合成
N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(60mg,0.0420mmol)、1-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸盐)(12.4mg，粗品)和DIPEA(54.2mg,0.420mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(19.2mg,0.0505mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将反应溶液通过制备型HPLC(柱：Xselect CSH C18 OBD柱30*150mm5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在12分钟内，5％ B至25％ B，25％ B；波长：254/220nm；RT1(分钟)：12分钟)纯化，以得到34.3mg(产率51％)白色固体状Hy-B-CIDE-5。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1608。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.21(s,1H),9.59(br,1H),8.99(d,J＝1.6Hz,1H),8.38(d,J＝7.6Hz,1H),8.11(t,J＝5.9Hz,1H),7.86(dd,J＝18.6,7.0Hz,2H),7.68–7.51(m,4H),7.49–7.26(m,9H),7.14(t,J＝7.5Hz,1H),7.07(s,3H),6.67(d,J＝6.5Hz,1H),6.29(s,1H),6.11(s,1H),5.10(s,2H),4.91(t,J＝7.3Hz,1H),4.60-4.40(m,5H),4.38–4.31(m,3H),4.29(s,1H),3.50-3.05(m,25H),2.85(s,3H),2.75(s,6H),2.46(s,9H),2.05–1.87(m,5H),1.86–1.55(m,8H),1.50-1.30(m,5H),1.25-1.15(m,4H),0.97(d,J＝6.6,3H),0.89-0.70(m,3H)。
实例17
Hy-B-CIDE-8的合成
N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：(5-((2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
在氮气下，将(5-(甲基氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(1.00g,4.62mmol)、N-(2-溴乙基)氨基甲酸苄酯(1.80g,6.97mmol)和DIPEA(1.80g,13.9mmol)在乙腈(10mL)中的溶液在50℃搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩并添加水。所得溶液用DCM萃取，并合并有机层。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-5％MeOH/DCM)纯化，以得到1.30g(产率71％)无色油状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)：[M+H]+＝394。
步骤2：(5-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
在氢气(3atm)下，将甲胺(在THF中的2M)(7.5mL,15.2mmol)和10％ Pd/C(240mg)在MeOH(50mL)中的溶液在室温搅拌30分钟(以去除在MeOH中的微量甲醛)。然后添加(5-((2-(((苄氧基)羰基)氨基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(1.20g,3.05mmol)并将反应在室温搅拌2小时。过滤后，将滤液在减压下浓缩，以得到810mg(粗品)黄色油状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)：[M+H]+＝260。
步骤3：(5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯
在氮气下，将(5-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(800mg,3.08mmol)和顺丁烯二酸酐(300mg,3.05mmol)在CH3COOH(10mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将溶液在真空下浓缩，并将残余物与DCM/己烷(1:4)一起研磨3次，添加甲苯(10mL)，接着添加三乙胺(1.56g,15.4mmol)和4A分子筛(2.86g)。将反应在110℃搅拌1小时。过滤后，将滤液在减压下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-100％EtOAc/石油醚)纯化，以得到825mg黄色油状标题化合物。LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝340。
步骤4：1-(2-((5-氨基戊基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸)
在氮气下，将(5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(13.0mg，0.0400mmol)在DCM(1mL)和2,2,2-三氟乙酸(0.3mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。蒸发溶剂，以得到30mg(粗品)黄色油状标题化合物。LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝240。
步骤5：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在氮气下，在室温向1-(2-((5-氨基戊基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸盐)(8.0mg，粗品)、1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(40.0mg，0.0300mmol，中间体10)和DIPEA(38.7mg,0.300mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液中添加HATU(14.0mg,0.0400mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将粗品通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在11分钟内，19％ B至34％ B，34％ B；波长：254/220nm；RT1(分钟)：10；以得到7.0mg白色固体状Hy-B-CIDE-8。
LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝1649。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.13(s,1H),9.57(s,1H),8.99(s,1H),8.41(d,J＝7.7Hz,1H),8.00–7.80(m,3H),7.55(d,J＝8.3Hz,2H),7.50–7.39(m,2H),7.39–7.11(m,8H),7.08–6.97(m,2H),6.96(s,2H),6.56(d,J＝6.5Hz,1H),6.18(s,1H),6.00(s,1H),4.98(s,2H),4.79(t,J＝7.2Hz,1H),4.50–4.12(m,10H),3.60–3.51(m,5H),3.37(q,J＝11.1,10.2Hz,10H),3.06–2.83(m,11H),2.72–2.57(m,9H),2.45–2.35(m,7H),2.31–2.10(m,2H),1.99–1.85(m,3H),1.79(s,2H),1.72–1.39(m,9H),1.34(d,J＝7.0Hz,3H),1.25(d,J＝7.0Hz,3H),1.20–0.90(m,7H),0.85(dd,J＝6.6,3.7Hz,3H),0.69(dd,J＝10.5,6.6Hz,3H)。
实例18
Hy-B-PCIDE-2的合成
(3R,5S)-1-((2R)-2-(3-(2-(4-((1r,3R)-3-((4-(3-(3-氨基-6-(2-((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-基)乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：((3R,5S)-5-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)吡咯啶-3-基)磷酸二叔丁酯
在氮气下，在0℃向(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-4-羟基吡咯啶-2-甲酰胺(500mg,0.921mmol)和1H-四唑(6.1mL，在ACN中的0.45M)在THF(15mL)中的溶液中添加二异丙基亚膦酰胺二叔丁酯(511mg,1.84mmol)。所得溶液在室温搅拌隔夜。然后在-30℃添加t-BuOOH(在癸烷中5M)(0.74mL,3.69mmol)并在室温搅拌5小时。用NaHSO3淬灭反应。所得溶液用EtOAc萃取，并合并有机层。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(梯度：0％-87％乙酸乙酯/石油醚)纯化，以得到420mg(产率62％)无色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝735。
步骤2：(3R,5S)-5-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐
在氮气下，将((3R,5S)-5-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)吡咯啶-3-基)磷酸二叔丁酯(70.0mg,0.100mmol)在HCOOH(0.5mL)和水(0.5mL)中的溶液在60℃搅拌1小时。将溶液在真空下浓缩，以得到50mg(粗品)固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝549。
步骤3：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-(膦酰氧基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
在氮气下，将(3R,5S)-5-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐(62.8mg,0.115mmol)、1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(56.0mg,0.0602mmol)、CH3COONa(14.9mg,0.182mmol)在甲醇(1.5mL)和二氯甲烷(0.5ml)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(5.6mg,0.0891mmol)，并在室温搅拌3小时。反应通过水淬灭。将反应混合物在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到60mg(产率65％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1464。
步骤4：(3R,5S)-1-((2R)-2-(3-(2-(4-((1r,3R)-3-((4-(3-(3-氨基-6-(2-((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-基)乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-(膦酰氧基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(60.0mg,0.0410mmol)、1-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸盐)(10.5mg，粗品)和DIPEA(54.2mg,0.420mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(18.7mg,0.0492mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将粗品通过制备型HPLC(柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在12分钟内，14％ B至23％ B，23％ B；波长：254/220nm；RT1(分钟)：11.75分钟)纯化，以得到20.3mg(产率30％)白色固体状Hy-B-PCIDE-2。
LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1643。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.24(s,1H),9.67(s,1H),8.56(d,J＝7.3Hz,1H),8.12(s,1H),7.88–7.73(m,4H),7.68–7.49(m,4H),7.49–7.25(m,6H),7.20-6.80(m,4H),6.61(s,1H),6.21-5.95(m,2H),5.30-5.00(m,3H),4.90(t,J＝6.9Hz,1H),4.76(s,1H),4.52–4.27(m,7H),3.76–3.67(m,6H),3.55-3.40(m,9H),3.30-3.20(m,5H),3.15-2.95(m,5H),2.81(s,3H),2.73(s,6H),2.45-2.30(m,9H),2.01–1.54(m,15H),1.49-1.20(m,5H),0.94(d,J＝6.4Hz,3H),0.79(d,J＝7.0Hz,3H)。
实例19
Hy-B-CIDE-7的合成
N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-氧代-1-((4-((2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯
在氮气下，将(S)-1-((1-((4-((2-溴苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯(500mg,0.852mmol)、B2Pin2(649mg,2.55mmol)、Pd(dppf)Cl2(124mg,0.170mmol)和KOAc(250mg,2.55mmol)在1,4-二噁烷(5mL)中的溶液在80℃搅拌2小时。将反应用DCM稀释，并用水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法(梯度：0％-20％ MeOH/DCM(含0.3％7M NH3/MeOH))纯化，以得到390mg(产率72％)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝636。
步骤2：4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-(2-((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯
在氮气下，将(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-氧代-1-((4-((2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯(390mg,0.614mmol)、4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-氯哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(395mg,0.676mmol)、Ad2nBuPPdG2(41.0mg,0.061mmol)和K2CO3(260mg,1.22mmol)在二噁烷(5.0mL)和H2O(1.2mL)中的溶液在95℃搅拌2小时。将所得溶液用水稀释，并用EtOAc萃取。将有机层在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％MeOH(0.1％NH4HCO3))纯化，以得到310mg(产率47％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1060。
步骤3：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-((1-(叔-丁氧基羰基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸锂
将4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-(2-((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(270mg,0.255mmol)和LiOH.H2O(32.1mg,0.765mmol)在THF(2mL)和H2O(2mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将所得混合物在真空下浓缩。该粗品直接用于下一步。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1032。
步骤4：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
将1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-((1-(叔丁氧羰基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸锂(从上一步得到的粗品)在TFA(0.75mL)和HFIP(14mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。将所得混合物在真空下浓缩。将所获得的粗产物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％MeOH(0.1％NH4HCO3))纯化，以得到170mg(产率71％)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝932。
步骤5：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
在氮气下，将1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(170.0mg,0.183mmol)、(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯啶-2-甲酰胺(111mg,0.237mmol)、HOAc(21.9mg,0.365mmol)在DCM(1.5mL)和MeOH(0.5mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后在0℃添加NaBH3CN(17.3mg,0.274mmol)并在室温搅拌30分钟。用水淬灭反应。将所得溶液在真空下浓缩。将所获得的粗产物通过预填充的C18柱(梯度：在水中的0～100％MeOH(0.05％NH4HCO3))纯化，以得到180mg(产率71％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1384。
步骤5：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(2,2,2-三氟乙酸盐)(60.0mg，粗品)、1-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(12.8mg,0.065mmol)、DIPEA(56.0mg,0.434mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(19.8mg,0.052mmol)。将反应在室温搅拌30分钟。将所得溶液通过制备型HPLC(Xselect CSH C18 OBD柱30x 150mm5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在8分钟内由8％ B至32％B；254/220nm；RT1：8分钟)纯化，以得到29.5mg(产率43％)白色固体状Hy-B-CIDE-7。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1563。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.22(s,1H),9.69(br,2H),8.46(d,J＝7.3Hz,1H),8.12(s,1H),7.90-7.70(m,4H),7.70-7.50(m,4H),7.51–7.27(m,6H),7.19–6.96(m,5H),6.65(s,1H),6.17–5.98(m,2H),5.22(s,1H),5.10(s,2H),4.90(d,J＝7.2Hz,1H),4.51(s,4H),4.45–4.19(m,5H),3.76–3.65(m,7H),3.43(s,5H),3.30-3.20(m,5H),3.14–2.97(m,6H),2.84(s,3H),2.75(s,7H),2.42-2.30(m,7H),2.27–2.24(m,1H),2.07–1.52(m,17H),1.50-1.20(m,5H),0.96(t,J＝6.3Hz,3H),0.82(dd,J＝9.1,6.6Hz,3H)。
实例20
Hy-B-CIDE-9的合成
6-(8-氯-4-(2-(二甲基氨基)乙基)-5,6-二氢-4H-[1,4]氧氮杂并[5,6,7-de]喹唑啉-9-基)-4-甲基-5-(三氟甲基)吡啶-2-胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-(2-(甲氧基甲氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，将4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-氯哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.50g,2.56mmol)、2-(甲氧基甲氧基)苯基硼酸(559mg,3.07mmol)、Pd(PPh3)4(591mg,0.512mmol)和K2CO3(1.06g,7.68mmol)在二噁烷(12.5mL)和H2O(2.5mL)中的溶液在100℃搅拌1小时。将反应混合物用水稀释并用DCM萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥并在减压下浓缩。将所获得的粗产物通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-10％ MeOH/DCM)，以得到1.33g(产率75％)黄色固体状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)：[M+H]+＝688。
步骤2：4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-((((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-(甲氧基甲氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，在0℃向4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-(2-(甲氧基甲氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(400mg,0.582mmol)、(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯(882mg,2.04mmol)和DIPEA(1.19g,9.20mmol)在THF(10mL)中的溶液中添加三光气(313mg,1.05mmol)。将反应在室温搅拌0.5小时。蒸发溶剂，并将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ MeOH(0.05％NH4HCO3))纯化，以得到160mg(产率23％)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1148。
步骤3：1-(((2S)-6-(二甲基氨基)-1-((4-((((6-(2-氨基苯基)-4-(8-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
将4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-((((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-(甲氧基甲氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(60.0mg,0.0520mmol)和LiOH.H2O(6.58mg,0.156mmol)在THF(0.5ml)和H2O(0.5ml)中的溶液在室温搅拌1小时。将所得混合物在真空下浓缩。然后将其溶解在浓HCl(0.33ml)和H2O(0.67ml)的溶液中。将反应在室温搅拌20分钟。将所得混合物在0℃用饱和NaHCO3溶液碱化至pH＝8，并通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％MeOH(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到35mg黄色固体状标题化合物。LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝976。
步骤4：1-(((2S)-1-((4-((((4-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
在氮气下，将1-(((2S)-6-(二甲基氨基)-1-((4-((((6-(2-羟基苯基)-4-(8-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(30.0mg,0.0310mmol)、(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯啶-2-甲酰胺(28.8mg,0.0620mmol)和HOAc(3.69mg,0.0620mmol)在DCM(0.75mL)和MeOH(0.25mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(2.90mg,0.0460mmol)并在室温搅拌0.5小时。在0℃用水淬灭反应。将所得混合物在真空下浓缩并通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ MeOH(0.05％NH4HCO3))纯化，以得到27mg白色固体状标题化合物。LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝1428。
步骤5：(4-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)胺甲酸4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄酯(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((((4-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(22.0mg,0.0150mmol)、1-(2-((5-氨基戊基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸盐)(5.5mg，粗品)和DIPEA(19.9mg,0.154mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(7.62mg,0.0200mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将所得混合物通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XBridgeShield RP18 OBD柱，30*150mm，5μm；流动相A：水(0.05％ TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在10分钟内，2％ B至32％ B，32％ B；波长：220/254nm；RT(分钟)：11.93，以得到13.8mg白色固体状Hy-B-CIDE-9。
LCMS(ESI,m/z)：[M+H]+＝1649。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.17(s,1H),10.03(s,1H),9.70(br,1H),9.47(br,2H),8.47(d,J＝7.3Hz,1H),7.99–7.83(m,4H),7.78(m,J＝9.1,7.3Hz,2H),7.64(d,J＝8.2Hz,3H),7.45(m,J＝8.5,2.4Hz,2H),7.37–7.25(m,3H),7.08(d,J＝3.9Hz,2H),6.98–6.90(m,2H),6.72(s,1H),6.22(s,1H),6.14(s,1H),5.20(s,1H),5.11(s,2H),4.89(t,J＝7.0Hz,1H),4.69(s,2H),4.50(s,2H),4.44–4.38(m,1H),4.31(t,J＝11.3Hz,3H),3.75–3.69(m,7H),3.42–3.39(m,2H),3.38–3.33(m,2H),3.33–3.27(m,3H),3.27–3.12(m,7H),3.12–3.00(m,4H),3.00(s,3H),2.74(s,6H),2.46–2.38(m,7H),2.37–2.09(m,1H),2.05–2.00(m,2H),1.95–1.85(m,5H),1.85–1.75(m,5H),1.75–1.59(m,5H),1.43(t,J＝6.6Hz,3H),1.33(d,J＝7.0Hz,4H),1.30–1.20(m,3H),0.94(d,J＝6.5Hz,3H),0.78(d,J＝6.8Hz,3H)。
实例21
Hy-B-CIDE-10的合成
(4-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)胺甲酸4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((5-((S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰氨基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄酯
步骤1：(S)-N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰胺(2,2,2-三氟乙酸)
在氮气下，将(S)-(5-(3-(叔丁氧基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)戊基)氨基甲酸叔丁酯(8.8mg,0.0094mmol)在TFA(0.3mL)中的溶液在室温搅拌1.5小时。将溶剂在真空下浓缩，以得到10mg(粗品)无色油状标题化合物。LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝270。
步骤2：(4-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)胺甲酸4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((5-((S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰氨基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄酯(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((((4-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(27.0mg,0.0190mmol)、(S)-N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰胺(2,2,2-三氟乙酸)(8.8mg，粗品)和DIPEA(24.4mg,0.189mmol)在DMF(0.9mL)中的溶液中添加HATU(9.3mg,0.025mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将粗品通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：Xselect CSH C18 OBD柱30*150mm 5μm，n；流动相A：水(0.05％ TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在12分钟内，15％ B至27％ B，27％ B；波长：254/220nm；RT(分钟)：12；以得到9.9mg白色固体状Hy-B-CIDE-10。
LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝1679。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.16(s,1H),10.04(s,1H),9.60(br,1H),9.35(br,1H),8.47(d,J＝7.4Hz,1H),8.06–7.84(m,4H),7.79(t,J＝8.3Hz,2H),7.69–7.58(m,3H),7.45(d,J＝8.4,2H),7.40–7.34(m,3H),7.04(s,2H),7.00–6.88(m,2H),6.72(s,1H),6.21(s,1H),6.14(s,1H),5.19(s,1H),5.11(s,2H),4.89(t,J＝7.1Hz,1H),4.68(d,J＝7.1Hz,2H),4.55–4.23(m,7H),3.97–3.82(m,2H),3.67(d,J＝9.5Hz,3H),3.62–3.52(m,8H),3.17–2.95(m,10H),2.73(d,J＝4.1Hz,6H),2.45–2.30(m,8H),2.19–1.97(m,4H),1.95–1.85(m,5H),1.82–1.53(m,8H),1.45–1.30(m,8H),1.25–1.15(m,4H),0.95(t,J＝6.4Hz,3H),0.90–0.70(m,3H)。
实例22
Hy-B-CIDE-11的合成
N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-((1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
在氮气下，将4-((1r,3r)-3-((4-(3-(3-氨基-6-氯哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(550mg,0.900mmol)、(S)-1-((6-(二甲基氨基)-1-氧代-1-((4-((2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯(600mg,0.900mmol)、Pd(dppf)Cl2(138mg,0.200mmol)和Na2CO3(300mg,2.800mmol)在1,4-二噁烷(10mL)和水(2mL)中的溶液在110℃搅拌1小时。将反应冷却至室温并添加LiOH.H2O(160mg,3.800mmol)。将反应在室温搅拌1小时。将所得混合物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-70％ ACN(0.5％ NH4HCO3))纯化，以得到383mg(产率39％)棕色固体状标题化合物。LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝1032。
步骤2：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(2,2,2-三氟乙酸盐)
将1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-((1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(383.0mg,0.3700mmol)在DCM(1mL)和2,2,2-三氟乙酸(1mL)中的溶液在室温搅拌30分钟。将溶剂在真空下蒸发，并且将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％ TFA))纯化，以得到290mg白色固体状标题化合物。LCMS(ESI,m/z)：[M+H]+＝931。
步骤3：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
将1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(2,2,2-三氟乙酸盐)(260mg,0.248mmol)、(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁烯基)吡咯啶-2-甲酰胺(195mg,0.420mmol)和NaOAc(228mg,2.79mmol)在MeOH(1mL)和DCM(3mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(52.0mg,0.830mmol)并在室温搅拌1小时。将粗品通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ MeOH(0.05％ NH4HCO3))，以得到210mg黄色固体状标题化合物。LCMS(ESI，m/z)：[M+H]+＝1383。
步骤4：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(50.0mg,0.0400mmol)、1-(2-((5-氨基戊基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸盐)(30.0mg，粗品)和DIPEA(46.6mg,0.360mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(18.0mg,0.0500mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将粗品通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在12分钟内，8％ B至26％ B，26％ B；波长：254/220nm；RT(分钟)：12；以得到16.7mg白色固体状Hy-B-CIDE-11。LCMS(ESI,m/z)：[M+H]+＝1604。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.12(s,1H),9.53(s,2H),8.36(d,J＝7.4Hz,1H),8.00–7.77(m,3H),7.74(d,J＝8.1Hz,2H),7.55(d,J＝8.3Hz,2H),7.51–7.39(m,2H),7.45–7.29(m,5H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),7.02(t,J＝7.6Hz,1H),6.96(s,2H),6.87(s,1H),6.51(s,1H),6.04(d,J＝9.9Hz,2H),5.09(s,1H),4.97(s,2H),4.80(t,J＝7.0Hz,1H),4.69–4.49(m,1H),4.39(s,4H),4.37–4.30(m,1H),4.27–4.03(m,3H),3.70–3.52(m,6H),3.40–3.30(m,5H),3.03–2.78(m,11H),2.82–2.70(m,9H),2.45 -2.30(m,8H),2.22–2.15(m,1H),1.97–1.84(m,4H),1.77(s,4H),1.69–1.54(m,5H),1.54–1.40(m,5H),1.39–1.28(m,3H),1.25–1.14(m,8H),0.84(t,J＝6.3Hz,3H),0.69(dd,J＝9.2,6.6Hz,3H)。
实例23
Hy-B-CIDE-12的合成
N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)-N-(5-((S)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰氨基)戊基)环丁烷-1,1-二甲酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)
在氮气下，在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(40.0mg,0.0300mmol)、(S)-N-(5-氨基戊基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3-羟基丙酰胺(2,2,2-三氟乙酸盐)(30.0mg，粗品)和DIPEA(37.0mg,0.290mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液中添加HATU(14.0mg,0.0400mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将产物通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：Xselect CSH C18 OBD管柱30*150mm 5μm，n；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在12分钟内，12％ B至27％ B，27％ B；波长：254/220nm；RT(分钟)：12；以得到7.2mg白色固体状Hy-B-CIDE-12。
LCMS(ESI,m/z)：[M+H]+＝1634。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.23(s,1H),9.59(d,J＝47.0Hz,2H),8.49(d,J＝7.3Hz,1H),8.00–7.75(m,6H),7.68(d,J＝8.2Hz,2H),7.57(t,J＝8.6Hz,2H),7.52–7.28(m,6H),7.14(t,J＝7.6Hz,1H),7.05(s,2H),6.98(s,1H),6.64(s,1H),6.17(d,J＝8.2Hz,2H),5.25–5.05(m,4H),4.92(t,J＝6.8Hz,2H),4.58–4.25(m,9H),4.01–3.85(m,3H),3.74–3.66(m,3H),3.17–2.96(m,11H),2.80–2.70(m,7H),2.45–2.30(m,8H),2.29–2.18(m,2H),2.16–1.52(m,18H),1.49–1.13(m,12H),0.97(d,J＝6.4Hz,3H),0.82(dd,J＝9.3,6.6Hz,3H)。
实例24
Hy-B-CIDE-13的合成
(4-(5-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)胺甲酸4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄酯(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：4-((1r,3r)-3-((4-(8-(6-(2-(((烯丙氧基)羰基)氧基)苯基)-3-氨基哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，在0℃向4-((1r,3r)-3-((4-(8-(3-氨基-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(480mg,7.28mmol)和DPIEA(847mg,65.6mmol)在DCM(6mL)中的溶液中添加AllocCl(306mg,25.5mmol)。将所得溶液在室温搅拌30分钟。将粗品通过硅胶快速色谱法(溶剂梯度：0-5％MeOH/DCM)，以得到505mg(产率86％)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝744。
步骤2：4-((1r,3r)-3-((4-(8-(3-((((4-((S)-6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-(((烯丙氧基)羰基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，在0℃向4-((1r,3r)-3-((4-(8-(6-(2-(((烯丙氧基)羰基)氧基)苯基)-3-氨基哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(460mg,0.619mmol)、(S)-1-((6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯(908mg,1.86mmol)和DIPEA(480mg,3.72mmol)在THF(6mL)中的溶液中添加三光气(208mg,0.433mmol)。将反应在室温搅拌0.5小时。蒸发溶剂，并将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到230mg(产率29％)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1260。
步骤3：4-((1r,3r)-3-((4-(8-(3-((((4-((S)-6-氨基-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，将4-((1r,3r)-3-((4-(8-(3-((((4-((S)-6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-(((烯丙氧基)羰基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(230mg,0.183mmol)、吡咯啶(131mg,1.83mmol)和Pd(PPh3)4(22.0mg,0.01830mmol)在DCM(4mL)中的溶液在室温搅拌1小时。蒸发溶剂，并且粗品直接用于下一步骤。
步骤4：4-((1r,3r)-3-((4-(8-(3-((((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，将4-((1r,3r)-3-((4-(8-(3-((((4-((S)-6-氨基-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(230mg，粗品)和37％ CH2O水溶液(230mg)在MeOH(4mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(63.5mg,1.06mmol)并将溶液在室温搅拌15分钟。用水淬灭反应，并且将所得残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-90％ MeOH(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到140mg(产率55％)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1120。
步骤5：1-(((S)-1-((4-((((4-(5-(2-((1r,3r)-3-((1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
在氮气下，将4-((1r,3r)-3-((4-(8-(3-((((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-5-基)吡啶-2-基)氧基)环丁氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(140mg,0.125mmol)和LiOH.H2O(15.9mg,0.375mmol)在THF(2mL)和H2O(2mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将所得混合物在真空下浓缩，以得到160mg(粗品)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1092。
步骤6：1-(((S)-6-(二甲基氨基)-1-((4-((((6-(2-氨基苯基)-4-(5-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧)环丁氧基)吡啶-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
在氮气下，将1-(((S)-1-((4-((((4-(5-(2-((1r,3r)-3-((1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(160mg，粗品)在HFIP(4.8mL)和2,2,2-三氟乙酸(0.25mL)中的溶液在室温搅拌15分钟。将溶剂在真空下蒸发并通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-70％ ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到74.0mg(产率51％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝992。
步骤7：1-(((S)-1-((4-((((4-(5-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
在氮气下，将1-(((S)-6-(二甲基氨基)-1-((4-((((6-(2-羟基苯基)-4-(5-(2-((1r,3r)-3-(哌啶-4-基氧)环丁氧基)吡啶-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(30.0mg,0.0300mmol)、(2S,4R)-N-((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)吡咯啶-2-甲酰胺(28.5mg,0.061mmol)和CH3COOH(3.60mg,0.0610mmol)在MeOH(0.25mL)和DCM(0.75mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(3.00mg,0.0450mmol)并在室温搅拌0.5小时。将粗品通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-80％ MeOH(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到18.0mg(产率41％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1444。
步骤8：(4-(5-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)胺甲酸4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄酯(2,2,2-三氟乙酸盐)
在氮气下，在室温向1-(((S)-1-((4-((((4-(5-(2-((1R,3r)-3-((1-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-氰基苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌啶-4-基)氧基)环丁氧基)吡啶-4-基)-2-氧杂-5,8-二氮杂螺[3.5]壬烷-8-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(18.0mg,0.0125mmol)、1-(2-((5-氨基戊基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸盐)(13.0mg，粗品)和DIPEA(25.8mg,0.200mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(9.50mg,0.025mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将粗品通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：Xselect CSH C18 OBD柱30*150mm 5μm，n；流动相A：水(0.05％ TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在10分钟内，14％ B至28％ B，28％ B；波长：254/220nm；RT(分钟)：10，以得到14.9mg(产率71.7％)白色固体状Hy-B-CIDE-13。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1665。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.17(d,J＝17.2Hz,2H),9.55(br,1H),9.40(br,1H),8.49(d,J＝7.3Hz,1H),8.03(d,J＝7.9Hz,1H),7.95–7.82(m,3H),7.79(d,J＝8.3Hz,2H),7.67(d,J＝8.4Hz,2H),7.47(m,J＝8.4,2.7Hz,2H),7.38(t,J＝8.5Hz,3H),7.10(s,2H),7.02–6.92(m,2H),6.42–6.34(m,1H),6.16(s,1H),5.75(s,1H),5.20(s,1H),5.14(s,2H),4.91(t,J＝7.2Hz,1H),4.63(d,J＝4.4Hz,3H),4.51(s,2H),4.42(s,1H),4.33(t,J＝8.2Hz,2H),3.81–3.66(m,10H),3.21–2.94(m,13H),2.82–2.74(m,9H),2.45–2.20(m,12H),2.18–2.00(m,3H),1.92–1.70(m,7H),1.70–1.50(m,5H),1.47(q,J＝7.1Hz,3H),1.39–1.21(m,8H),0.96(d,J＝6.5Hz,3H),0.80(d,J＝6.8Hz,3H)。
实例25
Hy-B-CIDE-14的合成
(4-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)胺甲酸4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄酯(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：(3R)-4-(2-((4-(3-(3-((((4-((S)-6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-(((烯丙氧基)羰基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，在0℃向(3R)-4-(2-((4-(3-(6-(2-(((烯丙氧基)羰基)氧基)苯基)-3-氨基哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(500mg,0.714mmol)、(S)-1-((6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-1-((4-(羟基甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸乙酯(1.05g,2.15mmol)和DIPEA(554mg,4.29mmol)在DCM(15mL)中的溶液中添加三光气(109mg,0.367mmol)在DCM(1mL)中的溶液。将反应在室温搅拌2小时。将溶剂在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ CH3CN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到480mg(产率55％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1216。
步骤2：(3R)-4-(2-((4-(3-(3-((((4-((S)-6-氨基-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在氮气下，在室温向(3R)-4-(2-((4-(3-(3-((((4-((S)-6-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-(((烯丙氧基)羰基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(400mg,0.329mmol)、吡咯啶(234mg,3.29mmol)在DCM(5mL)中的溶液中添加Pd(PPh3)4(76.0mg,0.0658mmol)。将反应在室温搅拌1小时。反应混合物用DCM(100mL)稀释并用水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩，以得到390mg(粗品)黄色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1048。
步骤3：(3R)-4-(2-((4-(3-(3-((((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将(3R)-4-(2-((4-(3-(3-((((4-((S)-6-氨基-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(465mg,0.440mmol)和37％ CH2O水溶液(465mg,5.73mmol)在CH3OH(5mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(140mg,2.22mmol)并在室温搅拌1小时。用水(0.2mL)淬灭反应。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ MeOH(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到260mg(产率54％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M]+＝1077。
步骤4：1-(((2S)-6-(二甲基氨基)-1-((4-((((6-(2-羟基苯基)-4-(8-(2-(2-((R)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
将(3R)-4-(2-((4-(3-(3-((((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-(乙氧基羰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-甲酸叔丁酯(75.0mg,0.0697mmol)和LiOH.H2O(8.4mg,0.210mmol)在THF(5mL)和水(5mL)中的溶液在室温搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩。然后添加在HFIP(3mL)中的5％ TFA，并将溶液在室温搅拌1小时。将溶剂在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％MeOH(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到55.0mg(产率83％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M]+＝949。
步骤5：1-(((2S)-6-(二甲基氨基)-1-((4-((((4-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
在氮气下，将1-(((2S)-6-(二甲基氨基)-1-((4-((((6-(2-羟基苯基)-4-(8-(2-(2-((R)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(20.0g,0.0211mmol)、(2S,4R)-4-羟基-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺(19.4mg,0.0359mmol)和NaOAc(4.0mg,0.0488mmol)在甲醇(1.5mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(5.2mg,0.0827mol)并在室温搅拌3小时。将反应溶液在真空下浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-100％ CH3OH(0.05％NH4HCO3))纯化，以得到18mg(产率58％)白色固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1473。
步骤6：(4-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)胺甲酸4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((5-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)戊基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄酯(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-6-(二甲基氨基)-1-((4-((((4-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-6-(2-羟基苯基)哒嗪-3-基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(40.0mg,0.0272mmol)、1-(2-((5-氨基戊基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸盐)(9.70mg，粗品)和DIPEA(35.1mg,0.272mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(13.5mg,0.0355mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将粗品通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XSelect CSH Fluoro Phenyl，30*150mm，5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在10分钟内，15％ B至20％ B；波长：254/220nm；RT(分钟)：10.5，以得到13.0mg(产率28.3％)黄色固体状Hy-B-CIDE-14。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝1808。1H NMR(300MHz,DMSO-d6,ppm)δ10.09(s,1H),9.97(s,1H),9.50(s,2H),8.88(d,J＝1.3Hz,1H),8.30(d,J＝7.7Hz,1H),8.00–7.80(m,4H),7.58–7.50(m,3H),7.39–7.16(m,7H),6.96(s,2H),6.84(ddd,J＝11.0,7.0,2.3Hz,2H),6.65(d,J＝6.6Hz,1H),6.29(s,1H),6.00(s,1H),5.01(s,2H),4.95–4.80(m,1H),4.59(s,2H),4.37(s,2H),4.35–4.21(m,4H),4.21–4.15(m,2H),3.59–3.48(m,6H),3.40–3.30(m,4H),3.27–2.97(m,14H),2.89(s,4H),2.70–2.60(m,9H),2.45–2.34(m,4H),2.30–2.19(m,2H),2.17–2.03(m,2H),2.05–1.83(m,5H),1.83–1.66(m,5H),1.66–1.49(m,4H),1.34(d,J＝7.1Hz,3H),1.25(d,J＝7.0Hz,3H),1.20–1.10(m,6H),0.85(d,J＝6.6Hz,3H),0.69(dd,J＝10.7,6.6Hz,3H)。
实例26
Hy-B-CIDE-3的合成
步骤1：(2-((2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
将碳酸钾(10.9g,78.7mmol)、2-(2-溴乙基)异二氢吲哚-1,3-二酮(10.0g,39.4mmol)和(2-(甲基氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(8.23g,47.2mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(200mL)中的混合物在90℃在N2气氛下搅拌16小时。将反应冷却至25℃并用水(30mL)稀释并用乙酸乙酯(50mL x 3)萃取。有机物用盐水(20mL x 2)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，并浓缩至干。将残余物通过快速色谱法(硅胶，100至200目，在二氯甲烷中的0-15％甲醇)纯化，以得到白色固体状标题化合物(4.5g，产率32.9％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)7.92-7.82(m,2H),7.73(m,2H),4.32-4.28(m,1H),4.01-3.98(m,1H),3.84-3.74(m,1H),3.50(s,1H),3.37-3.09(m,3H),2.94-2.78(m,1H),2.69-2.65(m,1H),2.55-2.50(m,1H),2.31-2.35(m,1H),1.49-1.32(m,10H)。
步骤2：(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
向(2-((2-(1,3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(4.00g,11.5mmol)在乙腈(60mL)中的搅拌的溶液中逐滴添加一水合肼(22.4mL,230mmol)。将反应混合物在70℃在N2气氛下搅拌16小时。将反应混合物倒入冰水(15.0mL)中，并用乙酸乙酯(20.0mL x 3)萃取。合并的有机层用盐水(20.0mL x 2)洗涤，并用无水硫酸钠干燥，浓缩，以得到粗产物，该粗产物通过制备型TLC(在二氯甲烷中的5％甲醇)纯化，以得到无色油状标题化合物(1.50g，产率60％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.13-4.10(m,2H),3.43-3.33(m,2H),3.30-3.25(m,2H),2.96-2.92(m,5H),1.41(s,9H)。
步骤3：(2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
向(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(100mg,0.46mmol)在四氢呋喃(2.00mL)中的溶液中添加2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-甲酸甲酯(107mg,0.69mmol)和碳酸氢钠(116mg,1.38mmol)在水(1.00mL)中的溶液。将反应混合物在0℃搅拌2小时。将反应混合物过滤，并将有机层在真空中浓缩至干。向所得溶液中添加水(20.0mL)并用乙酸乙酯(3x 20mL)萃取。合并的有机层用无水硫酸钠干燥并浓缩至干。残余物通过快速色谱法(硅胶，100至200目，在二氯甲烷中的0-10％甲醇)纯化，以得到无色油状标题化合物(73mg，产率53.4％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)6.71(s,2H),3.65-3.62(m,2H),3.16-3.13(m,2H),2.62-2.41(m,4H),2.25(s,3H),1.45(s,10H)。
步骤4：1-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮2,2,2-三氟乙酸盐
向(2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(73.0mg,0.25mmol)在二氯甲烷(2.0mL)中的混合物中添加三氟乙酸(2.31mL,29.95mmol)。将反应混合物在20℃搅拌5小时。将反应浓缩，以得到黄色油状标题化合物(40mg,82.6％)。
步骤5：N-((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)-N-(2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)环丁烷-1,1-二甲酰胺
向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-4-(2-((5-((R)-1-((2S,4R)-4-羟基-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷甲酸(40.0mg,0.03mmol)和1-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮2,2,2-三氟乙酸盐(10.5mg,0.03mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(4.00mL)中的混合物中添加N,N-二异丙基乙胺(0.01mL,0.08mmol)、2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(12.8mg,0.03mmol)。将反应混合物在25℃搅拌3小时。将混合物通过油泵浓缩。残余物通过制备型HPLC(Boston Green ODS 150*30mm*5um，水(0.075％三氟乙酸)-乙腈20％-50％)纯化，以得到白色固体状标题化合物(12.0mg，产率26.7％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.19(s,1H),9.02-8.86(m,1H),8.39(d,J＝8.0Hz,1H),7.94(d,J＝6.8Hz,1H),7.87-7.78(m,2H),7.65(d,J＝8.0Hz,2H),7.51-7.41(m,5H),7.36(d,J＝6.8Hz,5H),7.29-7.09(m,1H),6.97(s,2H),6.76(s,1H),6.42(s,1H),6.15-5.96(m,2H),5.07(s,2H),4.93-4.86(m,1H),4.71-4.60(m,2H),4.52-4.24(m,9H),3.66(s,4H),3.33(d,J＝7.2Hz,5H),3.09-2.96(m,8H),2.45(s,3H),2.42-2.34(m,4H),2.29-2.14(m,2H),2.04(d,J＝11.2Hz,3H),1.91(s,2H),1.83-1.55(m,5H),1.51-1.30(m,9H),1.19(d,J＝5.8Hz,5H),0.96(d,J＝6.4Hz,3H),0.86-0.75(m,3H)。
LCMS(ESI)m/z：1609.8[M+H]+。
实例27
Hy-B-PCIDE-1的合成
(3R,5S)-1-((2R)-2-(3-(2-((3R)-4-(2-((4-(3-(3-氨基-6-(2-((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐(2,2,2-三氟乙酸盐)
步骤1：((3R,5S)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基)磷酸二叔丁酯
在氮气下，在0℃向(2S,4R)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-4-羟基-N-((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)吡咯啶-2-甲酰胺(500mg,0.81mmol)和1H-四唑(5.4mL，在ACN中的0.45M)在THF(5mL)中的溶液中逐滴添加二异丙基亚膦酰胺二叔丁酯(451mg,1.63mmol)。将反应在室温搅拌过夜。然后在-30℃添加tBuOOH(0.4mL，在癸烷中的5M)并在-30℃搅拌30分钟。然后将混合物在室温搅拌4小时。将反应用水性NaHSO3淬灭，并用EtOAc萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。将残余物通过预填充的C18柱(溶剂梯度：在水中的0-70％ ACN(0.05％ NH4HCO3))纯化，以得到340mg(产率51％)黄色油状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝807。
步骤2：(3R,5S)-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐
在氮气下，将((3R,5S)-1-((R)-2-(3-(2,2-二乙氧基乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基)磷酸二叔丁酯(150mg,0.185mmol)在HCOOH(0.5mL)和水(0.5mL)中的溶液在60℃搅拌1小时。将溶液在真空下浓缩，以得到121mg(粗品)固体状标题化合物。LC-MS:(ESI,m/z)：[M+H]+＝695。
步骤3：1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-2-甲基-4-(2-((5-((R)-3-甲基-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-(膦酰氧基)吡咯啶-1-基)-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸
将1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-2-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(100mg,0.110mmol)、(3R,5S)-1-((R)-3-甲基-2-(3-(2-氧代乙氧基)异噁唑-5-基)丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐(121mg,0.190mmol)和NaOAc(13.6mg,0.170mmol)在甲醇(1.2mL)和二氯甲烷(0.4mL)中的溶液在室温搅拌1小时。然后添加NaBH3CN(34.7mg,0.550mmol)并在室温搅拌0.5小时。添加水以淬灭反应。将溶剂在真空下浓缩。将产物通过制备型HPLC(柱：YMC-Actus Triart C18ExRS，30*150mm，5μm；流动相A：水(10mmol/L NH4HCO3)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在9分钟内，36％ B至60％B，60％ B；波长：254/220nm；RT1(分钟)：7.63)纯化，以得到30.0mg(产率18％)白色固体状标题化合物。LCMS(ESI)[M+H]+＝1509。
步骤4：(3R,5S)-1-((2R)-2-(3-(2-((3R)-4-(2-((4-(3-(3-氨基-6-(2-((4-((S)-6-(二甲基氨基)-2-(1-((2-((2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)(甲基)氨基)乙基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酰氨基)己酰氨基)苄基)氧基)苯基)哒嗪-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)吡啶-2-基)氧基)乙基)-3-甲基哌嗪-1-基)乙氧基)异噁唑-5-基)-3-甲基丁酰基)-5-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)吡咯啶-3-基磷酸二氢盐(2,2,2-三氟乙酸盐)
在室温向1-(((2S)-1-((4-((2-(6-氨基-5-(8-(2-(2-((R)-2-甲基-4-(2-((5-((R)-3-甲基-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯基)乙基)氨基甲酰基)-4-(膦酰氧基)吡咯啶-1-基)-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)乙基)哌嗪-1-基)乙氧基)吡啶-4-基)-3,8-二氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)哒嗪-3-基)苯氧基)甲基)苯基)氨基)-6-(二甲基氨基)-1-氧代己烷-2-基)氨基甲酰基)环丁烷-1-甲酸(30.0mg,0.0200mmol)、1-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2,2,2-三氟乙酸盐)(12.3mg，粗品)和DIPEA(25.6mg,0.200mmol)在DMF(1mL)中的溶液中添加HATU(9.07mg,0.0200mmol)。将反应在室温搅拌10分钟。将粗品通过制备型HPLC(柱：XselectCSH C18 OBD柱30*150mm 5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/分钟；梯度：在10分钟内，12％ B至24％ B，24％ B；波长：254/220nm；RT1(分钟)：10)纯化，以得到8.70mg(产率24％)白色固体状Hy-B-PCIDE-1。LCMS(ESI)[M+H]+＝1688。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.26(s,1H),8.99(s,1H),8.50(d,J＝7.5Hz,1H),8.15(t,1H),7.87(d,J＝6.5Hz,2H),7.65(d,J＝8.3Hz,2H),7.61-7.51(m,2H),7.50–7.30(m,8H),7.20-6.90(m,5H),6.62(s,1H),6.14(s,1H),5.99(s,1H),5.09(s,2H),4.92(t,J＝7.2Hz,1H),4.79(s,1H),4.55–4.25(m,8H),3.80-3.65(m,8H),3.25-2.95(m,17H),2.70(s,3H),2.62(s,6H),2.48-2.38(m,9H),2.20–1.55(m,13H),1.52-1.30(m,5H),1.30-1.15(m,4H),0.85(d,J＝6.4Hz,3H),0.85-0.70(m,3H)。
实例28
用于确定DC50和Dmax的细胞测定
将HCC515和H1944细胞分别以4000和2500个细胞/孔的密度接种于384孔板中。第二天，添加Ab-CIDE。经药物处理24小时后，将细胞用4％甲醛固定15分钟。将板用PBS洗涤3次。将细胞用IF封闭溶液(10％ FCS，1％ BSA，0.1％ Triton，0.01％叠氮化物，在PBS中的X-100)孵育。1.5小时后，添加在IF封闭缓冲液中稀释2X的一抗溶液：添加BRM(Cellsignaling目录号11966，1:2000)。将板在4℃孵育过夜。第二天早上，将细胞用PBS洗涤3次。然后将细胞用二抗(兔-Alexa 488A21206(1:2000))在室温避光孵育1小时。将HoechstH3570以1:5000添加至孔中，并将板继续孵育30分钟。将板用PBS洗涤3次，并在OperaPhenixTM高容量筛选系统上成像。使用核染色作为遮蔽物，对核BRM平均信号强度进行量化。
数据显示在下表中。数据证明本文所公开的成功的抗体靶向策略，并且含有可水解的接头的Ab-CIDE能够以与含有不可水解的接头的Ab-CIDE相似的水平降解靶蛋白。
实例29
将可水解的接头缀合至抗体以实现高DAR
显示可水解的含有马来酰亚胺的接头可提供高DAR(值高于6)。在该DAR的水平下，某些不可水解的接头变得不稳定，而抗体缀合的可水解的接头经制备、分离和表征。因此，可水解的接头能够在获得高DAR方面提供优势，这导致大量CIDE可以连接至单个抗体。
数据显示使用含有可水解的接头的CIDE可获得的DAR的水平：
相较于含有不可水解的接头的CIDE，缀合至抗体的含有可水解的接头的CIDE的DAR水平具有有利的高DAR：
已努力确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑到一些实验误差和偏差。
本领域的技术人员将认识到许多与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，其可用于实施本文所述的主题。本公开决不仅限于所述的方法和材料。
除非另外定义，否则本文所用的技术和科学术语的含义与本主题所属领域普通技术人员通常理解的含义相同，并且与下述文献一致：Singleton等人(1994)Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons,New York,NY；和Janeway,C.,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)Immunobiology,第5版,GarlandPublishing,New York。
在本说明书和权利要求书中，除非上下文另有要求，否则“包括”、“包含”和“含有”这些词是在非排他性意义上使用的。应理解的是，本文所述的实施例包括“由实施例组成”和/或“基本上由实施例组成”。
如本文所用的术语“约”，当指的是数值时，是指包括从指定量起的变化，在一些实施方案中为±50％，在一些实施方案中为±20％，在一些实施方案中为±10％，在一些实施方案中为±5％，在一些实施方案中为±1％，在一些实施方案中为±0.5％，在一些实施方案中为±0.1％，因为此类变化适于执行所公开的方法或采用所公开的组合物。
若提供数值的范围，则应理解的是涵盖了介于该范围上限与下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一，除非上下文另外明确规定)以及所指定范围内的任何其他指定值或中间值。也涵盖了可独立地包括在较小范围内的这些小范围的上限和下限，以所指定范围内任何明确排除的限值为准。在规定范围包括一个或两个限制的情况下，还包括排除那些包括的限制中的一个或两个的范围。
对于本主题所涉及的领域的技术人员而言，在受益于上文的描述和相关附图中所提出的教导的情况下，将想到本文阐述的许多变型例和其他实施例。因此，应当理解的是，本主题不限于所公开的特定实施例，并且变型例和其他实施例旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文采用了特定的术语，但这些术语仅在通用和描述性的意义上使用，而非出于限制的目的。

Claims (58)

1.一种化合物，其具有以下结构：
L1-D
其中，
D为CIDE；
L1为与D共价结合且具有式I的结构的接头-1：
其中，
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-；
p为1至24的整数；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，
其中，v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、
卤代C1-6烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：-C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2和–NH-C(NH)-NH2，其中，Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者
Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中Q为：
其中q为1、2、3或4。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中q为2。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中Q为：
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、
卤代C1-6烷基或C1-6烷基。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中R2为氢或C1-6烷基。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述C1-6烷基为甲基。
7.根据权利要求4所述的化合物，其中Q1为：
8.根据权利要求4所述的化合物，其中R2为氢或甲基。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中Q1为：
10.根据权利要求4所述的化合物，其中t为0。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中Z为-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4、5或6。
12.根据权利要求11所述的化合物，其中p为4、5或6。
13.根据权利要求11所述的化合物，其中p为5。
14.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物，其中Z为-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中p为1、2或3。
16.根据权利要求14所述的化合物，其中p为1。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中RA为氢或C1-6烷基。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中RA为氢或甲基。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物，其中RA为苯基或苄基。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的化合物，其中R7和R8各自为氢。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的化合物，其中RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基。
22.根据权利要求21所述的化合物，其中所述C3-6环烷基为环丁烷。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的化合物，其中K为–CH(R)–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基。
24.根据权利要求23所述的化合物，其中R为氢或C1-3烷基。
25.根据权利要求24所述的化合物，其中R为氢。
26.一种抗体-CIDE缀合物，其具有以下结构：
Ab-(L1-D)j
其中，
Ab为抗体；
j为1至16；
D为CIDE；
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A的结构的接头-1：
其中，
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1至24的整数；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，其中，v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代(C1-6)烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2和–NH-C(＝NH)(NH2)，其中，Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者
Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
27.根据权利要求26所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q为：
其中q为1、2、3或4。
28.根据权利要求26或27所述的抗体-CIDE缀合物，其中q为2。
29.根据权利要求26所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q为：
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基。
30.根据权利要求29所述的抗体-CIDE缀合物，其中R2为氢或C1-6烷基。
31.根据权利要求30所述的抗体-CIDE缀合物，其中所述C1-6烷基为甲基。
32.根据权利要求29所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q1为：
33.根据权利要求29所述的抗体-CIDE缀合物，其中R2为氢或甲基。
34.根据权利要求33所述的抗体-CIDE缀合物，其中Q1为：
35.根据权利要求29至34中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中t为0。
36.根据权利要求26至35中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中Z为-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4、5或6。
37.根据权利要求36所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为4、5或6。
38.根据权利要求36所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为5。
39.根据权利要求26至35中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中Z为-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6。
40.根据权利要求39所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为1、2或3。
41.根据权利要求39所述的抗体-CIDE缀合物，其中p为1。
42.根据权利要求26至41中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为氢或C1-6烷基。
43.根据权利要求42所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为氢或甲基。
44.根据权利要求26至41中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RA为苯基或苄基。
45.根据权利要求26至44中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中R7和R8各自为氢。
46.根据权利要求26至45中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基。
47.根据权利要求46所述的抗体-CIDE缀合物，其中所述C3-6环烷基为环丁烷。
48.根据权利要求26至47中任一项所述的抗体-CIDE缀合物，其中K为–CH(R)-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基。
49.根据权利要求48所述的抗体-CIDE缀合物，其中R为氢或C1-3烷基。
50.根据权利要求49所述的抗体-CIDE缀合物，其中R为氢。
51.一种药物组合物，其包含根据权利要求26至50中任一项所述的抗体-CIDE缀合物以及一种或多种药用赋形剂。
52.一种治疗有此需要的人的疾病的方法，所述方法包括向所述人施用有效量的根据权利要求26至50和57中任一项所述的抗体-CIDE缀合物、根据权利要求58所述的抗体-缀合物、或根据权利要求51所述的药物组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述疾病为癌症。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述癌症为BRM依赖性的。
55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌。
56.一种降低受试者中靶蛋白的水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求26至50和57中任一项所述的抗体-CIDE缀合物、根据权利要求58所述的抗体-缀合物、或根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述PB部分结合所述靶蛋白，其中泛素连接酶引起所述结合的靶蛋白的降解，其中所述靶蛋白的所述水平被降低。
57.一种抗体-CIDE缀合物，其具有以下结构：
Ab-((LX)-D)j
其中，
Ab为抗体；
j为1至16；
D为CIDE；
LX选自由以下项组成的组：L1和L1h，其中LX的至少一个实例中存在L1h：
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A的结构的接头-1：
并且，
L1h为与D共价结合且具有式I-B的结构的接头-1：
其中，#指示位置a或b处的连接点；
在L1和L1h中，指示与所述抗体的连接点；
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，其中，v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、
卤代C1-6烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：-C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2、–NH-C(＝NH)-NH2，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者
Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
58.一种抗体-缀合物，其具有以下结构：
Ab-(LZ)j
其中，
Ab为抗体；
j为1至16；
LZ选自由以下项组成的组：LX1和Lx-D，其中LZ的至少一个实例中存在LX1：
LX1与Ab共价结合且具有式I-G的结构：
并且，
Lx-D，其中LX选自由以下项组成的组：L1和L1h：
L1为与Ab以及与D共价结合且具有式I-A或式I-C的结构的接头-1：
并且，
L1h为与D共价结合且具有式I-B的结构的接头-1：
其中，#指示位置a或b处的连接点；
指示与所述抗体的连接点；
Z为-(CH2)p-或-CH2-(CH2-O-CH2)p-CH2-，其中p为1、2、3、4、5或6；
RA为氢、C1-6烷基或–(CH2)v-芳基，其中，v为0或1；
Q选自由以下项组成的组：
i)
其中q为1、2、3或4；以及
ii)
其中t为0、1、2、3或4；
Q1为氢、其中R2为氢、卤代C1-6烷基或C1-6烷基；并且
L1-A为：
其中指示与D的连接点；
w为0、1、2、3、4或5；
J选自由以下项组成的组：-C1-5烷基、–N(Rx)(Ry)、–C(O)NH2、–NH-C(O)-NH2、–NH-C(＝NH)-NH2，其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基；
K选自由以下项组成的组：C1-3亚烷基、–CH(R)–、–C(O)–、–C(O)-O-CH(R)–、–CH2-O-C(O)–、–CH2-O-C(O)-NH-CH2–和–CH2-O-C(O)-R-[CH2]u-O–，其中R为氢、C1-3烷基、N(Rx)(Ry)、–O-N(Rx)(Ry)或C(O)-N(Rx)(Ry)，其中u为0、1、2或3，并且其中Rx和Ry各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者
Rx和Ry与各自所连接的氮一起形成任选地经取代的5元至7元杂环基；
RC和RD各自独立地选自氢和C1-3烷基，或者RC和RD与各自所连接的碳一起形成任选地经取代的C3-6环烷基；并且
R7和R8各自独立地为氢、卤代、C1-5烷基、C1-5烷氧基或羟基。
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