CN118591379A - 用于治疗或预防t细胞相关疾病的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
根据本发明，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，上述药物组合物包含具有高功能性且具有稳定的免疫抑制功能的诱导性调节性T细胞。本发明提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，上述药物组合物包含具有选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性和AREG阳性中的至少一个特征的诱导性调节性T细胞作为有效成分。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物。
背景技术
作为免疫系统内在的CD25阳性CD4阳性调节性T细胞的重要特征，特异性地表达转录因子FoxP3，由于FoxP3的缺损或突变，有时调节性T细胞的发育和分化、以及抑制功能会受损。调节性T细胞除了FoxP3以外，还通过CTLA4、IL-10等多种基因的表达来抑制免疫系统。DNA脱甲基化等表观遗传状态被认为对于以FoxP3的稳定表达为代表的调节性T细胞的全局基因表达调节有贡献，它们与功能性调节性T细胞的表型相关。
发明内容
解决问题的手段
本发明的发明人首次发现，在从人外周T细胞诱导调节性T细胞时，通过使用抗CD3抗体的刺激从人外周T细胞诱导稳定的诱导性T细胞后，实施休眠培养，再次进行抗CD3抗体刺激并培养，再实施休眠培养，由此能够诱导具有高抑制性分子的表达和高抑制功能的调节性T细胞。另外，本发明的发明人还发现，这样得到的诱导性调节性T细胞具有足以作为药物发挥作用的免疫抑制能力。
因此，本发明提供以下内容。
(项目X1)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有选自FoxP3阳性、CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少一个特征的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1A)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含NT5E阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1B)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含ITGAE(CD103)阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1C)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含AREG阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1D)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含CD172g阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1E)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含CD26阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1F)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含CTLA4阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1G1)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少两个特征的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1G2)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少三个特征的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1G3)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少四个特征的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1G4)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少五个特征的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X1G5)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性的所有特征的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
(项目X2)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞至少为CTLA4阳性和FoxP3阳性。
(项目X3)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞至少为CD172g阳性和/或CD26阳性。
(项目X4)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞的FOXP3基因的CNS2位点被脱甲基化。
(项目X5)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞为CD4阳性或CD8阳性。
(项目X6)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞从人的外周血T细胞或来自人组织的T细胞获得或诱导。
(项目X7)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞通过包括下述步骤的方法获得：
(a)将人外周血中的CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞在第一基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；
(b)将步骤(a)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤；
(c)将步骤(b)中得到的细胞在第二基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；和
(d)将步骤(c)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤。
(项目X8)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物含有包含所述诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的选自FoxP3阳性、CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少一个特征的比例分别为约50％以上。
(项目X8A)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的NT5E阳性的比例分别为约50％以上。
(项目X8B)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的ITGAE(CD103)阳性的比例分别为约50％以上。
(项目X8C)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的AREG阳性的比例分别为约50％以上。
(项目X8D)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的CD172g阳性的比例分别为约50％以上。
(项目X8E)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的CD26阳性的比例分别为约50％以上。
(项目X8F)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的CTLA4阳性的比例分别为约50％以上。
(项目X8G1)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，其中，所述细胞群的选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少两个特征的比例分别为约50％以上。
(项目X8G2)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，其中，所述细胞群的选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少三个特征的比例分别为约50％以上。
(项目X8G3)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，其中，所述细胞群的选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少四个特征的比例分别为约50％以上。
(项目X8G4)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，其中，所述细胞群的选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少五个特征的比例分别为约50％以上。
(项目X8G5)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，其中，所述细胞群的CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性的所有特征的比例分别为约50％以上。
(项目X9)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中至少所述CTLA4阳性和FoxP3阳性的比例分别为约50％以上。
(项目X10)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中至少所述CD172g阳性和/或CD26阳性的比例分别为约50％以上。
(项目X11)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中的所述至少一个特征的比例为约60％以上。
(项目X12)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中的所述至少一个特征的比例为约80％以上。
(项目X12a)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中FoxP3强阳性的比例为约50％以上。
(项目X13)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群的约90％以上为T细胞。
(项目X14)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物以每施用一次施用约108～约109个、或约107个/kg的方式包含所述诱导性调节性人T细胞。
(项目X15)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述T细胞相关疾病包括能够通过免疫抑制作用治疗的自身免疫疾病、感染症、癌症、过敏症、炎症性疾病和ALS。
(项目X16)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述自身免疫疾病选自：艾迪森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良型大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力症、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性大肠炎、心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、恰加斯(Chagas)心肌病、恰加斯巨结肠、恰加斯巨食管症、恰加斯神经障碍、良性前列腺增生、硬皮症、牛皮癣、雷诺综合征、先兆子痫、心肌炎、青光眼、高血压病、肺动脉高压、恶性高血压病、阿尔茨海默病、系统性硬化症、多发性肌炎、混合性结缔组织病、抗磷脂抗体综合征、显微镜下多血管炎、肉芽肿性多血管炎、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、新月体肾小球肾炎、器官特异性自身免疫疾病、巴塞多病(Basedow's disease)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、肺出血肾炎综合征(Goodpasture syndrome)、自身免疫性溶血性贫血、巨幼红细胞性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性硬化性胆管炎、结节性多动脉炎、大动脉炎(Takayasu arteritis)、巨细胞动脉炎、风湿性多肌痛、成人斯蒂尔病、白塞病和溃疡性大肠炎。
(项目X17)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物通过注射被施用。
(项目X18)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，在向患者施用所述药物组合物后的情况下，对于没有效果或效果不充分的患者，追加施用所述药物组合物。
(项目X19)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，从最初施用起至少约2周后追加施用所述药物组合物。
另外，本发明还提供以下内容。
(项目1)
一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性和AREG阳性中的至少一个特征的诱导性调节性T细胞作为有效成分。
(项目2)
根据上述项目所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性T细胞具有选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性和AREG阳性中的至少两个特征。
(项目3)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性T细胞至少为CTLA4阳性。
(项目4)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性T细胞的FOXP3基因的CNS2位点被脱甲基化。
(项目5)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性T细胞为CD4阳性或CD8阳性。
(项目6)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性T细胞从人的外周血T细胞或来自人组织的T细胞获得或诱导。
(项目7)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞通过包括下述步骤的方法获得：
(a)将外周血中的CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞在第一基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；
(b)将步骤(a)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤；
(c)将步骤(b)中得到的细胞在第二基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；和
(d)将步骤(c)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤。
(项目8)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包含T细胞群，所述T细胞群中的细胞的约50％以上为所述诱导性调节性T细胞。
(项目9)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物包含T细胞群，所述T细胞群中的细胞的约80％以上为所述诱导性调节性T细胞。
(项目10)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述T细胞群是调节性T细胞群。
(项目11)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群的约90％以上为T细胞。
(项目12)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物以每施用一次施用约108～约109个、或约107个/kg的方式包含所述诱导性调节性T细胞。
(项目13)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述T细胞相关疾病包括能够通过免疫抑制作用治疗的自身免疫疾病、感染症、癌症、过敏症、炎症性疾病和ALS。
(项目14)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良型大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本病、溶血性贫血、多发性硬化症、重症肌无力症、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性大肠炎和心肌病。
(项目15)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物通过注射给予。
(项目16)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，在向患者施用所述药物组合物后的情况下，对于没有效果或效果不充分的患者，追加施用所述药物组合物。
(项目17)
根据上述项目中任一项所述的药物组合物，其中，从最初施用起至少约2周后追加施用所述药物组合物。
在本发明中，上述的一个或多个特征，除了明示的组合之外，还意在可以进一步组合来提供。另外，根据需要在阅读并理解以下的详细说明后，本领域技术人员能够认识到本发明另外的实施方式及优点。
另外，通过参照以下发明的实施方式的项目及附图，上述以外的本发明的特征及显著的作用和效果对本领域技术人员来说将变得明确。
发明效果
本发明可提供一种从人外周T细胞在体外诱导具有高功能性的调节性T细胞的方法。通过本发明的方法诱导的调节性T细胞高表达与调节性T细胞相关的基因，具有较强的抑制能力。因此，作为调节性T细胞，可以用于各种免疫疾病、自身免疫病等炎症性疾病的治疗和预防等。
通过本发明的方法，可以从人外周T细胞在体外诱导功能性调节性T细胞。通过本发明的方法获得的调节性T细胞具有高的抑制功能，作为调节性T细胞是稳定的。即，通过本发明的方法，可以从人外周T细胞稳定地表达调节性T细胞的主基因FoxP3，诱导具有高功能性的调节性T细胞。
附图说明
图1是小鼠诱导性调节性T细胞(也称为小鼠高功能稳定型iTreg(HSF iTreg)细胞)的一个实施方式的制作方法的概要，以及其诱导性调节性T细胞的流式细胞术的结果。图1的A示出了通过各种刺激方法从小鼠CD4阳性初始T细胞诱导iTreg细胞时的方案概要。图1的B是通过流式细胞术法分析图1的A中制作的iTreg细胞和活性T细胞、活化nTreg细胞中FoxP3、CD25的表达的结果。
图2是示出了通过流式细胞术方法分析基于图1的本发明的iTreg(图中的SF-iTreg)的一个实施方式的制作方法从小鼠CD4阳性初始T细胞或效应T细胞制作SF-iTreg时的FoxP3表达，以及通过亚硫酸氢盐法分析Treg特异性去甲基化区域的去甲基化状态的结果的图。
图3是通过RNA序列法分析图1的各细胞的全面性基因表达模式的一个实施方式的结果。图3的A示出了PCA分析图，图3的B示出了Treg相关基因的热图。
图4是分析图1的各细胞的体外抑制能力的一个实施方式的结果。用Cell TraceViolet试剂对小鼠CD4阳性初始T细胞进行染色，与图1的各细胞以一定的比例，在抗小鼠CD3抗体+MHC-II阳性细胞或Dynabeads T-活化剂(VERITAS)(5μL/孔)存在下混合培养3天，用流式细胞术法分析Cell Trace Violet强度。
图5是关于未使用图1的CD28抗体单次刺激的组和本发明的iTreg，将其对野生型小鼠进行施用，分析2周后植入的调节性T细胞的Foxp3表达的一个实施方式的结果。
图6是向RAG2缺失的小鼠植入小鼠CD4阳性初始T细胞来制作成大肠炎模型，施用本发明的iTreg细胞并分析治疗效果的一个实施方式的结果。图6的A示出了体重(g)的变化，图6的B示出了大肠组织的HE染色图像，图6的C示出了通过流式细胞术法分析淋巴结T细胞中CD69表达的结果。
图7示出了来自人克罗恩病患者的本发明的iTreg的一个实施方式的分析结果。图7的A是从来自人克罗恩病患者的CD4阳性T细胞制作本发明的诱导性调节性T细胞(图中为HSF-iTreg)，并用流式细胞术法分析FOXP3、CTLA4、Helios的表达的结果。将普通nTreg(CD4阳性CD25阳性T细胞)刺激后的细胞和普通iTreg(常规的iTreg:将CD4阳性T细胞在IL-2和TGF-β1存在下进行CD3/CD28刺激3天后的细胞)进行比较。图7的B是图7的A的各细胞的体外抑制能力的分析结果。用Cell Trace Violet试剂对人CD4阳性T细胞进行染色，与图1的各细胞以一定的比率在Treg抑制功能检测试剂(Treg Suppression Inspector)(MiltenyiBiotec)(5μL/孔)存在下混合培养3天，通过流式细胞术法分析Cell Trace Violet强度。
图8是示出了从人CD8阳性T细胞制作的本发明的iTreg(HSF iTreg)细胞的一个实施方式的表型分析(流式细胞分析)的图。从人CD8阳性T细胞制作高功能诱导性调节性T细胞，用流式细胞术法分析FOXP3、CTLA4、Helios的表达。
图9是示出了本发明的iTreg(HSF iTreg)细胞的一个实施方式的CD25表达和FOXP3表达(流式细胞术法)的图。通过使用BD FACSLyric流式细胞仪的流式细胞术法分析CD25和FOXP3的表达强度。
图10是示出了本发明的iTreg(HSF iTreg)细胞的一个实施方式的表型分析的图。制作本发明的诱导性调节性T细胞(HSF-iTreg)，分析CD172g和CD26等的表达。
图11是示出了从来自SLE患者的CD4阳性T细胞制作的本发明的iTreg(HSF iTreg)细胞的一个实施方式的表型分析(流式细胞分析)的图。从来自SLE患者的CD4阳性T细胞制作高功能诱导性调节性T细胞，用流式细胞术法分析FoxP3、CD4、CTLA4的表达。
图12是示出了从来自类风湿性关节炎患者的CD4阳性T细胞制作的本发明的iTreg(HSF iTreg)细胞的一个实施方式的表型分析(流式细胞术)的图。从来自类风湿性关节炎患者的CD4阳性T细胞制作高功能诱导性调节性T细胞，用流式细胞术法分析FoxP3、CD4、CTLA4的表达。
具体实施方式
以下，将表示并描述本发明的最佳方式。应当理解，在本说明书的整个范围内，除非特别指出，单数形式的表达还包括其复数形式的概念。因此，应理解，除非特别指出，单数形式的冠词(例如，在英语中的“a”、“an”、“the”等)也包括其复数形式的概念。此外，应理解，除非特别指出，本说明书中使用的术语以本领域通常使用的意思使用。因此，除非另外定义，本说明书中使用的所有术语和科技技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。在不一致的情况下，本说明书(包括定义)优先。
以下适当地说明在本说明书中特别使用的用语的定义和/或基本技术内容。
在本说明书中，“约”是指后续数值的±10％。例如，“约20”包括“18～22”。数值范围包括两端点之间的所有数值和两端点的数值。关于范围的“约”适用于该范围的两端点。因此，例如，“约20～30”包含“18～33”。
在本说明书中，在标记基因名称及其产物时，与通常的用法不同，在全部用大写字母表示的情况下，有时指基因和蛋白质两者。有时也分开使用为例如，FOXP3基因、FOXP3蛋白质，在标记为FoxP3的情况下，是指该基因或蛋白质的概念和实体两者(整体)。
在本说明书中，“调节性T细胞(Regulatory T cell)”是FoxP3表达为阳性的T细胞。在本说明书中，有时也称为“Treg”。Treg有内源性调节性T细胞(Naturally OccurringRegulatory T cell:nTreg)、诱导性调节性T细胞(Inducible Regulatory T cell:iTreg)等。调节性T细胞通常可以具有各种功能(例如免疫抑制功能)。
在本说明书中，“诱导性调节性T细胞(Inducible Regulatory T cell，iTreg)”是指在调节性T细胞中IKZF2(Helios)的表达为阴性。iTreg通常通过从初始CD4阳性T细胞等分化诱导而获得。
在本说明书中，“内源性调节性T细胞(Naturally Occurring Regulatory Tcell，nTreg)”是指在调节性T细胞中IKZF2(Helios)和CTLA4的表达为阳性。通常为存在于生物体内的细胞。
在本说明书中，“外周T细胞”是指存在于胸腺外的T细胞，可以从外周血液、淋巴结、其他组织取得。在本说明书中，当称为“外周T细胞”时，只要细胞群中含有外周T细胞即可，不需要分离T细胞。除了外周血单个核细胞(PBMC)等T细胞，还可以使用包含各种淋巴细胞的细胞级分。
在本说明书中，“流式细胞术”是指测量悬浮在液体中的细胞、个体和其他生物颗粒的颗粒数、各自的物理、化学、生物学性状的技术。使用该技术的装置称为“流式细胞仪”。在本发明中，细胞标记物(例如，FoxP3、CTLA4、Helios、CD103等)的“阳性”、“阴性”如本领域中通常使用的一样通过流式细胞术确定。更具体地说，在流式细胞术中，使细胞排成一列流动，通过光谱学方法计数细胞的数量。例如，对由荧光或发光酶标记的细胞照射激光，通过光电二极管等检测器检测由此从细胞发出的荧光或发光信号，从而对靶细胞的数量进行计数。此外，可以将检测器的检测结果导入到计算机中来生成和显示二维图。由此，能够容易地掌握靶细胞的有无及其数量等。
在本说明书中，“去甲基化”是指代表性地除去甲基化的腺嘌呤(例如，6位；m6A，1位；m1A)或胞嘧啶(例如，5位；m5C，3位；m3C)的甲基化修饰。去甲基化可以使用该领域公知的方法来确定，例如可以使用亚硫酸氢盐法等进行测定。
在本说明书中，“细胞群”是包含两个以上细胞的群，例如可以是平面上细胞彼此聚集的状态，也可以是三维上细胞彼此粘附而构成的细胞块。另外，“细胞群”可以由单一种类的细胞形成，也可以含有多种细胞。
在本说明书中，“刺激”是指通过TCR的刺激。例如，T细胞的刺激包括使用抗CD3抗体及包含其的复合体的刺激、使用与TCR结合的肽及包含肽的复合体的刺激、使用抗原呈递细胞的刺激、同时使用抗CD3抗体和抗原呈递细胞的刺激、同时使用肽、蛋白质和抗原呈递细胞的刺激等。
在本说明书中，“休眠培养”是指在没有上述刺激的状态下培养细胞。
(优选实施方式)
以下说明本发明的优选实施方式。以下提供的实施方式是为了更好地理解本发明而提供的，并且本发明的范围不应限于以下记载。因此，显而易见的是本领域技术人员能够参考本说明书中的记载，在本发明的范围内进行适当改变。另外，本发明的以下实施方式可以单独使用或者将它们组合使用。
本发明涉及高功能稳定型诱导性调节性T细胞(也称为高功能稳定型iTreg、HSFiTreg)的药物用途。
在本发明的一个方面，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，其包含具有选自FoxP3阳性、CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少一个特征的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞还可以具有选自CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性和AREG阳性中的至少两个特征。此外，在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞可以至少为CTLA4阳性。并非意在进行限定，但本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞也可以为CD4阳性或CD8阳性。
在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞可至少为CTLA4阳性和FoxP3阳性。在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞可至少为CD172g阳性和/或CD26阳性。
本发明提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，其含有CD172g阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。由于CD172g是与酪氨酸激酶相关的蛋白质，参与神经元等细胞粘附(小脑神经元的粘附，神经突生长和胶质细胞附着)，因此期望CD172g阳性的诱导性调节性人T细胞被激活与粘附性等相关的功能，对与此相关的各种疾病的效果较好。
本发明提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，其含有CD26阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。CD26是也被称为DPP4的基因，与糖代谢、胰岛素代谢、免疫功能(在感染症中也显著)相关，因此期望CD26阳性的诱导性调节性人T细胞对与此相关的各种疾病的效果较好。
本发明提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，其含有NT5E阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。NT5E(CD73)是具有将细胞外的核苷酸转化为膜透过性的核苷的催化作用的细胞膜蛋白质。所编码的蛋白质被用作淋巴细胞分化的决定因素。如果该基因存在缺陷，则可能引起关节和动脉的钙化，因此期望NT5E阳性的诱导性调节性人T细胞对与此相关的各种疾病的效果较好。
本发明提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，其含有ITGAE(CD103)阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。ITGAE(CD103)编码具有I结构域的α整合素，在细胞外结构域接受翻译后切割，生成以二硫键结合的重链和轻链。该蛋白质与β7整合素结合，形成已知为人粘膜淋巴细胞-1抗原的E-钙粘蛋白结合整合素。该蛋白质优先在人肠道上皮内淋巴细胞(IEL)表达，除了粘附作用之外，还可能作为用于IEL活化的辅助分子发挥作用。因此，期望ITGAE(CD103)阳性的诱导性调节性人T细胞对与之相关的各种疾病的效果较好。
本发明提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，其含有AREG阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。AREG是上皮生长因子家族的一员，与上皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)相关。该蛋白质与EGF/TGF-α受体相互作用促进正常上皮细胞生长，抑制某种攻击性癌细胞株生长。另外，也对乳腺、卵子、骨组织的发育发挥作用。该基因与类似牛皮癣的皮肤表型有关，也与包括各种癌症和炎症状态的其他病态疾病有关。因此，期望AREG阳性的诱导性调节性人T细胞对与其相关的各种疾病的效果较好。
本发明提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，其含有CTLA4阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。CTLA4属于免疫球蛋白超家族，是向T细胞传递抑制性信号的蛋白质。膜结合型CTLA4作为以二硫键结合的同二聚体的形式起作用，可溶型CTLA4以单体的形式起作用。该基因的变异被认为与胰岛素依赖性糖尿病、巴塞多病、桥本甲状腺炎、乳糜泻、系统性红斑狼疮、甲状腺相关眼眶病、其他自身免疫疾病有关。因此，期望CTLA4阳性的诱导性调节性人T细胞对与之相关的各种疾病的效果较好。另外，期望CTLA4阳性的诱导性调节性人T细胞对自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎等自身免疫疾病的效果较好。
关于FoxP3在调节性T细胞中的表达，通过将CD4阳性T细胞在包含IL2和TGFβ的培养基中、在抗CD3抗体和抗CD28抗体的存在下培养，然后在包含IL2和TGFβ的培养基中培养，可以在试管内进行诱导。另外，虽然已知有几种从外周T细胞诱导调节性T细胞的方法，但诱导性调节性T细胞中FoxP3的表达不稳定，FoxP3以外的许多功能性分子表达尚未得到确认。
近年来，开发了通过在诱导性调节性T细胞中向培养基中添加抗坏血酸的方法(Kasahara et al.Int.Immunol.(2017)29(10):457-469)、不使用CD28抗体刺激的方法(Mikami et al.Proc Natl Acad Sci U S A.(2020)117(22):12258-12268.)，来引起DNA去甲基化诱导的培养方法。但是，用该方法制作的诱导性调节性T细胞中也没有确认到功能性分子的表达，没有得到充分的免疫抑制活性。在临床上也有1件使用了诱导性调节性T细胞的临床试验，以GVHD为对象实施，但所使用的细胞的调节性T细胞的比例低，目前未确认到GVHD的预防等有效性(MacMillan et al.，Blood Adv.(2021)5(5)：1425-1436)。
在本发明中，FoxP3的表达是稳定的，有利地，可以提供含有稳定地保持免疫抑制作用的诱导性调节性T细胞作为有效成分的药物组合物，这样的诱导性调节性T细胞例如可以通过在本申请说明书的其他地方说明的制造诱导性调节性T细胞的方法来制造。例如，本发明可以提供一种药物组合物，其中，诱导性调节性T细胞通过包括下述步骤的方法获得的：(a)将外周血中的CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞在第一基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；(b)将步骤(a)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤；(c)将步骤(b)中得到的细胞在第二基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；和(d)将步骤(c)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤。
本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞具有诱导性调节性T细胞特异性去甲基化状态。所得到的调节性T细胞处于调节性T细胞特异性去甲基化状态，例如可以通过FoxP3的基因(FOXP3(均为斜体字)的CNS2位点被去甲基化来确认。这样的去甲基化状态可以成为稳定型的指标，因此本发明的医药组合物中的诱导性调节性T细胞可以通过确认去甲基化状态来显示为稳定型的诱导性调节性T细胞。
在本说明书中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞的免疫抑制活性或免疫抑制作用例如可以通过测定应答T细胞中的Cell Trace Violet强度来确认。本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞可以稳定地提供免疫抑制活性或免疫抑制作用，例如，本发明的诱导性调节性T细胞可以在至少约2周内提供免疫抑制活性或免疫抑制作用。如下述实施例所示，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞可具有比以往的调节性T细胞(包括诱导性和内源性)更高的免疫抑制作用。因此，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞也可以称为功能性或高功能的诱导性调节性T细胞。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞可稳定地表达FoxP3。因此，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞也可以称为稳定型诱导性调节性T细胞。本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞在一个方面是高功能且稳定型的，可以称为高功能稳定型诱导性调节性T细胞(HSF iTreg)。
在本发明的一个实施方式中，本发明的诱导性调节性T细胞中的标记物是否为阳性可以通过利用流式细胞术的阳性率测定来进行。例如，可以用流式细胞仪进行分析，根据显示基准以上抗原表达量的细胞的比例来判定是否为阳性。根据细胞表面标记物的表达强度，也可以区分为阴性、弱阳性、中阳性、强阳性(弱阳性、中阳性、以及强阳性统称为“阳性”)等。例如，根据设备的设定，在各标记物的荧光强度中值/阴性对照的荧光强度中值(利用同型对照抗体染色)的值小于5、5以上且小于10、10以上且小于30、30以上的情况下，也可以分别设为阴性、弱阳性、中阳性、强阳性。这样的判定可如(利用流式细胞术的阳性率测定)中所说明的那样进行判定，但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方式中，本发明的诱导性调节性T细胞中的细胞表面标记物的表达强度，例如根据使用如本申请实施例所述准备的样品，由BD FACSLyric流式细胞仪(BD Biosciences公司)分析的结果，可以是其表达强度在102以上为弱阳性，103以上为中阳性，104以上为强阳性，或者103以上为强阳性，其以下为弱阳性，或者102以上为强阳性，其以下为弱阳性。这样的判定可以根据实验条件、实验目的、细胞的种类、设备的设定条件等适当设定，本发明不限于此。另外，在用BD FACSLyric流式细胞仪以外的流式细胞仪设备进行分析的情况下，也能够计算与用BD FACSLyric流式细胞仪进行分析的情况下的表达强度对应的其他设备中的表达强度，能够根据使用的设备适当地找到表示表达强度的值。
在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞可以从任何细胞诱导，但优选可以从人的外周血T细胞或者来自人组织的T细胞诱导。
在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞或其细胞群可以以人细胞为对象，可以包括以从人的外周血获得的T细胞为材料通过规定方法诱导的诱导性调节性人T细胞或其细胞群。人细胞和小鼠细胞的性质明显不同，即使存在相同的细胞表面标记物，也不能视为细胞的性质相同。例如，在诱导性调节性T细胞的领域，在小鼠和人时可适用的技术不同，在小鼠的情况下，抗原未致敏的淋巴细胞占大部分，而在人的情况下，外周血中T细胞的抗原致敏的程度和活化程度多种多样。因此，在小鼠时，虽然能够由从小鼠淋巴组织采集的T细胞直接制作高功能稳定型诱导性调节性T细胞，但在人时这样做是困难的，不能仅以存在细胞表面标记物而视为同样的细胞。
在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物可包含T细胞群，其中T细胞群中约50％以上的细胞是本说明书其它地方所述的诱导性调节性T细胞。在一个实施方式中，关于本发明的细胞群，细胞群中的T细胞中的约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上可以是本申请说明书其他地方描述的诱导性调节性T细胞。
在本发明的一个实施方式中，本发明的细胞群中的T细胞可以是调节性T细胞。在这种情况下，在本发明的细胞群的调节性T细胞中，约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上可以是本申请说明书其他地方所述的诱导性调节性T细胞。
在本发明的一个实施方式中，本发明的细胞群可包含除T细胞以外的细胞，但优选地，本发明的细胞群的约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上可以为T细胞，优选约90％以上可以为T细胞。
在本发明的一个方面，提供了一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，上述细胞群的CTLA4阳性和FoxP3阳性的比例分别为约50％以上。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中的细胞群的CTLA4阳性和FoxP3阳性的比例可为约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上。
在本发明的一个实施方式中，在本发明的药物组合物中的细胞群中，至少上述CD172g阳性和/或CD26阳性的比例可以分别为约50％以上。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中的细胞群的CD172g阳性和/或CD26阳性的比例可为约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上。
在本发明的一个实施方式中，在本发明的药物组合物中的细胞群中，FoxP3强阳性的比例可以为约50％以上。在一个实施方式中，本发明的药物组合物中的细胞群中，FoxP3强阳性的比例可为约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上。并非意在进行限定，但在这样的药物组合物中的细胞群中，细胞表面标记物的表达强度的测定可以通过如上所述的利用流式细胞术的阳性率测定来进行。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，上述细胞群的FoxP3阳性比例为约50％以上。并非意在进行限定，但在一个实施方式中，这样的药物组合物中的细胞群以细胞数为基准可包含约50％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上的FoxP3阳性的诱导性调节性人T细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，上述细胞群的CTLA4阳性比例为约50％以上。并非意在进行限定，但在一个实施方式中，这样的药物组合物中的细胞群以细胞数为基准可包含约50％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上的CTLA4阳性的诱导性调节性人T细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，上述细胞群的NT5E阳性比例为约50％以上。并非意在进行限定，但在一个实施方式中，这样的药物组合物中的细胞群以细胞数为基准可包含约50％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上的NT5E阳性的诱导性调节性人T细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，上述细胞群的ITGAE(CD103)阳性比例为约50％以上。并非意在进行限定，但在一个实施方式中，这样的药物组合物中的细胞群以细胞数为基准可包含约50％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上的ITGAE(CD103)阳性的诱导性调节性人T细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，上述细胞群的AREG阳性比例为约50％以上。并非意在进行限定，但在一个实施方式中，这样的药物组合物中的细胞群以细胞数为基准可包含约50％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上的AREG阳性的诱导性调节性人T细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，上述细胞群的CD172g阳性比例为约50％以上。并非意在进行限定，但在一个实施方式中，这样的药物组合物中的细胞群以细胞数为基准可包含约50％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上的CD172g阳性的诱导性调节性人T细胞。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，该药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，上述细胞群的CD26阳性比例为约50％以上。并非意在进行限定，但在一个实施方式中，这样的药物组合物中的细胞群以细胞数为基准可包含约50％以上、约60％以上、约65％以上、约70％以上、约75％以上、约80％以上、约85％以上、约90％以上、约95％以上、约97％以上、或约99％以上的CD26阳性的诱导性调节性人T细胞。
如上所述，由于人细胞和小鼠细胞的性质明显不同，因此即使诱导条件相同，在小鼠细胞和人细胞中特定细胞的诱导比例也不同，在本发明中，在以规定的诱导方法诱导的情况下，可以得到规定的细胞表面标记物的阳性的比例为约50％以上的细胞群，优选地可以获得“CTLA4阳性和FoxP3阳性的比例分别为约50％以上”的细胞群。
CTLA4是定位于细胞内的分子，至少不是能够作为浓缩和纯化的指标使用的水平。另外，由于FoxP3是转录因子，全部是存在于细胞内的分子，因此在表面上完全无法检测，也不能用于纯化。也就是说，CTLA4和FoxP3是在T细胞“内”表达的标记物，因此以CTLA4和/或FoxP3为指标进行分选(sorting)和浓缩，不能得到CTLA4阳性和/或FoxP3阳性为约50％以上的细胞群。因此，根据以往方法，获得CTLA4阳性和FoxP3阳性的比例分别小于约50％的细胞群，以这样的细胞群为原料，且以CTLA4和/或FoxP3为指标进行浓缩，也不能得到该细胞分别为约50％以上的细胞群。
在本发明的一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性人T细胞主要承担Treg的免疫抑制功能，该细胞通过在某个细胞群中占半数以上，能够稳定地实现医学上有效的免疫抑制效果，对技术和医学效果也很重要。即，通过含有50％以上起到医学上有效的免疫抑制效果的T细胞，能够提供作为细胞制剂稳定的细胞，因此该效果在医学上是极其重要的一点，不仅是量和数值的不同，作为制剂是否可行这样的质量问题也是重要的一点。
在本发明的一个实施方式中，在本发明的药物组合物中的细胞群中，诱导性调节性人T细胞还可以具有ITGAE(CD103)阳性、NT5E阳性和/或AREG阳性的特征。这些细胞标记物是在免疫抑制功能中起重要作用的基因，由于这些标记物高表达，从而在施用细胞后，与以往的诱导性调节性T细胞相比，能够保持更好的功能稳定性。例如，CD103对于调节性T细胞向炎症部位的迁移是重要的，NT5E(CD73)对于具有免疫抑制能力的adenosine的产生是重要的，以及AREG对于通过调节性T细胞的组织的再生是重要的。本发明的细胞群通过这些标记物高表达，可以达到能够保持功能稳定性的效果。
在本发明的一个方面，提供一种包含本发明的诱导性调节性T细胞或细胞群的药物组合物。另外，在另一方面，提供一种包含本发明的诱导性调节性T细胞或细胞群的再生医疗用材料或产品。该药物组合物或再生医疗用材料或产品可用于能够通过免疫抑制作用治疗的自身免疫疾病、炎症性疾病、过敏。这些药物、再生医用疗材料或产品可与培养基、其它在本领域中使用的任何添加剂一起使用。作为这样的培养基，可以使用在用于细胞培养的动物细胞培养用基础培养基中添加了必要因子的培养基。这样的培养基的例子在本说明书的其他地方有详细描述。关于添加到培养基中的成分，其例子也在本说明书的其它地方有详细描述。在作为这样的产品提供的情况下，可以包括DMSO等。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物可以用于治疗或预防T细胞相关疾病，作为T细胞相关疾病，只要是能够通过免疫抑制作用治疗的疾病就没有特别限制，作为T细胞相关疾病，可以列举出例如自身免疫疾病、感染病、癌症、过敏、炎症性疾病和ALS等。另外，在一个实施方式中，作为自身免疫疾病，并不限于此，也可以列举出：艾迪森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良型大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力症、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性大肠炎、心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、恰加斯心肌病、恰加斯巨结肠、恰加斯巨食管症、恰加斯神经障碍、良性前列腺增生、硬皮症、牛皮癣、雷诺综合征、先兆子痫、心肌炎、青光眼、高血压病、肺动脉高压、恶性高血压病、阿尔茨海默病、系统性硬化症、多发性肌炎、混合性结缔组织病、抗磷脂抗体综合征、显微镜下多血管炎、肉芽肿性多血管炎、嗜酸粒肉芽肿性多血管炎、新月体肾小球肾炎、器官特异性自身免疫疾病、巴塞多病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、肺出血肾炎综合征、自身免疫性溶血性贫血、巨幼红细胞性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性硬化性胆管炎、结节性多动脉炎、大动脉炎、巨细胞动脉炎、风湿性多肌痛、成人斯蒂尔病、白塞病、溃疡性大肠炎等。自身免疫疾病优选为自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎或原发性硬化性胆管炎，更优选为原发性胆汁性胆管炎或原发性硬化性胆管炎，进一步更优选为原发性硬化性胆管炎。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物可通过多种用量和用法来施用，但优选通过注射来施用。在一个实施方式中，本发明的药物组合物可以以每施用一次施用约108～约109个、或约107个/kg的方式包含本说明书其它地方描述的诱导性调节性人T细胞。
在一个实施方式中，本发明的药物组合物在向患者施用后的情况下，对于没有效果或效果不充分的患者，还可以进一步追加施用。对于是否没有效果或效果不充分，例如，也可以以目标疾病中的炎症抑制程度为指标进行判断。在一个实施方式中，当进行追加施用时，可以从最初施用起至少约1周、约2周、约3周或约4周后进行施用。
(制造方法)
制造本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞的方法是一种能够制造高功能、稳定型的诱导性调节性T细胞的新方法，本说明书中将在下面详细进行描述。
在本发明的一个方面，提供一种制造诱导性调节性T细胞的方法，其包括：(a)将外周血中的CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞在第一基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；(b)将步骤(a)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤；(c)将步骤(b)中得到的细胞在第二基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；和(d)将步骤(c)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～3天的步骤。在本发明中，无论使用CD4阳性T细胞还是CD8阳性T细胞作为原料都可以制造本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞，在一个实施方式中，本发明的药物组合物中的诱导性调节性T细胞也可以以CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞的混合细胞为原料制造。
在一个实施方式中，本发明的方法也可以是一种包括如下步骤的从人外周T细胞(包括CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞)制造调节性T细胞的方法：将人外周T细胞在抗CD3抗体刺激的存在下在含有TGFβ和IL-2的培养基进行培养的步骤、在不存在抗CD3抗体的情况下在含有IL-2的培养基中进行培养的步骤、再次在抗CD3抗体刺激的存在下在含有TGFβ和IL-2的培养基进行培养的步骤。
在一个实施方式中，T细胞的刺激是获得Treg时的刺激，只要是通过TCR的刺激就没有特别限制。例如，作为T细胞的刺激，可以包括使用抗CD3抗体和包含其的复合体的刺激、使用与TCR结合的肽及包含肽的复合体的刺激、使用抗原呈递细胞的刺激、同时使用抗CD3抗体和抗原呈递细胞的刺激、同时使用肽、蛋白质和抗原呈递细胞的刺激等，但只要是能够获得Treg的刺激，其培养基和条件就没有特别限定。
在一个实施方式中，作为休眠培养，只要是在没有如上所述刺激的状态下培养细胞，其培养基和条件就没有特别限制。
在本说明书中，“抗CD3抗体刺激”是指对细胞上的CD3受体给与特异性刺激。作为CD3刺激，例如可例示出抗CD3激动剂抗体。抗CD3激动剂抗体可以使用作为研究用试剂市售的产品，也可以采用常规方法制作。抗CD3抗体可以使用来自小鼠、兔子、山羊、牛等动物的抗体，以及来自人的抗体。
在一个实施方式中，通过本发明的方法，一旦对iTreg进行诱导(对引起去甲基化诱导的T细胞的刺激)后(步骤a)，通过更换培养基休眠培养1～3天来使细胞恢复(步骤b)，进一步地再一次刺激T细胞(步骤c)以引起去甲基化诱导，由此可以获得具有功能性且具有稳定性的诱导性调节性人T细胞。通常若进行两次刺激，T细胞会显示凋亡，这是技术常识，而通过本发明的方法，发现通过进行“休眠培养”和“第二次刺激”，可得到不显示凋亡、具有功能性且具有稳定性的诱导性调节性人T细胞。
即，在本发明的方法中，通过进行T细胞刺激、休眠培养、之后的再次刺激，能够得到具有功能性且具有稳定性的诱导性调节性人T细胞，因此，只要是这样得到的诱导性调节性人T细胞或包含这样的诱导性调节性人T细胞的细胞群，就能够实现本发明所希望的效果。因此，在本发明的一个实施方式中，用于培养的培养基或刺激的种类没有特别限定，通过使用任意组成的培养基和任意种类的刺激，可以得到功能性且具有稳定性的诱导性调节性人T细胞。
在一个实施方式中，在各步骤中使用的培养基中还可包含视黄酸和/或抗坏血酸。优选地，在培养基中可以包含抗坏血酸。在一个实施方式中，在培养基中还可包含CDK8抑制剂、CDK19抑制剂和/或CDK8/19抑制剂。优选地，在培养基中可以包含CDK8抑制剂、CDK19抑制剂和/或CDK8/19抑制剂。
在本发明的一个实施方式中，上述第一基础培养基和上述第二基础培养基也可以各自独立地包含选自抗CD3抗体、TGF-β1、IL-2、视黄酸、CDK8抑制剂、CDK19抑制剂、CDK8/19抑制剂和抗坏血酸中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或全部因子。另外，在其他实施方式中，上述第一基础培养基和上述第二基础培养基也可以各自独立地包含抗CD3抗体、TGF-β1、IL-2、视黄酸、CDK8抑制剂、CDK19抑制剂、CDK8/19抑制剂和抗坏血酸。作为这些各成分所含的浓度，可以是在该领域中所使用的通常浓度。在一个实施方式中，可使用的CDK8抑制剂、CDK19抑制剂和/或CDK8/19抑制剂的浓度可以是本领域中可以使用的任何合适浓度，例如，当使用SenexinA时，可以为约0.1μM以上、约0.5μM以上、约1μM以上、约2μM以上、约3μM以上、约4μM以上、约5μM以上、约6μM以上、约7μM以上、约8μM以上、约9μM以上、约10μM以上、约12μM以上、约14μM以上、约16μM以上、约18μM以上、约20μM等，但不限于这些浓度，适当地本领域技术人员可以根据其他培养基组成进行变更。
在一个实施方式中，通过本发明的方法，从人的外周T细胞制造调节性T细胞。在外周T细胞中，包含初始调节性T细胞、CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞等。可以从包含多种T细胞的培养物诱导调节性T细胞，也可以从这些细胞中分离CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞等特定的细胞，然后诱导调节性T细胞。另外，也可以在分离特定抗原特异性的T细胞后诱导调节性T细胞。因此，本发明的诱导性调节性T细胞包括CD4阳性的、CD8阳性的T细胞。另外，在本说明书中“CD4阳性”或“CD4+”的情况下，如果没有特别说明，则是指CD4阳性CD8阴性的单阳性细胞。另外，在本发明的制造方法中，可以使用CD4阳性或CD8阳性的任意T细胞作为原料，在生成诱导性调节性T细胞后，只要不进行特别的操作，就可以维持CD4阳性或CD8阳性的特征。
在一个实施方式中，在本发明的方法中，抗体可以添加到培养基中，也可以使用固定在培养容器内壁或不溶性载体表面上的抗体。不溶性载体是能够物理或化学地结合抗CD3抗体的部件，可以使用不溶于水溶液的载体。作为能够物理吸附抗CD3抗体的材料，可以举出聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、聚丙烯等合成树脂或玻璃等。不溶性载体的形状没有特别限定，可以采用例如板形状、珠子形状、容器形状等。抗CD3抗体量根据所使用的抗体的效价和来源而变动，但只要适当设定以给予用于诱导调节性T细胞的充分刺激即可。
在一个实施方式中，在本发明的方法中，在细胞培养中，可以使用向动物细胞培养用基础培养基中添加了必要因子的培养基。作为可用于本发明的方法的动物细胞培养用基础培养基，包括例如Iscove's modified Eagle'sMedium培养基、Ham's F12培养基、MEMZinc Option培养基、IMEM Zinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle'sMinimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modified Eagle'sMedium(DMEM)培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、以及它们的混合培养基或对部分组成进行了改变的培养基等。
在基础培养基中，可以含有血清(例如，胎牛血清(FBS))或无血清。在无血清培养基中，根据需要，可以包含例如白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白、脱铁转铁蛋白、KnockOut血清替代物(KSR)(ES细胞培养时的血清替代物)(Thermo Fisher Scientific)、N2补充剂(Thermo Fisher Scientific)、B27补充剂(Thermo Fisher Scientific)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫醇甘油、硫代甘油(Monothioglycerol)等一种以上的血清替代物。在基础培养基中，还可包含脂质(例如，chemically definedlipid concentrate)、氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)、非必需氨基酸(NEAA)、维生素类(例如，烟酰胺、抗坏血酸)、生长因子、抗生素(例如青霉素和链霉素)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类以及它们的等效物等一种以上的物质。
在一个实施方式中，作为基础培养基，可例示出含有血清和HEPES(4-(2-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)的RPMI 1640培养基。
在本发明的方法中，细胞的培养可以在通常的动物细胞培养条件下进行。培养温度不限于以下，为约30～40℃，优选约37℃。培养优选在含CO2的空气气氛下进行，CO2浓度优选为约2～5％。
在本发明的方法中，抗CD3抗体可以直接添加到培养基中，或者也可以使用固定化在培养容器的内壁或不溶性载体表面上的抗CD3抗体。抗CD3抗体量根据所使用的抗体的效价和来源而变动，但只要适当设定以给予用于诱导调节性T细胞的充分刺激即可。
作为所使用的TGFβ，可例示出TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，例如为TGFβ1。TGFβ的浓度只要由本领域技术人员适当确定即可，没有特别限定。作为TGFβ，使用TGFβ1或TGFβ3时，培养基中的浓度没有特别限定，可以为0.25～25ng/mL，例如为约10ng/mL。
IL-2在所用培养基中的浓度不受限定，可以为约5U/mL～约500U/mL，例如为约100U/mL。
在本发明中使用的培养基中还可以添加视黄酸和/或抗坏血酸。优选地，在培养基中包含抗坏血酸。抗坏血酸的浓度没有限定，为约1～约100μg/mL，例如约10μg/mL。
在本发明中使用的培养基中还可以添加CDK8抑制剂、CDK19抑制剂和/或CDK8/19抑制剂。作为CDK8抑制剂、CDK19抑制剂和/或CDK8/19抑制剂可以使用任何抑制剂，例如可列举出4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺、3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺或其盐、水合物、溶剂化物等，或美国专利第8598344、WO2013/001310、WO2013/040153、WO2013/116786、WO2014/029726、WO2014/063778、WO2014/072435、WO2014/090692、WO2014/1066606、WO2014/123900、WO2014/154723、WO2014/194245、WO2015/049325、WO2015/100420、WO2015/144290、WO2015/159937、WO2015/159938、WO2016/009076或WO2018/139660等中记载的化合物等。作为一个例子，例示出了SenexinA或AS2863619，但本发明不限于此。可使用的CDK8抑制剂、CDK19抑制剂和/或CDK8/19抑制剂的浓度可以是本领域中可使用的任何合适的浓度，也可以是上述文献中记载的任何合适的浓度，本领域技术人员可以根据其它培养基组成适当地进行变更。
在本发明的方法中，通过将人外周T细胞在含有TGFβ和IL-2的培养基中进行抗CD3抗体刺激，诱导调节性T细胞，另外在不含抗CD3抗体而含有IL-2的培养基中实施休眠培养后再次用抗CD3抗体进行刺激，可以诱导具有高免疫抑制功能的调节性T细胞。所得到的诱导性调节性T细胞具有高的免疫抑制功能可以通过例如RNA测序法的全面基因表达分析、体外细胞增殖抑制试验进行确认。
在本发明的一个实施方式中，(a)将外周血中的CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞在第一基础培养基中刺激约1～约5天的步骤中的培养天数可由本领域技术人员适当设定，并没有特别限定，例如也可为约3天。
另外，在一个实施方式中，步骤(b)的休眠培养步骤中的培养天数可以由本领域技术人员适当设定，没有特别限定，例如也可以为约2天。
另外，在一个实施方式中，步骤(c)的第二基础培养基中的培养步骤中的培养天数可以由本领域技术人员可适当设定，没有特别限定，例如也可以为约3天。
另外，在一个实施方式中，步骤(d)的休眠培养步骤中的培养天数可以由本领域技术人员适当设定，没有特别限定，例如也可以为约2天。在一个实施方式中，通过在IL-2的存在下且无刺激状态下进行培养，可以使具有所诱导的调节性T细胞特异性去甲基化状态的调节性T细胞增殖。培养基可以进一步包含抗坏血酸，另外还可以通过在包含IL-2的培养基中培养来得到所诱导的调节性T细胞的稳定的调节性T细胞培养物。
为了从所得到的含有调节性T细胞的细胞培养物中分离调节性T细胞，可以根据调节性T细胞特有的细胞表面标记物，通过常规方法分离细胞，例如可以通过细胞分选仪选出FoxP3阳性级分。另外，也可以根据需要分离具有特定抗原特性的调节性T细胞。
通过本发明的方法得到的诱导性调节性T细胞被期望用于治疗人的炎症性疾病，例如自身免疫疾病或过敏。
(采用流式细胞术的阳性率测定)
在一个实施方式中，可以如下地进行采用流式细胞仪的阳性率测定。
准备
·固定/透化浓缩液(以下称为缓冲液)(eBio Science，00-5123-43)
·固定/透化稀释液(以下称为稀释液)(eBio Science，00-5223-56)
·透化缓冲液(10×)(eBio Science，00-833-56)
·FOXP3单克隆抗体(236A/E7)、PE(以下称为抗FOXP3抗体)(eBio Science，12-4777-42)
·小鼠IgG1κ同型对照(P3.6.2.8.1)、PE(以下称为PE对照)(eBio Science)
·BV421、小鼠、抗人、CD152(以下称为抗CTLA4抗体)(BD)
·BV421小鼠IgG2a、k同型对照(以下称为BV421对照)(BD)
·CD4单克隆抗体(RPA-T4)、APC(以下称为抗CD4抗体)(eBio Science)
·小鼠IgG1κ同型对照(P3.6.2.8.1)、APC(以下称为APC对照)(eBio Science)
·D-PBS(Nacalai Tesque，14249-95)
·FBS(HyClone、SH30084.03)
·0.5mol/l-EDTA溶液(pH 8.0)(Nacalai Tesque，06894-14)
·MilliQ水
·离心机
·安全柜
·微量移液器(P200、P1000)
·5mL聚苯乙烯圆管(以下称为专用管)(Falcon，352008)
·尼龙网(65μm)(日本共进理工公司、PP-65N)
试剂配制
※固定缓冲液(每个样品使用100μL)
将缓冲液和稀释液以1:3的比例混合。
※透化缓冲液
将透化缓冲液(10×)用MilliQ水稀释10倍。
※FACS缓冲液(配制500mL时)
D-PBS 489mL
FBS 10mL(最终浓度2％)
0.5mol/l EDTA溶液1mL(最终浓度1mM)
以上试剂在配制后，在4℃或冰上保管。
方法
(1)将500μL FACS缓冲液加入到1.5mL管中。
(2)将1x106个最终产品加入到(1)的管中，通过微量移液器轻轻悬浮。
(3)用离心机在500×g、4℃下离心5分钟。
(4)用抽吸器除去上清液后，加入100μL固定缓冲液，轻轻地进行吹打。→注意不要起泡。
(5)在冰上遮光下，静置30分钟以上来进行固定。→45分钟也可以。
(6)固定后，向管中加入1mL透化缓冲液并轻轻地进行吹打。
(7)按照样品数准备1.5毫升的新管。
(8)各分注500μL样品以用于对照和抗体染色。
(9)用离心机在500×g、4℃下离心5分钟。
(10)在离心中用透化缓冲液将抗FOXP3抗体(原液浓度＝0.05mg/ml)、抗CTLA4抗体(Lot:0030269原液浓度＝0.2mg/ml)、抗CD4抗体(原液浓度＝0.1mg/ml)稀释100倍来进行配制(以下称为抗体配制液)。用于对照样品，将PE对照(原液浓度＝0.1mg/ml)、BV421对照(原液浓度＝0.2mg/ml)、APC对照(原液浓度＝0.1mg/ml)调整为与对应色素的抗体相同浓度(以下称为对照液)
＊在步骤内管理试验中不实施CTLA4的染色。
(11)用抽吸器除去上清液后，分别在抗体染色样品中加入100μL抗体配制液，在对照样品中加入100μL对照液，轻轻地进行吹打。→注意不要起泡。
(12)在冰上遮光下，静置60分钟来进行固定。
(13)在染色中实施测定设备的启动。
(14)染色后，加入1mL的FACS缓冲液，轻轻地进行吹打。
(15)用离心机在500×g、4℃下离心5分钟。→用抽吸器除去上清液后，再次重复(14)和(15)，进行清洗。
(16)用抽吸器除去上清液后，加入500μL FACS缓冲液，轻轻地进行吹打。
(17)用镊子将尼龙网放在专用管上，对悬浮液进行过滤。
(18)用任意的流式细胞仪设备进行分析。数据回收细胞数为10000个以上。在目标抗原阳性率计算中，以对照样品的阳性率为5％以下的方式划出基准线，将显示基准以上的抗原表达量的细胞的比例作为阳性率。
备注
·用于固定和染色的试剂类也可以作为“Foxp3/转录因子染色缓冲液试剂盒(Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set)”(Cat.:00-5523)购买1套3瓶。
·设备的设定等只要不脱离能够从一般、科学的观点明确地判断为不能实施正常的测定的程度，任何设定都没有问题。明确的脱离是指作为目标的细胞群的各种信号低于设定的荧光阈值的情况、对照样品或测定对象样品的各种信号值低于或超过仪器能够正常测定的极限值的情况等。
(免疫抑制活性测定)
本发明的细胞可具有免疫抑制活性。免疫抑制活性可以通过各种方法进行测定。
在一个实施方式中，如实施例所述，可以通过测量应答T细胞引起的免疫反应带来的细胞增殖来判定是否被抑制。优选地，在本发明中，希望使用体内模型来进行证实。例如，如实施例所述，对于大肠炎模型小鼠，可以从施用了本发明的诱导性调节性T细胞的大肠炎模型小鼠中在施用一定时间后回收组织，根据在该组织中是否确认到免疫抑制来测定其活性。组织中的免疫抑制的确认可以通过各种方法来实现，例如也可以通过组织的染色分析来确认有无免疫抑制。
(一般技术)
本说明书所用的分子生物学方法、生化方法和微生物学方法是本领域公知和常用的，例如Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning:A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor及其第三版(2001)；Ausubel，F.M.(1987).Current Protocols inMolecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Ausubel，F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Innis，M.A.(1990).PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications，Academic Press；Ausubel，F.M.(1992).Short Protocols in MolecularBiology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates；Ausubel，F.M.(1995).Short Protocols in MolecularBiology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates；Innis，M.A.etal.(1995).PCR Strategies，Academic Press；Ausubel，F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，and annual updates；Sninsky，J.J.et al(1999).PCR Applications：Protocols for Functional Genomics，Academic Press，实验医学特刊《基因导入&表达分析实验法》羊土社，1997等中有记载，这些在本说明书中相关的部分(可能是全部)被引用作为参考。
对于用于制作人工合成的基因的DNA合成技术和核酸化学，也可以使用例如GeneArt、GenScript、Integrated DNA Technologies(IDT)等的基因合成或片段合成服务，另外，例如Gait，M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach，IRLPress；Gait，M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach，IRLPress；Eckstein，F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach，IRL Press；Adams，R.L.et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids，Chapman&Hall；Shabarova，Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of NucleicAcids，Weinheim；Blackburn，G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry andBiology，Oxford University Press；Hermanson，G.T.(I996).Bioconjugate Techniques，Academic Press等中有记载，这些在本说明书中相关的部分被引用作为参考。
在本说明书中，“或”在能够采用文章中所列举的事项的“至少一个以上”时使用。“或者”也是同样。在本说明书中明确记载为“两个值”的“范围内”的情况下，在该范围中也包括两个值本身。
在本说明书中引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献，其整体以与分别具体记载的相同程度在本说明书中被引用作为参考。
以上，为了便于理解，示出了优选的实施方式来说明本发明。以下，基于实施例对本发明进行说明，但上述的说明和以下的实施例仅被提供用于例示的目的，并不是为了限定本发明而提供的。因此，本发明的范围不限于本说明书中具体记载的实施方式和实施例，而仅由权利要求书进行限定。
实施例
在以下实施例中，使用不含谷氨酰胺的RPMI 1640(含有10％FCS(v/v)、60μg/mL青霉素G、100μg/mL链霉素、10mM HEPES)作为基础培养基。根据需要将30～300mg/L的L-谷氨酰胺加入到培养基中进行使用。
亚硫酸氢盐测序
从诱导得到的细胞获得基因组DNA，用MethylEasy Xceed RapidDNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒(Human Genetic Signatures)处理后，研究调节性T细胞中特征性基因的去甲基化。使用已知的方法和引物(Floess et al.(2007)Plos Biology Volume 5，Issue2，e38和Ohkura et al.(2012)Immunity 37(5)785-799)来分析各基因的去甲基化。
另外，在人Foxp3 CNS2区域的分析中，在正向侧使用5’-TTGGGTTAAGTTTGTTGTAGGATAG-3’(序列号1)，在反向侧使用5’-ATCTAAACCCTATTATCACAACCCC-3’(序列号2)。
获取小鼠T细胞的级分
使用Foxp3-eGFP(eFox)报告小鼠(Ito et al.(2014)Science 346，363-368)。获得Foxp3-eGFP(eFox)报告小鼠的淋巴结细胞，通过用FACSAriaII(BD)对CD4+GFP+细胞进行分选来获得内源性调节性T细胞(nTreg)级分。对CD4+GFP-CD44低CD62L高细胞进行分选，获得初始T细胞级分。进一步地，获得CD4+GFP-CD44高CD62L低细胞级分，用作效应/记忆T细胞。
获取人T细胞的级分
从克罗恩病患者的PBMC中分离人CD4+T细胞。使用CliniMACS CD4GMP微珠，根据产品说明书(protocol)从浓缩的PBMC进行纯化。
(实施例1：小鼠高功能稳定型调节性T细胞的制作方法)
在含有抗CD3抗体(每孔加入100μL浓度为10μg/ml的抗体，在室温下静置60分钟来固相化到容器中)、hIL-2(100U/ml)、hTGFβ1(2.5ng/ml)、视黄酸(1μM)、SenexinA(5μM)的基础培养基中，将小鼠CD4阳性T细胞刺激3天。然后在含有hIL-2(100U/ml)的基础培养基中休眠培养2天。2天后同样地更换培养基，再休眠培养2天。2天后再次在含有抗CD3抗体(每孔加入100μL浓度为10μg/ml的抗体，在室温下静置60分钟来固相化到容器中)、hIL-2(100U/ml)、hTGFβ1(2.5ng/ml)、视黄酸(1μM)、SenexinA(5μM)、抗坏血酸(10μg/ml)的基础培养基中刺激2天。然后在含有hIL-2(100U/ml)的基础培养基中休眠培养2天。2天后同样地更换培养基，再休眠培养2天。分别用流式细胞术法(图1)分析2天后获得的调节性T细胞的FoxP3、CD25的表达，用亚硫酸氢盐法分析Treg特异性去甲基化区域的去甲基化状态，用RNA-seq法(图3)分析全面基因表达模式。
在以往的诱导性调节性T细胞(常规的iTreg)中，功能性分子(在此情况下为图3中的例如CTLA4、Entpd1、Nt5e、Itgae等)的表达不充分，FoxP3诱导效率也低，但可以确认通过本申请的制作方法得到的高功能的诱导性调节性T细胞高表达FoxP3和功能性基因(在此情况下为图3中的例如CTLA4、Entpd1、Nt5e、Itgae等)，具有Treg特征性的去甲基化状态(图1～3)。
(实施例2:调节性T细胞的体外抑制活性)
通过与实施例1相同的实验体系来获得调节性T细胞。将Cell Trace Violet标记的应答T细胞(5×104)、制作的调节性T细胞(5×104)在抗CD3抗体(1μg/ml)+抗原呈递细胞(MHC-II阳性细胞：1×104)，或Dynabeads T-活化剂(VERITAS)(5μL/孔)存在下混合培养3天，用流式细胞术法分析Cell Trace Violet强度。当应答T细胞引起免疫反应时，由于细胞增殖，Cell Trace Violet强度显示多个弱峰，但当该免疫反应被抑制时，Cell TraceViolet强度保持单独的强峰。确认了通过本申请的制作方法得到的调节性T细胞强抑制应答T细胞的免疫反应。因此，确认了所得到的调节性T细胞与现有的调节性T细胞群相比具有更高的抑制功能(图4)。
(实施例3：调节性T细胞的生物体内稳定性)
通过实施例1的方法从Thy1.2/eFox报告小鼠制作调节性T细胞，通过FACS分离Foxp3阳性细胞(2×105个)，尾静脉施用于Thy1.1/野生型小鼠。2周后从淋巴结中回收植入的Thy1.2细胞，分析Foxp3表达(图5)。确认了在没有CD28刺激的情况下诱导并进行了稳定化培养的调节性T细胞在体内经过2周后也稳定地表达Foxp3。
(实施例4：对大肠炎模型的抑制效果)
通过向RAG缺失的小鼠施用2×105个来自野生型小鼠的CD45RB高表达CD4阳性初始T细胞，来制作大肠炎模型。1周后，施用2x105个通过实施例1的方法制作的高功能稳定型iTreg细胞，经时地测定体重变化(图6的A)。然后，在施用后1个月回收大肠组织及淋巴结，实施大肠组织的HE染色分析(图6的B)、淋巴结T细胞的CD69表达分析(图6的C：流式细胞术法)。结果证实，高功能稳定型iTreg的施用可抑制大肠炎。另外，作为施用量，确认了每只小鼠(约20g)2x105个的治疗效果，确认到1x107个/kg的有效性。
(实施例5：从人外周T细胞制造调节性T细胞)
在含有抗CD3抗体(每孔加入100μL浓度为10μg/ml的抗体，在室温下静置60分钟来固相化到容器中)、hIL-2(100U/ml)、hTGFβ1(10ng/ml)、视黄酸(1μM)、SenexinA(5μM)的基础培养基中，将来自克罗恩病患者的CD4阳性T细胞刺激3天。然后在含有hIL-2(100U/ml)的基础培养基中休眠培养2天。2天后同样地更换培养基，再休眠培养2天。2天后再次在含有抗CD3抗体(每孔加入100μL浓度为10μg/ml的抗体，在室温下静置60分钟来固相化到容器中)、hIL-2(100U/ml)、hTGFβ1(10ng/ml)、视黄酸(1μM)、SenexinA(5μM)、抗坏血酸(10μg/ml)的基础培养基中刺激2天。然后在含有hIL-2(100U/ml)的基础培养基中休眠培养2天。2天后同样地更换培养基，再休眠培养2天。通过流式细胞术法分析2天后获得的调节性T细胞的FoxP3、CTLA4的表达(图7的A)。
在以往的诱导性调节性T细胞(常规的iTreg)中，功能性分子(在此情况下为CTLA4)的表达不充分，FoxP3诱导效率也低，但可以确认，通过本申请的制作方法得到的高功能的诱导性调节性T细胞是含有大量表达FoxP3和CTLA4的细胞的群体。
(实施例6:调节性T细胞的体外抑制活性)
通过与实施例1相同的实验体系来获得调节性T细胞。将Cell Trace Violet标记的应答T细胞(5×104)、制作的调节性T细胞(5×104)在Treg抑制功能检测试剂(MiltenyiBiotec)(5μL/孔)存在下混合培养3天，通过流式细胞术法分析Cell Trace Violet强度。当应答T细胞引起免疫反应时，由于细胞增殖，Cell Trace Violet强度显示多个弱峰，但当该免疫反应被抑制时，Cell Trace Violet强度保持单独的强峰。确认了通过本申请的制作方法得到的调节性T细胞强抑制应答T细胞的免疫反应。因此，确认了所得到的调节性T细胞与现有的调节性T细胞群相比具有更高的抑制功能。
(实施例7：从CD8阳性人外周T细胞制造调节性T细胞)
在含有抗CD3抗体(每孔加入100μL浓度为10μg/ml的抗体，在室温下静置60分钟来固相化到容器中)、hIL-2(100U/ml)、hTGFβ1(10ng/ml)、视黄酸(1μM)、SenexinA(5μM)的基础培养基中，将CD8阳性T细胞刺激3天。然后在含有hIL-2(100U/ml)的基础培养基中休眠培养2天。2天后同样地更换培养基，再休眠培养2天。2天后再次在含有抗CD3抗体(每孔加入100μL浓度为10μg/ml的抗体，在室温下静置60分钟来固相化到容器中)、hIL-2(100U/ml)、hTGFβ1(10ng/ml)、视黄酸(1μM)、SenexinA(5μM)、抗坏血酸(10μg/ml)的基础培养基中刺激2天。然后在含有hIL-2(100U/ml)的基础培养基中休眠培养2天。2天后同样地更换培养基，再休眠培养2天。通过流式细胞术法分析2天后获得的调节性T细胞的FoxP3、CTLA4、Helios的表达(图8)。
从CD8阳性T细胞制作诱导性调节性T细胞时，也可以确认为Helios阴性，是含有大量表达FoxP3和CTLA4的细胞的群体。
(实施例8：表达强度分析)
对于实施例1中制造的诱导性调节性T细胞的细胞群，通过使用BD FACSLyric流式细胞仪的流式细胞术方法分析CD25和FOXP3的表达强度。结果如图9所示。
可以确认，在所有测试的细胞中，FOXP3Hi的诱导性调节性T细胞的细胞群以高比例存在。
(实施例9：诱导性调节性T细胞的抗体组分析)
为了对实施例1中制造的诱导性调节性T细胞中的细胞表面标记物进行全面分析，进行抗体组分析。使用BioLegend的LEGENDScreen人PE试剂盒，对实施例1中制造的诱导性调节性T细胞进行染色，并通过流式细胞术法分析与本发明的诱导性调节性T细胞反应的抗体。结果的一部分(可以确认明确且显著的表达)如表1～4所示。
利用含有近400种的抗体组(Antibody panel)，进行染色后，通过至少185种表面标记物分子可以确认在本发明的诱导性调节性T细胞中细胞表面标记物的阳性/阴性的特征。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
(实施例10：诱导性调节性T细胞中的细胞表面标记物分析)
在图10中示出了实施例9中实施的抗体筛选结果中的特征性结果。
在本发明的诱导性调节性T细胞中，发现CD172g和CD26等特有的细胞表面标记物呈阳性。
(实施例11：从来自系统性红斑狼疮(SLE)患者的T细胞制造调节性T细胞)
使用来自SLE患者的CD4阳性T细胞，通过与实施例1相同的实验体系获得调节性T细胞。通过流式细胞术法分析所获得的调节性T细胞的FoxP3、CD4、CTLA4的表达(图11)。
在以往的诱导性调节性T细胞(传统iTreg)中，功能性分子(在此情况下为CTLA4)的表达不充分，FoxP3诱导效率也低，但是可以确认，通过本申请的制作方法得到的高功能的诱导性调节性T细胞是含有大量表达FoxP3和CTLA4的细胞的群体。
(实施例12：从来自类风湿性关节炎(RA)患者的T细胞制造调节性T细胞)
使用来自RA患者的CD4阳性T细胞，通过与实施例1相同的实验体系获得调节性T细胞。通过流式细胞术法分析所获得的调节性T细胞的FoxP3、CD4、CTLA4的表达(图12)。
在以往的诱导性调节性T细胞(传统iTreg)中，功能性分子(在此情况下为CTLA4)的表达不充分，FoxP3诱导效率也低，但是可以确认，通过本申请的制作方法得到的高功能的诱导性调节性T细胞是含有大量表达FoxP3和CTLA4的细胞的群体。
(注释)
如上所述，尽管已经使用本发明的优选实施方式对本发明进行了例示，但是应理解，本发明仅应通过权利要求书的范围来解释其范围。应当理解，本说明书中引用的专利、专利申请和其它文献其内容应与其内容本身在本说明书中具体记载的同样地被引用作为对于本说明书的参考。本申请是针对向日本专利局于2021年11月24日申请的特愿2021-190125主张优先权的申请，其内容整体如与构成本申请的内容同样地被引用作为参考。
[产业上的可利用性]
本发明的细胞群可用于治疗或预防各种免疫疾病、自身免疫病等炎症性疾病。另外，通过制作本发明的细胞群的方法，能够从外周T细胞稳定地诱导具有高功能性的调节性T细胞，可以期待应用于医疗领域。
[序列表自由文本]
序列号1：实施例中使用的正向引物
序列号2：实施例中使用的反向引物。
Claims (32)
1.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含具有选自FoxP3阳性、CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少一个特征的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
2.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含NT5E阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
3.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含ITGAE(CD103)阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
4.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含AREG阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
5.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含CD172g阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
6.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含CD26阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
7.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物包含CTLA4阳性的诱导性调节性人T细胞作为有效成分。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞至少为CTLA4阳性和FoxP3阳性。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞至少为CD172g阳性和/或CD26阳性。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞的FOXP3基因的CNS2位点被脱甲基化。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞为CD4阳性或CD8阳性。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞从人的外周血T细胞或来自人组织的T细胞获得或诱导。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的药物组合物，其中，所述诱导性调节性人T细胞通过包括下述步骤的方法获得：
(a)将人外周血中的CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞在第一基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；
(b)将步骤(a)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤；
(c)将步骤(b)中得到的细胞在第二基础培养基中刺激约1～约5天的步骤；和
(d)将步骤(c)中得到的细胞在含有IL-2的培养基中休眠培养至少约1～约3天的步骤。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物含有包含所述诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的选自FoxP3阳性、CTLA4阳性、NT5E阳性、ITGAE(CD103)阳性、AREG阳性、CD172g阳性和CD26阳性中的至少一个特征的比例分别为约50％以上。
15.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的NT5E阳性的比例分别为约50％以上。
16.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的ITGAE(CD103)阳性的比例分别为约50％以上。
17.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的AREG阳性比例分别为约50％以上。
18.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的CD172g阳性的比例分别为约50％以上。
19.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的CD26阳性的比例分别为约50％以上。
20.一种用于治疗或预防T细胞相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有包含诱导性调节性人T细胞的细胞群作为有效成分，所述细胞群的CTLA4阳性的比例分别为约50％以上。
21.根据权利要求14～20中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中至少所述CTLA4阳性和FoxP3阳性的比例分别为约50％以上。
22.根据权利要求14～21中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中至少所述CD172g阳性和/或CD26阳性的比例分别为约50％以上。
23.根据权利要求14～22中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中的所述至少一个特征的比例为约60％以上。
24.根据权利要求14～23中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中的所述至少一个特征的比例为约80％以上。
25.根据权利要求14～24中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群中FoxP3强阳性的比例为约50％以上。
26.根据权利要求1～25中任一项所述的药物组合物，其中，所述细胞群的约90％以上为T细胞。
27.根据权利要求1～26中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物以每施用一次施用约108～约109个、或约107个/kg的方式包含所述诱导性调节性人T细胞。
28.根据权利要求1～27中任一项所述的药物组合物，其中，所述T细胞相关疾病包括能够通过免疫抑制作用治疗的自身免疫疾病、感染症、癌症、过敏症、炎症性疾病和ALS。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中，所述自身免疫疾病选自：艾迪森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、克罗恩病、糖尿病(I型)、营养不良型大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力症、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、脊柱关节病、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性大肠炎、心肌病、扩张型心肌病(DCM)、围产期心肌病(PPCM)、特发性心肌病、恰加斯心肌病、恰加斯巨结肠、恰加斯巨食管症、恰加斯神经障碍、良性前列腺增生、硬皮症、牛皮癣、雷诺综合征、先兆子痫、心肌炎、青光眼、高血压病、肺动脉高压、恶性高血压病、阿尔茨海默病、系统性硬化症、多发性肌炎、混合性结缔组织病、抗磷脂抗体综合征、显微镜下多血管炎、肉芽肿性多血管炎、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、新月体肾小球肾炎、器官特异性自身免疫疾病、巴塞多病、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、肺出血肾炎综合征、自身免疫性溶血性贫血、巨幼红细胞性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性硬化性胆管炎、结节性多动脉炎、大动脉炎、巨细胞动脉炎、风湿性多肌痛、成人斯蒂尔病、白塞病和溃疡性大肠炎。
30.根据权利要求1～29中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物通过注射被施用。
31.根据权利要求1～30中任一项所述的药物组合物，其中，在向患者施用所述药物组合物后的情况下，对于没有效果或效果不充分的患者，追加施用所述药物组合物。
32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中，从最初施用起至少约2周后追加施用所述药物组合物。
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