CN114921468A

CN114921468A - 新型化合物以及调节性t细胞的制造方法

Info

Publication number: CN114921468A
Application number: CN202210570348.9A
Authority: CN
Inventors: 坂口志文; 大仓永也; 三上统久; 成宫周; 赤松政彦; 夏谷良; 原田博规; 中村尚登; 氏原悟; 滨口寿雄
Original assignee: Astellas Pharma Inc; Kyoto University NUC
Current assignee: Astellas Pharma Inc; Kyoto University NUC
Priority date: 2017-01-30
Filing date: 2018-01-30
Publication date: 2022-08-19
Also published as: JP2022172268A; US20190382403A1; ES3004107T3; WO2018139660A1; JP7385227B2; CN110234648A; JPWO2018139660A1; JP7142846B2; CN110234648B; EP3575297B1; EP3575297A4; EP3575297A1; US11578067B2

Abstract

本发明提供一种具有CDK8和/或CDK19抑制活性的新型化合物以及Treg的制造方法。通过利用CDK8和/或CDK19抑制剂对T细胞进行处理而将Foxp3诱导该T细胞。通过在体外(invitro)利用CDK8和/或CDK19抑制剂对Foxp3^‑T细胞进行处理，能够将其诱导为Foxp3⁺T细胞，能够诱导为Treg。

Description

新型化合物以及调节性T细胞的制造方法

本申请是申请日为2018年1月30日、申请号为201880008961.3、发明名称为“新型化合物以及调节性T细胞的制造方法”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有CDK8和/或CDK19抑制活性的新型化合物以及调节性T细胞的制造方法。

本申请要求通过参照而援引于此的美国临时申请第62/451807号以及第62/491279号的优先权。

背景技术

CDK8(cyclin-dependent kinase 8)以及作为其关联异构体的CDK19通过负责转录的RNA聚合酶2的磷酸化来调节转录活性。CDK8被鉴定为黑色素瘤(Nature 468,1105-1109,2010)、大肠癌(Nature 455,547-551,2008)中的癌症基因，还有报道指出，在大肠癌中CDK8的高表达与恶性肿瘤的发展相关(Int.J.Cancer 126,2863-2873,2010)。另外，已知CDK8维持胚胎干细胞的多能性性状，并且提示了与癌症干细胞的性状之间的关系(CancerRes.72,2129-2139,2012)。因此，作为各种癌症治疗药物，进一步地作为自身免疫疾病、炎症性疾病的治疗药物而提出了许多CDK8抑制剂、CDK19抑制剂。具体而言，例如，可列举为美国专利第8598344、WO2013001310、WO2013040153、WO2013116786、WO2014029726、WO2014063778、WO2014072435、WO2014090692、WO2014106606、WO2014123900、WO2014154723、WO2014194245、WO2015049325、WO2015100420、WO2015144290、WO2015159937、WO2015159938、WO2016009076中记载的化合物等。

在免疫系统中，存在具有抑制免疫应答功能的被称为调节性T细胞(Tregs)的CD4⁺T细胞亚群，通过调节自身免疫、炎症、过敏之类的各种病理性免疫应答而在维持免疫耐受以及免疫稳态方面起到重要作用。在Treg中，存在胸腺中产生的nTreg(natural-occurringTreg)和在末梢受TGF-β的作用诱导的iTreg(induced Treg)。上述Treg的免疫应答抑制功能由作为转录因子的Foxp3的表达和维持来决定(Science,299,1057-1061(2003)，Immunological Reviews 212,8-27(2006)，Nat.Immunol.,8,457-462(2007))。

提出了以Treg作为靶向来增强或减弱免疫应答从而治疗免疫疾病的方法、基于Treg的细胞治疗方法。例如，可列举：将以香叶基香叶基化抑制剂作为有效成分的免疫抑制剂使用于自身免疫性疾病、炎症性疾病的方法(专利文献1：日本特开2009-215284号公报)；在IL-33(Interleukin-33)的存在下对CD4⁺初始细胞和肥大细胞在体外(in vitro)进行共培养来制造Treg，并作为抑制过敏性疾病、风湿病等疾病、器官移植物排异反应的发病的免疫抑制剂来使用的方法(专利文献2：日本特开2010-4853号公报)；使T细胞与TGF-β(转化生长因子-β)以及视黄酸接触来刺激或增加向Treg分化并使用在自身免疫疾病等中的方法(专利文献3：美国公开专利US20090136470)；在IL-2(Interleukin-2)、TGF-β1以及atRA(全反式视黄酸或维甲酸)的存在下在体外(in vitro)对CD4⁺T细胞进行培养并诱导CD8⁺的Treg，并使用在自身免疫疾病、恶性肿瘤、病毒感染症等中的方法(专利文献4：WO2013/161408)；利用含有甲基转移酶抑制剂的调节组合物对非调节性T细胞进行离体(ex vivo)处理来制造Treg，并用于处置自身免疫疾病、异常的免疫应答的方法(专利文献5：美国公开专利US20090257988)等。

但是，期待Treg诱导方法的进一步的开发。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009-215284号公报

专利文献2：日本特开2010-4853号公报

专利文献3：美国公开专利US20090136470

专利文献4：WO2013/161408号公报

专利文献5：美国公开专利US20090257988

发明内容

发明所要解决的问题

本发明提供一种具有CDK8和/或CDK19抑制活性的新型化合物以及Treg的制造方法。

用于解决问题的方法

本发明的发明人在对具有CDK8和/或CDK19抑制活性的新型化合物的研究过程中首次发现了CDK8和/或CDK19抑制剂将Foxp3诱导至T细胞的见解。进一步地，发现通过在体外(in vitro)利用CDK8和/或CDK19抑制剂对CD4⁺CD25^-Foxp3^-T细胞进行处理，能够将其诱导为CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg。发现通过在体外(in vitro)利用CDK8和/或CDK19抑制剂对CD8⁺Foxp3^-T细胞进行处理，能够将其诱导为CD8⁺Foxp3⁺Treg，从而完成了本发明。

本发明包括以下内容。

(1)选自4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺以及3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺的化合物或其盐、水合物、溶剂合物。

(2)以选自4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺以及3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺的化合物或其盐、水合物、溶剂合物作为有效成分的、用于治疗癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病或过敏性疾病的医药组合物。

(3)一种Foxp3诱导剂，其用于由T细胞制造调节性T细胞，并以具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物或其盐、水合物、溶剂合物作为有效成分。

(4)根据前项(3)所述的Foxp3诱导剂，其中，T细胞为CD4⁺Foxp3^-T细胞。

(5)根据前项(3)所述的Foxp3诱导剂，其中，T细胞为CD4⁺CD25^-Foxp3^-T细胞。

(6)根据前项(3)所述的Foxp3诱导剂，其中，T细胞为CD8⁺Foxp3^-T细胞。

(7)根据前项(3)～(6)中任一项所述的Foxp3诱导剂，其中，具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物为以下1)～3)中任一项所示的化合物：

1)4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺；

2)3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺；

3)CDK8和/或CDK19的siRNA。

(8)一种调节性T细胞的制造方法，其通过利用具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物或其盐、水合物、溶剂合物对T细胞进行处理来制造该调节性T细胞。

(9)一种调节性T细胞的制造方法，其通过在具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物或其盐、水合物、溶剂合物的存在下对T细胞进行T细胞受体(TCR)刺激来制造该调节性T细胞。

(10)一种调节性T细胞的制造方法，其在TGF-β、雷帕霉素或视黄酸的存在下进行前项(9)所述的TCR刺激。

(11)根据前项(8)～(10)中任一项所述的调节性T细胞的制造方法，其中，T细胞为CD4⁺Foxp3^-T细胞。

(12)根据前项(8)～(10)中任一项所述的调节性T细胞的制造方法，其中，T细胞为CD4⁺CD25^-Foxp3^-T细胞。

(13)根据前项(8)～(10)中任一项所述的调节性T细胞的制造方法，其中，T细胞为CD8⁺Foxp3^-T细胞。

(14)根据前项(8)～(13)中任一项所述的调节性T细胞的制造方法，其中，具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物为以下1)～3)中任一项所示的化合物：

3)CDK8和/或CDK19的siRNA。

(15)一种调节性T细胞，其是通过前项(8)～(14)中任一项所述的方法制备的调节性T细胞。

(16)一种医药组合物，其是以通过前项(8)～(14)中任一项所述的方法制备的调节性T细胞作为有效成分的、用于治疗癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病或过敏性疾病的医药组合物。

(17)一种癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病或过敏性疾病的治疗方法，其特征在于，使用前项(2)所述的医药组合物。

(18)一种癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病或过敏性疾病的治疗方法，其特征在于，使用前项(16)所述的医药组合物。

发明效果

本发明的具有CDK8和/或CDK19抑制活性的新型化合物，能够在体内(in vivo)将Foxp3诱导至T细胞而形成Treg，因此能够作为用于治疗癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病或过敏性疾病的医药组合物来使用。另外，能够通过在体外(in vitro)利用具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物对T细胞进行处理来诱导Foxp3，因此可期待在Treg细胞疗法等中的应用。

附图说明

图1中的(a)是表示利用CDK8siRNA以及CDK19siRNA来敲低CDK8以及CDK19蛋白质的蛋白免疫印迹。图1中的(b)是表示利用CDK8siRNA以及CDK19siRNA分别敲低CDK8以及CDK19蛋白质时所诱导的Foxp3 mRNA的量的图。(实施例3)

图2中的(a)是表示化合物1的二盐酸盐(在图中记载为“化合物1盐”，以下相同)对初始T细胞的Foxp3的诱导量的FACS分析图。左图表示添加抗TGF-β抗体的情况下的分析结果，右图表示添加TGF-β的情况下的分析结果。图2中的(b)是以图表对通过图2中的(a)中的FACS分析而得到的Foxp3的量进行表示的图。(实施例5)

图3中的(a)是表示化合物1盐对初始T细胞的Foxp3的诱导量的FACS分析图。左图表示仅存在抗原提呈细胞(APC)的情况，中央的图表示存在抗原提呈细胞和抗原(OVA)的情况，右图表示存在T细胞受体刺激剂(CD3/CD28)的情况。图3中的(b)是以图表对通过图3(a)中的FACS分析而得到的Foxp3的量进行表示的图。(实施例6)

图4是表示化合物1盐对效应记忆性T细胞的Foxp3的诱导量的FACS。(实施例7中的(1))

图5中的(a)是表示化合物1盐对效应记忆性T细胞的Foxp3的诱导量的FACS分析图。图5中的(b)是表示对内源性的Treg(nTreg)与利用化合物1盐诱导的调节性T细胞(Tem-derived Treg)的T细胞增殖抑制作用进行比较的图。左图是表示使用对照组(Tconv)的情况下的T细胞增殖抑制作用的图，中央的图是表示并用Tconv和nTreg的情况下的T细胞增殖抑制作用的图，右图是表示并用Tconv和Tem-derived Treg的情况下的T细胞增殖抑制作用的图。在图中，黑线表示实测数据，红线(在图中以虚线箭头表示)表示非分裂细胞的峰值，蓝线(在图中以实线箭头表示)表示分裂细胞的峰值。另外，Cell Trace Violet表示通过分裂进行子细胞分配而发生细胞增殖的次数。(实施例7中的(2))

图6中的(a)是表示对来自化合物1盐给药后的小鼠的淋巴细胞的Foxp3的诱导量的FACS。左侧的图表示未对小鼠进行抗原给药的情况下的Foxp3的诱导量，右侧的图表示对小鼠进行抗原(OVA)给药的情况下的Foxp3的诱导量。图6中的(b)是以图表对通过图6中的(a)的FACS而得到的Foxp3的量进行表示的图。(实施例8)

图7中的(a)是表示化合物1盐对DNFB诱发性CHS模型的耳部肥厚的抑制作用的图。在图中，标记有“去除Treg”的部分表示通过白喉毒素的给药而去除了模型小鼠体内的Treg的情况。图7中的(b)是图7中的(a)中的小鼠的耳部组织的染色照片。(实施例9)

图8是表示基于化合物1盐的EAE模型的病理评分(EAEscore)的随时间变化的图。(实施例10)

图9是表示化合物2对主动致敏抗体诱发鼻过敏模型的挠鼻抑制作用的图。(实施例11)

图10A是表示化合物2对OVA诱发哮喘模型的气道高反应性的抑制作用的图。(实施例12中的(1))

图10B是表示化合物2对Th1型哮喘模型的气道高反应性的抑制作用的图。(实施例12中的(2))

图11中的(a)是表示化合物1盐对Foxp3阴性CD8⁺T细胞的Foxp3的诱导量的FACS分析图。左图表示添加抗TGF-β抗体的情况下的分析结果，右图表示添加TGF-β的情况下的分析结果。图11中的(b)是以图表对通过图11中的(a)中的FACS分析而得到的Foxp3的量进行表示的图。(实施例15)

图12是以图表对化合物1盐对人初始T细胞的Foxp3⁺CD25⁺细胞(％)诱导结果进行表示的图。(实施例16)

图13是以图表对化合物1盐对人初始T细胞的Foxp3诱导结果进行表示的图。(实施例17)

图14中的(a)是表示化合物1盐对人初始CD4⁺T细胞的Foxp3的诱导量的FACS分析图。左图表示添加抗TGF-β抗体的情况下的分析结果，右图表示添加TGF-β的情况下的分析结果。图14中的(b)是以图表对通过图14中的(a)中的FACS分析而得到的Foxp3的量进行表示的图。(实施例18中的(1))

图15中的(a)是表示化合物1盐针对人效应记忆性CD4⁺T细胞的Foxp3的诱导量的FACS分析图。左图表示添加抗TGF-β抗体的情况下的分析结果，右图表示添加TGF-β的情况下的分析结果。图15中的(b)是以图表对通过图15中的(a)的FACS分析而得到的Foxp3的量进行表示的图。(实施例18中的(2))

图16是以图表对化合物1盐对人初始CD8⁺T细胞的Foxp3诱导结果进行表示的图。(实施例19中的(1))

图17是以图表对化合物1盐对人效应记忆性CD8⁺T细胞的Foxp3诱导结果进行表示的图。(实施例19中的(2))

具体实施方式

在本发明中，具有CDK8和/或CDK19抑制活性的新型化合物为4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(以下，称为“化合物1”。)或3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺(以下，称为“化合物2”。)，例如，可以由后述的合成例所示的方法来进行制造。

对化合物1或化合物2以游离化合物、其盐、水合物、溶剂合物或者多晶型物的形式进行分离、精制。化合物1或化合物2的盐也可以通过实施常规方法的成盐反应来制造。

通过应用萃取、分级结晶化、各种分级色谱法等通常的化学操作来进行分离、精制。

各种异构体可以通过选择适当的原料化合物来制造，或者利用异构体之间的物理化学性质的差异来进行分离。例如，可以通过外消旋体的通常的光学拆分法(例如，引导为与光学活性的碱或酸的非对映异构体盐的分级结晶化、使用手性柱等的色谱法等)来得到光学异构体，另外，还可以由光学活性适当的原料化合物来制造。

化合物1或化合物2还包括制药学上所允许的前药。制药学上所允许的前药是指具有能够通过溶剂分解或者在生理学条件下而转换为氨基、羟基、羧基等的基团的化合物。作为形成前药的基团，例如可列举为Prog.Med.,5,2157-2161(1985)、“医药品的开发”(广川书店，1990年)第7卷分子设计163-198中记载的基团。

化合物1或化合物2的盐是指该化合物的在制药学上所允许的盐，根据取代基的种类有时会形成酸加成盐或与碱的盐。具体而言，可列举为与如下的酸的酸加成盐等：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰酒石酸、二甲基苯甲酰酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等有机酸。

进一步地，本发明还包括化合物1、化合物2或者它们的盐的各种水合物、溶剂合物以及多晶型物。另外，本发明还包括用各种放射性或非放射性同位素标记的化合物。

本发明的化合物能够在体内(in vivo)将Foxp3诱导至T细胞而形成Treg，因此能够应用于各种病理性免疫应答，例如，癌症、自身免疫疾病(类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、多发性硬化症、恶性贫血、天疱疮、血管炎等)、炎症性疾病(溃疡性结肠炎、克罗恩病等)、过敏性疾病等。

通常使用用于制剂化的载体、赋形剂、其他添加剂来制备含有本发明的化合物作为有效成分的用于自身免疫疾病等的治疗的医药组合物。给药可以是通过片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液剂等的口服给药、或者通过静脉注射、肌肉注射等注射剂、栓剂、经皮给药制剂、经鼻给药制剂或吸入剂等的非口服给药中的任一种方式。

在普通口服给药的情况下，1日的适当的给药量按体重计算约为0.001～100mg/kg，优选为0.1～30mg/kg，更优选为0.1～10mg/kg，将其分为1次或2次～4次进行给药。在静脉内给药的情况下，1日的适当的给药量按体重计算约为0.0001～10mg/kg，分为1日1次～多次进行给药。另外，作为经粘膜给药剂，按体重计算约为0.001～100mg/kg，分为1日1次～多次进行给药。考虑到症状、年龄、性別等并根据各个情况来适当决定给药量。

虽然根据给药途径、剂型、给药部位、赋形剂、添加剂的种类而有所不同，但本发明的医药组合物含有0.01～100重量％的作为有效成分的一种或一种以上的本发明的化合物或其盐，作为某一方式含有0.01～50重量％的作为有效成分的一种或一种以上的本发明的化合物或其盐。

作为根据本发明的用于口服给药的固体组合物，使用片剂、散剂、颗粒剂等。在这样的固体组合物中，一种或一种以上的活性物质与至少一种惰性赋形剂、例如乳糖、甘露醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、偏硅酸铝镁等混合。组合物根据常规方法可以含有惰性添加剂，例如硬脂酸镁等润滑剂、羧甲基淀粉钠等崩解剂、助溶剂。可以根据需要用糖衣或者胃溶性或肠溶性的包衣剂对片剂或丸剂进行包覆。

用于口服给药的液体组合物包括乳剂、液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等，并且含有通常使用的惰性溶剂，例如纯化水、乙醇。除惰性溶剂以外，该组合物还可以含有增溶剂、润湿剂、悬浮化剂这样的辅助剂、甜味剂、矫味剂、芳香剂、防腐剂。

作为用于非口服给药的注射剂，包括无菌的水性或非水性的液剂、悬浮剂、乳剂。作为水性的溶剂，例如包括注射用蒸馏水以及生理盐水。作为非水性的溶剂，例如有丙二醇、聚乙二醇、橄榄油之类的植物油、乙醇之类的醇类、聚山梨醇酯80(药典名称)等。这样的组合物还可以进一步含有等渗调节剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定化剂、助溶剂。例如利用穿过细菌滞留过滤器的过滤、杀菌剂的配合或照射而使上述注射剂无菌化。另外，还可以将上述注射剂制造成无菌的固体组合物，并在使用前于无菌水或无菌的注射用溶剂中溶解、悬浮来进行使用。

在本发明中，能够利用本发明的化合物以及其他具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物(以下，称为“CDK8/CDK19抑制剂”。)在体外(in vitro)诱导Treg，因此，例如能够通过细胞治疗等应用于癌症、自身免疫疾病、炎症性疾病或过敏性疾病的治疗。

作为在本发明中使用的CDK8/CDK19抑制剂，除了化合物1：4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺、化合物2：3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺或它们的盐、水合物、溶剂合物等以外，还可列举为公知的CDK8和/或CDK19抑制剂。具体而言，例如，可列举为美国专利第8598344、WO2013116786、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109 13799-13804(2012)、WO2013001310、WO2013040153、WO2014029726、WO2014063778、WO2014072435、WO2014090692、WO2014106606、WO2014123900、WO2014154723、WO2014194245、WO2015049325、WO2015100420、WO2015144290、WO2015159937、WO2015159938、WO2016009076中记载的化合物等。

在本发明中，通过CDK8/CDK19抑制剂进行处理的T细胞是作为存在于末梢血、脾脏或淋巴结等中的淋巴细胞的一种的T细胞。作为其他方式，所述T细胞为非调节性T细胞。该非调节性T细胞包括能够诱导为调节性T细胞的T细胞。作为另一其他方式，所述T细胞为Foxp3阴性CD4⁺T细胞(CD4⁺Foxp3^-T细胞)或CD4⁺CD25^-T细胞(CD4⁺CD25^-Foxp3^-T细胞)，或者CD8⁺T细胞(CD8⁺Foxp3^-T细胞)。例如，可列举为尚未受到抗原刺激的在细胞表面表达CD45RA抗原的初始T细胞(CD4⁺CD25^-CD45RA⁺Foxp3^-T细胞)。初始T细胞还可以使用进一步地根据CD44、CCR7、CD62L进行分离后的初始T细胞。具体而言，例如，可列举为CD4⁺CD25^-CD44^-CD62L⁺Foxp3^-T细胞。另外，在本发明中，作为通过具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物进行处理的T细胞，可列举为受到抗原刺激而在细胞表面表达CD45RO抗原的记忆性T细胞(CD4⁺CD25^-CD45RO⁺Foxp3^-T细胞)。记忆性T细胞还可以使用进一步地根据CD44、CD62L进行分离后的记忆性T细胞。具体而言，例如可列举为CD4⁺CD25^-CD44⁺CD62L^-Foxp3^-的效应记忆性T细胞等。

CD4⁺CD25^-Foxp3^-T细胞的处理，例如在0.01nM～10000nM、优选为0.1nM～1000nM的CDK8/CDK19抑制剂以及T细胞受体刺激剂(TCR刺激剂)的存在下，在1％～10％或5％CO₂浓度的气氛下，以30～42℃或37℃进行18～240小时或40～120小时即可。在本发明中，作为TCR刺激剂，可以并用抗CD3抗体和1～100μg/mL或1～10μg/mL的抗CD28抗体。可以使用包覆有抗CD3抗体以及抗CD28抗体的珠粒。另外，还可以使用抗原提呈细胞(APC)和抗原。更进一步，在TCR刺激时，可以并用TGF-β、雷帕霉素或视黄酸。

根据本发明，若通过CDK8/CDK19抑制剂在体外(in vitro)对T细胞进行处理，与以往通常使用的TGF-β相比，Foxp3的诱导效率较高，能够在体外(in vitro)制备更多的Treg(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺T细胞)。具体而言，可考虑利用于如下细胞疗法：例如从患者中分离出效应记忆性T细胞，在TCR刺激下通过CDK8/CDK19抑制剂对该效应记忆性T细胞进行处理，由此将Foxp3诱导至该效应记忆性T细胞，进一步地根据需要适当地进行公知的表观基因组处理之后返还给该患者，由此抑制该疾病。

实施例

以下，为了加深对本发明理解，具体地示出参考例、实施例来进行说明，当然，本发明并不限于这些参考例、实施例。首先，示出本发明的化合物1以及化合物2的制造方法并进一步地对各种药理试验进行详细说明。

(实施例1)化合物1的制造

在本实施例中，对化合物1及其二盐酸盐(在以下的实施例以及参考例中，将化合物1的二盐酸盐称为“化合物1盐”)的制造方法进行说明。首先在制造例1以及制造例2中对用于合成化合物1的原料化合物的制造方法进行说明，在合成例1以及合成例2中对化合物1的合成方法以及化合物1盐的制造方法进行说明。原料化合物、化合物1以及化合物1盐的制造方法不限定于以下方法，还可以通过对于本领域技术人员而言显而易见的方法来制造。

另外，在合成例以及制造例中，有时使用以下的简称。

Dat：物理化学数据。

MASS(ESI,m/z)：ESI-MS中的m/z值。除非有特殊记载，否则表示[M+H]⁺。

¹H NMR：室温下的DMSO-d6中的¹H NMR的峰的δ(ppm)。

1)制造例1

在2-甲基-1H-苯并咪唑-5-胺(8.31g)的乙醇(310mL)溶液中，加入4-氯-3-硝基吡啶(8.95g)、N,N-二异丙基乙胺(9.67mL)，以80℃搅拌5小时。使反应混合物冷却至室温，在减压下进行浓缩。在残渣中加入水(100mL)，在室温下搅拌1小时。过滤出不溶物，并通过水(50mL)、二乙醚(50mL)进行清洗。在减压下进行加热干燥，得到2-甲基-N-(3-硝基吡啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-胺(14.6g)。产物的物理化学数据如下所示。

Dat：MASS(ESI,m/z)270[M+H]⁺

2)制造例2

对制造例1中制造的2-甲基-N-(3-硝基吡啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-胺(14.6g)、乙醇(245mL)、10％钯/碳(约50％含水物，1.46g)的混合物在一个大气压的氢气气氛下在室温下搅拌21.5小时。用硅藻土对反应混合物进行过滤，在减压下对滤液进行浓缩，得到N⁴-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)吡啶-3,4-二胺(14.6g)。产物的物理化学数据如下所示。

Dat：MASS(ESI,m/z)240[M+H]⁺

3)合成例1

在本合成例中示出化合物1的制造方法。

[化1]

在4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-甲腈(9.03g)的甲醇(98.2mL)溶液中，加入甲醇钠(28％甲醇溶液，1.63mL)，在室温下搅拌30分钟。将反应混合物、甲醇(19.6mL)、乙酸(4.69mL)加入至在制造例2中制造的N⁴-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)吡啶-3,4-二胺(11.2g)中，在70℃下搅拌18小时。在反应混合物中加入乙酸(4.69mL)，进一步地在70℃下搅拌22小时。对反应混合物进行过滤，在减压下对滤液进行浓缩。用甲醇(100mL)对残渣进行清洗，在减压下进行加热干燥，得到4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(7.75g)。产物的物理化学数据如下所示。

Dat：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.55(3H,s),6.89(2H,s),7.21-7.31(2H,m),7.56-7.78(2H,m),8.45(1H,d,J＝5.6Hz),9.23(1H,d,J＝0.9Hz),12.6(1H,s).

MASS(ESI,m/z)333[M+H]⁺

4)合成例2

在本合成例中示出化合物1盐的制造方法。

[化2]

在合成例1中制造的4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(37.3g)的1,4-二噁烷(373mL)悬浮液中加入4M氯化氢/1,4-二噁烷溶液(224mL)，在室温下搅拌17小时。过滤出不溶物，并用1,4-二噁烷(149mL)进行清洗，在减压下进行加热干燥。在得到的固体中加入二乙醚(270mL)，在室温下搅拌2小时。过滤出不溶物，并用二乙醚(90mL)进行清洗，在减压下进行加热干燥。在得到的固体中加入乙醇(900mL)，在90℃下搅拌1小时后冷却至室温，在该温度下搅拌14小时。过滤出不溶物，并用乙醇(100mL)进行清洗，在减压下进行加热干燥。在得到的固体中加入乙醚(435mL)，在50℃下搅拌6小时。在该温度下过滤出不溶物，并用二乙醚(44mL)进行清洗。通过在减压下进行加热干燥，由此得到4-[1-(2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基)-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基]-1,2,5-噁二唑-3-胺二盐酸盐(42.0g)。产物的物理化学数据如下所示。

Dat：¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.86(3H,s),6.97(2H,s),7.74-7.83(2H,m),8.00-8.06(1H,m),8.22-8.26(1H,m),8.73(1H,d,J＝6.5Hz),9.71(1H,s).

MASS(ESI,m/z)333[M+H]⁺

(实施例2)化合物2的制造

在本实施例中，对化合物2的制造方法进行说明。首先在制造例3～5中对用于合成化合物2的原料化合物的制造方法进行说明，在合成例3中对化合物2的合成方法进行说明。原料化合物、化合物2的制造方法不限定于以下方法，还可以通过对于本领域技术人员而言显而易见的方法来制造。

1)制造例3

在4-氯-2-甲基-3-硝基吡啶(7g)、1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-胺(11g)的N-甲基-2-吡咯烷酮(70mL)溶液加入N,N-二异丙基乙胺(21mL)，在140℃下搅拌2小时。冷却至室温，在反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，并加入水，利用乙酸乙酯进行萃取。利用水以及饱和氯化钠水溶液对有机层进行清洗，利用无水硫酸镁进行干燥后，在减压下蒸馏去除溶剂。在残渣中加入乙酸乙酯(50mL)、己烷(200mL)，过滤出不溶物。减压干燥，得到N-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-2-甲基-3-硝基吡啶-4-胺(11.4g)。产物的物理化学数据如下所示。

Dat：MASS(ESI,m/z)343[M+H]⁺

2)制造例4

对制造例3中制造的N-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-2-甲基-3-硝基吡啶-4-胺(11.4g)、乙酸乙酯(150mL)、甲醇(150mL)、10％钯/碳(约50％含水物，3.54g)的混合物在一个大气压的氢气气氛下在室温下搅拌16小时。用硅藻土对反应混合物进行过滤，在减压下对滤液进行浓缩。在残渣中加入乙酸乙酯并进行搅拌之后，过滤出不溶物。减压干燥，得到N⁴-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-2-甲基吡啶-3,4-二胺(10.3g)。产物的物理化学数据如下所示。

Dat：MASS(ESI,m/z)313[M+H]⁺

3)制造例5

将制造例4中制造的N⁴-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-2-甲基吡啶-3,4-二胺(5.17g)、3-氨基吡嗪-2-羧酸(2.42g)、N,N-二异丙基乙胺(8mL)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(6.5g)、二氯甲烷(75mL)的混合物在室温下搅拌过夜。在反应混合物中加入3-氨基吡嗪-2-羧酸(350mg)、N,N-二异丙基乙胺(850μL)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(950mg)，在室温下搅拌5小时。在反应混合物中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用氯仿进行萃取。用饱和氯化钠水溶液对有机层进行清洗，在减压下蒸馏去除溶剂。通过硅胶柱色谱法对残渣进行精制，得到3-氨基-N-(4-{[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]氨基}-2-甲基吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺(7.45g)。产物的物理化学数据如下所示。

Dat：MASS(ESI,m/z)434[M+H]⁺

4)合成例3

在本合成例中示出化合物2的制造方法。

[化3]

使用微波反应装置将制造例5中制造的3-氨基-N-(4-{[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]氨基}-2-甲基吡啶-3-基)吡嗪-2-甲酰胺(7.45g)、碳酸钾(7.07g)、乙醇(75mL)的混合物在150℃下搅拌7小时。分为4次实施反应。冷却至室温，向反应混合物中加入饱和氯化铵水溶液，用氯仿进行萃取。用饱和氯化钠水溶液对有机层进行清洗，在减压下蒸馏去除溶剂。通过硅胶柱色谱法对残渣进行精制，得到3-{1-[1-(4-甲氧基苯基)哌啶-4-基]-4-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-基}吡嗪-2-胺(5.67g)。产物的物理化学数据如下所示。

Dat：¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ1.98-2.06(2H,m),2.51-2.62(2H,m),2.70-2.78(2H,m),2.77(3H,s),3.68-3.73(2H,m),3.71(3H,s),5.49-5.58(1H,m),6.83-6.87(2H,m),6.96-7.00(2H,m),7.59(1H,d,J＝5.7Hz),7.67(2H,s),7.97(1H,d,J＝2.4Hz),8.16(1H,d,J＝2.4Hz),8.21(1H,d,J＝5.7Hz).

MASS(ESI,m/z)416[M+H]⁺

(实施例3)CDK8以及CDK19与Foxp3 mRNA诱导之间的相关性

在本实施例中，对小鼠脾脏细胞中的CDK8以及CDK19与Foxp3 mRNA诱导之间的相关性进行了确认。将来源于9-11周龄的C57BL/6小鼠(SLC公司生产)的脾细胞在尼龙网上粉碎并进行过滤，制备细胞悬浮液。进一步地，利用CD4Micobeads,Mouse(Miltenyi Biotec公司制造)由细胞悬浮液制备CD4⁺T细胞。针对所制备的细胞，使用GenomONE-si(石原产业公司制造)，导入250nM的Negative Control siRNA(Thermo Fisher Scientific公司制造)、CDK8siRNA(s113914；Thermo Fisher Scientific公司制造)或者CDK19siRNA(s95476；Thermo Fisher Scientific公司制造)，利用抗CD3抗体(145-2C11，ATCC CRL-1975；Proc.Natl.Acad.Sci.USAvol.84(1987),p1374-1378)以及抗CD28抗体(37.51；BD公司制造)进行刺激，在5％CO₂气氛下，以37℃进行培养。2日后，再次导入CDK8siRNA或CDK19siRNA，在5％CO₂气氛下，以37℃进行培养。1日后，在3.3×10⁶beads/mL的GibcoDynabeads Mouse T-Activator CD3/28(Thermo Fisher Scientific公司制造)、250U/mL的mIL-2(R&D公司制造)以及5ng/mL的hTGF-β1(Peprotech公司制造)的存在下，在5％CO₂气氛下以37℃进行培养来进行Foxp3诱导处理。处理1日后，从该T细胞中萃取出全RNA，合成cDNA，通过Taqman Assay(Foxp3:Mm00475162_m1,18S:Mm03928990_g1；Thermo FisherScientific公司制造)对Foxp3 mRNA的表达量以及18s rRNA mRNA的表达量进行测定。之后，利用18S rRNA表达值对Foxp3 mRNA表达值进行修正。进一步地，求出相对于NegativeControl siRNA处理样本的百分比值。将三次试验的结果示于图1中的(b)。由于是通过CDK8或CDK19的敲低来诱导Foxp3 mRNA，由此可知只要抑制CDK8或CDK19的功能就能够将Foxp3诱导至T细胞。

此外，在上述条件下，使用第三天的经Foxp3诱导处理的T细胞，通过使用抗CDK8抗体(Cell Signaling Technology公司制造)以及抗CDK19抗体(SIGMA公司制造)的蛋白免疫印迹对基于CDK8siRNA或CDK19siRNA的CDK8以及CDK19蛋白质的敲低条件的妥当性进行了确认。如图1中的(a)所示，可确认，上述条件作为基于CDK8siRNA或CDK19siRNA的CDK8以及CDK19蛋白质的敲低条件是妥当的。

(实施例4)化合物1盐以及化合物2的CDK8/19的抑制活性

在本实施例中，针对在实施例1中制备的化合物1盐以及在实施例2中制备的化合物2，对其CDK8以及CDK19的抑制活性进行了确认。在CDK8的激酶活性测定中，使用QSSAssist^TMCDK8/CycC_ELISA kit(CarnaBiosciences公司制造)。在涂覆有链霉亲和素(Thermofisher Scientific公司制造)的玻片上添加试剂盒附带的酶液(10μL)、ATP/底物/Metal溶液(5μL)、化合物溶液(利用试剂盒附带的分析缓冲液制备为反应时终浓度的4倍浓度，5μL)，并在室温下温育90分钟。用洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl,0.02％Tween-20)清洗之后，添加100μL的0.1％BSA液，在室温下温育30分钟。在去除0.1％BSA液之后，添加50μL的试剂盒附带的一次抗体溶液并在室温下温育30分钟。用洗涤缓冲液清洗之后，添加50μL的试剂盒附带的二次抗体溶液，并在室温下温育30分钟。用洗涤缓冲液清洗之后，添加50μL的TMB Chromogen Solution(Lifetechno logies公司制造)，并在室温下温育5分钟。添加50μL的0.1MH₂SO₄停止显色反应。使用OD450以及OD540的测定值，化合物1盐是根据从四次试验、化合物2是根据从三次试验得到的数据计算出的IC₅₀值的几何平均。另外，在CDK19的激酶活性测定中，使用QSS Assist^TM CDC2L6/CycC_ELISA kit(CarnaBiosciences公司制造)。在涂覆有链霉亲和素(Thermofisher Scientific公司制造)的玻片上添加试剂盒附带的酶液(10μL)、ATP/底物/Metal溶液(5μL)、化合物溶液(利用试剂盒附带的分析缓冲液制备为反应时终浓度的4倍浓度，5μL)，并在室温下温育90分钟。用洗涤缓冲液清洗之后，添加100μL的0.1％BSA液，并在室温下温育30分钟。去除0.1％BSA之后，添加50μL的试剂盒附带的一次抗体溶液并在室温下温育30分钟。用洗涤缓冲液清洗之后，添加50μL的试剂盒附带的二次抗体溶液，并在室温下温育30分钟。用洗涤缓冲液清洗之后，添加50μL的TMB Chromogen Solution(Lifetechnologies公司制造)，并在室温下温育5分钟。添加50μL的0.1MH₂SO₄停止显色反应。使用OD450以及OD540的测定值，化合物1盐、化合物2均是根据从三次试验得到的数据计算出IC₅₀值的几何平均。将该结果示于表1。由表1可知化合物1盐以及化合物2为CDK8以及CDK19的双重抑制剂(dual inhibitor)。

[表1]

(实施例5)体外(in vitro)的基于化合物1盐的Foxp3的诱导

在本实施例中，针对在实施例1中制备的化合物1盐，对其在初始细胞中的Foxp3的诱导能力进行了确认。

收集6-8周龄的Foxp3-GFP融合蛋白KI小鼠(eFox小鼠)的淋巴结，使用磨砂玻璃将组织粉碎，并用尼龙网进行过滤制备全淋巴细胞悬浮液。根据Science.2014Oct17；346(6207):363-8.doi:10.1126/science.1259077中记载的方法制备eFox小鼠。用抗CD4抗体(RM-4.5；BD公司制造)、抗CD62L抗体(MEL-14；BD公司制造)、抗CD44抗体(IM7；BD公司制造)对上述制备的全淋巴细胞进行染色，并使用FACSAria^TMII(BD公司制造)制备CD4⁺CD25^-Foxp3^-CD62L⁺CD44^-初始T细胞。

按照以下(i)～(iv)所示，在2ng/mL的hTGF-β1(R&D公司制造)或10μg/mL的抗TGF-β抗体(R&D公司制造)和1μM的化合物1盐的存在/非存在下，使用5μL的抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)对所制备的初始T细胞(2×10⁵个)进行刺激，在5％CO₂气氛下以37℃处理72小时。

(i)抗TGF-β抗体(对照组)

(ii)抗TGF-β抗体+化合物1盐

(iii)hTGF-β1(对照组)

(iv)hTGF-β1+化合物1盐

用抗CD4抗体(BD公司制造)对上述处理后的细胞进行染色，通过流式细胞法分析Foxp3-GFP阳性细胞的比例。将其结果示于图2中的(a)。另外，在图2中的(b)中示出它们的Foxp3-GFP阳性细胞数(％)。

由图2中的(a)以及图2中的(b)的结果可知，即使在通过添加抗TGF-β抗体而阻断TGF-β的条件下，仅通过化合物1盐也能够将Foxp3优势性地诱导至初始T细胞(对照组：2.51％，化合物1盐处理：25.9％)。另外，可知通过并用化合物1盐和TGF-β，能够协同性地将Foxp3诱导至初始T细胞(TGF-β：44.3％，TGF-β+化合物1处理：81.1％)。

(实施例6)化合物1盐的抗原特异性Foxp3诱导

在本实施例中，针对在实施例1中制造的化合物1盐，对其在初始细胞中的抗原特异性Foxp3的诱导能力进行了确认。

按照与实施例5相同的方法从6-10周龄的DO11.10/eFox小鼠中制备CD4⁺CD25^-Foxp3^-CD62L⁺CD44^-初始T细胞。通过使DO11.10小鼠和eFox小鼠交配来制备DO11.10/eFox小鼠。另外，从6-10周龄的BALB/c小鼠(SLC公司制造)中分离出全淋巴结细胞，利用抗CD11c抗体(HL3；BD公司制造)进行染色，制备抗原提呈细胞(CD11c阳性细胞)。

按照以下(i)～(vi)所示，在2×10⁴个的APC(抗原提呈细胞)、5μM的OVA(卵清蛋白肽、OVA_323-339；MLB公司制造)或5μL的抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)和1μM的化合物1盐的存在/非存在下，对所制备的初始T细胞(1×10⁵个)在5％CO₂气氛下以37℃处理72小时。

(i)APC(对照组)

(ii)APC+化合物1盐

(iii)APC+OVA(对照组)

(iv)APC+OVA+化合物1盐

(v)抗CD3/CD28抗体(对照组)

(vi)抗CD3/CD28抗体+化合物1盐

利用抗DO11.10抗体(KJ1-26，BD公司制造)对各处理后的细胞进行染色，通过流式细胞法对Foxp3-GFP阳性细胞的比例以及DO11.10TCR的表达进行分析。将其结果示于图3中的(a)。另外，在图3中的(b)中示出它们的Foxp3-KJ1-26阳性细胞数(％)。

根据图3中的(a)以及图3中的(b)的结果，仅在通过APC和OVA对初始T细胞进行共刺激时，在化合物1盐的作用下，由KJ1-26识别的表达DO11.10TCR的Foxp3⁺T细胞增加(APC+OVA+化合物1盐：13.3％)。另一方面，在利用抗CD3抗体和抗CD28抗体进行刺激时，通过化合物1盐，未表达DO11.10TCR的Foxp3⁺T细胞也增加(CD3+CD28+化合物1盐：19.9％)。由上述结果可知，化合物1盐对Foxp3⁺T细胞进行抗原(OVA)特异性诱导。

(实施例7)化合物1盐对Foxp3诱导以及细胞增殖的影响

在本实施例中，针对实施例1中制造的化合物1盐，确认了效应记忆性T细胞中的Foxp3诱导作用以及由效应记忆性T细胞诱导得到的Treg的细胞增殖抑制作用。

(1)对效应记忆性T细胞的Foxp3诱导

按照与实施例5同样的方式，由eFox小鼠制备全淋巴细胞悬浮液。利用抗CD4抗体(RM-4.5；BD公司制造)、抗CD62L抗体(MEL-14；BD公司制造)、抗CD44抗体(IM7；BD公司制造)对制备的全淋巴细胞进行染色，使用FACSAria^TMII(BD公司制造)制备效应记忆性T细胞(CD4⁺Foxp3^-CD25-CD44^hi CD62L-)。在hTGF-β1(5ng/mL)以及化合物1盐(1μM)的存在下，使用5μL的抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28；Thermo FisherScientific公司制造)对得到的效应记忆性T细胞(2×10⁵个)进行刺激，在5％CO₂气氛下，以37℃处理72小时。通过流式细胞法分析处理后的Foxp3-GFP阳性细胞的比例，示于图4。将不含有化合物1盐的系统作为对照组。

其结果是，可知在用化合物1盐进行处理时，与对照组相比，优势性地诱导了Foxp3(对照组：1.86％，化合物1盐：17.0％)。

(2)由效应记忆性T细胞诱导得到的Treg的细胞增殖抑制

在5ng/mL的hTGF-β1以及1μM的化合物1盐的存在下对按照与上述(1)同样的方式所制备的效应记忆性T细胞(2×10⁵个)进行处理，并示于图5中的(a)。将不含有化合物1盐的系统作为对照组。

其结果是，与对照组(2.97％)相比，利用化合物1盐进行处理时，优势性地诱导出了CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞(Tem-derived Treg)(17.2％)。

接着，对该Tem-derived Treg和内源性Treg(nTreg)的T细胞增殖抑制作用进行比较。nTreg使用通过与实施例5相同的方法由eFox小鼠制备的nTreg。另外，作为T细胞，使用通过与实施例5相同的方法由BALB/c小鼠制备的初始T细胞(Tconv)。利用分裂标记色素Cell Tracer Violet(Thermo Fisher Scientific公司制造)对该Tconv进行标记。在抗原提呈细胞(4×10⁴个)以及1μg/mL的抗CD3抗体的存在下，在5％CO₂气氛下，以37℃对Tconv与nTreg为2：1的比例的细胞(6×10⁴个)或者Tconv与Tem-derived Treg为10：1的比例的细胞(4.4×10⁴个)培养72小时。之后，利用FACSAria^TMII(BD公司制造)对分裂标记色素进行测定，调查Tconv细胞的增殖状况。作为对照组，仅使用Tconv(4×10⁴个)。

将其结果示于图5中的(b)。在图中，黑线表示实测数据，红线(在图中以虚线箭头表示)表示非分裂细胞的峰值，蓝线(在图中以实线箭头表示)表示分裂细胞的峰值。由图5中的(b)的结果可知，在Tconv中既未添加nTreg也未添加Tem-derived Treg的系统(对照组)中，可观察到Tconv的分裂标记色素的衰减，观察到5次细胞分裂(蓝线：在图中，以1^st～5^th的箭头示出)，因此Tconv细胞发生了增殖。与其相对，可知在Tconv+nTreg(2：1)和Tconv+Tem-derived Treg(10：1)中，Tconv细胞的增殖几乎同等地受到抑制。由此，可知就Tem-derived Treg而言，以nTreg的1/5的量就具有与nTreg同等程度的T细胞的增殖抑制效果。

(实施例8)体内(in vivo)的Foxp3诱导

对6-10周龄的DO11.10/RAG2KO/eFox小鼠免疫给药OVA(OVA_323-339；MLB公司制造)和完全弗氏佐剂(CFA；BD公司制造)的混合乳液(100μgOVA/只)，从免疫当日起口服给药化合物1盐(以游离体计为30mg/kg)一周。将对照组设为未给药化合物1盐的系统。另外，针对未进行免疫给药的系统(Non Immunization)也同样进行了研究。使RAG2 KO小鼠与实施例6的DO11.10/eFox小鼠交配来制备DO11.10/RAG2KO/eFox小鼠。

在口服给药一周之后，按照与实施例5相同的方法采集小鼠的淋巴细胞，制备细胞悬浮液。接着，利用抗CD4抗体(BD公司制造)、抗DO11.10抗体(BD公司制造)对该淋巴细胞进行染色，通过流式细胞法对Foxp3-GFP阳性细胞的比例进行分析。将其结果示于图6中的(a)。另外，在图6中的(b)中示出它们的Foxp3-GFP阳性细胞数(％)。

由图6中的(a)以及图6中的(b)的结果可知，仅在经给药OVA的小鼠中在化合物1盐的作用下诱导出了Foxp3阳性T细胞(3.79％)。

(实施例9)化合物1盐对接触性超敏反应(CHS)的治疗效果

在本实施例中，针对化合物1盐对二硝基氟苯(DNFB)诱发性CHS模型中的接触性超敏反应的治疗效果进行了确认。通过以下方法制备DNFB诱发性CHS模型。对6-10周龄的Foxp3-DTR-GFP KI小鼠(FDG小鼠)(Nat.Immunol.2007Feb；8(2):191-7)，间隔一周一共两次每次100μL在腹部涂布DNFB((0.5％(w/v)DNFB in acetone/olive oil(4/1))使其致敏，进一步地在一周后在耳部涂布20μL，诱发DNFB诱发性的接触性超敏反应(CHS)，来制备CHS模型小鼠。

对该CHS模型小鼠口服给药化合物1盐(以游离体计为30mg/kg)14天(通常时)。另外，对该CHS模型小鼠预先腹腔给药白喉毒素50ng而得到的小鼠也同样地口服给药化合物1盐(去除Treg时)。对上述CHS模型小鼠分别进行饲养14天之后，利用表盘式厚度规(Dialthickness gauge,Peacock)测定耳部的肿胀，将其结果示于图7中的(a)。另外，用苏木精-伊红对各个小鼠的耳部组织进行染色并将结果示于图7中的(b)。

由图7中的(a)以及图7中的(b)的结果可知，通过给药化合物1盐，CHS模型小鼠的耳部肿胀减小。另外，耳部组织的染色结果也显示为同样的结果。另一方面，在给药白喉毒素而对Treg进行了去除处置的情况下，即便给药化合物1盐，小鼠的耳部肿胀也不会减小。耳部组织的染色结果也显示为同样的结果。由上述结果可知，化合物1盐对CHS的治疗效果有Treg依赖性。

(实施例10)化合物1盐对多发性硬化症的治疗效果

在本实施例中，作为多发性硬化症(Multiple screlosis)模型，对EAE(Experimental autoimmune encephalomyelitis)模型小鼠中的化合物1盐的治疗效果进行了确认。通过以下方法制备EAE模型。制备等量混和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的肽MOG_35-55和完全弗氏佐剂(CFA；BD公司制造)而成的乳液，对6-8周龄的C57BL/6小鼠(SLC公司制造)在背部进行皮下注射(MOG_35-55200μg/只)。接着，经腹腔内给药200ng的百日咳毒素(Pertussis Toxin：Ptx)(第0天)。进一步地在第2天经腹腔内给药200ng的Ptx来诱导EAE。

对该EAE模型小鼠从第1天起给药化合物1盐(以游离体计为30mg/kg)至第14天。依据Int.Immunol.2012Nov；24(11):681-91.doi:10.1093/intimm/dxs075.对小鼠的随时间的病理评分(EAEscore)进行测定。将该结果示于图8。

由图8的结果可知，在化合物1盐的作用下，与对照(Vehicle)相比，可优势性地观察到EAEscore的改善。

(实施例11)化合物2对鼻过敏的治疗效果

在本实施例中，作为鼻过敏模型，对小鼠主动致敏抗体诱发鼻过敏模型中的化合物2的治疗效果进行了确认。通过以下方法制备小鼠主动致敏抗体诱发鼻过敏模型。对7周龄的BALB/c小鼠(SLC公司生产,雄)腹腔内给药200μL的由OVA(和光纯药公司制造)(0.5mg/mL)(100μg/只)和5mg/mL的氢氧化铝(ALUM；和光纯药公司制造)以及1.5μg/mL的百日咳毒素(和光纯药公司制造)混合而成的混合液，作为初次致敏。接着，在该初次致敏的5天后，作为追加致敏，经背部皮下给药OVA(50μg/只)而进行全身致敏之后，从初次致敏起第18天以后的8天内，作为局部致敏，以一天一次的频率滴鼻给药OVA(100μg/只)，引起主动致敏所导致的鼻过敏症状。

自初次致敏3天前起对该模型连日口服给药化合物2(0.3～3.0mg/kg)，在局部致敏的最后一天，以1小时内的挠鼻行为次数作为指标来评价受试物质的效果。此外，在溶剂对照组中使用了作为溶剂的0.5％(w/v)甲基纤维素溶液，作为阳性对照，使用了地塞米松(东京化成公司制造)。将结果示于图9。

由图9的结果可知，通过化合物2(1.0mg/kg或3.0mg/kg)的给药，显著地抑制了挠鼻次数。

(实施例12)化合物2对气道高反应性(哮喘)的治疗效果

在本实施例中，作为哮喘模型，对OVA诱发哮喘模型以及Th1型哮喘模型中的化合物2的治疗效果进行了确认。

(1)对于OVA诱发哮喘

按照以下方法制备OVA诱发哮喘模型。对8周龄的Balb/c小鼠(Charles River公司制造)在初次致敏日、自初次致敏起第8天以及第15天经腹腔内给药200μL的含有OVA(SIGMA公司制造)(20μg/只)以及氢氧化铝(Alum；LSM公司制造)(2.25mg)的生理食盐溶液，使其致敏。之后，自初次致敏起第29天以后的连续6天内，使用超声波雾化器(欧姆龙公司制造)，1日1次使小鼠吸入1％OVA使其致敏来诱发炎症。针对正常组，将生理盐水同样地进行腹腔内给药以及吸入。

针对该制备的模型，以0.5mg/kg的用量，从致敏第一天起到最终诱发日为止的34天内，1日1次反复口服给药化合物2。针对溶剂对照组，同样地反复口服给药作为溶剂的0.5％(w/v)甲基纤维素溶液，作为阳性对照，同样地反复口服给药1mg/kg的地塞米松(SIGMA公司制造)。在最终抗原诱发的第二天，针对全部例子以在苏醒状态下吸入乙酰甲胆碱溶液后的气道阻力为指标来测定气道反应性。将小鼠置于丙烯酸制成的吸入室内，使用加压雾化器(PARI公司制造)，依次分别吸入生理盐水以及乙酰甲胆碱的1.56、3.125、6.25、12.5以及25mg/mL溶液各一分钟，在吸入各溶液后，对气道阻力(specific air wayresistance：sRaw)进行测定。将100次呼吸量的平均值设为各测定点中的个体的sRaw。使用综合呼吸功能测定系统(Pulmos-1；M.I.P.S.公司制造)，通过double flowplethysmograph法，在苏醒状态下对sRaw进行测定。将吸入25mg/mL乙酰甲胆碱溶液时的气道阻力测定结果示于图10A。

由图10A的结果可知，通过化合物2的给药，可抑制气道高反应性。

(2)对于Th1型哮喘

按照以下方法制备Th1型哮喘模型。对8周龄的Balb/c小鼠(Charles River公司制造)单次腹腔内给药200μL的含有无内毒素的OVA(Hyglos公司制造)(50μg/只)以及完全弗氏佐剂(FCA；和光纯药公司制造)的生理盐水，使其初次致敏。之后，自初次致敏起的第15天起连续3天，对小鼠鼻腔内给药50μL的含有无内毒素的OVA(100μg/只)以及脂多糖(LPS，SIGMA公司制造)(5μg/只)的磷酸缓冲生理盐水(PBS)，从而诱发炎症。对正常组腹腔内给药生理盐水以及鼻腔内给药PBS。

对该制备的模型，以0.5mg/kg的用量从致敏第一天起直至最终诱发日为止的17天内，1日1次反复口服给药化合物2。针对对照组同样地反复口服给药作为溶剂的0.5％(w/v)甲基纤维素溶液，作为阳性对照同样地反复口服给药1mg/kg的地塞米松(SIGMA公司制造)。在最终抗原诱发的第二天(第18天)，与上述(1)同样地对气道反应性进行测定。将吸入25mg/mL乙酰甲胆碱溶液时的气道阻力测定结果示于图10B。

由图10B的结果可知，通过化合物2的给药，可抑制气道高反应性。

(实施例13)离体(ex vivo)诱导的Treg的引入对接触性超敏反应的治疗效果

在本实施例中，对离体(ex vivo)诱导的Treg的引入对DNFB诱发性接触性超敏反应模型的治疗效果进行了确认。

按照以下方法制备Treg。在尼龙网上将来源于12周龄的eFox小鼠的脾细胞粉碎并过滤来制备细胞悬浮液。进一步地，将通过CD4 Micobeads,Mouse(Miltenyi Biotec公司制造)从细胞悬浮液中制备的CD4⁺T细胞(1×10⁵个)，在抗CD3/CD28抗体(Gibco DynabeadsMouseT-Activator CD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)(1×10⁵beads/mL)、hTGF-β1(Peprotech公司制造)(5ng/mL)、mIL-2(R&D公司制造)(250U/mL)以及化合物1盐(1μM)的存在下，在5％CO₂气氛下，以37℃培养3天。之后，通过FACSAria^TMII(BD公司制造)，获取CD25以及Foxp3-GFP阳性T细胞作为Treg。

按照以下方法制备DNFB诱发性接触性超敏反应模型。对8周龄的Balb/c小鼠(SLC公司生产，雌)的腹部进行剃毛之后，涂布25μL的DNFB(0.5％(w/v)DNFB in acetone/oliveoil(4/1)，Nacalai公司制造)。在涂布DNFB后的第5天，从尾部静脉引入上述获得的Treg(2×10⁴个或2×10⁵个)。接着，在耳廓涂布20μL的DNFB(0.3％(w/v)DNFB inacetone/oliveoil(4/1))，诱发接触性超敏反应。通过使用恒压测厚仪(Teclock公司制造，PG-20)的耳廓厚度变化测定对接触性超敏反应进行评价。

其结果是，在给药2×10⁵个利用化合物1盐诱导的Treg时，自诱发接触性超敏反应起的第二天的小鼠的耳部肿胀为220μm。与其相对地，未添加时为285μm。通过对DNFB诱发性接触性超敏反应模型给药利用化合物1盐诱导的Treg，具有统计学意义地(P<0.05；Dunnett's Multiple Comparison Test)观察到离体(ex vivo)诱导的Treg对以耳部肿胀为指标的接触性超敏反应进行抑制的效果。

(实施例14)基于各种CDK8/19抑制剂的从初始T细胞向Treg的诱导

在本实施例中，对基于各种CDK8/19抑制剂的从初始T细胞向Treg的诱导进行了确认，并且对具有CDK8和/或CDK19抑制活性的化合物的向Treg的诱导作用进行了确认。

按照以下方法制备初始T细胞。从8-12周龄的C57BL6小鼠(SLC公司制造)收集脾脏，与实施例13同样地在尼龙网上将脾细胞粉碎并进行过滤来制备细胞悬浮液。使用

CD4⁺Tcell Isolation Kit,mouse(Miltenyi Biotec公司制造)从该细胞悬浮液中制备初始Th细胞。向在Minimum Essential Medium Eagle(MEM,SIGMA公司制造)中悬浮的脾细胞中添加试剂盒附带的Biotin-Antibody Cocktail，在4℃下温育5分钟。进一步地，加入Anti-Biotin MicroBeads和CD44MicroBeads，在4℃下温育10分钟之后，进行离心分离操作(300xg,10分钟)。在去除上清液之后，利用MEM再次进行悬浮，并添加在LS柱(MiltenyiBiotech公司制造)中。将液流中含有的细胞用于以后的实验。将制备的初始Th细胞(2×10⁵个)在各种CDK8/19抑制剂(使用量1～10000nM)的存在下，在5％CO₂、37℃的条件下，进行抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28；Thermo FisherScientific公司制造)刺激。使用抗CD4抗体(RM4-5；eBioscience公司制造)、抗CD25抗体(7D4；BD公司制造)、抗Foxp3抗体(FJK-16s；eBioscience公司制造)以及flexibleviability dye(eBioscience公司制造)对培养44小时后的细胞进行染色。通过流式细胞法使用CantoII(BD公司制造)对染色后的细胞进行测定，使用FlowJo(FlowJo公司制造)对CD4⁺活细胞中的CD25⁺Foxp3⁺细胞的比例进行分析。进一步地，在将添加有溶剂(0.1％DMSO)的样本中的CD25⁺Foxp3⁺细胞的比例设为100％时，将可得到150％的CD25⁺Foxp3⁺细胞的化合物浓度定义为EC₁₅₀，计算出各化合物的EC₁₅₀值，根据由三次试验得到的数据计算出几何平均。将其结果示于表2。

由表2可知，在各种CDK8/19抑制剂的作用下，初始Th细胞被诱导为Treg。

[表2]

SenexinA：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.10913799-13804(2012)

(R)-2-[5-(3-氯-4-羟基苯基)-吡啶-3-基-氨基]-2-苯基乙酰胺：WO2014/029726例3

(实施例15)在体外(in vitro)基于化合物1盐的Foxp3诱导

在本实施例中，针对在实施例1中制备的化合物1盐，对其在CD8⁺T细胞中的Foxp3的诱导能力进行了确认。

收集6-8周龄的Foxp3-GFP融合蛋白KI小鼠(eFox小鼠)的淋巴结，使用磨砂玻璃将组织粉碎，并用尼龙网进行过滤来制备全淋巴细胞悬浮液。eFox小鼠使用根据Science.2014Oct 17；346(6207):363-8.doi:10.1126/science.1259077中记载的方法制备的eFox小鼠。利用抗CD8抗体(53-6.7；BD公司制造)对上述制备的全淋巴细胞进行染色，使用FACSAria^TMII(BD公司制造)来制备CD8⁺T细胞。

按照以下(i)～(iv)所示的那样，在2ng/mL的hTGF-β1(R&D公司制造)或10μg/mL的抗TGF-β抗体(R&D公司制造)和1μM的化合物1盐的存在/非存在下，使用5μL的抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)对所制备的CD8⁺T细胞(2×10⁵个)进行刺激，在5％CO₂气氛下，以37℃处理72小时。

(i)抗TGF-β抗体(对照组)

(ii)抗TGF-β抗体+化合物1盐

(iii)hTGF-β1(对照组)

(iv)hTGF-β1+化合物1盐

利用抗CD8抗体(BD公司制造)对上述处理后的细胞进行染色，通过流式细胞法分析Foxp3-GFP阳性细胞的比例。将其结果示于图11中的(a)。另外，在图11中的(b)中，示出了以图表的形式表示它们的Foxp3-GFP阳性细胞数(％)的结果。

由图11中的(a)以及图11中的(b)的结果可知，即便在通过添加抗TGF-β抗体而将TGF-β阻断的条件下，仅通过化合物1盐也能够将Foxp3优势性地诱导至CD8⁺T细胞。另外，可知通过并用化合物1盐和TGF-β，能够协同性地将Foxp3诱导至CD8⁺T细胞。

(实施例16)人T细胞中的基于化合物1盐的Foxp3诱导

在本实施例中，针对在实施例1中制备的化合物1盐，对其在人初始细胞(CD4⁺CCR7⁺CD45RA⁺)中的Foxp3的诱导能力进行了确认。

使用Human naive CD4⁺T Cell Isolation kit(Miltenyi Biotec公司制造)，由人末梢血细胞(Lifeline cell technology公司制造，Stemcell technologies公司制造)制备人初始CD4⁺T细胞(CD4⁺CCR7⁺CD45RA⁺)。使用抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads HumanT-Activator CD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)(2×10⁵beads)对制备的人初始T细胞(2×10⁵个)进行刺激，在化合物1盐(10、100、1000nM)的存在/非存在下，在5％CO₂气氛下，以37℃处理4天。

利用Fixable viability dye(eBioscience公司制造)、抗CD4抗体(RPA-T4:eBioscience公司制造)、抗CD25抗体(BC96:eBioscience公司制造)、抗Foxp3抗体(236A/E7:eBioscience公司制造)对处理后的细胞进行染色，使用CantoII(BD公司制造)通过流式细胞法进行测定。进一步地，使用FlowJo(FlowJo公司制造)对CD4⁺活细胞中的Foxp3⁺CD25⁺细胞的比例进行分析。在图12中示出Foxp3⁺CD25⁺细胞的比例(％)。由图12的结果可知，在化合物1盐的作用下，Foxp3被诱导至人初始CD4⁺T细胞。

(实施例17)人T细胞中的基于化合物1盐的Foxp3诱导

在本实施例中，针对在实施例1中制备的化合物1盐，对其在人初始细胞(CD4⁺CD25^-CD45RA⁺Foxp3^-)中的Foxp3的诱导能力进行了确认。

利用抗CD4抗体(RPA-T4；BD公司制造)、抗CD25抗体(M-A251；BD公司制造)、抗CD45RA抗体(HI100；BD公司制造)对人末梢血单核细胞(和光纯药工业公司制造)进行染色，使用FACSAria^TMII(BD公司制造)来制备人初始CD4⁺T细胞(CD4⁺CD25^-CD45RA⁺Foxp3^-)。使用抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28；Thermo FisherScientific公司制造)(2×10⁵beads)对制备的人初始T细胞(1×10⁵个)进行刺激，在hIL-2(盐野义制药公司制造)(50U/ml)、化合物1盐(10、100nM)的存在/非存在下，在5％CO₂气氛下，以37℃处理4天。

利用Fixable viability dye(eBioscience公司制造)、抗CD4抗体(BD公司制造)、抗Foxp3抗体(eBioscience公司制造)对处理后的细胞进行染色，通过流式细胞法分析CD4⁺T细胞中的Foxp3阳性细胞的比例。在图13中示出Foxp3阳性细胞的比例(％)。由图13的结果可知，在化合物1盐的作用下，Foxp3被诱导至人初始CD4⁺T细胞。

(实施例18)人CD4T⁺细胞中的基于化合物1盐的Foxp3诱导

在本实施例中，针对在实施例1中制备的化合物1盐，对其在人CD4⁺细胞中的Foxp3的诱导能力进行了确认。

(1)针对初始T细胞的Foxp3诱导

按照与实施例17同样的方式从人末梢血单核细胞(和光纯药工业公司制造)制备人初始CD4⁺T细胞(CD4⁺CD25^-CD45RA⁺Foxp3^-)。按照以下(i)～(iv)所示的那样，在2ng/mL的hTGF-β1(R&D公司制造)或10μg/mL的抗TGF-β抗体(R&D公司制造)和hIL-2(盐野义制药公司制造)(50U/ml)、100nM的化合物1盐的存在/非存在下，使用5μL的抗CD3/CD28抗体(GibcoDynabeads Human T-Activator CD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)对所制备的初始T细胞(2×10⁵个)进行刺激，在5％CO₂气氛下，以37℃处理72小时。

(i)抗TGF-β抗体(对照组)

(ii)抗TGF-β抗体+化合物1盐

(iii)hTGF-β1(对照组)

(iv)hTGF-β1+化合物1盐

利用抗CD4抗体(BD公司制造)、抗Foxp3抗体(eBioscience公司制造)对上述处理后的细胞进行染色，通过流式细胞法分析阳性细胞的比例。将其结果示于图14中的(a)。另外，在图14中的(b)中示出它们的Foxp3阳性细胞数(％)。

由图14中的(a)以及图14中的(b)的结果可知，即便在通过添加抗TGF-β抗体而阻断TGF-β的条件下，仅通过化合物1盐也能够将Foxp3优势性地诱导至初始T细胞(对照组：10.8％，化合物1盐处理：30.7％)。另外，可知通过并用化合物1盐和TGF-β，能够协同性地将Foxp3诱导至初始T细胞(TGF-β：26.9％，TGF-β+化合物1处理：44.6％)。

(2)针对效应记忆性T细胞的Foxp3诱导

利用抗CD4抗体(RPA-T4；BD公司制造)、抗CD25抗体(M-A251；BD公司制造)、抗CD45RA抗体(HI100；BD公司制造)对人末梢血单核细胞(和光纯药工业公司制造)进行染色，使用FACSAria^TMII(BD公司制造)来制备人效应记忆性CD4⁺T细胞(CD4⁺CD25-CD45RA-Foxp3-)。按照以下(i)～(iv)所示的那样，在2ng/mL的hTGF-β1(R&D公司制造)或10μg/mL的抗TGF-β抗体(R&D公司制造)和hIL-2(盐野义制药公司制造)(50U/ml)、100nM的化合物1盐的存在/非存在下，使用5μL的抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Human T-ActivatorCD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)对所制备的效应记忆性T细胞(2×10⁵个)进行刺激，在5％CO₂气氛下，以37℃处理72小时。

(i)抗TGF-β抗体(对照组)

(ii)抗TGF-β抗体+化合物1盐

(iii)hTGF-β1(对照组)

(iv)hTGF-β1+化合物1盐

利用抗CD4抗体(BD公司制造)、抗Foxp3抗体(eBioscience公司制造)对上述处理后的细胞进行染色，通过流式细胞法分析Foxp3阳性细胞的比例。将其结果示于图15中的(a)。另外，在图15中的(b)中示出它们的Foxp3阳性细胞数(％)。

由图15中的(a)以及图14中的(b)的结果可知，即便在通过添加抗TGF-β抗体而阻断TGF-β的条件下，仅通过化合物1盐也能够将Foxp3优势性地诱导至效应记忆性T细胞(对照组：21.1％，化合物1盐处理：34.5％)。另外，可知通过并用化合物1盐和TGF-β，能够协同性地将Foxp3诱导至效应记忆性T细胞(TGF-β：28.5％，TGF-β+化合物1处理：45.2％)。

(实施例19)人CD8T⁺细胞中的基于化合物1盐的Foxp3诱导

在本实施例中，针对在实施例1中制备的化合物1盐，对其在人CD8⁺T细胞中的Foxp3的诱导能力进行了确认。

(1)对初始T细胞的Foxp3诱导

利用抗CD8抗体(53-6.7；BD公司制造)、抗CD25抗体(M-A251；BD公司制造)、抗CD45RA抗体(HI100；BD公司制造)对人末梢血单核细胞(和光纯药工业公司制造)进行染色，使用FACSAria^TMII(BD公司制造)来制备人初始CD8⁺T细胞(CD8⁺CD25^-CD45RA⁺Foxp3^-)。按照以下(i)～(iv)所示的那样，在2ng/mL的hTGF-β1(R&D公司制造)或10μg/mL的抗TGF-β抗体(R&D公司制造)和hIL-2(盐野义制药公司制造)(50U/ml)、100nM的化合物1盐的存在/非存在下，使用5μL的抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)对所制备的初始T细胞(1×10⁵个)进行刺激，在5％CO₂气氛下，以37℃处理72小时。

(i)抗TGF-β抗体(对照组)

(ii)抗TGF-β抗体+化合物1盐

(iii)hTGF-β1(对照组)

(iv)hTGF-β1+化合物1盐

利用抗CD8抗体(BD公司制造)、抗Foxp3抗体(eBioscience公司制造)对上述处理后的细胞进行染色，通过流式细胞法分析Foxp3阳性细胞的比例。在图16中示出Foxp3阳性细胞的比例(％)。

由图16的结果可知，即便在通过添加抗TGF-β抗体而阻断TGF-β的条件下，仅通过化合物1盐也能够将Foxp3优势性地诱导至初始T细胞。另外，可知通过并用化合物1盐和TGF-β，能够协同性地将Foxp3诱导至初始T细胞。

(2)对效应记忆性T细胞的Foxp3诱导

利用抗CD8抗体(53-6.7；BD公司制造)、抗CD25抗体(M-A251；BD公司制造)、抗CD45RA抗体(HI100；BD公司制造)对人末梢血单核细胞(和光纯药工业公司制造)进行染色，使用FACSAria^TMII(BD公司制造)来制备人效应记忆性CD8⁺T细胞(CD8⁺CD25^-CD45RA-Foxp3^-)。按照以下(i)～(iv)所示的那样，在2ng/mL的hTGF-β1(R&D公司制造)或10μg/mL的抗TGF-β抗体(R&D公司制造)和hIL-2(盐野义制药公司制造)(50U/ml)、100nM的化合物1盐的存在/非存在下，使用5μL的抗CD3/CD28抗体(Gibco Dynabeads Human T-ActivatorCD3/CD28；Thermo Fisher Scientific公司制造)对所制备的效应记忆性T细胞(1×10⁵个)进行刺激，在5％CO₂气氛下，以37℃处理72小时。

(i)抗TGF-β抗体(对照组)

(ii)抗TGF-β抗体+化合物1盐

(iii)hTGF-β1(对照组)

(iv)hTGF-β1+化合物1盐

利用抗CD8抗体(BD公司制造)、抗Foxp3抗体(eBioscience公司制造)对上述处理后的细胞进行染色，通过流式细胞法分析Foxp3阳性细胞的比例。在图17中示出它们的Foxp3阳性细胞的比例(％)。

由图17的结果可知，即便在通过添加抗TGF-β抗体而阻断TGF-β的条件下，仅通过化合物1盐也能够将Foxp3优势性地诱导至效应记忆性T细胞。另外，可知通过并用化合物1盐和TGF-β，能够协同性地将Foxp3诱导至效应记忆性T细胞。

Claims

1.一种Foxp3诱导剂，其用于由T细胞制造调节性T细胞，并以CDK8和/或CDK19的siRNA或其盐作为有效成分。

2.根据权利要求1所述的Foxp3诱导剂，其中，T细胞为CD4⁺Foxp3^-T细胞。

3.根据权利要求1所述的Foxp3诱导剂，其中，T细胞为CD4⁺CD25^-Foxp3^-T细胞。

4.根据权利要求1所述的Foxp3诱导剂，其中，T细胞为CD8⁺Foxp3^-T细胞。

5.一种调节性T细胞的制造方法，其通过利用CDK8和/或CDK19的siRNA或其盐对T细胞进行处理来制造该调节性T细胞。

6.一种调节性T细胞的制造方法，其通过在CDK8和/或CDK19的siRNA或其盐的存在下对T细胞进行T细胞受体刺激来制造该调节性T细胞。

7.一种调节性T细胞的制造方法，其在TGF-β、雷帕霉素或视黄酸的存在下进行权利要求6所述的T细胞受体刺激。

8.根据权利要求5～7中任一项所述的调节性T细胞的制造方法，其中，T细胞为CD4⁺Foxp3^-T细胞。

9.根据权利要求5～7中任一项所述的调节性T细胞的制造方法，其中，T细胞为CD4⁺CD25^-Foxp3^-T细胞。

10.根据权利要求5～7中任一项所述的调节性T细胞的制造方法，其中，T细胞为CD8⁺Foxp3^-T细胞。