CN118434858A - 靶向actl6b的反义寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肌动蛋白样6B(ACTL6B)的反义寡核苷酸剪接调节剂。这些反义寡核苷酸剪接调节剂与ACTL6B前体mRNA互补，诸如完全互补，并且能够在TDP‑43耗竭的细胞中增加或恢复ACTL6B的表达，诸如用于TDP‑43功能耗竭的病况和医学适应症。

Description

靶向ACTL6B的反义寡核苷酸

本发明涉及肌动蛋白样6B(ACTL6B)的反义寡核苷酸剪接调节剂。这些反义寡核苷酸剪接调节剂与ACTL6B前体MRNA互补，诸如完全互补，并且能够在TDP-43耗竭的细胞中增加或恢复ACTL6B的表达，诸如用于TDP-43功能耗竭的病况和医学适应症。

背景技术

TAR DNA结合蛋白43(TDP-43、)是一种多功能的RNA/DNA结合蛋白，参与RNA相关代谢。TDP-43沉积物的失调在患有运动神经元疾病：肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶变性(FTLD)患者的大脑和脊髓中充当包涵体(Prasad等人，Front.Mol.Neurosci.，2019)。

TDP-43耗竭在一系列疾病中表现出来，称为TDP-43病理，并包括诸如以下的疾病：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

ACTL6B参与神经元分化过程中的染色质重塑。它是ACTL6A的一种剪接变体，并且在干细胞完成分化为成熟神经元后取代ACTL6A。

我们发现，ACTL6B的剪接至少部分受TDP-43控制，这是由于ACTL6B前mRNA序列中存在TDP-43结合位点。

发明内容

本发明人令人惊讶地确定，如果细胞中的TDP-43被耗竭，ACTL6BmRNA剪接会发生变化。

因此，本发明人假设，修改ACTL6B剪接模式可能能够改善TDP-43耗竭对神经元细胞的不利影响。

这里，本发明人已经使用反义寡核苷酸ACTL6B剪接调节剂来增加ACTL6B的表达。

在一个方面，本发明提供了一种反义寡核苷酸肌动蛋白样6B(ACTL6B)剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为8个至40个核苷酸，并包含长度为至少8个核苷酸的与ACTL6B前体mRNA互补的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可能能够增加TDP-43耗竭的细胞中肌动蛋白样6B(ACTL6B)的表达。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可能能够降低TDP-43耗竭的细胞中ACTL6B突变体多肽(诸如ACTL6B的剪接变体)的表达。

本发明人令人惊讶地确定，在TDP-43耗竭的细胞中，观察到包括另外的外显子的ACTL6B剪接变体的表达增加。这导致功能活性野生型(WT)ACTL6B多肽的产生减少。在一些实施例中，与野生型ACTL6B多肽序列相比时，剪接变体可以因此包含由另外的外显子编码的多肽序列。

在一些实施例中，与野生型ACTL6B多肽序列相比时，突变体ACTL6B剪接变体可以包含插入，诸如约23个氨基酸的插入。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与ACTL6B前体mRNA中的剪接增强子位点互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与选自SEQ IDNO：199至205的序列互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与选自SEQ IDNO：6至97和190至193的序列互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与选自SEQ IDNO：26、28、29、30、31、32、33、38、39、46、47、48、52、53、55和72的序列互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与选自SEQ IDNO：28、29、30、31、32、33和47的序列互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以是选自SEQ IDNo 98至189和194至197的序列，或其至少10个连续核苷酸。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以为选自由SEQID NO：118、120、121、122、123、124、125、130、131、138、139、140、144、145、147和164组成的组的序列或其至少10个连续核苷酸。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以是选自由SEQID NO：120、121、122、123、124、125和139组成的组的序列或其至少10个连续核苷酸。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的长度可以为至少12个核苷酸，诸如长度为至少13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个核苷酸。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与反义寡核苷酸剪接调节剂是长度相同的。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可以包含一个或多个经修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷，其可以独立地选自由以下项组成的组：2′-O-烷基-RNA；2′-O-甲基RNA(2′-OMe)；2′-烷氧基-RNA；2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)；2′-氨基-DNA；2′-氟-RNA；2′-氟-DNA；阿糖核酸(ANA)；2′-氟-ANA；锁核酸(LNA)或它们的任何组合。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以包含2'-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷，其任选地通过硫代磷酸酯核苷间键连接。

在一些实施例中，经修饰的核苷中的一者或多者可以是锁核酸核苷(LNA)，诸如选自由受限的乙基核苷(cEt)和β-D-氧基-LNA组成的组的LNA核苷。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与ACTL6B前体mRNA序列至少75％，诸如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％互补。

在其他实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列可以与ACTL6B前体mRNA完全互补。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可以不包含多于3个或多于4个连续DNA核苷的区域，并且可能无法介导RNA酶H切割。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂中的一者或多者或全部核苷间键可以是经修饰的。例如，经修饰的核苷间键可以包含硫代磷酸酯键。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可以与至少一个缀合物部分共价附接。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可以呈药用盐诸如钠盐或钾盐的形式。

在另一方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

在另一方面，提供了一种用于增加细胞中ACTL6B表达的方法，诸如体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用以有效量的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物，该细胞可能表达异常或表现出耗竭水平的TDP-43。

在另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防受试者的疾病的方法，其包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物。

在另一方面，提供了用作药物的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物。

在另一方面，提供了用于治疗或预防受试者的疾病的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物。

在另一方面，提供了用于制备治疗或预防受试者的疾病的药物的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或药物组合物。

在本发明的所有方面，该疾病可以是选自由以下项组成的组的神经系统疾患：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

在特定实施例中，该疾病可以是选自由肌萎缩侧索硬化(ALS)和额颞叶变性(FTLD)组成的组的神经系统疾患。

附图说明

图1显示了来自CLC Genomics Workbench软件的屏幕截图，从中可以看到ACTL6B基因的NGS读段映射。用箭头表示用化合物A(SEQ ID 198)处理的样品中包含新外显子。

具体实施方式

本发明人已鉴定，ACTL6B的剪接受到TDP-43的影响。这被认为会导致TDP-43细胞中产生无功能或功能较差的ACTL6B。

不希望受理论的约束，认为在TDP-43耗竭的细胞中，ACTL6B可以被剪接，使得包括额外的外显子。这个另外的外显子的长度可以为23个氨基酸。包括这个另外的外显子可能导致形成功能活性低于野生型ACTL6B的多肽。这种替代性剪接多肽在本文中被称为“突变体ACTL6B多肽”、“ACTL6B的剪接变体”或“ACTL6B剪接变体”。

本发明人还确定使用反义寡核苷酸剪接调节剂可以减少ACTL6B剪接变体的产生。在本文中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂也可以称为本发明的寡核苷酸或本发明的反义寡核苷酸。

本发明的寡核苷酸剪接调节剂可以靶向ACTL6B前体mRNA中的剪接增强子位点。这可以减少替代性剪接，从而增加常规剪接和野生型ACTL6B蛋白的产生。

增强野生型ACTL6B表达对于治疗一系列以ACTL6B表达减少为特征或由其引起的疾患是可取的。这些疾患包括肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

剪接调节

本发明的反义寡核苷酸是ACTL6B剪接调节剂，即它们会影响ACTL6B前mRNA的剪接。在本文中，本发明的寡核苷酸可被称为“反义寡核苷酸剪接调节剂”。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以与ACTL6B前体mRNA互补。

在一些实施例中，ACTL6B前体mRNA可以具有SEQ ID NO 1的序列。本文提供SEQ IDNO 1作为参考序列，并且应当理解，靶前体mRNA可以是SEQ ID NO 1的等位基因变体，诸如包含一个或多个多态性的等位基因变体。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂可能能够增加TDP-43耗竭的细胞中ACTL6B的表达。在本文中，预期野生型，即常规剪接的ACTL6B的表达将通过暴露于本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂而增加。

不希望受理论的约束，认为本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以增加ACTL6B前体mRNA的常规剪接。这被认为会导致常规剪接的成熟ACTL6B mRNA的量增加，进而认为导致野生型ACTL6B蛋白的量增加。

在本文中，术语“野生型”和“常规剪接”将互换使用。

在一些实施例中，野生型(即常规剪接的)成熟ACTL6B mRNA序列可以具有SEQ IDNO：2的序列或其片段或变体。本文提供SEQ ID NO 2作为参考序列，并且应当理解，常规剪接的ACTL6B mRNA可以是SEQ ID NO 2的等位基因变体，诸如包含一个或多个多态性的等位基因变体。

在一些实施例中，野生型ACTL6B蛋白可以具有SEQ ID NO：3的序列或其片段或变体。本文提供SEQ ID NO 3作为参考序列，并且应当理解，野生型ACTL6B蛋白可以是SEQ IDNO 3的等位基因变体，诸如包含一个或多个多态性的等位基因变体。

在本文中，术语“增加野生型ACTL6B的表达”被理解为指增加常规剪接的ACTL6BmRNA水平、增加野生型ACTL6B蛋白水平或增加常规剪接的ACTL6B mRNA水平和野生型ACTL6B蛋白水平。

在某些实施例中，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以使ACTL6B前体mRNA的常规剪接增加至少约10％。更优选地，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以使ACTL6B前体mRNA的常规剪接增加至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少大约500％、至少约600％或更多。

在某些实施例中，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以使野生型ACTL6B蛋白的量增加至少约10％。更优选地，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以使野生型ACTL6B蛋白的量增加至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少大约500％、至少约600％或更多。

在某些实施例中，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以增加ACTL6B前体mRNA的常规剪接，并使野生型ACTL6B蛋白的量增加至少约10％。更优选地，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以增加ACTL6B前体mRNA的常规剪接，并使野生型ACTL6B蛋白的量增加至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％或更多。

优选地，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂通过降低TDP-43耗竭的细胞中ACTL6B突变体多肽的表达来增加野生型ACTL6B的量。

ACTL6B突变体多肽可以是ACTL6B的剪接变体。在本文中，术语“剪接变体”(splicing variant/splice variant)包括但不限于变体成熟mRNA，它包括相对于野生型ACTL6B成熟mRNA序列的另外的外显子。野生型ACTL6B成熟mRNA序列可以是SEQ IS NO 2。

在一些实施例中，相对于野生型ACTL6B多肽序列，在ACTL6B成熟mRNA序列中包括另外的外显子可能导致翻译多肽序列的插入。野生型ACTL6B多肽可以具有SEQ ID NO 3的序列。

在一些实施例中，相对于野生型ACTL6B多肽序列，插入可以是约23个氨基酸。在其他实施例中，相对于野生型ACTL6B多肽序列，插入可以是20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个氨基酸。野生型ACTL6B多肽可以具有SEQ ID NO 3的序列。

在一些实施例中，突变体多肽可以由SEQ ID NO：4的核苷酸序列或其片段或变体编码。本文提供SEQ ID NO 4作为参考序列，并且应当理解，编码突变体ACTL6B多肽的核酸序列可以是SEQ ID NO 4的等位基因变体，诸如包含一个或多个多态性的等位基因变体。

在其他实施例中，ACTL6B突变体多肽可以具有SEQ ID NO：5的序列或其片段或变体。本文提供SEQ ID NO 5作为参考序列，并且应当理解，突变体ACTL6B多肽可以是SEQ IDNO 5的等位基因变体，诸如包含一个或多个多态性的等位基因变体。

在本文中，术语“降低ACTL6B突变体的表达”被理解为指降低替代性剪接的ACTL6B成熟mRNA水平、降低突变体ACTL6B多肽水平、或降低替代性剪接的ACTL6B成熟mRNA水平和降低突变体ACTL6B多肽水平。

在一些实施例中，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂能够将替代性剪接的ACTL6B成熟mRNA的水平降低至少10％。更优选地，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂能够将替代性剪接的ACTL6B成熟mRNA的水平降低至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％或更多。

在一些实施例中，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂能够将突变体ACTL6B多肽水平降低至少10％。更优选地，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂能够将突变体ACTL6B多肽水平降低至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％或更多。

在一些实施例中，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂能够降低替代性剪接的ACTL6B成熟mRNA水平，并将野生型ACTL6B多肽水平降低至少10％。更优选地，与对照相比，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂能够降低替代性剪接的成熟ACTL6B mRNA水平，并将突变体ACTL6B多肽水平降低至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％或更多。

对照

通过术语“对照”，当关于测量反义寡核苷酸剪接调节剂的效果使用时，通常理解为对照是未暴露于本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的细胞。

替代性地，野生型ACTL6B表达的增加或ACTL6B突变体表达的降低可以通过参考暴露于本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂之前表达的野生型和/或突变体ACTL6B mRNA和/或多肽的量来确定。

在其他实施例中，对照可以是用非靶向寡核苷酸处理的细胞。

在一些实施例中，对照可以是模拟转染，例如其中用PBS处理细胞。

寡核苷酸

如本文所用，术语“寡核苷酸”如本领域技术人员通常理解的那样被定义为包含两个或更多个共价连接的核苷的分子。此类共价结合的核苷也可被称为核酸分子或寡聚物。

寡核苷酸通常是在实验室中通过先经固相化学合成后再进行纯化和分离而制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可包含一个或多个经修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷。本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可包含一个或多个经修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂为单链寡核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为8个至40个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为8个至40个核苷酸并且包含8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为至少12个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为至少14个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为至少16个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为至少18个核苷酸。

优选地，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为16个至20个核苷酸。

更优选地，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为18个至20个核苷酸。

连续核苷酸序列

如本文所用的术语“连续核苷酸序列”是指本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的与靶核酸互补的区域，其可以为或可以包含寡核苷酸基序序列。在本文中，该术语与“连续核碱基序列”可互换使用。

反义寡核苷酸剪接调节剂包含连续核苷酸序列，并且可任选地包含其他一个或多个核苷酸，例如可用于将官能团(例如缀合物基团)与连续核苷酸序列附接的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。

应理解的是，反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列不能长于反义寡核苷酸剪接调节剂本身，并且反义寡核苷酸剪接调节剂不能短于连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的整个核苷酸序列为连续核苷酸序列。

连续核苷酸序列是本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂中核苷酸的序列，其与靶核酸、靶序列或靶位点序列互补，并且在一些情况下完全互补。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为8个至40个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为至少12个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为至少14个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为至少16个核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列的长度为至少18个核苷酸。

在优选实施例中，连续核苷酸序列的长度为16个至20个核苷酸。

更优选地，连续核苷酸序列的长度为18个至20个核苷酸。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂由连续核苷酸序列组成。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂为连续核苷酸序列。

靶向ACTL6B前体mRNA的反义寡核苷酸剪接调节剂

本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与ACTL6B前体mRNA互补的连续核苷酸序列。

ACTL6B前体mRNA可被描述为连续核苷酸序列或反义寡核苷酸剪接调节剂的靶标。换句话说，反义寡核苷酸剪接调节剂靶向ACTL6B前体mRNA。

在一些实施例中，靶序列可以具有SEQ ID NO 1的序列。本文提供SEQ ID NO 1作为参考序列，并且应当理解，ACTL6B前体mRNA可以是SEQ ID NO 1的等位基因变体，诸如包含一个或多个多态性的等位基因变体。这同样适用于本文中被鉴定为靶序列的所有序列。

在一个方面，本发明涉及一种反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为8个至40个核苷酸，并包含与SEQ ID NO 1互补的长度为至少8个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 1至少约75％互补、至少约80％互补、至少约85％互补、至少约90％互补、至少约95％互补或完全互补(即100％互补)的连续序列。这里的互补性是通过连续核苷酸序列的长度来确定的。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 1至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％互补或完全互补(即100％互补)的连续序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含连续序列，该连续序列可包含连续核苷酸序列与靶核酸之间的一个、两个或三个错配。

在优选实施例中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列在连续核苷酸序列的整个长度上与SEQ ID NO 1完全互补(100％互补)。

在一个实施例中，连续核苷酸序列与ACTL6B前体mRNA中的剪接增强子位点互补。

本发明的一方面涉及一种反义寡核苷酸剪接调节剂，其包含与SEQ ID NO 199互补的长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 199至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补的连续序列。

在优选实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 199完全互补(即100％互补)的连续序列。

本发明的一方面涉及一种反义寡核苷酸剪接调节剂，其包含与SEQ ID NO 200互补的长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 200至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补的连续序列。

在优选实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 200完全互补(即100％互补)的连续序列。

本发明的一方面涉及一种反义寡核苷酸剪接调节剂，其包含与SEQ ID NO 201互补的长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 201至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补的连续序列。

在优选实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 201完全互补(即100％互补)的连续序列。

本发明的一方面涉及一种反义寡核苷酸剪接调节剂，其包含与SEQ ID NO 202互补的长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 202至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补的连续序列。

在优选实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 202完全互补(即100％互补)的连续序列。

本发明的一方面涉及一种反义寡核苷酸剪接调节剂，其包含与SEQ ID NO 203互补的长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 203至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补的连续序列。

在优选实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 203完全互补(即100％互补)的连续序列。

本发明的一方面涉及一种反义寡核苷酸剪接调节剂，其包含与SEQ ID NO 204互补的长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 204至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补的连续序列。

在优选实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 204完全互补(即100％互补)的连续序列。

本发明的一方面涉及一种反义寡核苷酸剪接调节剂，其包含与SEQ ID NO 205互补的长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 205至少90％互补，诸如至少91％、诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％或100％互补的连续序列。

在优选实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含与SEQ ID NO 205完全互补(即100％互补)的连续序列。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 199。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 199互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 200。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 200互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 201。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 201互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 202。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 202互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 203。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 203互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 204。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 204互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 205。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 205互补。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含长度为8个至40个核苷酸的连续核苷酸序列，其与选自由以下项组成的组的靶核酸区域至少75％互补，诸如至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或100％互补：SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO 21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO 51、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 54、SEQ ID NO 55、SEQ ID NO56、SEQ ID NO 57、SEQ ID NO 58、SEQ ID NO 59、SEQ ID NO 60、SEQ ID NO 61、SEQ ID NO62、SEQ ID NO 63、SEQ ID NO 64、SEQ ID NO 65、SEQ ID NO 66、SEQ ID NO 67、SEQ ID NO68、SEQ ID NO 69、SEQ ID NO 70、SEQ ID NO 71、SEQ ID NO 72、SEQ ID NO 73、SEQ ID NO74、SEQ ID NO 75、SEQ ID NO 76、SEQ ID NO 77、SEQ ID NO 78、SEQ ID NO 79、SEQ ID NO80、SEQ ID NO 81、SEQ ID NO 82、SEQ ID NO 83、SEQ ID NO 84、SEQ ID NO 85、SEQ ID NO86、SEQ ID NO 87、SEQ ID NO 88、SEQ ID NO 89、SEQ ID NO 90、SEQ ID NO 91、SEQ ID NO92、SEQ ID NO 93、SEQ ID NO 94、SEQ ID NO 95、SEQ ID NO 96、SEQ ID NO 97、SEQ ID NO190、SEQ ID NO191、SEQ ID NO 192和SEQ ID NO 193。

在一些实施例中，靶序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO53、SEQ ID NO 55和SEQ ID NO 72。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与选自由以下项组成的组的序列互补：SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ IDNO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 46、SEQ IDNO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 52、SEQ ID NO 53、SEQ ID NO 55和SEQ ID NO 72。

在一些实施例中，靶序列选自由以下项组成的组：SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 47。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与选自由以下项组成的组的序列互补：SEQ ID NO 28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO 32、SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 47。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 26或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 26或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 26完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 28或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 28或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 28完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 29或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 29或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 29完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 30或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 30或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 30完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 31或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 31或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 31完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 32或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 32或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 32完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 33或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 33或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 33完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 38或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 38或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 38完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 39或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 39或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 39完全互补

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 46或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 46或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 46完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 47或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 47或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 47完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 48或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 48或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 48完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 52或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 52或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 52完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 53或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 53或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 53完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 55或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 55或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 55完全互补。

在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO 72或其片段。换句话说，在一些实施例中，连续核酸与SEQ ID NO 72或其片段互补。

在另一实施例中，连续核苷酸序列可以与SEQ ID NO 72完全互补。

在一些实施例中，任何靶序列的片段可以是其至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个或至少17个连续核苷酸，优选地至少10个连续核苷酸。

互补性

术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的沃森克里克碱基配对的能力。沃森克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。

应当理解，寡核苷酸可包含具有经修饰的核碱基的核苷，例如经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，并且因此，术语“互补性”包括未经修饰的核碱基与经修饰的核碱基之间的沃森克里克(Watson Crick)碱基配对(参见例如Hirao等人，(2012)，Accounts ofChemical Research，45，2055和Bergstrom，(2009)，Curr.Protoc.Nucleic Acid Chem.37，1.4.1)。

如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5′-3′和3′-5′的寡核苷酸序列比对时)互补(形成Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在这种比较中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和删除。应当理解的是，在确定互补性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算互补性百分比时，认为5′-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

在本发明中，术语“互补”要求反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列与靶序列(例如ACTL6B前体mRNA)至少约75％互补、至少约80％互补、至少约85％互补、至少约90％互补或至少约95％互补。在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续序列可以与靶序列(例如ACTL6B前体mRNA)至少约75％、至少约76％、至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％互补或100％互补。

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列可包括一个、两个、三个或更多个错配，其中错配是反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列中不与其靶标碱基配对的核苷酸。

术语“完全互补”是指100％互补性。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂与靶序列完全互补。

在一些实施例中，连续核苷酸序列与靶序列完全互补。

同一性

如本文所用的术语“同一性”是指核酸分子(例如反义寡核苷酸剪接调节剂)中连续核苷酸序列的在整个连续核苷酸序列上与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)。

因此，通过计数两个序列(在本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列和参考序列中)之间相同(匹配)的比对核碱基数，将该数除以连续核苷酸序列的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数x 100)/比对区域的长度(例如连续核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。

因此，应当理解，同一性和互补性之间存在关系，使得本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂中与靶序列互补的连续核苷酸序列也与所述靶序列共享一定百分比的同一性。

杂交

如本文所用的术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链(例如寡核苷酸和靶核酸)在相反链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间结合的亲和力为杂交的强度。它通常用解链温度(Tm)来描述，解链温度(Tm)定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm与亲和力并非严格成正比(Mergny和Lacroix，2003，Oligonucleotides 13：515-537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(Kd)通过ΔG°＝-RTln(Kd)相关，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸和靶核酸之间反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸和靶核酸之间的强杂交。ΔG°为与反应相关的能量，其中水性浓度为1M，pH为7并且温度为37℃。寡核苷酸与靶核酸的杂交为自发反应，并且对于自发反应，ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验测量，例如，通过利用如Hansen等人，1965，Chem.Comm.36-38和Holdgate等人，2005，Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)方法测量。本领域的技术人员将知道商业设备可用于测量ΔG°。ΔG°也可以通过使用如SantaLucia，1998，Proc Natl Acad SciUSA.95：1460-1465所述的最近邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995，Biochemistry 34：11211-11216和McTigue等人，2004，Biochemistry43：5388-5405描述的推导的热力学参数进行数值估算。

在一些实施例中，对于长度为10个至30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂与靶核酸以低于-10kcal的ΔG°估值杂交。

在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态Gibbs自由能ΔG°来测量。对于长度为8个至30个核苷酸的寡核苷酸，反义寡核苷酸剪接调节剂可与靶核酸以低于-10kcal范围，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的ΔG°估值杂交。在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂与靶核酸以-10至-60kcal，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal、诸如-18至-25kcal的ΔG°估值杂交。

反义寡核苷酸剪接调节剂

本发明的反义寡核苷酸是反义寡核苷酸剪接调节剂，其包含与ACTL6B前体mRNA互补的连续核苷酸序列。

在一些实施例中，连续核苷酸序列是选自由以下项组成的组的序列或其片段：SEQID NO 98、SEQ ID NO 99、SEQ ID NO 100、SEQ ID NO 101、SEQ ID NO 102、SEQ ID NO103、SEQ ID NO 104、SEQ ID NO 105、SEQ ID NO 106、SEQ ID NO 107、SEQ ID NO 108、SEQID NO 109、SEQ ID NO 110、SEQ ID NO 111、SEQ ID NO 112、SEQ ID NO 113、SEQ ID NO114、SEQ ID NO 115、SEQ ID NO 116、SEQ ID NO 117、SEQ ID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ ID NO 124、SEQ ID NO125、SEQ ID NO 126、SEQ ID NO 127、SEQ ID NO 128、SEQ ID NO 129、SEQ ID NO 130、SEQID NO 131、SEQ ID NO 132、SEQ ID NO 133、SEQ ID NO 134、SEQ ID NO 135、SEQ ID NO136、SEQ ID NO 137、SEQ ID NO 138、SEQ ID NO 139、SEQ ID NO 140、SEQ ID NO 141、SEQID NO 142、SEQ ID NO 143、SEQ ID NO 144、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 146、SEQ ID NO147、SEQ ID NO 148、SEQ ID NO 149、SEQ ID NO 150、SEQ ID NO 151、SEQ ID NO 152、SEQID NO 153、SEQ ID NO 154、SEQ ID NO 155、SEQ ID NO 156、SEQ ID NO 157、SEQ ID NO158、SEQ ID NO 159、SEQ ID NO 160、SEQ ID NO 161、SEQ ID NO 162、SEQ ID NO 163、SEQID NO 164、SEQ ID NO 165、SEQ ID NO 166、SEQ ID NO 167、SEQ ID NO 168、SEQ ID NO168、SEQ ID NO 170、SEQ ID NO 171、SEQ ID NO 172、SEQ ID NO 173、SEQ ID NO 174、SEQID NO 175、SEQ ID NO 176、SEQ ID NO 177、SEQ ID NO 178、SEQ ID NO 179、SEQ ID NO180、SEQ ID NO 181、SEQ ID NO 182、SEQ ID NO 183、SEQ ID NO 184、SEQ ID NO 185、SEQID NO 186、SEQ ID NO 187、SEQ ID NO 189、SEQ ID NO 194、SEQ ID NO 195、SEQ ID NO196和SEQ ID NO 197。

在一些实施例中，片段可以是连续核苷酸序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个或至少17个连续核苷酸，优选地其至少10个连续核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列是选自由以下项组成的组的序列或其片段：SEQID NO 118、SEQ ID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ ID NO124、SEQ ID NO 125、SEQ ID NO 130、SEQ ID NO 131、SEQ ID NO 138、SEQ ID NO 139、SEQID NO 140、SEQ ID NO 144、SEQ ID NO 145、SEQ ID NO 147、SEQ ID NO 164。

在一些实施例中，片段可以是连续核苷酸序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个或至少17个连续核苷酸，优选地其至少10个连续核苷酸。

在一些实施例中，连续核苷酸序列是选自由以下项组成的组的序列或其片段：SEQID NO 118、SEQ ID NO 120、SEQ ID NO 121、SEQ ID NO 122、SEQ ID NO 123、SEQ ID NO124、SEQ ID NO 125和SEQ ID NO 139。

在一些实施例中，片段可以是连续核苷酸序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个或至少17个连续核苷酸，优选地其至少10个连续核苷酸。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 118或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 118或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 120或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 120或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 121或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 121或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 122或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 122或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 123或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 123或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 124或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 124或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 125或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 125或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 130或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 130或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 131或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 131或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 138或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 138或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 139或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 139或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 140或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 140或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 144或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 144或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 145或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 145或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 147或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 147或其片段组成。

在一个实施例中，连续核苷酸序列包含SEQ ID NO 164或其片段。

在一个实施例中，连续核苷酸序列由SEQ ID NO 164或其片段组成。

在一些实施例中，片段可以是连续核苷酸序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个或至少17个连续核苷酸，优选地其至少10个连续核苷酸。

核苷酸和核苷

核苷酸和核苷是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸和核苷。在自然界中，核苷酸，诸如DNA和RNA核苷酸，包含核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(其不存在于核苷中)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

经修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与等同的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。

有利地，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可包含一个或多个经修饰的核苷。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列(基序序列)可以经修饰以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。有利地，使用高亲和力修饰的核苷。

有利地，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的经修饰的核苷中的一者或多者可包含经修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中被称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中具有修饰的核苷如果允许沃森克里克(WatsonCrick)碱基配对，则通常仍称为DNA或RNA。可以在根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂中使用的示例性经修饰的核苷包括LNA、2′-O-MOE、2'oMe和吗啉代核苷类似物。

修饰的核苷间键

有利地，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含一个或多个经修饰的核苷间键。

术语“经修饰的核苷间键”被定义为技术人员通常所理解的除磷酸二酯(Po)键以外的将两个核苷共价偶联在一起的键。因此，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可包含一个或多个经修饰的核苷间键，诸如一个或多个硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％、诸如至少90％或更多。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。

在进一步实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列包含至少一个经修饰的核苷间键。如果连续核苷酸序列内的至少75％诸如所有的核苷间键是硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷间键，则是有利的。

有利地，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的连续核苷酸序列的全部核苷间键可以为硫代磷酸酯，或者根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的全部核苷间键可以为硫代磷酸酯键。

核碱基

术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文中，术语核碱基还包括经修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但在核酸杂交过程中具有功能。在此上下文中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry增刊371.4.1。

在一些实施方案中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2′-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

核碱基部分可由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每个字母可任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。

经修饰的寡核苷酸

本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以为经修饰的寡核苷酸。

术语“修饰的寡核苷酸”描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合寡核苷酸”是已经在文献中用于描述包含糖修饰的核苷和DNA核苷的寡核苷酸的术语。在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂是嵌合寡核苷酸或包含嵌合寡核苷酸可能是有利的。

在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列可以包括经修饰的核碱基，其在碱基配对中起到所示核碱基的作用，例如可以使用5-甲基胞嘧啶代替甲基胞嘧啶。肌苷可用作通用碱基。

应当理解，连续核碱基序列(基序序列)可经修饰以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。

将经修饰的核苷(诸如高亲和力修饰的核苷)掺入寡核苷酸序列中的模式通常被称为寡核苷酸设计。

在一实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含至少1个经修饰的核苷，诸如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或至少19个经修饰的核苷。

合适的修饰在本文中在标题“经修饰的核苷”、“高亲和力修饰的核苷”、“糖修饰”、“2′糖修饰”和“锁核酸(LNA)”下进行了描述。

高亲和力修饰的核苷

高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，其当掺入寡核苷酸中时增强寡核苷酸对其互补靶标的亲和力，例如通过解链温度(Tm)所测量的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地导致每个经修饰的核苷的解链温度增加介于+0.5℃至+12℃之间，更优选地介于+1.5℃至+10℃之间，最优选地介于+3℃至+8℃之间。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2′取代的核苷以及锁定的核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，203-213)。

糖修饰

与DNA和RNA中发现的核糖部分相比时，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可包含一个或多个具有经修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。

已经制备了许多具有核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的某些特性，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

这些修饰包括这样的修饰，其中对核糖环结构进行修饰，例如替代为己糖环(HNA)或双环，其通常在核糖环(LNA)上的C2与C4碳原子之间具有双基桥(biradicle bridge)的双环，或通常在C2与C3碳原子之间缺少键的未连接的核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被非糖部分替换的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基改变为除氢以外的基团或DNA和RNA核苷中天然存在的2′-OH基团而进行的修饰。例如，可以在2′、3′、4′或5′位置引入取代基。

2′糖修饰的核苷

2′糖修饰的核苷是一种核苷，其在2′位置具有除H或-OH以外的取代基(2′取代的核苷)或包含能够在2′碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2′连接双基，诸如LNA(2′-4′双基桥连)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2′糖取代的核苷，并且发现许多2′取代的核苷掺入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2′修饰的糖可提供对寡核苷酸的增强的结合亲和力和/或增加的核酸酶抗性。2′取代的修饰的核苷的实例为2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA(2′oMe)、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier和Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，203-213以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面为一些2′取代的修饰的核苷的示意图。

关于本发明，2′取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2′桥连的核苷。

在一个实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可包含一个或多个糖修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷。优选地，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含一个或多个2′糖修饰的核苷，其独立地选自由以下项组成的组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA(2′oMe)、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。

锁核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”为2′-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖糖环的C2′和C4′的双基(也称为“2′-4′桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也被称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交亲和力的增强(双链体稳定化)相关。这可通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12，73-76，Seth等人.J.Org.Chem.2010，Vol 75(5)pp.1569-81，和Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research2009，37(4)，1225-1238，和Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016，59，9645-9667中。

其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。

方案1：

特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6′-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6′-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。

一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。

吗啉代寡核苷酸

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂包含吗啉代核苷或由吗啉代核苷组成(即为吗啉代寡聚物和磷酸二氨基酯吗啉代寡聚物(PMO))。剪接调节吗啉代寡核苷酸已被批准用于临床-参见例如依特普森(eteplirsen)，一种靶向DMD中移码突变的30核苷酸吗啉代寡核苷酸，用于治疗杜氏肌营养不良。吗啉代寡核苷酸具有与六元吗啉环而不是核糖附接的核酸酶，诸如通过磷酸二氨基酯基团连接的亚甲基吗啉环，例如由以下4个连续吗啉代核苷酸的图示所示：

在一些实施例中，根据本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的长度可以为例如8个至40个吗啉代核苷酸，诸如长度为16个至20个吗啉代核苷酸，诸如长度为18个至20个核苷酸。

RNA酶H活性和募集

反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其与互补RNA分子形成双链体时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNA酶H的能力。如果寡核苷酸在提供互补靶核酸序列时具有的初始速率(以pmol/l/min计)是当使用具有与正被测试的经修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但仅含有在寡核苷酸中所有单体之间均具有硫代磷酸酯键合的DNA单体的寡核苷酸并且使用由WO01/23613(通过引用并入本文)的实例91至95提供的方法时确定的初始速率的至少5％，诸如至少10％、至少20％或超过20％，则通常认为该寡核苷酸能够募集RNA酶H。为了用于确定RNA酶H活性，可从LubioScience GmbH(Lucerne，Switzerland)获得重组RNA酶H1。

已知DNA反义寡核苷酸可有效募集RNA酶H，包含DNA核苷区域(通常至少5或6个连续的DNA核苷)的间隔聚体寡核苷酸也是如此，其5′和3′侧接包含2′糖修饰核苷(通常高亲和力2′糖修饰核苷，诸如2-O-MOE和/或LNA)的区域。为了有效发挥剪接调节剂的功能，前体mRNA的降解是不可取的，并且因此优选地避免靶标RNA酶H的降解。因此，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂优选地不是RNA酶H募集间隔聚体寡核苷酸。

可以通过限制反义寡核苷酸剪接调节剂中连续DNA核苷酸的数量来避免RNA酶H募集，因此可以使用混聚体和全聚体设计。有利地，在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列不包含多于3个连续DNA核苷。进一步，有利地，在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列不包含多于4个连续DNA核苷。进一步有利地，在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列不包含多于2个连续DNA核苷。

混聚体和全聚体

为了用作剪接调节剂，使用不募集RNA酶H且不引起靶前体RNA破坏的反义寡核苷酸通常是有利的。由于RNA酶H活性需要DNA核苷酸的连续序列，因此可以通过设计不包含多于3个或多于4个连续DNA核苷区域的寡核苷酸来防止RNA酶H募集。这可以通过使用具有混聚体设计的反义寡核苷酸或其连续核苷区域(其包含糖修饰的核苷，诸如2′糖修饰的核苷)以及短的DNA核苷区(诸如1个、2个或3个DNA核苷)来实现。混聚体在本文中通过“每两个”设计(其中核苷在1个LNA与1个DNA核苷之间交替，例如LDLDLDLDLDLDLDLL，具有5′端和3′端LNA核苷)和“每三个”设计(诸如LDDLDDLDDLDDLDDL，其中每三个核苷为LNA核苷)来举例说明。

在一个实施例中，混聚体可包含或由在1个、2个或3个连续的DNA核苷之间交替的核苷，随后是1个或2个连续的LNA核苷组成。

全聚体是不包含DNA或RNA核苷的寡核苷酸或其连续核苷酸序列，并且可以例如仅包含2′-O-MOE核苷，诸如完全MOE硫代磷酸酯，例如MMMMMMMMMMMMMMMMMMMM，其中M＝2′-O-MOE，或者可以例如仅包含2′-oMe核苷，据报道其对治疗用途有效。

替代性地，混聚体可包含经修饰的核苷的混合物，诸如MLMLMLMLMLMLMLMLMLML，其中L＝LNA并且M＝2′-O-MOE核苷。

有利地，混聚体和全聚体中的核苷间核苷或混聚体中的大部分核苷键合可以为硫代磷酸酯。

混聚体和全聚体可包含其他核苷间键，诸如磷酸二酯或硫代磷酸酯(作为示例)。

在一些实施例中，反义寡核苷酸剪接调节剂为或包含寡核苷酸混聚体或全聚体。在一些实施例中，连续核苷酸序列是混聚体或全聚体。

寡核苷酸中的区域D′或D″

本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂在一些实施例中可包含与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列，诸如混聚体或全聚体区域，以及其他5′和/或3′核苷。所述其他5′和/或3′核苷可以与靶核酸互补或可以不互补(诸如完全互补)。此类其他的5’和/或3’核苷本文中可称为区域D’和D″。

出于将连续核苷酸序列(诸如混聚体或全聚体)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D′或D″。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。另选地，其可用于提供核酸外切酶保护或促进合成或制造。

区域D′或D″可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F′区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D′或D″区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5′和/或3′端核苷酸与磷酸二酯键合连接，并且为DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作区域D′或D″的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO2015/113922中公开了在聚寡核苷酸构建体中可生物裂解的接头的用途，其中它们被用于在单个寡核苷酸内连接多个反义构建体。

在一个实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂除包含可构成混聚体或全聚体的连续核苷酸序列外还可包含区域D′和/或D″。

在一些实施例中，位于区域D′或D″与混聚体或全聚体区域之间的核苷间键可以为磷酸二酯键。

缀合

本发明包括与至少一个缀合物部分共价附接的反义寡核苷酸剪接调节剂。在一些实施例中，它可以称为本发明的缀合物。

在一些实施例中，本发明提供了与至少一个缀合物部分共价附接的反义寡核苷酸剪接调节剂。

如本文所用的术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的反义寡核苷酸剪接调节剂。缀合物部分可以与反义寡核苷酸剪接调节剂共价连接到，任选地经由接头(诸如区域D′或D″)基团。

寡核苷酸缀合物及其合成也在Manoharan于Antisense Drug Technology，Principles，Strategies，and Applications，S.T.Crooke编辑，第16章，Marcel Dekker，Inc.，2001中所作综述和Manoharan，Antisense and Nucleic Acid Drug Development，2002，12，103中报导。

在一些实施例中，所述非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物(例如GalNAc)、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或其组合组成的组。

接头

键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可以直接或通过连接部分(例如接头或系链)与反义寡核苷酸剪接调节剂附接。接头用于将第三区域(例如缀合物部分(区域C))共价连接到第一区域(例如反义寡核苷酸剪接调节剂或与靶核酸互补的连续核苷酸序列(区域A))。

在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或反义寡核苷酸剪接调节剂可任选地包含接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)，其位于反义寡核苷酸剪接调节剂或与靶核酸互补的连续核苷酸序列(区域A或第一区域)与缀合物部分(区域C或第三区域)之间。

区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物切割的接头对S1核酸酶切割敏感。在一些实施例中，核酸酶敏感接头包含1个至5个核苷，诸如一个或多个包含至少两个连续磷酸二酯键合的DNA核苷。包含可生物裂解的接头的磷酸二酯的详细说明请参阅WO 2014/076195。

区域Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)与寡核苷酸(区域A或第一区域)共价连接的接头。区域Y接头可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-Y-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，接头(区域Y)为氨基烷基，诸如C2-C36氨基烷基基团，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一些实施例中，接头(区域Y)为C6氨基烷基基团。

盐

如本文使用的术语“盐”符合其通常已知的含义，即阴离子和阳离子的离子组装体。

在一些实施例中。本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂可以呈药用盐的形式。换句话说，本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的药用盐。

在一些实施例中，药用盐可以为钠盐或钾盐。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的药用钠盐。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的药用钾盐。

反义寡核苷酸剪接调节剂的递送

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中反义寡核苷酸剪接调节剂封装在基于脂质的递送载体中，与树枝状聚合物共价连接或封装在树枝状聚合物中，或与适体缀合。

这可能是为了将本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂递送至靶细胞和/或改善反义寡核苷酸剪接调节剂的药代动力学。

基于脂质的递送载体的实例包括水包油乳液、胶束、脂质体和脂质纳米颗粒。

药物组合物

本发明提供一种药物组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂，以及药用盐。

例如，盐可以包含金属阳离子，诸如钠盐或钾盐。

本发明提供了本发明的药物组合物，其中药物组合物包含本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂和水性稀释剂或溶剂。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂的溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液。在一些实施例中，本发明的溶液(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液)为无菌溶液。

用于增加ACTL6B表达的方法

本发明提供了一种用于增强、上调或恢复细胞(诸如表达ACTL6B的细胞)中野生型ACTL6B的表达的方法，所述方法包括向所述细胞施用以有效量的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物。

在一些实施例中，该方法为体外方法。

在一些实施例中，该方法为体内方法。

在一些实施例中，细胞为动物细胞，优选地哺乳动物细胞，诸如小鼠细胞、大鼠细胞、仓鼠细胞或猴子细胞，或优选地人细胞。

在一些实施例中，细胞为哺乳动物细胞。

在一些实施例中，细胞为人细胞。

在一些实施例中，细胞是患有或易患与野生型ACTL6B表达减少相关联的疾病的受试者的一部分或衍生自受试者。此类疾病包括但不限于肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

治疗

如本文所用的术语“治疗”是指对现有疾病(例如本文所指的疾病或疾患)的治疗，或对疾病的阻止(即预防)。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。

本发明提供了一种用于治疗或预防疾病的方法，其包括向患有或易患该疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物。

该疾病可能与野生型ACTL6B的表达减少相关联。

在一些实施例中，本发明提供了一种用于治疗或预防与野生型ACTL6B的表达减少相关联的疾病的方法，其包括向患有或易患与野生型ACTL6B的表达减少相关联的疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物。

在一个实施例中，该疾病是神经系统疾患。

在一个实施例中，该疾病选自由以下项组成的组：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

在一些实施例中，受试者是动物，优选地哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠或猴子，或人。

在一些实施方案中，受试者是人。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂，其用作药物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂，其用于制备药物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂，其用于疗法中。

本发明提供了本发明的药物组合物，其用作药物。

本发明提供了本发明的药物组合物，其用于制备药物。

本发明提供了本发明的药物组合物，其用于疗法中。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂，其用作治疗神经系统疾患的药物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂，其用作治疗选自由肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病组成的组的疾病的药物。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂在制备用于治疗或预防神经系统疾患的药物中的用途。

本发明提供了本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，该疾病选自由以下项组成的组：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

本发明提供了本发明的药物组合物，其用作治疗神经系统疾患的药物。

本发明提供了本发明的药物组合物，其用作治疗选自由肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病组成的组的疾病的药物。

本发明提供了本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防神经系统疾患的药物中的用途。

本发明提供了本发明的药物组合物在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途，该疾病选自由以下项组成的组：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

施用

本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物可以局部施用(诸如，皮肤、吸入、眼内或耳内施用)或肠内施用(诸如，口服或通过胃肠道施用)或肠道外施用(诸如，静脉内、皮下、肌内、脑内、脑室内或鞘内施用)。

在优选实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注、鞘内或颅内，例如，脑内或心室内施用。在一个实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂经脑内或脑室内施用。在另一实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂经鞘内施用。

本发明还提供了如所述的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物在制备药物中的用途，其中药物呈鞘内施用的剂型。

本发明还提供如所述的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物在制备药物中的用途，其中药物呈脑内或心室内施用的剂型。

本发明还提供了如所述的本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物在制备药物中的用途，其中药物呈脑室内施用的剂型。

组合疗法

在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸剪接调节剂或本发明的药物组合物用于与一种或多种其他治疗剂的联合治疗。

实例

实例1：鉴定ACTL6B为TDP43 mRNA剪接调控的新靶标。

ALS疾病的一个标志性特征是在患者的一小部分神经元细胞中存在细胞质聚集的TDP43蛋白。TDP43的细胞质聚集的结果是它在细胞核中被耗竭，并且因此不能在细胞核中发挥其正常功能。

已证明TDP43会影响mRNA剪接。为了鉴定其mRNA受TDP43的存在调控的新基因，我们在神经元细胞模型中敲低了TDP43。对细胞进行了RNA测序，并进行了从头转录本分析以鉴定具有新剪接模式的受影响基因。

将人谷氨酸能神经元(Fujifilm)以60,000个活细胞与10,000个活星形胶质细胞(Fujifilm)一起铺板在涂有200μl培养基中的层粘连蛋白和聚乙烯亚胺溶液(SigmaAldrich)的96孔板中(第-1天)。

为了敲低TDP-43，在第0天将化合物A(SEQ ID 198)以5μM添加到培养基中，而在其他孔中添加PBS作为对照。在整个实验期间(第2天、第5天、第7天、第10天、第12天、第14天和第17天)，每周更换3次一半的细胞培养基。在第20天使用Magnapure裂解缓冲液(Roche)收获细胞，并根据制造商的说明(包括DNA酶处理步骤)在MagNA pure 96系统(Roche、)上分离RNA。使用KAPA mRNA HyperPrep Kit平台(Roche)从100ng的总RNA制备NGS文库。在NovaSeq6000测序仪(Illumina)上对文库进行配对末端测序，读段长度为150-bp。使用CLC Genomics Workbench 21进行数据分析。首先通过使用hg38基因组组装进行大间隙映射分析，然后进行转录本发现来分析数据。通过人工目测检查预测的新剪接事件，以鉴定真实的剪接事件。

发现TDP43丢失后，ACTL6B中包含新的69碱基对外显子。根据hg38人类基因注释，新外显子中的第一个碱基和最后一个碱基为100,650,643和100,650,575，ACTL6B被置于负方向。

图1显示了来自CLC Genomics Workbench软件的屏幕截图，从中可以看到ACTL6B基因的NGS读段映射。用箭头表示用化合物A(SEQ ID 198)处理的样品中包含新外显子。该样品中大约99％的全部mRNA均含有该外显子。对于未经处理的样品，在不到0.5％的读段中发现该外显子的包含。

实例2：使用ASO挽救因缺乏TDP43而导致的ACTL6B mRNA剪接错误

在此，我们显示了ASO诱导TDP43靶标ACTL6B正确剪接的能力。

将人谷氨酸能神经元(Fujifilm)以60,000个活细胞与10,000个活星形胶质细胞(Fujifilm)一起铺板在涂有200μl培养基中的层粘连蛋白和聚乙烯亚胺溶液(SigmaAldrich)的96孔板中(第-1天)。为了敲低TDP-43，在第0天将化合物A(SEQ ID 198)以5μM添加到培养基中(每个板四个对照孔除外)。在整个实验期间(第2天、第5天、第7天、第9天、第12天、第14天、第16天和第19天)，每周更换3次一半的细胞培养基。靶向隐性ACTL6B外显子的ASO在第5天以10μM添加到培养基中。总共添加了96种不同的ASO(SEQ ID 98至189和194至197)。每个板至少有12个孔仅接受化合物A(SEQ ID 198)作为基线参考。实验重复进行。总共有四个96孔板。

在第20天使用Magnapure裂解缓冲液(Roche)收获细胞，并根据制造商的说明(包括DNA酶处理步骤)在MagNA pure 96系统(Roche)上分离RNA。在cDNA合成之前，将纯化的RNA在90℃下变性30秒。根据制造商的说明，使用用于RT-qPCR(Biorad)的iScript高级cDNA合成试剂盒创建cDNA。

使用QX1系统(Bio-Rad)与QX1软件标准版通过液滴数字PCR进行对靶基因的表达水平的测量。用于测量正常剪接靶mRNA表达的PCR探针测定被设计为跨越两个外显子，其中在这两个外显子之间会出现新的“突变体”外显子。

两次重复实验的表达值如表1所示。

使用在(Integrated DNA technologies(IDT))合成的以下PCR探针测定：

TARDBP：

引物1：CAGCTCATCCTCAGTCATGTC，

引物2：GATGGTGTGACTGCAAACTTC，P

袍：/5Cy5/CAGCGCCCCACAAACACTTTTCT/3IAbRQSp/)

ACTL6B wt(ex4-ex5)：

引物1：TCTGAGCCAAACCTGCAC，

引物2：ATCAGCTCTGTCAGCTTCTCC，

探针：/5HEX/CGAGGCTCC/ZEN/GTGGAACACACG/3IABkFQ/)

以下CY5.5标记的HPRT1探针购自BioRad：dHsaCPE13136107。

表1：暴露于寡核苷酸后TDP43和ACTL6B WT的产生

将表2中所示的数据归一化为管家基因HPRT1的表达，并最终归一化为未接受任何TDP43敲低或CA重复ASO的对照孔(PBS)的平均表达值。最后一列示出了所有给定条件的平均表达。KD(“敲低”，描述仅接受降解TDP43 mRNA的间隔聚体ASO处理的孔)

Claims (64)

1.一种反义寡核苷酸肌动蛋白样6B(ACTL6B)剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂的长度为8至40个核苷酸，并包含长度为至少8个核苷酸的与ACTL6B前体mRNA互补的连续核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述ACTL6B前体mRNA具有SEQID NO：1的序列。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂能够增加TDP-43耗竭的细胞中肌动蛋白样6B(ACTL6B)的表达。

4.根据权利要求3所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中ACTL6B由SEQ ID NO：2的核苷酸序列或其片段或变体编码。

5.根据权利要求3或权利要求4所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中ACTL6B蛋白具有SEQ ID NO：3的序列或其片段或变体。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂能够降低TDP-43耗竭的细胞中ACTL6B突变体多肽的表达。

7.根据权利要求6所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述ACTL6B突变体多肽为ACTL6B的剪接变体。

8.根据权利要求7所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中与野生型ACTL6B多肽序列相比时，所述ACTL6B突变体多肽包含由另外的外显子编码的多肽序列。

9.根据权利要求8所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中与所述野生型ACTL6B多肽序列相比时，所述ACTL6B突变体多肽包含插入。

10.根据权利要求9所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述插入为约23个氨基酸的插入。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述ACTL6B突变体多肽由SEQ ID NO：4的核苷酸序列或其片段或变体编码。

12.根据权利要求6至11中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述ACTL6B突变体多肽具有SEQ ID NO：5的序列或其片段或变体。

13.根据权利要求6至12中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与所述ACTL6B前体mRNA中的剪接增强子位点互补。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 199互补。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 200互补。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 201互补。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 202互补。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 203互补。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 204互补。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与SEQ ID NO 205互补。

21.根据权利要求1至20中一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO 6至97和190至193的序列互补。

22.根据权利要求21所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO：26、28、29、30、31、32、33、38、39、46、47、48、52、53、55和72的序列互补。

23.根据权利要求22所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO：28、29、30、31、32、33和47的序列互补。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列为选自SEQ ID No 98至189和194至197的序列或其至少10个连续核苷酸。

25.根据权利要求24所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列为选自SEQ ID NO 118、120、121、122、123、124、125、130、131、138、139、140、144、145、147和164的序列或其至少10个连续核苷酸。

26.根据权利要求25所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列为选自SEQ ID NO 120、121、122、123、124、125和139的序列或其至少10个连续核苷酸。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列的长度为至少12个核苷酸。

28.根据权利要求1至27中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列的长度为至少13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个或32个核苷酸。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与所述反义寡核苷酸剪接调节剂是长度相同的。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂是分离的、纯化的或制造的。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列包含一个或多个经修饰的核苷。

32.根据权利要求1至31中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂为吗啉代反义寡核苷酸。

33.根据权利要求31或权利要求32所述的反义剪接调节剂寡核苷酸，其中所述一个或多个经修饰的核苷为2′糖修饰的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组的2′糖修饰的核苷：2′-O-烷基-RNA；2′-O-甲基RNA(2′-OMe、)；2′-烷氧基-RNA；2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)；2′-氨基-DNA；2′-氟-RNA；2′-氟-DNA；阿糖核酸(ANA)；2′-氟-ANA；锁核酸(LNA、)或它们的任何组合。

34.根据权利要求33所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述2′糖修饰的核苷为亲和力增强的2′糖修饰的核苷。

35.根据权利要求1至34中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂的所述连续核苷酸序列包含2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE、)核苷。

36.根据权利要求35所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列的全部所述核苷为2′-O-甲氧基乙基-RNA(2′-MOE)核苷，其任选地通过硫代磷酸酯核苷间键所连接。

37.根据权利要求31至36中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述经修饰的核苷中的一者或多者为锁核酸核苷(LNA)，诸如选自由受限的乙基核苷(cEt)和β-D-氧基-LNA组成的组的LNA核苷。

38.根据权利要求37所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂的所述连续核苷酸序列包含LNA核苷和DNA核苷或由其组成。

39.根据权利要求1至38中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与ACTL6B前体mRNA序列至少75％互补。

40.根据权利要求39所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与所述ACTL6B前体mRNA序列至少80％、至少85％、至少90％或至少95％互补。

41.根据权利要求1至38中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列与所述ACTL6B前体mRNA完全互补。

42.根据权利要求1至40中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述连续核苷酸序列包含与所述ACTL6B前体mRNA序列的1个、2个、3个或更多个错配。

43.根据权利要求1至42中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂对互补靶RNA的吉布斯自由能低于约-10ΔG，诸如低于约-15ΔG，诸如低于约-17ΔG。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂不包含多于3个或多于4个连续DNA核苷的区域。

45.根据权利要求1至44中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂不能介导RNA酶H切割。

46.根据权利要求1至45中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列为混聚体或全聚体。

47.根据权利要求1至46中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中存在于所述反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列中的胞嘧啶碱基独立地选自由以下项组成的组：胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶。

48.根据权利要求1至47中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中存在于所述反义寡核苷酸剪接调节剂或其连续核苷酸序列中的所述胞嘧啶碱基为5-甲基胞嘧啶。

49.根据权利要求1至48中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中位于所述连续核苷酸序列上的所述核苷之间的核苷间键中的一者或多者是经修饰的。

50.根据权利要求1至49中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中位于所述连续核苷酸序列上的所述核苷之间的至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％的核苷间键是经修饰的。

51.根据权利要求1至50中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中经修饰的核苷间键中的一者或多者或全部包含硫代磷酸酯键。

52.根据权利要求1至51中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中存在于所述反义寡核苷酸剪接调节剂中的全部所述核苷间键均为硫代磷酸酯核苷间键。

53.根据权利要求1至52中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂与至少一个缀合物部分共价附接。

54.根据权利要求1至53中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述反义寡核苷酸剪接调节剂呈药用盐的形式。

55.根据权利要求54所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述药用盐为钠盐或钾盐。

56.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至55中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂，以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

57.一种用于增加细胞中ACTL6B表达的方法，诸如体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用以有效量的根据权利要求1至55中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂或根据权利要求56所述的药物组合物。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述细胞表达异常或表现出耗竭水平的TDP-43。

59.一种用于治疗或预防受试者的疾病的方法，所述方法包括向患有或易患所述疾病的受试者施用治疗或预防上有效量的根据权利要求1至55中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂或根据权利要求56所述的药物组合物。

60.根据权利要求1至55中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂或根据权利要求56所述的药物组合物，其用作药物。

61.根据权利要求1至55中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂或根据权利要求56所述的药物组合物，其用于治疗或预防受试者的疾病。

62.根据权利要求1至55中任一项所述的反义寡核苷酸剪接调节剂或根据权利要求56所述的药物组合物，其用于制备用于治疗或预防受试者的疾病的药物。

63.根据权利要求57至59中任一项所述的方法或用于根据权利要求60至62中任一项的反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述疾病为选自由以下项组成的组的神经系统疾患：肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶变性(FTLD)、进行性核上麻痹(PSP)、原发性侧索硬化症、进行性肌萎缩、阿尔茨海默病、帕金森病、自闭症、海马硬化性痴呆、唐氏综合征、亨廷顿病、多聚谷氨酰胺疾病，诸如脊髓小脑性共济失调3、肌病和慢性创伤性脑病。

64.用于根据权利要求63的方法或反义寡核苷酸剪接调节剂，其中所述疾病为选自由肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶变性(FTLD)组成的组的神经系统疾患。