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CN118389554A - 一种提高fgf-21持续表达水平和稳定性的aav重组病毒及其应用 - Google Patents

一种提高fgf-21持续表达水平和稳定性的aav重组病毒及其应用 Download PDF

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CN118389554A
CN118389554A CN202410577639.XA CN202410577639A CN118389554A CN 118389554 A CN118389554 A CN 118389554A CN 202410577639 A CN202410577639 A CN 202410577639A CN 118389554 A CN118389554 A CN 118389554A
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aav2
abd
luciferase
mice
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黄晓飞
卢森林
曹春雨
吕亚丰
张琼
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China Three Gorges University CTGU
Original Assignee
China Three Gorges University CTGU
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Abstract

本发明公开了一种提高FGF‑21持续表达水平和稳定性的AAV及其应用，利用基因工程技术将ABD与FGF‑21连接，然后重组至AAV2核心质粒上，构建得到重组质粒pAAV‑ABD‑FGF‑21‑Luciferase，将重组质粒转染、包装得到的重组AAV2‑ABD‑FGF‑21腺相关病毒，该病毒可以介导ABD‑FGF‑21‑Luciferase基因转导小鼠肝脏并持续地分泌性表达ABD‑FGF‑21，显著增加小鼠外周血FGF‑21水平和稳定性，在II型糖尿病小鼠体内具有显著增强FGF‑21降血糖和降血脂的效应，该效应可以维持7周以上，同时显著降低了胰岛素抵抗和高脂饮食HFD造成的II型糖尿病小鼠肝损伤。

Description

一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒及其 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒及其应用。
背景技术
近年来II型糖尿病（T2D）发病率快速增长，II型糖尿病及其并发症白内障、糖尿病肾病等已成为我国和全球的一个主要健康问题。高血糖、胰岛素抵抗与肝脂肪样变性是II型糖尿病的重要特征，其导致糖尿病患者罹患心脏病、免疫功能障碍、高血压、关节炎、神经退行性疾病和某些类型癌症的风险显著增加。胰岛素抵抗导致的药物降糖作用下降是当前临床治疗II型糖尿病面临的主要困境，因而亟待开发新的II型糖尿病治疗技术。
成纤维细胞生长因子21（FGF-21）是主要由肝脏细胞分泌的一种肽激素，其可通过辅助因子β-klotho结合FGF-21受体作用于肝脏、脂肪和胰腺细胞，提高胰岛素敏感性、促进棕色脂肪发热作用和降低血糖水平等，由此发挥调节糖脂代谢的作用。已有大量临床研究表明，外源性补充FGF-21肽或FGF-21肽的结构类似物能够下调血糖和血脂水平，提示FGF-21肽具有治疗II型糖尿病和肥胖的应用前景。然而天然FGF-21分子量仅为21KDa，且其C端十个氨基酸可被丝氨酸蛋白酶FAP和二肽基肽酶IV切割，因此静脉注射的FGF-21肽一方面易于通过肾小球滤过而被肾脏代谢、另一方面由于酶切割作用，导致其体内半衰期仅为0.5至1.5小时，从而无法发挥持续的降糖降血脂效应，严重限制了其作为肽类药物的应用效果。
然而，II型糖尿病通常由于长期胰岛素分泌相对不足或持续胰岛素抵抗所致，补充外源性降糖药物会引起一过性的药物代谢波峰，常需要不断调整给药剂量和间隔时间、连续多次用药维持降糖药物的有效浓度；同时长期的反复给药不仅增加了病人的痛苦，而且增加了治疗费用，同时也引起一系列副反应的发生。李德山等采用分子质量为20ku的单甲氧基聚乙二醇-丙醛（mPEG-ALD）对鼠源FGF-21进行N端定点修饰，以改善Mfgf-21的性质，提高了体内半衰期，降低了免疫原性等。但是聚乙二醇修饰剂的分子质量对修饰结果影响较大，且存在纯化难度大、纯化效率低等问题。抗体FC段能够通过增加融合蛋白的分子量，使其不易通过肾小球滤过，也能够增加FGF-21的血浆稳定性和表达水平，但FC段分子量偏大（50-60KDa），因而对FGF-21（分子量21 KDa）等蛋白质的生物功能造成了显著影响。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV2)作为基因递送的载体，具有安全性好、免疫原性低、持续表达和长期稳定等优点，目前已经作为递送载体开发出多种基因药物用于先天性黑朦病、血友病、脊髓性脊肌萎缩症等遗传病的临床治疗。ABD(Albumin-binding domain)，即白蛋白结合结构域（分子量为14KDa），其具有与血清白蛋白结合的亲和力，能够由此增加含ABD蛋白的血清稳定性，延长其半衰期。与采用抗体FC段融合蛋白相比较，ABD-FGF-21融合蛋白方案一方面可增加FGF-21的分子量使其不易通过肾脏滤出；另一方面，ABD结构域与白蛋白结合能够保护FGF-21免受血清中的蛋白酶降解，增加FGF-21分子肽的稳定性。除此之外，本发明中采用的ABD结构域分子量仅为14KDa，约为抗体Fc段分子量的三分之一，显著降低了融合蛋白对FGF-21生物功能的影响。因此，利用腺相关病毒载体来递送FGF-21肽与ABD融合蛋白的编码DNA序列，有望实现ABD-FGF-21肽融合蛋白在体内的持续长期表达，从而增加FGF-21的血清稳定性和半衰期，提高FGF-21的降血糖功能。由此，建立针对II型糖尿病这一慢性病的基因治疗方法。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒及其应用，通过分子克隆技术构建携带有ABD-FGF-21融合基因的AAV质粒，然后将其与AAV衣壳蛋白编码质粒和辅助质粒共转染293T细胞进行包装，得到腺相关病毒AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase。AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase显著提高了小鼠外周血FGF-21水平，并在注射II型糖尿病小鼠后，显示出具有持续降血糖、降血脂的效果。
为了实现上述目的，本发明提供一种ABD-FGF-21融合基因，所述FGF-21基因的5`端连接有ABD基因，所述融合基因的序列为SEQ ID NO:1。
优选的，所述ABD-FGF-21融合基因通过自剪切序列P2A与报告基因Luciferase的编码序列连接，共同组成开放阅读框。
本发明还提供一种FGF-21融合基因在制备治疗II型糖尿病药物上的应用。
本发明还提供一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒，包括腺相关病毒衣壳和上述的ABD-FGF-21融合基因。
优选的，所述腺相关病毒衣壳为AAV2、AAV5或AAV8。
进一步优选的，所述腺相关病毒衣壳为AAV2。
优选的，所述AAV重组病毒中还包括Flag序列，P2A和Luciferase。
优选的，AAV重组病毒中的启动子为CMV promoter。
本发明还提供一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒在制备治疗II型糖尿病药物上的应用。
本发明的有益效果在于：
1、将ABD与FGF-21融合，得到的融合基因翻译成肽后使得外源性的ABD-FGF-21多肽进入血循环后快速结合到白蛋白上，从而免受肾脏滤过和蛋白酶降解，延长FGF-21肽在体内的半衰期和在体内循环的时间。
2、利用基因治疗载体AAV2高转导和长期稳定表达的能力，进行ABD-FGF-21融合基因的递送，实现FGF-21在体内肝脏的长期（7周以上）、持续表达，有效提高了FGF-21的血浆水平。
3、将ABD-FGF-21融合基因与AAV表达质粒重组，得到重组质粒pAAV-ABD-FGF-21-Luciferase，然后进行三质粒包装，得到重组病毒AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase，该重组病毒具有AAV2血清型II型的肝脏组织高效基因转导能力。
4、将重组病毒AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase通过尾静脉注射至II型糖尿病小鼠中，其对小鼠肝脏组织具有高效基因转导作用和分泌性表达的作用，能够显著提高小鼠外周血FGF-21水平，且一次注射后表面出持续7周以上的降血糖、降甘油三酯、促进脂肪分解和胰岛素抵抗下降、肝细胞脂肪变性缓解和体重改善，且在实验第7周仍可将T2DM小鼠外周血中FGF-21含量增加1.83倍。
5、本发明制备的ABD-FGF-21融合基因、重组质粒pAAV-ABD-FGF-21-Luciferase以及重组病毒AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase可以用于制备治疗II型糖尿病的基因药物。
附图说明
图1为实施例1中构建的ABD-FGF-21重组表达盒示意图；图中A为pAAV2-Null-Luciferase，B为pAAV2-FGF-21-Luciferase，C为pAAV2-ABD-FGF-21-Luciferase。
图2为实施例2中双酶切产物的凝胶电泳图，图中A为重组质粒pAAV2-FGF-21-Luciferase的双酶切电泳图，B为重组质粒pAAV2-ABD-FGF-21-Luciferase的双酶切电泳图。
图3为实施例3中ABD-FGF-21和FGF-21的序列检测对比图，图中A为FGF-21的序列对比图，B为ABD-FGF-21的序列对比图。图4为实施例6中质粒转染后FGF-21及ABD-FGF-21蛋白表达的Western Blot分析图。
图5为实施例7中Western Blot检测AAV2病毒衣壳蛋白VP1，VP2，VP3表达情况图。
图6为实施例8中T2DM小鼠模型的构建流程图。
图7为实施例9中注射重组腺相关病毒后的T2DM小鼠活体成像图。
图8为实施例10中注射重组腺相关病毒后T2DM小鼠的生理生化指标变化情况；图中A为实验结束时小鼠的照片，B为实验过程中小鼠的体重变化情况折线图，C为实验过程中小鼠的血糖水平变化情况折线图，D为实验结束时小鼠的空腹血清胰岛素（INS）水平，E为实验结束时小鼠血清中胰岛素抵抗水平(HOME-IR胰岛素抵抗指数)，F为实验结束时小鼠对胰岛素敏感柱状图(HOMR-IS是胰岛素敏感指数)。
图9为实施例10中重组腺相关病毒对T2DM小鼠生化参数的影响；图中A为小鼠葡萄糖耐量折线图，B为葡萄糖耐量曲线下面积柱状图，C为糖化血清蛋白含量柱状图，D为血清中FGF-21循环含量柱状图。
图10为实施例11中重组腺相关病毒对T2DM小鼠血脂水平的影响；图中A为总胆固醇的含量柱状图，B为甘油三酯的含量柱状图，C为低密度脂蛋白胆固醇的含量柱状图，D为高密度脂蛋白胆固醇的含量柱状图。
图11为实施例12中重组腺相关病毒对T2DM小鼠肝损伤的影响；图中A为肝脏形态照片，B为肝脏指数柱状图，C为血清AST含量柱状图，D为血清ALT含量柱状图，E为H&E染色肝脏切片照片；其中E图a为200倍图像，b为400倍图像。
图12为实施例13中重组腺相关病毒对T2DM小鼠中棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）的影响；图中A为棕色脂肪组织（BAT）切片的H&E染色，B为白色脂肪组织（WAT）切片的H&E染色。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步解释说明，值得注意的是，下述实施例仅为本发明的优选实施例，而不应理解为对本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的内容为准。本领域技术人员在没有做出创造性劳动而对本发明的技术方案做出的修改、替换均落入到本发明的保护范围之内。
细胞、小鼠及质粒：
HEK-293T细胞：由吕亚丰老师提供，保存于三峡大学基础医学院；
pAAV-Luciferase质粒：由吕亚丰老师提供，保存于三峡大学基础医学院；
pHelper质粒：由吕亚丰老师提供，保存于三峡大学基础医学院；
pAAV2 Capsid质粒：由吕亚丰老师提供，保存于三峡大学基础医学院；
SPF级雄性6周龄C57BL/6小鼠：购自三峡大学实验动物中心；
试剂：
胎牛血清：Biological Industries；
DMEM培养基：Thermo Fisher Scientific；
Imafect转染试剂：北京码因科技有限公司；
全能核酸酶：上海翌圣生物科技股份有限公司；
60％碘克沙醇：Stem cell公司；
蛋白制备缓冲液：Thermo Fisher Scientific公司；
PVDF膜：默克密理博公司；
FGF-21抗体（1:1000）：American Research Products公司；
抗鼠IgG（1:2000）：proteintech公司；
anti-Capsid(衣壳蛋白)抗体（1:1000）：American Research Products公司；
STZ缓冲液：pH 4.2-4.5，0.1mol/L柠檬酸钠溶液；
Luciferin：上海翌圣生物科技股份有限公司；
Elisa试剂盒：杭州联科生物技术公司；
PBS：8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，高压灭菌后4℃保存；
10×PBS MK：10×100mLPBS溶液+0.2g MgCl2•6H2O+0.19g KCl，溶解；
0 .5％酚红：称取酚红0.1g于20mL 50％乙醇中，加热溶解；
1×TBST：2.42g Tris base，8.80g NaCl溶于900mL ddH2O中，加入500μL吐温20，调节pH至7.40，定容至1000mL。
实施例1重组腺相关病毒载体的构建
人工合成ABD-FGF-21核苷酸序列，并连接至pAAV2-luciferase载体中，具体方法如下：
（1）从美国国家生物技术信息中心网站（NCBI）上获取小鼠FGF-21的蛋白编码核苷酸序列，然后在其5`端加上小鼠ABD蛋白的编码核苷酸序列，使其能够表达ABD-FGF-21，然后在ABD-FGF-21的5`端加上EcoR1酶切位点及其保护碱基、3`端加上P2A序列、Hind III酶切位点及其保护碱基，得到ABD-FGF-21核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO：1；
（2）将步骤（1）得到的ABD-FGF-21核苷酸序列送至苏州金唯智科技有限公司合成，然后通过EcoR I和Hind III双酶切法克隆至载体pAAV2-luciferase（图1A），构建重组质粒pAAV2-ABD-FGF-21-luciferase（图1C）；
（3）按照步骤（2）所述的方法，通过EcoR I和Hind III双酶切ABD-FGF-21核苷酸序列后与经过同样双酶切处理的pAAV2-luciferase质粒混合，以DNA连接酶法在16℃催化连接反应，然后转化连接子到大肠杆菌DH5，以氨苄抗性琼脂平板筛选出重组质粒，经过DNA测序鉴定，完成构建重组质粒pAAV2-FGF-21-luciferase（图1B）；此外以pAAV2-luciferase载体作为pAAV-Null-Luciferase，作为空白对照（图1A）。
实施例2重组质粒的双酶切检测
利用Hind III和EcoR I对实施例1构建的两个重组质粒进行双酶切，检测酶切片段的大小是否与设计结果一致，具体步骤如下：
（1）将实施例1构建的两个重组质粒转化至大肠杆菌中，摇菌扩增后提取质粒；
（2）利用Hind III和EcoR I以及步骤（1）提取的质粒配置双酶切体系（表1），在37℃恒温水浴下酶切1小时；
（3）酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后的电泳条带。
表1 双酶切体系
结果如图2所示，pAAV2-FGF-21-Luciferase经双酶切，电泳后在凝胶成像系统下可见两条带，一条为5900bp左右，一条为630bp左右（图2中泳道2所示），分别符合pAAV2质粒片段、FGF-21片段大小，表示pAAV2-FGF-21-Luciferase经酶切鉴定正确；质粒pAAV-ABD-FGF-21-Luciferase经双酶切，电泳后在凝胶成像系统下可见两条带，一条为5900bp左右，一条为760bp左右（图2中泳道5所示），分别符合pAAV2质粒载体片段、ABD-FGF-21-P2A片段大小，表示pAAV2-ABD-FGF-21-Luciferase经酶切鉴定正确。
实施例3重组质粒的测序检测
（1）根据pAAV2-luciferase质粒的启动子CMV序列和P2A序列进行引物设计，然后在苏州金唯智生物科技有限公司合成引物；其中前引物（F）序列为SEQ ID NO:2，后引物（R）序列为SEQ ID NO:3；
（2）由该公司利用合成的引物对实施例1中构建的两个重组质粒pAAV2-ABD-FGF-21-luciferase、pAAV2-FGF-21-luciferase进行目的片段的DNA测序；
（3）利用DNAMAN软件分别将测序结果与重组质粒中的预期DNA序列进行比对。
结果如图3所示，pAAV2-ABD-FGF-21-luciferase重组质粒中插入的ABD-FGF-21基因序列比对正确，pAAV2-FGF-21-luciferase重组质粒中插入的FGF-21基因序列比对正确，表明重组质粒中基因开放阅读框架对接无误。
实施例4重组腺相关病毒制备
将重组质粒pAAV2-ABD-FGF-21-Luciferase和重组质粒pAAV2-FGF-21-luciferase分别与Helper质粒和AAV2衣壳蛋白质粒共转染至HEK-293T细胞中，分别制备AAV病毒AAV2-ABD-FGF-21-luciferase和AAV2-FGF-21-luciferase，具体方法如下：
（1）将HEK-293T细胞贴壁传代于含10%胎牛血清的DMEM培养基，并在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养至细胞密度为80%细胞融合，收集细胞并计数；
（2）将步骤（1）中得到的HEK-293T细胞传代于10cm直径的细胞培养皿中（1×106个细胞/皿），于含10%胎牛血清的DMEM培养基，并在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养20小时至细胞密度为90％细胞融合。然后在质粒转染前4小时更换新鲜的DMEM培养基；
（3）分别取10μg的pAAV2-ABD-FGF-21-Luciferase，8μg的pHelper，8μg的pAAV2衣壳质粒用于包装重组AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase腺相关病毒；将pAAV2-ABD-FGF-21-Luciferase替换为pAAV2-FGF-21-Luciferase，用于包装重组AAV2-FGF-21-Luciferase腺相关病毒；将pAAV2-ABD-FGF-21-Luciferase替换pAAV2-Null-Luciferase，用于包装AAV2-Luciferase腺相关病毒；
（4）将步骤（3）中的三组质粒加入至500μL无血清DMEM培养基中，轻柔混匀后室温静置5分钟后得到A液；将13μL的Imafect转染试剂加入至500μL无血清DMEM培养基中，轻柔混匀后室温静置5分钟后得到B液；
（5）轻柔地将B液滴加入A液中静置数秒后轻柔混匀，混合液室温静置15分钟后逐滴加入步骤（2）得到的细胞培养皿中轻柔混匀，6小时后更换新鲜的细胞培养液；待细胞培养液变黄后进行换液处理并收集上清，转染后培养72小时使用600μL PBS将皿中贴壁细胞轻柔吹下并于-80℃冰箱中保存备用；
实施例5病毒提取及纯化
利用冻融法提取包装后的AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase、AAV2-FGF-21-Luciferase和pAAV2-Null-Luciferase病毒，然后利用碘克沙醇密度梯度离心法进行病毒的纯化，具体步骤如下：
（1）取实施例4得到的包装有病毒的HEK 293T细胞于-80℃和37℃温度之间反复冻融3次，且每冻融一次需将沉淀涡旋混匀，以便病毒更好的从细胞中释放；
（2）使用100U全能核酸酶将冻融3次的细胞37℃孵育2小时，然后后10000rpm离心10分钟收集上清；
（3）在10mL超高速离心管中由上而下轻柔加入15%(3mL)、25%(2mL)、40%(2mL)和60%(1mL)密度梯度碘克沙醇（表2），待各层稳定后在最上层缓慢加入步骤（2）得到的上清，40000rpm离心4小时；
（4）吸取目的病毒所在层(40％碘克沙醇)液体加入10000kDa的滤管中，使用PBS将滤管补满后3000rpm离心4分钟，进行多次重复离心过滤去除碘克沙醇，并浓缩目的病毒，于-80℃冰箱中保存备用。
表2不同浓度的碘克沙醇溶液配方
实施例6Western Blot检测目的蛋白表达
利用实施例5纯化后的病毒（AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase、AAV2-FGF-21-Luciferase和AAV2-Null-Luciferase）感染HEK-293T细胞，然后利用Western Blot检测目的蛋白的表达情况，具体方法如下：
（1）取20μL实施例5纯化后的病毒感染HEK-293T细胞，收集感染36小时后的HEK-293T细胞培养液，加入5μL蛋白制备缓冲液后于100℃沸水中煮样7分钟，迅速置于冰上冷却，获得样品，于20℃保存；
（2）取20μL PBS（磷酸盐缓冲液），进行HEK-293T细胞的感染（未经病毒感染的HEK-293T细胞），方法同步骤（1），得到样品，作为空白对照；
（3）分别将步骤（1）得到的蛋白样品经10％SDS-PAGE于 80V恒定电压条件下电泳，电泳结束后取出PAGE胶，以300mA恒定电流进行转印90分钟；
（4）将蛋白样品转膜后的PVDF膜放置于1×TBST配制的5％牛奶中室温摇床封闭1小时，待封闭完全后弃去牛奶并多次加入TBST室温摇床7分钟洗去残余牛奶；
（5）将PVDF膜放置于3％BSA配制的FGF-21抗体（1:1000）中，4℃摇床孵育过夜；孵育结束后使用TBST多次漂洗去除FGF-21抗体，然后将PVDF膜放置于3％BSA配制的羊抗小鼠IgG（1：2000）中室温摇床孵育1小时，加入TBST漂洗三次，ECL法显色后观察结果。
结果如图4所示，感染了AAV2-FGF-21-Luciferase的HEK-293T细胞培养液和转染了AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase的HEK-293T细胞培养液中均能检测到FGF-21蛋白条带，空白对照HEK-293T细胞培养液中未检测到FGF-21蛋白条带。
实施例7Western Blot检测衣壳蛋白的表达
利用Western Blot检测AAV2衣壳VP1、VP1和VP3衣壳蛋白的表达，方法、步骤同实施例1，仅将步骤（5）中的FGF-21抗体（1:1000）替换为anti-Capsid(衣壳蛋白)抗体（1:1000）。
结果如图5所示，腺相关病毒AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase、AAV2-FGF-21-Luciferase和AAV2-Null-Luciferase制备的蛋白样品均可见明显的AAV衣壳蛋白条带VP1、VP2和VP3。结果表明，本研究制备的质粒pAAV2-FGF-21-Luciferase和质粒pAAV2-ABD-FGF-21-Luciferase均可在HEK-293T细胞内组装成AAV2病毒。
实施例8构建T2DM小鼠模型
利用C57BL/6小鼠构建II型糖尿病小鼠模型T2DM，构建流程如图6，具体如下：
（1）取SPF级雄性6周龄C57BL/6小鼠30只，在经过认证的标准实验动物中心内，于12小时反向明暗循环（温度22±2°C，湿度60±5%）的环境中自由取食饲养，实验前进行1周适应性喂养；
（2）采用随机分组的方法将步骤（1）得到的30只小鼠分为5组，每组6只，分别为正常饲料组（Normal）、模型对照组（Model）、AAV2-Null组、AAV2-FGF-21-Luciferase组、AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组，其中：
模型对照组（Model）：喂食高脂肪饮食（HFD）准备小鼠胰岛素抵抗，
正常饲料组（Normal）：喂食正常饲料，
AAV2-Null组：喂食高脂肪饮食（HFD），
AAV2-FGF-21-Luciferase组：喂食高脂肪饮食（HFD），
AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组：喂食高脂肪饮食（HFD），
（3）将步骤（2）喂养8周后的小鼠饥饿12小时，然后在30分钟内腹腔注射新鲜制备的STZ（链脲佐菌素）缓冲液至模型对照组（Model）、AAV2-Null组、AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组中，正常饲料组（Normal）注射相同体积的柠檬酸钠溶液；其中注射用量为80mg/kg；
（4）72小时后使用葡萄糖分析仪测量小鼠空腹血糖（FBG）水平，当小鼠FBG超过11.1mmol/L时，即表明成功构建了T2DM小鼠模型，同时记录小鼠的体重（Body Weight）。
实施例9AAV2腺相关病毒的小鼠肝脏组织靶向性
（1）采用尾静脉注射的方式将1×1011vg的病毒（实施例5得到的）注射到实施例8构建的T2DM小鼠模型体内，根据病毒的种类分为AAV2-Null-Luciferase组、AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组，而正常饲料组（Normal）、模型对照组（Model）注射相同体积的PBS；
（2）7天后在每只小鼠腹腔注射荧光素酶底物Luciferin，Luciferin的注射量为1.5mg/10g，即20g的小鼠腹腔注射100μL（30mg/mL）Luciferin；
（2）Luciferin注射后10-35分钟内，使用小动物活体成像仪观察AAV2病毒在小鼠体内转导基因的表达及其分布。
结果如图7所示，与Normal组和Model组相比，AAV2-Null-Luciferase组、AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组均能够靶向肝脏组织，表明对AAV2质粒进行改造后并没有改变其对肝脏组织的嗜性，换言之AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase保持了原本对肝脏的组织嗜性。
实施例10FGF-21和ABD-FGF-21在肝脏中的分泌性过表达对T2DM小鼠的影响
（1）采用尾静脉注射的方式将1×1011vg的病毒（实施例5得到的）注射到实施例8构建的T2DM小鼠模型体内，根据病毒的种类分为AAV2-Null-Luciferase组、AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组，而正常饲料组（Normal）、模型对照组（Model）注射等体积100μL PBS；，每两天测量小鼠体重一次，每周测量血糖水平一次；
（2）喂养8周后处死小鼠，并收集组织和血液，制备组织标本后立即保存于-80℃；
（3）将血液中的血清分离，通过H&E染色检查肝肾和脂肪组织形态，通过ELISA法检测血清FGF-21表达水平。
结果如图8所示，与Normal组小鼠相比较，Model组和AAV2-Null对照组的小鼠平均体重在整个实验期间均显著下降（P<0.05），符合II型糖尿病小鼠症状。而AAV2-FGF-21-Luciferase组的小鼠平均体重在注射病毒后的第1-2周显著下降（P<0.01），在第2-5周有所缓解、在第5-7周又继续下降。AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组小鼠的平均体重在注射病毒后的第1周有下降趋势，但在第2-7周体重快速恢复，第7周恢复至与正常小鼠一致的水平（图8A和B）。与AAV2-FGF-21-Luciferase组相比较，AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase注射显著改善了II型糖尿病小鼠的体重减轻症状（P<0.01）。
在整个实验期间，首先与Normal组相比，Model组的小鼠空腹血糖水平显著升高（P<0.01），表明模型制备成功。其次与Model组相比，AAV2-Null组的小鼠空腹血糖水平无显著差别，表明尾静脉注射给予AAV2腺相关病毒对II型糖尿病小鼠血糖水平无显著影响。实验组结果表明，AAV2-FGF-21-Luciferase组小鼠的空腹血糖水平在1-5周显著降低（P<0.01），但于第5周开始升高，表明利用AAV2递送FGF-21能够显著降低II型糖尿病小鼠血糖水平，但其降糖效果随着时间延长而下降；而AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组的小鼠空腹血糖水平显著低于模型组（P<0.01）、且没有出现低血糖现象（图8C）。
在实验结束时，与Normal组相比，Model组的INS和HOMA-IR水平显著升高，而HOMA-IS水平显著下降（P<0.01）；与Model组相比，AAV2-Null组的INS、HOMA-IR和HOMA-IS水平无统计学差异，而AAV2-FGF-21组的INS和HOMA-IR水平相比降低，HOMA-IS水平相比升高（P<0.05）。AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组的INS和HOMA-IR水平显著降低，HOMA-IS水平显著升高（p<0.01）（图8D和F）。
上述结果表明，通过重组AAV2载体递送基因在肝脏中过表达FGF-21能降低T2DM小鼠的空腹血糖，但在第五周其降血糖效应减弱、空腹血糖水平开始升高；而给予ABD-FGF-21-Luciferase能够在小鼠肝脏长期持续地过表达ABD-FGF-21，在整个8周实验期间显著降低T2DM小鼠的空腹血糖、恢复其体重，并显著改善强基胰岛素抵抗和对胰岛素的敏感性。
实施例11
（1）采用尾静脉注射的方式将1×1011vg的病毒（实施例5得到的）注射到实施例8构建的T2DM小鼠模型体内，根据病毒的种类分为AAV2-Null-Luciferase组、AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组，而正常饲料组（Normal）、模型对照组（Model）注射等体积100μL PBS，以前述实施例8的条件饲养；
（2）7周后在每只小鼠腹腔注射的葡萄糖溶液（浓度为20%），并在给药后的不同时间点测量血糖水平：0、15、30、60和120分钟检测各组小鼠的葡萄糖耐量（GTT测定），其中葡萄糖的注射量为1g/kg，并利用酶免Elisa试剂盒按照说明书测量糖化血清蛋白；
（3）7周后，处死小鼠收集血液，然后将血液中的血清分离，并利用Elisa试剂盒检测血清中循环FGF-21水平。
结果如图9所示，各组小鼠在腹腔注射葡萄糖后，各组小鼠空腹血糖均升高，在15分钟时血糖值达到最高峰值，其中Model组、AAV2-Null组血糖水平显著高于Normal组，并持续至注射葡萄糖后120分钟。而AAV2-FGF-21-Luciferase组的小鼠血糖水平相比较Model组降低（P<0.05）；AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组的小鼠血糖水平相对于Model组显著下降（P<0.01）（图9A）。
将测得的血糖数据使用prism程序运用AUC=7.5*（G0+2G15+G30）+15*(G30+2G60+2G90+G120)公式进行分析，计算出各组葡萄糖曲线下面积（AUC），可见Model组、AAV2-Null组小鼠血糖AUC显著高于Normal组（P<0.01），而AAV2-FGF-21-Luciferase组的小鼠血糖AUC相对于Model组有所降低（P<0.05），与AAV2-FGF-21-Luciferase组相比，AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组的小鼠血糖AUC显著下降（图9B）。
与Model组相比，AAV2-Null组和AAV2-FGF-21-Luciferase组小鼠的平均GSP水平无显著变化；但AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组小鼠的平均GSP水平相对于Model组、AAV2-Null组和AAV2-FGF-21-Luciferase组均呈显著下降（P<0.01）（图9C）。
ELISA检测结果显示，AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组小鼠的平均血清FGF-21水平显著高于AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-Null组，表明ABD-FGF-21融合蛋白显著提高了FGF-21的血清水平（图9D）。
上述结果表明，AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase腺相关病毒能够显著提高II型糖尿病小鼠的血清FGF-21水平，降低其糖化血红蛋白水平，改善糖耐量、降低空腹血糖。并且，AAV2-ABD-FGF2-Luciferase腺相关病毒的上述效果优于AAV2-FGF-21-Luciferase腺相关病毒，表明AAV2介导的肝脏ABD-FGF-21表达在II型糖尿病小鼠体内具有更好的降血糖效应。
实施例12
（1）采用尾静脉注射的方式将1×1011vg的病毒（实施例5得到的）注射到实施例8构建的T2DM小鼠模型体内，根据病毒的种类分为AAV2-Null-Luciferase组、AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组，而正常饲料组（Normal）、模型对照组（Model）注射等体积100μL PBS，以前述实施例8的条件饲养；
（2）7周后处死小鼠收集血液，然后将血液中的血清分离，并利用Elisa试剂盒检测各组小鼠血清中TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）、LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）和HDL-C（高密度脂蛋白胆固醇）的含量。
结果如图10所示，与Normal组相比，Model组小鼠血清中TC，TG和LDL-C含量均显著升高（P＜0.01），HDL-C 含量显著降低（P＜0.01）；与Model组相比，AAV2-Null组小鼠的TC、TG、LDL-C和HDL-C含量几乎无变化；而AAV2-FGF-21-Luciferase组小鼠的TC，TG和LDL-C含量有所降低（P<0.05），HDL-C 含量有所升高（P<0.05）；AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组小鼠的TC，TG和LDL-C含量显著下降（P<0.01），HDL-C含量显著升高（P＜0.01）（如图10）。
上述结果表明，在肝脏中过表达FGF-21能降低T2DM小鼠的TC，TG和LDL-C含量，升高HDL-C含量，改善小鼠血脂水平。重组AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase腺相关病毒注射的上述效果优于重组AAV2-FGF-21-Luciferase腺相关病毒注射，表明重组AAV2介导的肝脏ABD-FGF-21表达在II型糖尿病小鼠体内具有更好的降血脂效应。
实施例13
（1）采用尾静脉注射的方式将1×1011vg的病毒（实施例5得到的）注射到实施例8构建的T2DM小鼠模型体内，根据病毒的种类分为AAV2-Null-Luciferase组、AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组，而正常饲料组（Normal）、模型对照组（Model）注射等体积100μL PBS，以前述实施例8的条件饲养；
（2）7周后记录小鼠的体重，然后处死、取出肝脏，观察肝脏的形态并记录重量，然后制成切片，HE染色后观察肝脏内部的病理变化以及肝细胞的形态；
（3）处死过程中收集血液，分离得到血清，检测血清AST和ALT活性。
Normal组小鼠肝脏呈红褐色、质地柔软、表面光滑细腻；而Model组与AAV2-Null组小鼠的肝脏组织形态几乎无差别，体积增大，颜色较浅，有颗粒感，包膜紧张，较不柔软；AAV2-FGF-21-Luciferase组小鼠的肝脏稍大，部分颜色较浅，少有颗粒感；AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组小鼠的肝脏体积大小正常，颜色与Normal组小鼠相似且质地柔软（图11A）。
与Normal组相比，Model组小鼠的肝脏指数、血清AST和ALT活性显著升高；与Model组相比，AAV2-Null组小鼠的肝脏指数、血清AST和ALT活性几乎无变化；而AAV2-FGF-21-Luciferase组小鼠的肝脏指数、血清AST和ALT活性有所降低（P<0.05）；与AAV2-Null组和Model组相比，AAV2-ABD-FGF-21组小鼠的肝脏指数、血清AST和ALT活性均显著下降（P<0.01）（图11B-D）。
H&E染色结果显示，Normal组小鼠肝小叶结构良好，肝细胞形态规则，排列良好，无肝细胞脂肪变性或坏死；而Model组与AAV2-Null组小鼠的肝小叶结构紊乱，肝细胞形态不规则、肿胀明显、具有脂肪变性，多发炎细胞浸润；与Model组相比，AAV2-FGF-21-Luciferase组小鼠的肝细胞结构相对清晰有序，肝细胞脂肪变性得到改善、炎症细胞浸润减少；且AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组小鼠的效果优于AAV2-FGF-21组小鼠（图11E）。
上述结果表明，AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase腺相关病毒能够逆转II型糖尿病小鼠的肝细胞脂肪变性，其效果优于AAV2-FGF-21-Luciferase腺相关病毒。
实施例14
（1）采用尾静脉注射的方式将1×1011vg的病毒（实施例5得到的）注射到小鼠体内，根据病毒的种类分为AAV2-Null-Luciferase组、AAV2-FGF-21-Luciferase组和AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组，而正常饲料组（Normal）、模型对照组（Model）注射等体积100ulPBS，以前述实施例8的条件饲养；
（2）7周后处死、分别取出小鼠腹股沟白色脂肪组织（WAT）和肩胛区棕色脂肪组织（BAT）制备免疫切片，然后通过苏木精-伊红(H&E)染色，观察小鼠白色脂肪组织形态和棕色脂肪组织形态。
结果如图12所示，无论是WAT还是BAT，与Normal组小鼠相比，Model组小鼠的脂肪细胞增大；AAV2-Null组小鼠的脂肪形态与Model组相似；而AAV2-FGF-21-Luciferase组小鼠的脂肪细胞肥大得到改善，脂肪细胞的大小重新分布，小脂肪细胞的比例更大；且AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase组小鼠脂肪细胞肥大的改善效果优于AAV2-FGF-21-Luciferase组小鼠。
上述结果表明，给予AAV2-ABD-FGF-21-Luciferase腺相关病毒能够抑制II型糖尿病小鼠脂肪堆积，其效果优于AAV2-FGF-21-Luciferase腺相关病毒。

Claims (7)

1. 一种FGF-21融合基因，其特征在于：所述FGF-21基因的5`端连接有ABD基因，序列为SEQ ID NO:1。
2.如权利要求1所述的一种FGF-21融合基因，在制备治疗II型糖尿病药物上的应用。
3.一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒，其特征在于：包括腺相关病毒衣壳和如权利要求1所述的FGF-21融合基因。
4.根据权利要求3所述的一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒，其特征在于：所述腺相关病毒衣壳为AAV2、AAV5或AAV8。
5.根据权利要求3所述的一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒，其特征在于：所述AAV重组病毒还包括Flag序列，P2A序列和Luciferase。
6. 根据权利要求3所述的一种提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒，其特征在于：AAV重组病毒中的启动子为CMV promoter。
7.如权利要求3-6任一项所述的提高FGF-21持续表达水平和稳定性的AAV重组病毒，在制备治疗II型糖尿病药物上的应用。
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