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CN115044615A - 一种靶向感染乳腺癌细胞的aav载体及应用 - Google Patents

一种靶向感染乳腺癌细胞的aav载体及应用 Download PDF

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CN115044615A CN202210461802.7A CN202210461802A CN115044615A CN 115044615 A CN115044615 A CN 115044615A CN 202210461802 A CN202210461802 A CN 202210461802A CN 115044615 A CN115044615 A CN 115044615A
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breast cancer
aav
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CN202210461802.7A
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吕亚丰
曹春雨
张�浩
黄文峰
黄晓飞
吴红艳
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China Three Gorges University CTGU
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Abstract

本发明公开了靶向乳腺癌细胞的嵌合AAV2衣壳、靶向感染乳腺癌细胞的AAV2载体构建方法、使用所述载体靶向乳腺癌细胞的方法以及携带自杀基因治疗乳腺癌的方法。本发明通过基因工程技术将EC1蛋白插入到AAV2衣壳表面以及突变VP1蛋白R585、R588位点，获得一种AAV病毒载体（AAV2M‑EC1），与野生型AAV2相比，AAV2M‑EC1具有靶向乳腺癌细胞的特性，且大大减少对肝脏、肌肉组织的感染能力。以AAV2M‑EC1为载体，携带自杀基因HSV‑TK，尾静脉注射移植瘤小鼠后，可显著抑制小鼠乳腺癌细胞的增殖。

Description

一种靶向感染乳腺癌细胞的AAV载体及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向感染乳腺癌细胞的AAV病毒及其应用。
背景技术
乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤，是女性最常见的恶性肿瘤之一。研究报道，每年中乳国乳腺癌新发病数量和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％，并且有逐年增高的趋势。由于乳腺癌病理学分型复杂，导致其治疗针对性差和反应差异大。随着对乳腺癌认识的不断深入，以及当前个性化医疗理念的发展，乳腺癌的治疗进入了综合治疗时代，形成了乳腺癌局部治疗与全身治疗并重的治疗模式。目前，临床上根据肿瘤分期，常综合采用手术切除、放化疗、内分泌治疗、生物靶向治疗及中医药辅助治疗等多种手段。目前，化疗药物的毒副作用及肿瘤耐药性的产生是临床亟待解决的问题。肿瘤靶向治疗是近年来的抗肿瘤研究热点，与化疗相比分子靶向治疗在靶向性和毒副作用方面具有明显优势，因此开发一种可靶向乳腺癌细胞的药物递送载体对于乳腺癌的治疗具有重要的临床意义。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)作为基因递送的载体，具有安全性好、免疫原性低、表达稳定等优点，在基因治疗中得到广泛应用。近年来，AAV介导的肿瘤基因治疗备受关注，AAV已成功用于传递和转导各种肿瘤治疗基因(自杀基因、抗血管生成基因、免疫相关基因等)以抑制肿瘤发生、发展和转移。如何消除AAV2原有的组织嗜性(脱靶效应)并赋予新的靶向能力是开发靶向乳腺癌载体的关键。由于AAV的衣壳蛋白决定AAV组织细胞特异性，因此对AAV衣壳蛋白的修饰和改造可以提高AAV的靶向性。上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecuLes，EpCAM)是一种I型跨膜糖蛋白，主要参与细胞增殖、分化、迁移和肿瘤细胞免疫逃逸等多种生理活动。有研究报道，在原发性乳腺癌组织中EpCAM的表达比正常组织高100余倍，因此EpCAM可作为乳腺癌的潜在靶向分子，可以将其引入AAV病毒载体中增强AAV病毒的靶向性。
发明内容
本发明的目的是提供一种可靶向感染乳腺癌细胞的新型AAV病毒载体，其主要是通过一种新的AAV病毒载体的包装方法实现的，具体步骤如下：
(1)以AAV2衣壳质粒pRC为模板，通过突变VP1蛋白T138位点为A获得表达VP1及VP3的pRVP1/3质粒，衣壳pRVP1/3DNA序列为SEQ ID NO：1；
(2)以AAV2衣壳质粒pRC为模板，通过对pRC质粒的VP2蛋白M1和M203位点进行定点突变，获得质粒pVP2，该质粒提供衣壳蛋白VP2，其DNA序列为SEQ ID NO：2；
(3)将步骤(1)得到的质粒pRVP1/3，步骤(2)得到的质粒pVP2，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统；
(4)将步骤(3)得到的包装系统，包装AAV病毒。
步骤(1)中质粒RVP1/3为PCR模板，将衣壳蛋白VP1第585位点精氨酸突变为丙氨酸，第588位点的精氨酸突变为丙氨酸，获得pRVP1/3M质粒，衣壳pRVP1/3M质粒DNA序列为SEQ ID NO：3。
将pRVP1/3M质粒、步骤(2)得到的质粒pVP2，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统，并包装成AAV病毒。
步骤(2)中在pVP2质粒基础上，将EC1蛋白序列插入VP2蛋白氨基端，获得pVP2-EC1质粒。
步骤(2)所述的EC1蛋白序列由Nikolas Stefan等人通过噬菌体展示技术筛选得到，DNA序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
将pRVP1/3M质粒或者pRVP1/3质粒，pVP2-EC1质粒，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统，并包装成AAV病毒。
步骤(3)所述的质粒pAAV为pAAV-eGFP，pAAV-Luciferase、pAAV-TK表达质粒中的任意一种。
作为优选方案，以10cm皿为例，本发明包装得到的病毒包括如下：
8μg pVP2、8μg pRVP1/3、10μg pHelper和6μg pAAV-luciferase用于包装AAV2-LUC病毒，
8μg pVP2、8μg pRVP1/3、10μg pHelper和6μg pAAV-TK用于包装AAV2-TK病毒，
8μg pVP2、8μg pRVP1/3M、10μg pHelper和6μg pAAV-luciferase用于包装AAV2M-LUC病毒，
8μg pVP2-EC1、8μg pRVP1/3M、10μg pHelper和6μg pAAV-luciferase用于包装AAV2M-EC1-LUC病毒，
8μg pVP2-EC1、8μg pRVP1/3M、10μg pHelper和6μg pAAV-TK用于包装AAV2M-EC1-TK病毒。
对包装后的AAV病毒载体进行离心纯化，然后采用Western Blotting检测AAV病毒衣壳中三种成分：VP1，VP2，VP3的表达情况，从而评估AAV病毒的改造情况。
本发明将所述得到的AAV病毒载体在制备靶向治疗乳腺癌的药物上的应用。
所述的AAV病毒载体携带自杀基因HSV-TK在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物上的应用。所述的乳腺癌细胞为4T1乳腺癌细胞。
通过靶向感染小鼠移植瘤实验评估AAV2-LUC，AAV2M-LUC以及AAV2M-EC1-LUC病毒载体在小鼠组织器官中的分布情况，其方法是为通过小鼠尾静脉注射携带luciferase的AAV病毒，小动物活体成像检测AAV病毒在小鼠体内的分布情况；取小鼠的各个脏器进行成像检测AAV病毒的分布情况。
本发明还提供一种基于AAV病毒载体的包装方法获得的AAV2-EC1病毒的应用，其技术方案为构建pAAV-TK质粒替换pAAV-luciferase质粒，然后进行病毒包装，将获得病毒通过静脉注射的方式注射到荷瘤小鼠内，通过检测荷瘤小鼠的体重、肿瘤体积、小鼠成活率评价AAV2M-EC1-TK对小鼠乳腺癌细胞的靶向效果。
有益效果
本发明通过将pRC质粒改造成为pRVP1/3和pVP2质粒，将获得的两类质粒与pAAV质粒、pHelper质粒构建成四质粒包装系统，通过四质粒包装系统成功包装AAV2病毒。
此外通过将pRVP1/3进一步突变得到pRVP1/3M质粒，在pVP2中插入EC1序列得到pVP2-EC1质粒，然后将获得两种质粒与pAAV质粒、pHelper质粒构建四质粒包装系统，通过该系统对AAV进行包装，获得了AAV2M-EC1病毒载体。野生型AAV2病毒载体和改造后的AAV2M-EC1病毒载体相比，AAV2-EC1病毒载体具有靶向乳腺癌细胞的特性，感染效率高、感染能力强，并且对肝脏、肌肉组织的感染能力大大降低，在制备治疗乳腺癌药物上具有广阔的前景。
附图说明
图1为AAV2衣壳蛋白改造示意图及质粒酶切鉴定图，其中A为改造示意图，B为酶切鉴定图,其中M：DNA Marker；1：pR-EC1-VP2质粒；2：pR-EC1-VP2质粒经内切酶Nco I和EcoRV酶切产物；3：pR-VP2质粒；4：pR-VP2质粒经内切酶Nco I和EcoR V酶切产物；5：pR-VP1,3质粒；6：pR-VP1,3质粒经内切酶Nco I和EcoR V酶切产物。
图2为Western blot检测AAV病毒衣壳蛋白VP1，VP2，VP3。
图3为AAV2M-EC1病毒靶向感染4T1移植瘤的活体成像图。
图4为AAV2M-EC1病毒感染4T1移植瘤小鼠后主要组织器官成像图。
图5为小鼠各组织器官中luciferase酶活性图。
图6为pAAV-TK质粒酶切鉴定图，经EcoR1+Hind111双酶切。
图7为AAV2M-EC1-TK基因治疗乳腺癌实验动物流程图。
图8为AAV2M-EC1-TK基因治疗乳腺癌后小鼠体重生长曲线。
图9为AAV2M-EC1-TK基因治疗乳腺癌后小鼠生存期曲线。
图10为AAV2M-EC1-TK基因治疗乳腺癌后小鼠肿瘤体积变化曲线图。
图11为AAV2M-EC1-TK基因治疗乳腺癌后肿瘤离体直观图。
图12为AAV2M-EC1-TK基因治疗乳腺癌后小鼠肿瘤质量统计图。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1构建pRVP1/3质粒
(1)设计突变引物
根据AAV2衣壳的DNA序列，在VP2起始密码子处设计突变引物，使VP1的第138氨基酸位点的苏氨酸T突变为丙氨酸A，并将设计的引物序列送至金唯智生物技术有限公司合成。
T138-F：GAGGAACCTGTTAAGACCCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGT
T138-R：ACCGGCCTCTTTTTTCCCGGAGGGTCTTAACAGGTTCCTC
(2)PCR定点突变T138位点
以AAV2衣壳质粒pRC(由北京协和医学院张业教授惠赠)为模板，采用购买于TAKARA公司的Prime STAR@HS DNA Polymerase，结合步骤(1)所得的引物，进行PCR扩增，PCR反应体系见表1，反应程序见表2：
表1 PCR反应体系
Figure BDA0003622399820000041
表2 PCR反应程序
Figure BDA0003622399820000042
Figure BDA0003622399820000051
PCR反应结束后将PCR产物采用DpnⅠ酶切2小时，消化模板质粒，取5μL消化产物转入DH5α大肠杆菌感受态细胞中(购买于北京全式金生物技术有限公司)，并涂布于含有100mg/mL氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃恒温培养过夜，得到突变后的质粒pRVP1/3的阳性菌落。
(3)质粒提取及鉴定
将步骤(3)得到的阳性菌落接种于含有100mg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床过夜培养。过夜培养的菌液4000rpm离心5min后收集沉淀，利用购买于天根生物技术有限公司的无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，通过限制性内切酶Nde I和Xba I(购买于Takara公司)进行双酶切(表3)检测，同时采用DNA测序(金唯智生物技术有限公司)进行鉴定，结果见图1B，双酶切后出现了1000bp和6200bp两条带，说明pRVP1/3质粒构建成功。
表3双酶切检测体系
Figure BDA0003622399820000052
实施例2构建pVP2质粒
步骤方法同实施例1，仅改变了定点突变引物，突变位点以及质粒。
将VP2蛋白的第1及第203氨基酸位点的蛋氨酸定点突变为丙氨酸，突变引物为：
M1-F：AATGATTTAAATCAGGTCTGGCTGCCGATGGTTAT
M1-R：ATAACCATCGGCAGCCAGACCTGATTTAAATCATT
M203-F：GTCTGGGAACTAATACGCTGGCTACAGGCAGTGGC
M203-R：GCCACTGCCTGTAGCCAGCGTATTAGTTCCCAGAC
结果见附图1B，双酶切后出现了1000bp和6200bp两条带，通过DNA测序鉴定第1位及第203氨基酸位点的蛋氨酸定点突变为丙氨酸，说明pVP2质粒构建成功。
实施例3构建pVP2-EC1质粒
(1)设计同源重组引物：
AAV2-F：CATAGGTTCCTCAACCAGCTT
AAV2-R：GCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGPCR
(2)PCR扩增质粒pVP2：
以实施例2所得的pVP2质粒为模板，采用步骤(1)设计的引物进行PCR扩增，获得线性化的pVP2质粒，PCR扩增体系同实施例1。
(3)合成EC1序列及其引物
EC1的DNA序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ ID NO:2，并根据EC1的序列设计引物，EC1序列及引物序列均由金唯智生物技术有限公司合成：
EC1-F：GTTAAGCTGGTTGAGGAA
EC1-R：TACCGGCCTCTTTTTTCC
并采用PCR技术扩增得到EC1基因，反应体系及程序同实施例1。
(4)PCR产物纯化及重组
将步骤(2)和步骤(3)所得的PCR产物进行凝胶电泳分离，然后将含有目的条带的胶块切下，利用DNA胶试剂盒(购买于天根生化科技有限公司)分别进行回收，将回收的产物pVP2和EC1按照摩尔比为1:3的比例混合，进行同源同组，同源重组试剂盒购买于北京全式金生物技术有限公司，反应体系如下：
Figure BDA0003622399820000061
轻轻混匀上述反应体系，将其置于50℃反应15min。反应结束后，将离心管置于冰上冷却数秒，之后重组产物用于转化扩增。
取5μL上述重组产物加入到DH5α感受态细胞(购买于北京全式金生物技术有限公司)中，轻柔混匀后冰上放置15min，42℃热激60s后迅速置于冰上2min，加入400μL常温LB培养液，37℃摇床培养1h，取100μL细胞均匀的涂在平板上，37℃摇床培养过夜，挑取阳性克隆，提取质粒后进行测序及双酶切验证，结果见图1B，双酶切后出现了1000bp和6600bp两条带，说明成功构建pVP2-EC1质粒。
实施例4构建pRVP1/3M衣壳表达质粒
方法步骤同实施例1，仅将模板改为实施例1所得的质粒pRVP1/3，并通过设计引物将衣壳蛋白VP1第585和第588氨基酸位点的精氨酸R突变为丙氨酸A，引物序列为：
M-F：TCTGTATCTACCAACCTCCAGGCAGGCAACGCACAAGCAGCTACCGCAGATGTC
M-R：GACATCTGCGGTAGCTGCTTGTGCGTTGCCTGCCTGGAGGTTGGTAGATACAGA；
PCR定点突变结束后对质粒进行DNA测序鉴定，成功构建R585和R588位点突变的pRVP1/3M质粒。
实施例5重组腺相关病毒的包装与纯化
(1)将HEK293T细胞采用胎牛血清(购买于Biological Industries)浓度为10％的DMEM培养基(购买于Thermo Fisher Scientific)培养，并在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养到对数生长期，收集细胞并计数。在10cm直径的细胞培养皿中接种，接种量为4×106个细胞，继续培养20h至细胞密度为80～90％；病毒包装前4h需更换新鲜的细胞培养液。
(2)病毒包装
8μg pVP2、8μg pRVP1/3、10μg pHelper和6μg pAAV-luciferase用于包装AAV2-LUC病毒，
8μg pVP2、8μg pRVP1/3M、10μg pHelper和6μg pAAV-luciferase用于包装AAV2M-LUC病毒，
8μg pVP2-EC1、8μg pRVP1/3M、10μg pHelper和6μg pAAV-luciferase用于包装AAV2M-EC1-LUC病毒，
其中pVP2为实施例2制备所得，pRVP1/3为实施例1制备所得，pVP2-EC1为实施例3制备所得，pRVP1/3M为实施例4制备所得，pHelper购买于addgene网站，pAAV-luciferase由北京协和医学院张业教授惠赠。
将以上质粒加入500μL无血清DMEM培养基(A液)轻柔混匀后静置5min；
(3)将13μL的转染试剂Imafect(购买于北京码因科技有限公司)加入500μL无血清DMEM培养基(B液)轻柔混匀后静置5min。轻柔地将B液滴加入A液中静置数秒后轻柔混匀，混合液静置15min。
(4)将混合液逐滴加入细胞培养皿中轻柔混匀，6h后更换新鲜的细胞培养液；待细胞培养液变黄后进行换液处理并收集上清，转染后培养72h使用600μL PBS(称取8.0gNaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L，高压灭菌后4℃保存)将皿中贴壁细胞轻柔吹下并于-80℃冰箱中保存备用。
(5)取出步骤(2)得到的包装的AAV病毒于-80℃和37℃温度之间反复冻融3次，且每冻融一次需将沉淀涡旋混匀，以便病毒更好的从细胞中释放；
(6)使用100U全能核酸酶(购买于上海翌圣生物科技股份有限公司)将冻融3次的细胞37℃孵育2h后10000rpm离心10min收集上清；
(7)在10mL超高速离心管中由上而下轻柔加入15％(3mL)、25％(2mL)、40％(2mL)和60％(1mL)密度梯度碘克沙醇(表4)，待各层稳定后在最上层缓慢加入步骤(6)所得上清，40000rpm离心4h；
(8)目的病毒存在于40％的碘克沙醇所在位置，吸取目的病毒所在层(40％碘克沙醇)液体加入10000kDa的滤管中，使用PBS将滤管补满后3000rpm离心4min，进行多次重复离心过滤去除碘克沙醇，并浓缩目的病毒；浓缩的病毒-80℃冰箱保存备用。
表4不同浓度的碘克沙醇溶液配方
Figure BDA0003622399820000081
其中60％碘克沙醇原液购买于Stem cell公司；
10×PBS-MK：10×100mLPBS溶液+0.2g MgCl2·6H2O+0.19g KCl，溶解；
0.5％酚红：称取酚红粉末0.1g于20mL 50％乙醇中，加热溶解。
实施例6 Western Blotting检测蛋白表达AAV病毒
(1)取20μL实施例5所得的病毒，加入5μL蛋白制备缓冲液(购买Thermo FisherScientific公司)后于100℃沸水中煮样7min，迅速置于冰上，获得AAV病毒样品，样品于-20℃保存；
(2)取20μL步骤(1)所得的AAV样品经10％SDS-PAGE 80V恒定电压电泳，电泳结束后取出PAGE胶，以300mA恒定电流转膜90min；
(3)将蛋白样品转膜后的PVDF膜(购买于默克密理博公司)放置于1×TBST(2.42gTris-base，8.80g NaCl溶于900mL ddH2O中，加入500μL吐温-20，调节pH至7.40，定容于1000mL)配制的5％牛奶中室温摇床封闭1h，待封闭完全后弃去牛奶并多次加入TBST室温摇床7min洗去残余牛奶；
(4)将PVDF膜放置于3％BSA配制的anti-CAP抗体(1:1000)(购买于AmericanResearch Products公司)中，4℃摇床孵育过夜；第二天使用TBST多次漂洗去除一抗，将PVDF膜放置于3％BSA配制的抗鼠IgG(1:2000)(购买于proteintech公司)中室温摇床孵育1h，加入TBST漂洗三次，ECL法显色后观察结果。
结果见图2，与未改造的AAV一样，改造后的AAV2-EC1病毒可见明显的衣壳蛋白条带，但是由于实验设计中在VP2中插入了EC1蛋白，因此VP2-EC1蛋白所在的位置发生改变，位于VP1上方，该结果充分说明本发明成功将EC1序列插入到VP2，且插入EC1序列的VP2与VP1、VP3一起可在细胞内组装成AAV病毒。
实施例9
(1)皮下荷瘤前一天将4T1细胞进行传代处理，保留原皿1/2细胞数；
(2)第二天待细胞融合度为80％左右时使用胰酶消化贴壁细胞，加入含有血清的DMEM细胞培养液终止消化，800rpm离心3min，弃去上清并加入PBS充分重悬为单个细胞；
(3)使用细胞计数板进行细胞计数，将细胞按照每只小鼠背部皮下接种2.5×105个细胞数，总体积为75μL，进行荷瘤，负荷瘤结束后将小鼠放回鼠笼中正常饲养一周左右；
(4)将已荷瘤的模型小鼠进行肿瘤体积大小测量，待肿瘤直径约3mm左右时进行肿瘤局部皮肤脱毛处理；
(5)采用随机分组的方法将18只小鼠分为3组，分别为AAV2-LUC组、AAV2M-LUC组和AAV2M-EC1-LUC组，每组小鼠各6只；
(6)采用尾静脉注射的方式将1×1011vg的病毒注射到荷瘤小鼠体内，7d后在每只小鼠腹腔注射荧光素酶底物Luciferin，Luciferin的注射量为1.5mg/10g，即20g的小鼠腹腔注射100μL 30mg/mL Luciferase酶底物工作液，Luciferase酶底物工作液购买于上海翌圣生物科技股份有限公司；
(7)荧光素酶底物注射后10-12min时间段内，使用动物活体成像仪观察AAV病毒在小鼠体内的分布，结果见图4，AAV2-LUC组小鼠荧光主要分布于肝脏；AAV2M-LUC组小鼠荧光主要分布于背部肌肉，肝脏荧光信号明显减弱；AAV2M-EC1-LUC组小鼠荧光信号主要分布于肿瘤部位，该结果说明，本发明设计的AAV2M-EC1病毒对乳腺癌的靶向性得到了显著增强，AAV2M-EC1病毒在小鼠体内可以很好的靶向乳腺癌细胞；
(8)在得到个体的小动物活体成像结果后，立即对小鼠进行解剖，将个体的脏器组织进行活体成像。底物注射至成像结束时间不超过25min。小鼠各主要组织器官成像结果见图5，结果显示，AAV2-LUC组小鼠荧光主要分布于肝脏；AAV2M-LUC组小鼠荧光在肿瘤以及肌肉组织中有少量富集；AAV2M-EC1-LUC组小鼠荧光信号主要分布于肿瘤部位，其他组织器官几乎不能检测到荧光信号，该结果说明，本发明设计的AAV2M-EC1病毒对乳腺癌的感染能力最强，AAV2M-EC1病毒在小鼠体内可以很好的靶向乳腺癌细胞；
(9)成像结束后，取重量约为100mg组织，把各组织放到盛有1mL PBS的EP管中清洗，3000rpm离心3min，沉淀加入到装有400μL RIPA裂解液(购买于北京索莱宝科技有限公司)的匀浆管中，并放入6颗陶瓷小珠子，放入电动匀浆器进行匀浆：10s匀浆，10s歇息，共3次。若匀浆3次后仍然存在大块的组织，可以继续进行1-2轮匀浆，把匀浆后的混悬液放置在冰上孵育10min，振荡器混匀，共三次。12000rpm，离心10min得到上清液；
(10)将步骤(9)得到的上清转移到新的EP管中，然后将小鼠组织总蛋白的浓度调整到一致，为25μg/μL，共20μL，并加入到测定管中配置新鲜的荧光素酶底物工作液：将Luciferin底物稀释50倍混合在检测缓冲液中，避光保存；在暗室中，打开荧光检测仪。分别向每一管测定管中加入50μL底物反应液，迅速混匀，10s后上机进行检测得到各组织器官中Luciferase的酶活性值。结果见附图6，结果显示：AAV2-LUC在肿瘤、肝脏和肌肉组织中均有分布，但主要分布于肝脏组织中；AAV2M-LUC由于病毒衣壳蛋白中R585及R588位点的突变，病毒对小鼠各个组织的感染能力均减弱；而AAV2M-EC1-LUC由于EC1蛋白的插入，其主要感染肿瘤细胞，对肝脏和肌肉组织的感染能力显著低于其他两种病毒，因此AAV2M-EC1-LUC病毒对乳腺癌细胞的靶向性最好。
实施例10构建pAAV-TK质粒
TK编码序列由金唯智生物公司合成并直接构建到pAAV载体，5′末端酶切位点为EcoR1，3′末端酶切位点为Hind111。pAAV-TK质粒经EcoR1+Hind111酶切后，用1％的琼脂糖凝胶电泳分离，可见1200bp与5000bp两个限制性片段(图6)，结果与预期一致。酶切鉴定为阳性的重组质粒经DNA测序，证实质粒中插入序列正确，阅读框架对接无误。
实施例11含有自杀基因TK的AAV病毒的包装
步骤、方法同实施例5，仅改变了进行包装的质粒，其中pVP2为实施例2制备得到的，pVP2-EC1为实施例3制备得到的，pRVP1/3为实施例1制备得到的，pRVP1/3M为实施例4制备得到的，pAAV-TK为实施例10制备得到的：
pVP2、pRVP1/3、pHelper和pAAV-TK用于包装AAV2-TK病毒；
pVP2、pRVP1/3M、pHelper和pAAV-TK用于包装AAV2M-TK病毒；
pVP2-EC1、pRVP1/3M、pHelper和pAAV-TK用于包装AAV2M-EC1-TK病毒。
实施例12 AAV病毒在小鼠体内介导自杀基因TK治疗肿瘤
(1)将已荷瘤的模型小鼠进行肿瘤体积大小测量，待肿瘤大小约3mm左右时进行肿瘤局部皮肤脱毛处理；
(2)采用随机分组的方法将18只小鼠分为3组，分别为AAV2-TK组、AAV2M-TK组和AAV2M-EC1-TK组，每组小鼠各6只。
(3)采用尾静脉注射的方式将1×1011vg的病毒注射到荷瘤小鼠体内，48h后每只小鼠腹腔注射100mg/kg的更昔洛韦GCV(购买于selleck公司)，实验设计见图7；
(4)第一次注射GCV后的12d内，每隔24h进行一次腹腔注射100mg/kg的GCV；且记录小鼠体重，小鼠体重变化见图8，结果显示，总体来说AAV2-TK组、AAV2M-TK组和AAV2M-EC1-TK组小鼠体重无明显差异。定期记录小鼠肿瘤长径a和短径b，并依据公式V＝ab2/2计算肿瘤体积。结果见图10，AAV2-TK组、AAV2M-TK组小鼠肿瘤体积随着时间的推移逐渐增加，AAV2M-EC1-TK组下属肿瘤体积明显小于以上两组，说明AAV2M-EC1-TK注射后很好的抑制的乳腺癌细胞的增值。
根据图9小鼠生存曲线显示，AAV2-TK组在注射病毒后的第6天出现了小鼠死亡现象、AAV2M-TK组在注射后第5天和第6天均出现了小鼠死亡现象，这可能是由于AAV2-TK和AAV2M-TK病毒靶向肿瘤的能力较弱，病毒进入小鼠体内后主要感染其主要脏器组织，产生了脱靶效应，因此造成自杀基因对正常细胞的杀伤，从而出现死亡；而AAV2M-EC1-TK组小鼠始终未出现死亡的现象，该实验进一步说明AAV2M-EC1-TK病毒对乳腺癌细胞的靶向性较强，对小鼠的损伤更轻。
在连续GCV腹腔注射给药10天后，AAV2M-EC1-TK组小鼠肿瘤增殖出现明显的抑制，在GCV注射的第12d手术剥离各组小鼠肿瘤，进行测量及称重，结果见图10、图11及图12，AAV2-TK组肿瘤直径10-12mm，AAV2M-TK组肿瘤直径10-12mm，AAV2M-EC1-TK组中的小鼠肿瘤直径更小，平均直径5-7mm；AAV2-TK组肿瘤质量0.5g，AAV2M-TK组肿瘤质量0.3g，AAV2M-EC1-TK组中的小鼠肿瘤肿瘤质量约0.15g，具有统计学差异，说明注射AAV2M-EC1-TK后，小鼠乳腺癌细胞的增殖得到了明显的抑制。
序列表
<110>三峡大学
<120>一种靶向感染乳腺癌细胞的AAV载体及应用
<160>总数目6
<210>1
<211>2208
<212>DNA
<213>人工序列
<223>VP1/3 DNA
<400>SEQ ID NO：1
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGGCGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
<210>2
<211>2208
<212>DNA
<213>人工序列
<223>pVP2
<400>SEQ ID NO：2
CTGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGCTGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
<210>3
<211>2207
<212>DNA
<213>人工序列
<223>VP1/3M
<400>SEQ ID NO：3
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGGCGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGGCAGGCAACGCACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
<210>4
<211>2745
<212>DNA
<213>人工序列
<223>VP2-EC1
<400>SEQ ID NO：4
ATGGACCTGGGCAAGAAGCTGCTGGAGGCCGCTAGAGCCGGCCAAGACGACGAGGTGAGAATCCTGGTGGCCAACGGCGCCGACGTCAACGCCTACTTCGGTACCACACCGCTACACCTTGCGGCTGCTCACGGCAGACTTGAGATAGTGGAAGTTCTGTTGAAGAATGGAGCTGACGTCAACGCGCAAGACGTGTGGGGCATCACGCCCCTGCACTTAGCCGCATACAATGGACACCTGGAGATCGTGGAAGTCCTGCTGAAGTATGGAGCCGACGTAAACGCACACGACACAAGAGGCTGGACTCCCCTGCACCTGGCCGCCATCAACGGCCACCTGGAAATAGTTGAGGTGCTGCTCAAGAATGTAGCCGACGTAAATGCGCAAGACAGAAGCGGCAAGACCCCCTTCGACCTGGCCATCGACAACGGCAACGAGGACATCGCCGAGGTGCTGCAGAAGGCCGCCAAGCTGAACGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGATCCCTGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGCTGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA
<210>5
<211>537
<212>DNA
<213>人工序列
<223>EC1
<400>SEQ ID NO：5
ATGGACCTGGGCAAGAAGCTGCTGGAGGCCGCTAGAGCCGGCCAAGACGACGAGGTGAGAATCCTGGTGGCCAACGGCGCCGACGTCAACGCCTACTTCGGTACCACACCGCTACACCTTGCGGCTGCTCACGGCAGACTTGAGATAGTGGAAGTTCTGTTGAAGAATGGAGCTGACGTCAACGCGCAAGACGTGTGGGGCATCACGCCCCTGCACTTAGCCGCATACAATGGACACCTGGAGATCGTGGAAGTCCTGCTGAAGTATGGAGCCGACGTAAACGCACACGACACAAGAGGCTGGACTCCCCTGCACCTGGCCGCCATCAACGGCCACCTGGAAATAGTTGAGGTGCTGCTCAAGAATGTAGCCGACGTAAATGCGCAAGACAGAAGCGGCAAGACCCCCTTCGACCTGGCCATCGACAACGGCAACGAGGACATCGCCGAGGTGCTGCAGAAGGCCGCCAAGCTGAACGGCGGCGGCGGCAGC GGCGGCGGCGGATCC GGCGGCGGCGGATCCGGCGGCGGCGGATCC
<210>6
<211>179
<212>氨基酸序列
<213>人工序列
<223>EC1
<400>SEQ ID NO：6
MDLGKKLLEAARAGQDDEVRILVANGADVNAYFGTTPLHLAAAHGRLEIVEVLLKNGADVNAQDVWGITPLHLAAYNGHLEIVEVLLKYGADVNAHDTRGWTPLHLAAINGHLEIVEVLLKNVADVNAQDRSGKTPFDLAIDNGNEDIAEVLQKAAKLNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

Claims (10)

1.一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）以AAV2衣壳质粒pRC为模板，通过突变VP1蛋白T138位点为A获得表达VP1及VP3的pRVP1/3质粒，衣壳VP1/3 DNA序列为SEQ ID NO：1；
（2）以AAV2衣壳质粒pRC为模板，通过对pRC质粒的VP2蛋白M1和M203位点进行定点突变，获得质粒pVP2，该质粒提供衣壳蛋白VP2，其DNA序列为SEQ ID NO：2；
（3）将步骤（1）得到的质粒pRVP1/3，步骤（2）得到的质粒pVP2，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统；
（4）将步骤（3）得到的包装系统，包装AAV病毒。
2. 根据权利要求1所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，步骤（1）中质粒RVP1/3为PCR模板，将衣壳蛋白VP1第585位点精氨酸突变为丙氨酸，第588位点的精氨酸突变为丙氨酸，获得pRVP1/3M质粒，衣壳VP1/3M DNA序列为SEQ ID NO：3。
3.根据权利要求2所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，将pRVP1/3M质粒、步骤（2）得到的质粒pVP2，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统，并包装成AAV病毒。
4. 根据权利要求3所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，步骤（2）中在pVP2质粒基础上，将EC1蛋白序列插入VP2蛋白氨基端，获得pVP2-EC1质粒，VP2-EC1 DNA序列为SEQ ID NO:4。
5. 根据权利要求4所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，步骤（2）所述的EC1的 DNA序列为SEQ ID NO:5，氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
6.根据权利要求5所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，将pRVP1/3M质粒或者pRVP1/3质粒，pVP2-EC1质粒，pHelper，pAAV组合，构建AAV四质粒包装系统，并包装成AAV病毒。
7.根据权利要求6所述的一种AAV病毒载体的包装方法，其特征在于，步骤（3）所述的质粒pAAV为pAAV-Luciferase、pAAV-TK表达质粒中的任意一种。
8.根据权利要求1-7任一项AAV病毒载体的包装方法制备的AAV病毒载体在制备靶向治疗乳腺癌的药物上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的AAV病毒载体携带自杀基因HSV-TK在制备抑制乳腺癌细胞增殖的药物上的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的乳腺癌细胞为4T1乳腺癌细胞。
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