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CN118344426A - 五环三萜类异硫氰酸酯衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

五环三萜类异硫氰酸酯衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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CN118344426A
CN118344426A CN202410406041.4A CN202410406041A CN118344426A CN 118344426 A CN118344426 A CN 118344426A CN 202410406041 A CN202410406041 A CN 202410406041A CN 118344426 A CN118344426 A CN 118344426A
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CN
China
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pentacyclic triterpene
compound
isothiocyanate derivative
isothiocyanate
mmol
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Application number
CN202410406041.4A
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俞飞
张继虹
杜晓天
王若亚
张宇豪
张岚清
刘薇
徐期振
李天刚
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Kunming University of Science and Technology
Original Assignee
Kunming University of Science and Technology
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract

本发明公开了一类五环三萜类异硫氰酸酯衍生物及其制备方法，以及将其用于靶向恢复或降解突变P53蛋白以达到治疗癌症目的的应用，所述五环三萜类异硫氰酸酯衍生物如下：式中：R1选自n＝1‑3、(n＝1‑2)；R2为

Description

五环三萜类异硫氰酸酯衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一类五环三萜类异硫氰酸酯衍生物及其制备和应用，属于药物化学领域。
背景技术
P53蛋白是人体内十分重要的肿瘤抑制因子，其功能的丧失往往是癌症发生的先决条件。突变后的P53不仅会丧失原本的抑癌活性，还可以通过调节癌细胞代谢，促进癌细胞的侵袭与转移等方式促进肿瘤的发生。P53蛋白的突变发生在超过50％的人类癌症中，是人类癌症中最常见的突变基因，因此，针对突变P53蛋白开发新型抗癌药物也是一个极具吸引力的研究热点。虽然长期以来，人们都认为P53蛋白是一个不可成药的靶点，但目前已有证据表明一些化合物可以通过恢复突变P53蛋白野生型构象，降解突变型P53蛋白，靶向P53蛋白下游通路等多种途径，实现对肿瘤的有效治疗。然而遗憾的是。目前为止仍没有一款相关药物上市。
异硫氰酸酯(isothiocyanates)是一类含有R-N＝C＝S结构的化合物，主要来源于十字花科植物及其近缘植物白花菜科中。研究表明异硫氰酸酯具有高度的生物活性，如杀菌、抑制血小板聚集以及抗氧化等作用，同时其也是十字花科蔬菜最主要的抗肿瘤活胜成分。已有多种异硫氰酸酯衍生物如PEITC、BITC以及金刚烷基ITC被报道具有选择性地耗尽人类癌细胞中的突变P53蛋白活性，并且PEITC已进入临床试验。这些化合物的结构通式均为高亲脂性基团连接异硫氰酸酯，通过PEITC与金刚烷基ITC消耗突变P53蛋白和诱导凋亡的结构-活性关系(SARs)研究表明，增加亲脂性基团是其增强效力的关键结构特征之一。
五环三萜是由六个异戊二烯单元连接而成的五个闭合环为母体的三萜类化合物，是一类重要的天然化合物，依据苷元的不同，五环三萜类化合物主要分为齐墩果烷型、乌苏烷型、羽扇烷型、木栓烷型四种类型；其在自然界分布极广，具有广泛的药理作用和重要的生物活性。五环三萜类化合物可通过阻遏细胞周期，诱导细胞凋亡，抗新生血管形成，抗肿瘤侵袭和转移作用等多种途径抑制癌症的发生，研究表明，与传统的抗癌药相比，五环三萜类化合物在有效治疗范围内几乎不存在不良反应，为癌症治疗带来了曙光。
发明内容
本发明提供了一类五环三萜类异硫氰酸酯衍生物，它们能够有效杀死癌细胞；本发明化合物能够用于靶向降解突变P53蛋白或恢复突变P53野生型构象，从而达到杀灭癌细胞治愈癌症的目的，但不仅局限于此机制。
本发明五环三萜类异硫氰酸酯衍生物结构式如下式所示：
式中：R1选自R2为本发明化合物具体结构式如下：
本发明五环三萜类异硫氰酸酯衍生物还包括五环三萜类异硫氰酸酯衍生物药学上可接受的盐。
本发明另一目的是提供上述五环三萜类异硫氰酸酯衍生物的制备方法，具体是：
(1)将1mmol五环三萜化合物溶于四氢呋喃溶剂中，依次加入1.2～1.5mmol 2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、1.5～2mmol二异丙基乙胺，反应获得五环三萜类活泼酯中间体；
(2)将步骤(1)产物与1.2～1.5mmol不同长度的Boc单保护的烷基或烷氧二胺链共同溶于四氢呋喃溶剂中，搅拌下加入1.5mol的三乙胺，常温反应过夜；
(3)将步骤(2)产物脱除Boc后溶于无水乙醇溶剂中，再加入10mmol二硫化碳、1mmol三乙胺，室温搅拌1h后，将反应体系冷却至0℃，再加入1mmol二碳酸二叔丁酯、1.2mmol的二甲氨基吡啶，室温下继续搅拌反应2-3h后，获得五环三萜类异硫氰酸酯衍生物。
所述溶剂选自四氢呋喃、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、水、二氧六环。
本发明另一目的是将上述五环三萜类异硫氰酸酯衍生物应用在制备预防或/和治疗癌症药物中。
本发明化合物可以以纯净化合物或化合物的混合物的形式给药，或者优选在药物赋形剂，稀释剂或载体中给药。可以通过任何适当的途径来施用活性剂进行治疗。适当的施用途径可以包括口服，直肠，鼻，气雾或颗粒吸入剂，局部(包括含化和舌下)，经皮，阴道，膀胱内，伤口内和胃肠外(包括皮下，肌内，静脉内，胸骨内，膜内，硬膜外和真皮内)。
本发明也涉及药物组合物，包含本发明化合物，或其药学可接受的盐，与一种或多种药学可接受的添加剂和任选的其他药物一起。药学可接受的添加剂可以是载体、稀释剂、佐剂和(或)赋形剂的形式，可以包括所有常规的溶剂、分散剂、填充剂、固体载体、包衣剂、抗真菌或抗菌剂、皮渗透剂、表面活性剂等张剂和吸收剂和缓释或控释基质。活性剂可以以同时，分开或连续施用活性剂的组分的试剂盒的形式；在与组合物的其他成分相容和患者生理耐受的意义上，每种载体，稀释剂，佐剂和/或赋形剂必须是“药学可接受的”。该组合物可以方便地以单元剂型的形式存在，可以通过制药领域公知的方法来制备；这些方法包括将活性成分与载体相混合的步骤，其中载体是由一种或多种助剂组成的；一般地，制备该组合物，包括将活性成分与液体载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂或精细分离的固体载体或两者均匀和直接地混合，然后必要时使产物成型。
适合口服的本发明的组合物可以是以每个都包含预定量的活性成分的分离单元例如胶囊、囊剂或片剂的形式存在；作为粉末或颗粒；作为水相或非水液体中的溶液或混悬液；或者作为水包油性液体乳剂或油包水性乳剂。活性成分也可以以大丸剂、药糖剂或糊剂的形式存在。可以通过任选与一种或多种助剂压片或成模来制备片剂；可以通过在适当的机器中压制自由流动形式例如粉末或颗粒的活性成分来制备压制片，任选与粘合剂(例如惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、淀粉羟乙酸钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂混合。可以通过在适当的机器中用惰性液体稀释剂湿润的粉末状化合物形成的混合物使其成型来制备模印片；任选可以将片剂包衣或刻痕，可以通过配制来缓释或控释活性成分，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素来产生所需的释放性质；片剂任选可以具有肠溶衣，以在肠部位而不是胃中释放。
适合胃肠外施用的组合物包括水性和非水性等无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和使组合物与所预期的患者的血液等张的溶质；和水性和非水性无菌混悬液，其可以包括助悬剂和增稠剂。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器例如安瓿和管中，可以贮存在冷冻-干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前加入无菌液体载体例如注射用水。可以由上述种类的无菌粉末，颗粒和片剂来制备无准备的注射溶液和混悬液。
适合局部施用于皮肤，即经皮施用的组合物可以包含溶解或悬浮在任何适当的载体或基质中的活性剂，可以是洗剂、凝胶、乳膏、糊剂、软膏等等的形式。适当的载体可以包括液状石蜡、丙二醇、蜡、聚氧乙烯和长链醇。也可以使用经皮装置例如贴剂，可以包含适当材料例如硝酸/乙酸纤维素、丙烯和聚碳酸酯制成的微孔膜。贴剂也可以包含适当的皮肤粘附性和基底材料。
本发明的活性化合物也可以以植入物的形式存在，其可以包含药物的聚合性装置，其中聚合物是生物相容性的和无毒性的。适当的聚合物可以包括水凝胶、硅酮、聚乙烯和生物可降解的聚合物。
本发明的化合物可以以持续(即控释)或缓释的形式施用。持续释放制剂是将其施用后活性成分在患者体内缓慢释放并在最小的时间里维持所需的药物浓度的制剂。持续释放制剂的制备是本领域技术人员公知的。剂型可以包括口服形式、植入物和经皮形式。对于缓释施用，活性成分可以作为例如缓释颗粒悬浮或在脂质体内。
依据选择的化合物的特定活性，患者状况以及要处理的病症选择本发明化合物适合的剂量范围。本领域技术人员可以根据其普通知识和在本领域的经验适合的剂量范围。例如对于肿瘤，人类适合的剂量范围可以为每人每天1-500mg，例如10-300mg，通常为30-150mg。
本发明的优点和技术效果如下：
1、本发明将五环三萜类化合物与异硫氰酸酯连接起来，既保留了降解突变P53蛋白或恢复突变P53野生型构象的活性，又增加了整体化合物的脂溶性使其较易穿过细胞膜，从而实现抑制肿瘤增值的目的；
2、本发明中的五环三萜类异硫氰酸酯的合成方法简单，产率高且稳定；
3、本发明中的化合物企图通过降解突变P53蛋白或重新将突变P53的构象恢复成野生型构象以达到治愈癌症的目的，P53蛋白的突变发生在超过50％的人类癌症中，是人类癌症中最常见的突变基因，因此我们的化合物为广谱抗肿瘤抑制剂的研究提供了依据。
附图说明
图1为W2-35以及W2-2在具有突变型P53的肿瘤细胞、具有野生型P53的肿瘤细胞、P53缺失的肿瘤细胞以及正常结肠上皮细胞中IC50汇总结果；
图2为化合物W2-35分别处理MDA-MB-231、TOV112D、SK-BR-3以及HCT116 WTP53细胞的蛋白质免疫印迹结果；
图3为化合物W2-2分别处理MDA-MB-231、TOV112D、SK-BR-3以及HCT116 WTP53细胞的蛋白质免疫印迹结果。
具体实施方式
下面通过实例实施对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。
实施例1：五环三萜类异硫氰酸酯衍生物的制备
1、化合物1的制备
化合物1的合成方法如下，其余化合物2、3、4制备方法相同，不同在于原料为不同的五环三萜类化合物：
在50mL圆底烧瓶中加入1mmol齐墩果酸(OA)，加入15mL THF使其完全溶解，加入1.2mmol 2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)充分搅拌后，在白色悬浊液中滴加1.5mmol二异丙基乙胺(DIEA)0.8mL，常温反应12小时，过滤去除沉淀，将所得滤液减压旋蒸去除溶剂，得到的固体通过色谱柱分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)，得到白色固体，收率95％；
2、化合物1与不同长度的Boc单保护的烷基或烷氧二胺链相连
化合物5-12系列的合成方法如下，以化合物5系列中，n＝1的化合物为例：
在100mL圆底烧瓶中加入1mmol的化合物1，加入20mL的四氢呋喃使其完全溶解，加入1.5mol的三乙胺充分搅拌后，加入1.2mol的叔丁氧羰基1，2-乙二胺，常温反应12小时，减压去除溶剂，用乙酸乙酯与水萃取三次除去三乙胺，收集有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝1:2)，得白色固体产物，产率92％；
化合物5系列中n＝1-3，化合物6系列中n＝1-3，化合物7系列中n＝1-3，化合物8系列中n＝1-3，化合物9系列中n＝1-2，化合物10系列中n＝1-2，化合物11系列中n＝1-2，化合物12系列中n＝1-2；
3、五环三萜类异硫氰酸酯衍生物的合成
以化合物W2-2为例，制备工艺如下，其余化合物OA3CNCS、OA4CNCS、OA4C1ONCS、OA6C2ONCS、UA2CNCS、UA3CNCS、UA4CNCS、UA4C1ONCS、UA6C2ONCS、W2-35、BA3CNCS、BA4CNCS、BA4C1ONCS、BA6C2ONCS、GA2CNCS、GA3CNCS、GA4CNCS、GA4C1ONCS、GA6C2ONCS的合成相同，化合物具体结构见结构式表；
在100mL圆底烧瓶中加入1mmol的化合物5系列中n＝1的化合物，加入5mL三氟乙酸，室温搅拌2h后TLC检测反应是否完成，茚三酮显色剂显色，反应完全后，将溶剂蒸干，加入20mL的无水乙醇使其完全溶解，加入10mmol的二硫化碳、1mmol的三乙胺，室温下充分搅拌1小时后将反应体系冷却到0℃，继续加入1mmol的二碳酸二叔丁酯、1.2mmol的二甲氨基吡啶，常温下搅拌反应3小时，减压去除溶剂，用乙酸乙酯与水萃取三次除去三乙胺，收集有机相用无水硫酸钠干燥、浓缩、硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯＝2:1)，得白色固体产物，产率92％；
化合物W2-2：1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.74,0.76,0.87,0.90,0.91,0.96,1.15(7×CH3),0.67-1.80(m),2.56(d,J＝9.84Hz,1H),3.18-3.25(m,2H),3.52(dt,J＝14.34,4.56Hz),3.63-3.68(m,1H),3.70-3.74(m,2H),5.44(s,1H),6.32(t,J＝5.64,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.4,15.6,16.9,18.3,23.6,23.7,23.8,25.8,27.1,27.3,28.1,30.7,32.3,32.5,33.0,34.1,37.0,38.4,38.8,39.3,39.6,42.0,45.1,46.5,46.6,48.0,55.1,78.9,123.4,132.7,144.5,179.0.
化合物OA3CNCS：1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.76,0.79,0.91,0.93,0.99,1.17,1.25(7×CH3),0.73-2.01(m),2.52(d,J＝13.02Hz,1H),3.09(td,J＝12.78Hz,6.72Hz,1H),3.22(dd,J＝4.08Hz,11.22Hz,1H),3.47-3.53(m,1H),3.57(t,J＝6.54Hz,2H),5.42(s,1H),6.11(t,J＝5.64Hz,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.4,15.6,16.9,18.3,23.5,23.6,23.8,25.8,27.1,27.3,28.1,29.9,30.7,32.3,32.6,32.9,34.1,36.8,36.9,38.4,38.7,39.3,42.0,42.2,43.1,46.4,46.7,47.5,55.0,78.9,123.0,132.7,144.9,178.9.
化合物OA4CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.70,0.72,0.85,0.86,0.93,1.11,1.20(7×CH3),0.67-1.93(m),2.46(d,J＝10.56,1H),2.95-3.00(m,1H),3.15(d,J＝10.38Hz,1H),3.32-3.38(m,1H),3.51(t,J＝6.24Hz,2H),5.35(s,1H),5.98(t,J＝5.28Hz,1H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ15.4,15.6,16.9,18.2,23.5,23.6,23.7,25.7,26.7,27.1,27.2,27.5,28.1,30.7,32.3,32.5,32.9,34.1,36.9,38.4,38.7,39.3,41.9,42.1,44.7,46.2,46.7,47.5,55.0,78.7,122.9,129,9,144.8,178.5.
化合物UA2CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.78,0.87,0.88,0.93,0.95,0.98,1.10(7×CH3),0.71-2.02(m),3.21(dd,J＝4.62Hz,11.52Hz,1H),3.24-3.30(m,1H),3.51-3.56(m,1H),3.59-3.78(m,1H),5.34(s,1H),6.29(t,J＝5.76Hz,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.6,15.7,17.0,17.4,18.4,21.4,23.4,23.6,25.0,27.3,27.9,28.2,30.9,32.8,37.1,37.3,38.8,38.9,39.1,39.6,39.7,40.0,42.6,45.3,47.6,48.1,53.7,55.2,79.1,123.5,126.4,139.6,178.9.
化合物UA3CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.76,0.79,0.91,0.92,0.99,1.17,1.25(7×CH3),0.73-2.01(m),2.51(d,J＝9.78Hz,1H),3.07-3.12(s,1H),3.22(dd,J＝4.08Hz,11.22Hz,1H),3.47-3.53(m,1H),3.57(t,J＝6.54Hz,2H),5.42(s,1H),6.11(t,J＝5.64Hz,1H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ15.4,15.6,16.9,18.2,23.5,23.6,23.8,25.8,27.1,27.3,28.1,29.9,30.7,32.3,32.6,32.9,34.1,36.8,36.9,38.4,38.8,39.3,42.0,42.2,43.1,46.4,46.7,47.5,55.1,78.9,123.0,139.6,144.9,178.9.
化合物UA4CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.78,0.79,0.88,0.93,0.96,0.99,1.10(7×CH3),0.72-1.98(m),2.99-3.04(m,1H),3.22(dd,J＝4.38Hz,11.28Hz,1H),3.38-3.43(m,1H),3.56(t,J＝6.36Hz,2H),5.34(s,1H),5.98(t,J＝5.4Hz,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.5,15.6,16.9,17.2,18.2,21.2,23.2,23.4,24.9,26.7,27.1,27.5,27.8,28.1,30.8,32.6,36.9,37.2,38.4,38.6,38.7,39.0,39.5,39.8,42.5,44.7,47.5,47.7,53.8,55.0,78.9,125.7,129.9,139.9,178.5.
化合物W2-35:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.70,0.77,0.88,0.91,0.92,1.33,1.63(7×CH3),0.62-1.98(m),2.38(t,J＝3.18Hz,1H),3.01-3.06(m,1H),3.12-3.14(m,1H),3.35(s,1H),3.50-3.70(m,3H),4.54(s,1H),4.68(s,1H),6.28(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ14.7,15.5,16.1,16.2,18.3,19.5,21.0,25.6,27.4,28.0,29.5,30.8,33.6,34.4,37.2,37.8,38.3,38.7,38.9,39.7,40.8,42.5,45.0,46.8,50.1,50.6,55.4,55.8,78.9,109.5,132.1,150.7,177.1.
化合物BA3CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.75,0.81,0.92,0.96,0.97,1.26,1.68(7×CH3),0.62-1.94(m),2.41(t,J＝8.28Hz,1H),3.11(td,J＝11.1Hz,4.38Hz,1H),3.18(dd,J＝4.62Hz,11.46Hz,1H),3.27-3.33(m,1H),3.38-3.44(m,1H),3.59(q,J＝6.42Hz,2H),4.59(s,1H),4.73(s,1H),5.88(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ14.7,15.4,16.1,16.2,18.3,19.5,20.9,25.6,27.4,27.9,29.5,30.2,30.9,33.7,34.4,36.7,37.2,37.8,38.4,38.7,38.9,40.7,42.5,43.1,46.7,50.1,50.6,55.3,55.7,78.9,109.5,130.5,150.8,176.7.
化合物BA4CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.73,0.79,0.91,0.94,0.95,1.24,1.67(7×CH3),0.65-1.93(m),2.41(t,J＝11.58Hz,1H),3.08-3.23(m,3H),3.31-3.37(m,1H),3.56(t,J＝6.42Hz,2H),4.57(s,1H),4.72(s,1H),5.70(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ14.7,15.5,16.2,16.3,18.3,19.6,20.9,25.7,27.3,27.4,27.5,28.1,29.6,30.9,33.8,24.4,37.3,37.8,38.1,38.5,38.8,38.9,40.8,42.5,44.7,46.8,50.1,50.7,55.4,55.7,78.9,109.5,129.9,150.9,176.5.
化合物GA2CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.81,0.84,1.01,1.13,1.18,1.25,1.38(7×CH3),0.71-1.93(m),2.17(d,J＝13.3 2Hz,1H),2.34(s,1H),2.63(s,1H),2.78(d,J＝13.56Hz,1H),3.23(dd,J＝5.22Hz,10.86Hz,1H),3.46-3,52(m,1H),3.54-3.59(m,1H),3.65-3.75(m,1H),5.69(s,1H),6.05(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.7,16.5,17.6,18.8,23.5,26.4,26.5,27.4,28.2,28.7,29.7,29.8,31.6,32.0,32.8,37.2,37.6,39.3,39.9,41.1,41.7,43.3,43.9,45.1,45.5,48.1,55.0,61.9,78.9,128.8,169.1,176.6,200.3.
化合物GA3CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.79,0.81,0.99,1.12,1.13,1.24,1.36(7×CH3),0.67-2.04(m),2.11(d,J＝11.34Hz,1H),2.33(s,1H),2.78(d,J＝13.5Hz,1H),3.22(dd,J＝5.22Hz,10.96Hz,1H),3.38(q,J＝6.42Hz,2H),3.58(t,J＝6.42Hz,2H),5.64(s,1H),5.94(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.7,16.5,17.6,18.8,23.5,26.4,26.5,27.4,28.2,28.7,29.7,29.8,31.6,31.8,32.0,32.8,37.2,37.6,39.3,39.9,41.1,41.7,43.3,43.9,45.1,45.5,48.1,55.0,61.9,78.9,128.8,169.1,176.6,200.3.
化合物GA4CNCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.80,0.81,1.00,1.12,1.13,1.25,1.37(7×CH3),0.80-2.05(m),2.13(d,J＝8.64Hz,1H),2.33(s,1H),2.79(d,J＝13.5Hz,1H),3.23(dd,J＝5.28Hz,10.98Hz,1H),3.32(q,J＝6.78Hz,2H),3.56(t,J＝6.24Hz,2H),5.64(s,1H),13CNMR(150MHz,CDCl3):δ14.3,15.7,16.5,18.8,22.8,23.5,26.5,26.6,27.3,27.4,27.5,28.2,28.7,29.5,29.8(2C),32.1,32.9,37.2,27.6,38.5,39.3,41.9,43.3,43.8,44.8,45.5,48.3,55.0,61.9,78.9,128.7,169.3,176.1,200.3.
化合物OA4C1ONCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.77,0.78,0.91,0.92,0.93,0.99,1.17(7×CH3),0.72-2.00(m),2.59(d,J＝10.38Hz,1H),3.21-3.23(m,1H),3.28-3.32(m,1H),3.55-3.56(m,4H),3.66-3.68(m,4H),5.44(s,1H),6.35(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.6,15.7,16.9,17.2,18.3,21.3,23.3,23.4,24.8,27.2,27.8,28.1,30.9,32.7,26.9,17.1,38.6,38.8,38.9,39.2,39.5,39.8,42.4,45.3,47.5,47.8,53.5,55.1,69.1,69.9,78.9,125.7,133.2,139.5,178.4.
化合物OA6C2ONCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.68,0.81,0.89,1.07,1.46(7×CH3),0.64-1.91(m),2.46(d,J＝12.3Hz,1H),3.11(s,1H),3,25(s,1H),3.44(s,1H),3.54(s,2H),3.61(s,6H),5.29(s,1H),6.29(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ14.1,15.3,15.6,16.7,18.1,23.4,23.5,25.6,26.9,27.1,28.0,30.6,32.2,32.3,32.9,33.9,36.8,38.3,38.6,38.9,39.2,41.8,41.9,45.1,46.1,47.3,54.9,69.1,69.6,70.1,70.5,78.5,122.6,132.4,144.4,178.0.
化合物UA4C1ONCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.78,0.88,0.89,0.93,0.95,0.99,1.10(7×CH3),0.71-2.01(m),3.21-3.28(m,2H),3.54-3.55(m,3H),3.65-3.69(m,4H),5.36(s,1H),6.35(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.4,15.7,16.9,17.2,18.3,21.3,23.3,23.4,24.8,27.0,27.8,28.1,30.9,32.7,26.9,17.1,38.3,38.8,38.9,39.2,39.5,39.7,42.4,45.3,47.5,47.8,53.5,54.1,69.1,69.9,78.9,125.7,132.2,138.5,178.9.
化合物UA6C2ONCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.76,0.77,0.89,0.90,0.94,0.97,1.08(7×CH3),0.69-1.98(m),3.21(dd,J＝4.38Hz,11.28Hz,1H),3.28-3.34(m,1H),3.46-3.54(m,3H),3.61-3.70(m,8H),5.30(s,1H),6.30(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.6,15.7,17.0,17.4,18.3,21.4,23.3,23.5,24.9,27.2,27.9,28.2,30.9,32.8,34.2,36.9,37.2,38.7,38.8,39.1,39.6,39.8,42.5,45.4,47.6,47.8,53.8,55.1,69.4,69.8,70.3,70.8,79.0,125.8,132.8,139.6,178.2.
化合物BA4C1ONCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.75,0.81,0.93,0.96,0.97,1.26,1.68(7×CH3),0.67-2.05(m),2.44(t,J＝12.9Hz,1H),3.13(td,J＝11.1Hz,4.38Hz,1H),3.18(dd,J＝4.62Hz,11.4Hz,1H),3.41-3.45(m,1H),3.50-3.57(m,3H),3.66(s,4H),4.59(s,1H),4.73(s,1H),6.11(t,J＝5.46Hz,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ14.7,15.4,16.2,16.3,18,3,19.5,20.9,25.6,27.4,27.9,29.4,29.7,30.9,33.7,34.4,37.2,37.7,38.7,38.8,38.9,40.7,42.5,45.4,46.8,50.1,55.3,55.7,68.9,70.0,70.3,109.4,133.9,151.1,176.5.
化合物BA6C2ONCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.73,0.79,0.91,0.94,0.95,1.24,1.66(7×CH3),0.65-1.97(m),2.40(t,J＝12.94Hz,1H),3.08-3.17(m,2H),3.37-3.41(m,1H),3.46-3.55(m,3H),3.61-3.67(m,8H),4.56(s,1H),4.71(s,1H),6.06(t,J＝5.52Hz,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ14.7,15.5,16.2,18.4,19.5,20.9,25.7,27.5,28.1,29.5,30.9,33.7,34.5,37.2,37.8,38.4,38.8,38.9,38.9,40.8,42.5,45.3,46.9,50.1,50.6,55.4,55.7,60.5,69.3,70.2,70.3,70.8,78.9,109.4,132.7,151.1,176.3.
化合物GA4C1ONCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.81,0.82,1.01,1.13,1.14,1.16,1.39(7×CH3),0.69-2.14(m),2.76(d,J＝13.56Hz,1H),3.22-3.25(m,1H),3.42-3.47(m,1H),3.59-3.73(m,6H),3.79-3.83(m,1H),5.66(s,1H),6.20(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ14.2,15.6,16.4,17.5,18.7,23.3,26.4,26.5,27.3,28.1,28.6,29.5,31.4,31.9,32.7,37.0,37.4,39.1,39.2,39.3,42.0,43.2,43.7,45.45,45.5,48.4,54.9,61.8,69.0,70.1,78.7,128.3,169.3,175.9,200.3.
化合物GA6C2ONCS:1H NMR(600MHz CDCl3):δ0.79,0.80,0.99,1.10,1.11,1.12,1.37(7×CH3),0.68-2.16(m),2.33(s,1H),2.76(d,J＝13.5Hz,1H),3.22(dd,J＝5.04Hz,11.04Hz,1H),3.40-3.45(m,1H),3.57(s,3H),3.65-3.70(m,8H),5.65(s,1H),6.15(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ15.7,16.5,17.6,18.8,23.5,26.5,26.6,27.4,28.2,29.6,31.5,31.9,32.8,37.1,37.6,39.2,39.3,41.9,43.3,43.7,45.3,45.5,48.2,54.9,60.5,61.9,69.2,70.3,70.4,70.7,78.8,128.4,132.4,169.5,175.9,200.3.
实施例2：本发明五环三萜类异硫氰酸酯衍生物作为突变P53蛋白拯救剂的生物活性评价
1、化合物抗肿瘤活性检测实验(MTT法)
如果化合物具有一定的抗肿瘤活性，将化合物按照不同浓度处理肿瘤细胞后细胞的增殖将被抑制，故采用MTT法在具有不同P53突变位点的肿瘤细胞(TOV112D、HT29、MDA-MB-231、SK-BR-3、HCT116p53 R175H、HUH-7、SW620)、表达野生型P53细胞(HCT116p53WT)中检测该系列化合物的抗肿瘤活性。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在用DMSO中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以此反映出活细胞数目，具体步骤如下：
(1)铺板：取生长旺盛的细胞制备单细胞悬液，并通过血球计数板计算细胞密度，根据细胞的接种量(铺96孔板时，一般为5000个/孔)及每孔的总体积，计算所需细胞悬液与新鲜培养基体积，然后，根据计算结果，配制细胞悬液，充分混匀后用300μL的排枪将细胞悬液铺至96孔板中(每孔的总体积为180μL)，轻振板身使细胞在孔中分布均匀之后放入培养箱用含有10％FBS的培养基培养至细胞贴壁；
(2)加化合物：粉末状化合物提前用DMSO溶解至20mM放置于-20℃，细胞贴壁之后。根据化合物的母液浓度以及想要检测的工作浓度，吸取相应体积的母液至新鲜培养基中，配得一系列浓度梯度的稀释液，充分混匀后，按每孔20μM的体积加入96孔板中，然后将细胞放入培养箱培养72小时；
(3)MTT检测：取出96孔板并于避光处加入MTT溶液(终浓度为5μg/mL)，细胞放回培养箱继续孵育4h；孵育完毕后，泵吸掉孔中液体并加入二甲基亚砜(加入量为150μL/孔)，在振板器充分振荡15min，使蓝紫色甲瓒晶体充分溶解，用酶联免疫检测仪测定波长490nm处的OD值；
(4)IC50计算：根据OD值绘制曲线，利用SPSS软件计算。
齐墩果酸异硫氰酸酯衍生物W2-2和白桦脂酸异硫氰酸酯衍生物W2-35在除了HUH-7细胞以外的其他具有不同P53突变体的肿瘤细胞中有较好的抗肿瘤活性，但未在具有突变型P53的肿瘤细胞、具有野生型P53的肿瘤细胞以及P53缺失的肿瘤细胞中表现出明显的选择性。W2-2对CDD841(人正常结肠上皮细胞)有一定的增殖抑制作用，但W2-35对该细胞的增殖抑制并不明显(图1)。为提高选择性改变链接所获得的BA3CNCS、BA4CNCS、BA1ONCS、OA3CNCS、OA4CNCS、OA1ONCS、OA2ONCS同样在除了HUH-7以外的其他具有不同P53突变体的肿瘤细胞中有较好的抗肿瘤活性，但依然未在不具有明显的选择性。BA2ONCS在表达野生型P53和表达突变型P53的细胞株中表现出一定的选择性，但在表达内源性突变P53的肿瘤细胞中其抗肿瘤活性并不稳定，在MDA-MB-231中具有抗肿瘤活性，但在HT29中活性较差，在同时具有P53 R175H的肿瘤细胞TOV112D以及SK-BR-3中，前者具有较好的活性(IC50＝8.91μM)后者活性较差(IC50＝17.29μM)(表1)；
表1：BA及OA衍生物抗肿瘤活性数据
熊果酸异硫氰酸酯衍生物UA2CNCS在具有内源性突变P53的肿瘤细胞中除HUH-7以外均具有较好的抗肿瘤活性，但在具有外源性突变P53 R175H的HCT116 P53R175H中抑制细胞增殖的效果(IC50＝13.25μM)，没有在表达内源性突变P53 R175H的细胞TOV11D(IC50＝5.618μM)以及SK-BR-3(IC50＝5.97μM)中的效果好；UA3CNCS、UA4CNCS、UA1ONCS同样在除了HUH-7以外的其他具有不同P53突变体的肿瘤细胞中有较好的抗肿瘤活性，但依然未在不具有明显的选择性。UA2ONCS在表达野生型P53和表达突变型P53的细胞株中表现出一定的选择性，但在表达内源性突变P53的肿瘤细胞中其抗肿瘤活性与BA2ONCS一样并不稳定，在MDA-MB-231细胞、TOV112D细胞以及SK-BR-3细胞中具有抗肿瘤活性，但在HT29中活性较差(表2)；
甘草次酸异硫氰酸酯衍生物GA2CNCS、GA3CNCS、GA4CNCS、GA1ONCS、GA2ONCS在所有检测细胞株中均未表现出较好的活性(表2)；
表2：GA及UA衍生物抗肿瘤活性数据

Claims (6)

1.结构式如下式所示的五环三萜类异硫氰酸酯衍生物：
式中：R1选自
R2为
2.根据权利要求1所述的五环三萜类异硫氰酸酯衍生物，其特征在于，具体结构式如下：
3.根据权利要求1所述的五环三萜类异硫氰酸酯衍生物，其特征在于：还包括五环三萜类异硫氰酸酯衍生物药学上可接受的盐。
4.权利要求1或2所述的五环三萜类异硫氰酸酯衍生物的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将1mmol五环三萜化合物溶于溶剂中，依次加入1.2～1.5mmol 2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、1.5～2mmol二异丙基乙胺，反应获得五环三萜类活泼酯中间体；
(2)将步骤(1)产物与1.2～1.5mmol不同长度的Boc单保护的烷基或烷氧二胺链共同溶于溶剂中，搅拌下加入1.5mol的三乙胺，常温反应过夜；
(3)将步骤(2)产物脱除Boc后溶于溶剂中，再加入10mmol二硫化碳、1mmol三乙胺，室温搅拌1h后，将反应体系冷却至0℃，再加入1mmol二碳酸二叔丁酯、1.2mmol的二甲氨基吡啶，室温下继续搅拌反应2-3h后，获得五环三萜类异硫氰酸酯衍生物。
5.根据权利要求4所述的五环三萜类异硫氰酸酯衍生物的制备方法，其特征在于：溶剂选自四氢呋喃、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、水、二氧六环。
6.权利要求1或2所述的五环三萜类异硫氰酸酯衍生物在制备预防或/和治疗癌症药物中的应用。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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