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CN118302540A - 包括用于对靶多核苷酸进行测序的盒的方法和系统 - Google Patents

包括用于对靶多核苷酸进行测序的盒的方法和系统 Download PDF

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CN118302540A
CN118302540A CN202280063737.0A CN202280063737A CN118302540A CN 118302540 A CN118302540 A CN 118302540A CN 202280063737 A CN202280063737 A CN 202280063737A CN 118302540 A CN118302540 A CN 118302540A
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CN
China
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nucleic acid
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target nucleic
target
Prior art date
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Pending
Application number
CN202280063737.0A
Other languages
English (en)
Inventor
萨姆·里德
诺姆·纳尔逊
戴维·伍尔德里奇
亨利·法塔因博
亚历山德罗·马尔图拉诺
达恩·莫利
格雷厄姆·沃斯利
道格拉斯·爱德华·斯坦德里奇
卡米尔·安杰伊·利平斯基
布拉德利·布朗
亚历克斯·弗拉姆
本·莱恩
梅拉妮·斯普林格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dnae Diagnostics Ltd
Original Assignee
Dnae Diagnostics Ltd
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Publication date
Application filed by Dnae Diagnostics Ltd filed Critical Dnae Diagnostics Ltd
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Abstract

本申请描述了使用基于盒的系统而从样本中鉴定靶多核苷酸序列的方法、以及在固体载体上形成扩增的核酸分子阵列的方法。

Description

包括用于对靶多核苷酸进行测序的盒的方法和系统
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年7月21日提交的美国临时申请第63/224,116号的优先权权益，该相关申请的内容整体并入本文。
技术领域
本公开主要涉及样本处理和核酸测序。
背景技术
近年来，核酸测序技术取得了巨大进步。这一进步的重要贡献是二代测序或NGS的出现(例如，参见The sequence of sequencers:The history of sequencing DNA(2016)Heather and Chain；Genomics 107:1-8)。例如，作为人类基因组计划的一部分，在大约13年内对第一个人类基因组进行了测序，耗资至少数亿美元。今天，在某些情况下，可以在几天内对人类基因组进行测序，成本为1000美元(见https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Sequencing-Human-Genome-cost)。核酸测序现在被广泛用于许多领域，其价值得到了很好的评价。
然而，在许多应用中，测序工作流程(准备用于测序的样本中所含的靶多核苷酸、进行测序和分析所得数据所需的过程)是乏味、耗时、复杂且通常为成本高昂的。许多步骤仍然是手动进行的，并且需要高度熟练的人员。即使工作流程中的特定程序是自动化的，也需要多个仪器和辅助组件，并且需要在各个点进行熟练的人工干预来执行整个工作流程。此外，从样本到结果的时间是几个小时到几天或更长。而且，样本输入的最大允许量较低，这代表了进一步的当下限制。
因此，在实际使用中测序(包括二代测序)的能力和价值可能会大大降低。
发明内容
本发明的系统和方法认识到了对如下测序工作流程的现有需求：该测序工作流程完全自动化(样本到报告)，一旦开始运行就不需要用户干预，快速(样本在几个小时内就能够得到可操作的结果)，灵敏、准确、经济高效，并可在需要时使用。如本文所公开的，用于样本制备、文库制备和测序的先前单独的步骤可以在单个台式仪器内的单个盒中自动进行。
本文公开了可用于快速分析靶多核苷酸的实施方案，包括使用全自动系统从大范围的输入样本类型和量中确定其核苷酸序列，该全自动系统包括盒、仪器以及操作和分析软件，在开始运行后无需人工干预(例如，样本到报告)。进一步的实施方案公开了半导体芯片用于检测的用途以及用于在表面(包括半导体芯片的表面)上产生核酸簇的方法。所述实施方案可用于多种应用，包括临床诊断、流行病学和监测、肿瘤学、遗传和基因组分析，包括宏基因组学、医院感染控制、基础和应用研究、食品测试、取证、环境测试、生物威胁检测、动物健康、农业测试等。
在各种实施方案中，本文所述的任何试剂(例如引物、酶和缓冲液)和/或系统可以组合并以一个或以上套件(kit)提供。因此，可设想包括本文所述的任何系统、其部件(例如，盒或仪器)和/或试剂并且能够进行本文所述任何方法的套件。
本发明的各个方面可以包括用于分析样本中的靶标的方法，包括将样本引入盒和将盒引入仪器等步骤。然后，该仪器能够操纵盒内的样本，从而从样本中自动分离靶核酸；扩增分离的靶核酸；并使用二代测序对扩增的靶核酸进行测序。在整个分离步骤、扩增步骤和测序步骤中样本可以保持在盒内。此外，整个过程可以在单个仪器内进行，而无需用户干预。在某些实施方案中，可以在将样本引入盒后8小时或更短时间内进行分离步骤、扩增步骤和测序步骤。
在某些实施方案中，对于包括以低至3个拷贝的水平存在于样本中的真菌核酸的分离的、扩增的和测序的靶核酸，本发明的系统和方法可以提供极好的灵敏度。在某些实施方案中，靶核酸可以包括以低至3个拷贝的水平存在于样本中的细菌核酸或以低至单个拷贝的水平存在于样本中的病毒核酸。
本文所述系统和方法的另一个优点是盒的所占空间相对较小，提供了更易于管理的运输、存储和处理的优点，同时允许较小的分析仪的所占空间，从而以较低成本占用实验室空间。如本文所述，盒或仪器的外部体积可指盒或仪器所占据的总三维体积(例如，矩形棱柱形盒的高度x长度x宽度)。在某些实施方案中，盒可以具有约3升或以下的外部体积。盒可以具有约2.5升或以下的外部体积。在一些实施方案中，盒可以具有约2.1升或以下的外部体积。类似地，除了相对较小的外部体积之外，本发明的盒还可以具有相对较小的最长线性维度(例如，矩形棱柱形盒的最长高度、长度或宽度)，以便于处理并获得紧凑的仪器。在某些实施方案中，盒可以具有约200mm或以下的最长线性维度。在一些实施方案中，盒可以具有约160mm或以下的最长线性维度。
通过例如改变工作流程中的试剂和/或各种步骤的特定时间、顺序和持续时间，本发明的系统和方法可以适应各种测定以及不同的样本类型和体积。在各种实施方案中，单个盒可能能够进行多个不同的测定，并且如果需要进行不同的测定的话，单个仪器可以接受不同的盒。本发明的系统和方法设想，如果需要不同的盒内部构件来进行不同的测定(例如，处理生物样本与环境样本的不同样本制备单元)，则不同盒的总尺寸和形状基本相同，以允许与单个仪器的互用性。在各种实施方案中，样本可以选自由生物样本、临床样本、环境样本和食品样本组成的组中。本发明的一个特别的优点是能够接收原始或最低限度处理的样本，并自动进行所选测定的所需工作流程步骤，以提供测序结果，而无需任何用户干预，也无需从单个盒或单个仪器去除样本。因此，在某些实施方案中，样本可以是从受试者获得的生物样本，并且在引入到盒之前未经处理。
样本处理(其可包括分离样本中的靶核酸)可包括消化样本中的蛋白质。可以使用蛋白酶K消化蛋白质。分离可以包括裂解样本中的生物体(例如，细菌、真菌或如人类细胞之类的宿主细胞)以释放靶核酸。裂解可以包括机械裂解。在各种实施方案中，机械裂解可以包括使样本流入盒内的裂解室中、并使桨在裂解室内旋转。机械裂解可以还包括使桨在裂解室内旋转之前将锆珠添加到裂解室中。分离可以包括使靶核酸变性。变性包括热变性。分离可以包括通过以下方式捕获靶核酸：使靶捕获寡核苷酸与靶核酸进行退火以形成复合物；将复合物与固体载体结合；并从固体载体去除未结合的材料。在某些实施方案中，去除未结合的材料可以包括用洗涤试剂洗涤固体载体结合的复合物。
在一些实施方案中，可以在固体载体结合的靶核酸上进行扩增步骤。该扩增步骤可以在盒的样本处理单元内进行，并且可以代替或补充作为盒的文库制备单元中文库制备的一部分进行的扩增步骤(例如，引入任何所需的条形码、标签或衔接子)。在某些实施方案中，方法可包括从洗涤的固体载体洗脱靶核酸以制备分离的靶核酸。用于文库制备的扩增步骤可以直接在洗脱的靶核酸上进行，而无需介入步骤。
在某些实施方案中，分离步骤可以从体积在约1mL和约25mL之间的样本中自动分离靶核酸。分离步骤可以仅包括一个纯化步骤。分离的核酸可以在未定量的情况下进行扩增。
在一些实施方案中，扩增步骤可包括使用第一引物集对分离的靶核酸进行第一扩增以产生第一扩增产物；稀释第一扩增产物并等分成多个等分试样；使用第二引物集对多个等分试样中的靶核酸进行第二扩增以产生多个第二扩增产物；以及汇集第二扩增产物。在各种实施方案中，第一引物集中的一个或以上引物可以与第二引物集中一个或以上引物相同。扩增步骤还可以包括纯化汇集的第二扩增产物以产生扩增的靶核酸。第一扩增和第二扩增的一个或以上可以包括PCR扩增。多个等分试样可以包括至少10个单独的等分试样。第一PCR扩增和第二PCR扩增可以在未定量的情况下进行。在一些实施方案中，第二引物集可以相对于第一引物集嵌套。扩增步骤可以包括在测序步骤之前对扩增的靶核酸进行拷贝控制。扩增步骤可以仅包括一个纯化步骤。
在某些实施方案中，可以在未定量的情况下对扩增的靶核酸进行测序。测序步骤可以包括：将扩增的靶核酸固定至在盒内的包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器的半导体表面上方。扩增步骤的所有产物在没有介入步骤的情况下流过半导体表面。在一些实施方案中，可以通过结合在ISFET传感器上方的捕获寡聚体固定扩增的靶核酸，其中所述捕获寡聚体与靶核酸的一部分杂交。该表面可以包括ISFET传感器的阵列，各ISFET传感器具有位于其上方的孔。至少一个孔被定位在ISFET传感器阵列中的多个ISFET传感器上方。一个或以上孔可以包括与靶核酸的一部分杂交的表面结合正向引物和与靶核酸的一部分杂交的表面结合反向引物，并且其中测序步骤包括双端测序。在某些实施方案中，一个或以上孔或一个或以上孔之间的孔际间隙可以包括不与靶核酸杂交的多个结合的惰性寡聚体。可以通过结合在ISFET传感器上方的通用捕获寡聚体固定扩增的靶核酸，其中通用捕获寡聚体与通用结合位点杂交。在一些实施方案中，扩增步骤可以包括使用包括通用结合位点的引物扩增分离的靶核酸。在某些实施方案中，扩增步骤可以包括将衔接子连接到分离的靶核酸上，所述衔接子包括通用结合位点。测序步骤可以包括固定的靶核酸的克隆扩增，并且克隆扩增可以包括重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、桥式PCR、链置换扩增或环介导等温扩增。
在某些方面，本发明的系统可以包括样本盒，样本盒包括：样本输入；样本制备单元，其能够从样本输入接收样本并从样本中分离靶核酸；文库制备单元，其能够从样本制备单元接收分离的靶核酸并扩增分离的靶核酸；和测序单元，其能够从文库制备单元接收扩增的靶核酸并对扩增的靶核苷酸进行测序。系统还可以包括仪器，该仪器包括盒接口，盒接口包括物理连接和电子连接，通过物理连接和电子连接仪器能够驱动盒内的样本和试剂的移动并与测序单元通信。分离靶核酸、扩增分离的靶核酸以及对扩增的核酸测序所需的一种或以上试剂可以是干燥试剂，该仪器能够重构一种或以上试剂。
本发明的系统还可以包括一个或以上试剂盒，试剂盒包含分离靶核酸、扩增分离的靶核酸以及对扩增的核酸测序所需的一种或以上试剂。仪器可以能够将试剂从一个或以上试剂盒转移到样本盒。通过使用试剂盒，可以避免在仪器内维护板载试剂孔时的污染和物流组织问题。此外，可以在生产后密封试剂盒，从而避免在手动重新填充试剂孔中可能出现的污染或用户错误。试剂盒可以是测定特异性的，并且可以包括1个完整测定或多个测定所需的试剂。用户可以在测定运行开始时将适当的试剂盒与样本盒一起插入。在某些实施方案中，仪器可以监测试剂盒内的试剂水平，特别是在单个试剂盒包含用于多个测定的试剂量的情况下，并且当试剂水平低或不足以进行所需测定时通知用户。样本盒和/或一个或以上试剂盒可以包括密封气动接口(SPI)端口，并且仪器可以能够使用一个或以上移液器经由SPI端口将一种或以上试剂从一个或以上试剂盒转移到样本盒。
在某些实施方案中，仪器可以包括能够转移一种或以上试剂的3自由度移液器台架。系统能够对样本中的低至3个拷贝水平的靶真菌核酸进行分离、扩增和测序，系统能够对样本中存在的低至3个拷贝水平的靶细菌核酸进行分离、扩增和测序，和/或系统能够对样本中存在的低至单个拷贝水平的靶病毒核酸进行分离、扩增和测序。
本发明的仪器可具有约150升或以下的总外部体积。在一些实施方案中，仪器的外部体积可以是约135升或以下。仪器可以具有约700mm或以下的最长线性维度。在某些实施方案中，仪器可以具有约650mm或以下的最长线性维度。样本盒可能够接收生物样本、临床样本、环境样本和食品样本，包括未处理的样本。分离靶核酸可以包括消化样本中的蛋白质(例如通过将样本暴露于样本制备单元中的蛋白酶K的仪器)。样本制备单元可以能够裂解生物体以释放靶核酸。为此，样本制备单元可以包括裂解室，裂解室包括旋转桨，仪器能够使样本流入裂解室内，并与样本盒对接以使旋转桨旋转以机械裂解样本中的生物体。裂解室可以包括锆珠以帮助裂解。
该仪器能够向样本制备单元提供热能以使其中的核酸变性。通过使样本暴露于样本制备单元中的靶捕获寡核苷酸和固体载体，以使靶捕获寡核苷酸与靶核酸进行退火，从而形成复合物并将复合物与至固体载体结合，仪器可以进一步能够用于进行靶捕获。然后该仪器可以将洗涤缓冲液引入固体载体结合的复合物并将固体载体结合的复合物与未结合的样本分离。然后该仪器可以将分离的固体载体结合的复合物转移到文库制备单元并扩增固体载体结合的靶核酸。本发明的仪器仪器能够将洗脱缓冲液引入分离的固体载体结合的复合物以从固体载体洗脱靶核酸，并将洗脱的靶核酸转移到文库制备单元用于扩增。该仪器还能够将扩增试剂引入固体载体结合的复合物并扩增样本制备单元内的靶核酸。
在各种实施方案中，盒和仪器可能够自动容纳通过样本输入接收的体积在约1mL和约25mL之间的样本。该仪器可能够与样本盒的文库制备单元对接，以引入所需试剂并提供热能以：使用第一引物集对分离的靶核酸进行第一扩增以产生第一扩增产物；稀释第一扩增产物并将其等分成多个等分试样；使用第二引物集对多个等分试样中的靶核酸进行第二扩增以产生多个第二扩增产物；和汇集第二扩增产物。第一引物集中的一个或以上引物可以与第二引物集中一个或以上引物相同。该仪器还可以能够纯化汇集的第二扩增产物以产生扩增的靶核酸。
本发明的系统还可以能够对分离的靶核酸和扩增的靶核酸的一个或以上进行拷贝控制，并控制分别转移到文库制备单元或测序单元的输出拷贝的数量。测序单元可以包括半导体表面，半导体表面包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器阵列，各ISFET传感器具有位于其上方的孔，该仪器能够将扩增的靶核酸固定在ISFET传感器阵列的上方，当将样本盒定位在其中时ISFET传感器阵列通过盒接口的电子连接与仪器进行电子通信。该仪器能够使得来自文库制备单元的所有输出均流进在半导体表面上的孔中。
该盒可以包括结合在ISFET传感器阵列上方的捕获寡聚体，其中所述捕获寡聚体被配置为与靶核酸的一部分杂交。至少一个孔可被定位在ISFET传感器阵列中的多个ISFET传感器上方。在一些实施方案中，一个或以上孔可以包括与靶核酸的一部分杂交的表面结合正向引物和与靶核酸的一部分杂交的表面结合反向引物，仪器能够进行双端测序。一个或以上孔和孔之间的孔际间隙可以包括不与靶核酸杂交的多个结合的惰性寡聚体。盒可以包括结合在ISFET传感器阵列上方的通用捕获寡聚体，其中所述通用捕获寡聚体被配置为与通用结合位点杂交。
仪器能够与文库制备单元对接，从而使用包括通用结合位点的引物扩增分离的靶核酸。在一些实施方案中，仪器能够将衔接子连接到样本制备单元或文库制备单元中的分离的靶核酸上，所述衔接子包括通用结合位点。仪器能够与测序单元对接以进行固定的靶核酸的克隆扩增，并且克隆扩增可包括重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、桥式PCR、链置换扩增或环介导等温扩增。仪器与样本和/或试剂盒之间的物理连接和电子连接可以包括用于驱动样本盒之间和/或内部的流体运动的气动系统。盒接口可以还包括物理连接和电子连接，通过该物理连接和电子连接，仪器能够与样本制备单元和文库制备单元中的一个或以上通信。
附图说明
图1A至图1C示出了根据本公开的示例性捕获寡聚体，其包括捕获序列、阻断部分、捕获序列的互补序列(C')、附加序列(例如，第三附加序列或第四附加序列)和靶杂交序列、以及其他分子。在图1A中，捕获寡聚体与靶多核苷酸(靶标)退火，并且靶多核苷酸的3'端与靶杂交序列的5'端退火。捕获序列与C'退火。在图1B中，靶标的3'端已延伸至阻断部分，并且所得的靶延伸序列与附加序列和C'退火，而捕获序列已被置换并已变成单链。捕获寡聚体的3'端也沿着靶多核苷酸延伸。在图1C中，图1B的复合物与包括捕获序列的互补序列以及结合配偶体或固体基质的第二捕获试剂退火。同时，过量的捕获寡聚体连同与捕获序列的互补序列退火的捕获序列一同保留，并且不与第二捕获试剂相互作用。
图2A示出了本公开的一个实施方案，其中如图1B中的复合物与包括捕获序列的互补序列并与固体基质(在这种情况下，为链霉亲和素包被的磁珠)缔合的第二捕获试剂退火。固体基质可为第二捕获试剂的一部分，或者可以通过与第二捕获试剂的结合配偶体(例如生物素)相互作用而与第二捕获试剂缔合。
图2B示出了本公开的一个实施方案，其中来自图2A的延伸的捕获寡聚体和靶标的复合物已经从第二捕获试剂洗脱。
图3示出了根据本公开的捕获寡聚体的实施方案，其包括作为第一附加序列的稳定(夹)序列、捕获序列、接头、内部延伸阻断序列、捕获序列的互补序列、作为第三附加序列的稳定(夹)序列、第四附加序列和靶杂交序列。
图4A示出了根据本公开的示例性分子和示例性反应方案。提供了一种靶分子，其中第一链在其5'端包括序列Sf并在其3'端包括Sr'，并且第二链在其3'端包括序列Sf'并在其5'端包括Sr。在此处以及全文中，具有'的序列名称表示与名称没有'的序列互补。靶分子可以是(例如)来自先前使用具有序列Sf和Sr的引物进行的反应的扩增子。进行第一个循环延伸(循环1)，其中根据本公开的捕获寡聚体与第一靶链1(+)退火，捕获寡聚体包括捕获序列C、内部延伸阻断序列(实心圆)、捕获序列的互补序列C'、第四附加序列A4以及与Sr'互补的靶杂交序列THS。反向扩增寡聚体与第二靶链1(-)退火，反向扩增寡聚体包括附加序列A2以及与至少Sf'互补的靶杂交序列Sf*。Sf*可包括增强亲和性的修饰和/或与第二靶链互补的附加核苷酸，以增强其与靶标的亲和性，并促进与来自先前反应的具有序列Sf的引物(如果存在)的结合竞争。捕获寡聚体和反向扩增寡聚体的延伸分别产生产物2(-)和2(+)，而第一链沿着捕获寡聚体延伸以产生产物1(+)e，并且第二链沿着反向扩增寡聚体延伸以产生产物1(-)e。基本上如图1B所述置换延伸的捕获寡聚体2(-)中的捕获序列。进行第二个循环反应(循环2)，其中2(-)与反向扩增寡聚体退火，引起延伸以产生产物2(-)e和3.1(+)。同时，1(+)e与捕获寡聚体退火，并且后者延伸产生产物3.1(-)。1(-)e和2(+)以及2(-)e和3.1(+)的其他实例也由适当的杂交和延伸事件产生。该反应方案说明在靶标的每一端包括附加序列，以及通过以可用于结合的形式引入C，例如与第二捕获试剂结合，从而使靶标可捕获。
图4B示出了根据本公开的示例性分子和示例性反应方案。提供了一种靶分子，其中第一链在其5'端包括序列Sf并在其3'端包括Sr'和A4'，并且第二链在其3'端包括序列Sf'并在其5'端包括Sr和A4。靶分子可以是(例如)来自先前使用具有序列Sf和A4-Sr的引物进行的反应的扩增子，例如，其中A4是最初不存在于模板中的附加序列。进行第一个延伸循环(循环1)，其中根据本公开的捕获寡聚体与第一靶链(未示出)退火，捕获寡聚体包括捕获序列C、内部延伸阻断序列(实心圆)、捕获序列的互补序列C'、第四附加序列A4以及与A4'互补的靶杂交序列THS。反向扩增寡聚体与第二靶链(未示出)退火，反向扩增寡聚体包括附加序列A2和与至少Sf'互补的靶杂交序列Sf*。Sf*可包括增强亲和性的修饰和/或与第二靶链互补的附加核苷酸，以增强其与靶标的亲和性，并促进与来自先前反应的具有序列Sf的引物(如果存在)的结合竞争。这些复合物的延伸产生延伸的捕获寡聚体2(-)和延伸的第一靶链1(+)e、以及延伸的第二靶链1(-)e和延伸的反向扩增寡聚体2(+)。基本上如图1B所述置换延伸的捕获寡聚体2(-)中的捕获序列。进行第二个反应循环(循环2)，其中2(-)与反向扩增寡聚体退火，引起延伸以产生产物2(-)e和3.1(+)。同时，1(+)e与捕获寡聚体退火，并且后者延伸产生产物3.1(-)。1(-)e和2(+)以及2(-)e和3.1(+)的其他实例也由适当的杂交和延伸事件产生。该反应方案说明在远离捕获寡聚体结合位点的靶标端包括附加序列，以及使用能够在前一步骤中附接到靶标(例如通过扩增或连接)的、可具有通用THS(即结合附加序列A4')的捕获寡聚体来引入C(以可用于结合的形式)，从而使靶标可捕获。
图5示出了根据本公开的示例性分子和示例性反应方案。提供了一种捕获寡聚体，其包括3'阻断部分和结合靶链中的序列A1'的靶杂交序列(THS)等。A1'可为在前一步骤中(例如，通过扩增或连接)附接至靶标的附加序列。捕获寡聚体还包括序列x，该序列x包括捕获寡聚体的捕获序列的互补序列，并且还可包括捕获序列的互补序列和THS之间的第三附加序列或第四附加序列。如别处所论述的，靶链可以沿着捕获寡聚体延伸以从捕获序列的互补序列置换捕获序列。可以以相对于靶标(例如1014个拷贝)的限制性量(例如1012个拷贝)提供捕获寡聚体。还提供了超过靶标(例如1015个拷贝)的引物，靶标包括序列A2和Sf。该引物的延伸产生在其5'端包括A2并在其3'端包括A1'的链。靶链也沿着引物延伸以包括序列A2'。如果进行第二个循环延伸(向下箭头)，则形成产物的混合物，包括上述那些物质以及靶链与捕获寡聚体的复合物，其中靶链在其5'端包括A2，在其3'端附近包括A1'。该反应方案说明产生了单链可捕获产物，包括(当进行第二个延伸循环时)其中靶链中已包括附加序列的单链可捕获产物。
图6示出了(在虚线上方)具有可延伸的3'端的捕获寡聚体与另一捕获寡聚体的杂交如何在延伸后产生二聚体，其中的捕获序列从C'置换。该二聚体现为可捕获的，并且可能干扰下游过程，例如通过占据第二捕获试剂(未示出)进行与所需靶标的捕获竞争，随后分析干扰(例如，二聚体将变成测序文库的一部分，从而降低随后的测序运行的输出和质量)等。Sx'为靶杂交序列的一部分的互补序列，其他元件如前面的图中所示。在虚线下方，示出了在其3'端具有阻断部分的捕获寡聚体(带圆圈的x)，其可阻止二聚体延伸产物的形成，使得任何二聚体均不会发生C的置换。
图7A示出了一个实施方案，其中使用了包括捕获序列、各种中间元件(由“…”表示)、可逆延伸阻断序列(实心圆)和靶杂交序列(THS)的捕获寡聚体。在对可逆延伸阻断序列解除阻断之前，捕获序列和各种中间元件(如果存在)不是用于延伸(例如，靶链或扩增寡聚体的延伸)的模板。这可以通过在整个延伸或扩增过程中，避免在产物中(例如，在可能形成的任何错误引发的产物中)引入与捕获序列互补的附加序列和各种中间元件(如果存在)直至对可逆延伸阻断序列解除阻断，从而促进更有效且更特异的延伸或扩增；在解除阻断后，可以引入捕获序列和各种中间元件(如果存在)。
图7B图示了一个实施方案，其中使用了第一扩增寡聚体，该第一扩增寡聚体从3'至5'包括：靶杂交序列Sr、可逆延伸阻断序列(实心正方形)、附加序列A1和任选的附加元件(由“…”表示)，例如任选的捕获序列。任选地，使用第二扩增寡聚体，该第二扩增寡聚体从3'至5'包括：靶杂交序列Sf、可逆延伸阻断序列(空心正方形；该序列可以与第一扩增寡聚体中的可逆延伸阻断序列相同或不同)、附加序列A2和任选的附加元件(由“…”表示，这些附加元件可以与第一扩增寡聚体中的那些附加元件相同或不同)(如图中所示)。在一个或多个可逆延伸阻断序列解除阻断之前，附加序列和任选的附加元件(如果存在)不是用于延伸(例如，靶链或扩增寡聚体的延伸)的模板。这可以通过在整个初始延伸或扩增过程中，避免在产物中(例如，在可能形成的任何错误引发的产物中)引入与附加序列互补的序列和其他各种元件(如果存在)，从而促进更有效且更特异的延伸或扩增。可逆延伸阻断序列是未阻断的(如果存在两个可逆延伸阻断序列，则解除阻断可以同时或分开发生)，并且可以在该方法的后期阶段(例如后一个循环延伸)引入附加序列和存在的任何其他元件。
图8A示出了根据本公开的示例性分子和示例性反应方案。初始靶链1(+)和1(-)与图4A中相同。在直的垂直箭头下方，提供了一种捕获寡聚体，其包括靶杂交序列THS、以及如图4A的寡聚体所述的附加元件A4、C'、内部延伸阻断序列和C。THS结合于靶链的内部位点并经过延伸以产生产物2N(-)。提供了包括Sr的置换寡聚体，并且使其延伸，从而将2N(-)从1(+)置换并产生了2(-)。提供了如图4A中的反向扩增寡聚体，其沿着1(-)的延伸产生了2.1(+)，而1(-)沿着反向扩增寡聚体的延伸产生了1(-)e。一旦2N(-)被置换(左边的曲线箭头)，则反向扩增寡聚体与2N(-)退火并各自延伸，从而产生产物2N(-)e和2.2(+)，其现在包括A2'并且其中从C'置换C。该反应方案说明了置换寡聚体的使用，以促进仅在循环1中即产生靶序列的两端均包括附加序列(例如衔接子)的可捕获产物。此外，该反应方案示出了这样的实施方案，其中捕获寡聚体不结合包括靶链的3'端在内的位点。
图8B示出了根据本公开的另外的示例性分子和另一示例性反应方案。反应方案基本上类似于图4A中描述的反应方案，不同之处在于以下1)和2)。1)初始靶链1(+)和1(-)包括附加序列，其包括靶杂交序列THS、任选的间隔序列S和置换寡聚体结合位点D。这些附加序列为用户定义的任意序列，并且可以引入靶标中，例如，通过使用包括Sr以及包括THS、S和D的序列标签的扩增寡聚体和包括Sf的扩增寡聚体的扩增反应进行引入。2)捕获寡聚体的THS结合至用户定义的THS位点。否则，如图8A所示进行反应，所得的产物示于图8B。任选的间隔序列可以用于改善置换寡聚体的延伸和随后的捕获寡聚体的置换。与图4A中所示的方案一样，该反应方案说明了置换寡聚体的使用，以促进(例如仅在循环1中)产生靶序列的两端均包括附加序列(例如衔接子)的可捕获产物。此外，该方案示出了附加的、用户定义的序列的使用，该序列可以作为捕获寡聚体和置换寡聚体这两者的结合位点。这种设计可以使该方法通用化，并且允许设计用于不同靶标的捕获寡聚体和置换寡聚体的更简单且更成本有效的手段，包括以多重形式。
图9示出了阻断寡聚体如何阻止寡聚体中的附加序列与延伸产物中的其互补序列之间杂交的一般原理。用含有序列f的与靶链T(-)杂交的正向引物、以及含有序列A(靶标中不存在的附加序列)和序列r的与靶链T(+)杂交的反向引物进行扩增反应。延伸产生了产物1(-)和1(+)。提供了包括序列A和3'阻断部分的阻断寡聚体。在循环2中，正向引物沿着1(-)延伸，从而产生2(+)，并且反向引物沿着1(+)延伸，从而产生2(-)。在循环3以及之后的循环中，阻断寡聚体与2(+)退火，这意味着r与r'的杂交对于反向引物引发沿着2(+)的延伸是必需的。这在发生任何错误引发事件的情况下是有益的，所述错误引发事件会产生少量具有r的不完全互补序列但延伸至包括A'的副产物。当没有阻断寡聚体时，由于反向扩增寡聚体的A与A'之间的相互作用，将更有利于反向扩增寡聚体与错误引发的副产物的结合，从而导致比具有阻断寡聚体时更多的副产物扩增(同时，正向引物与2(-)退火并经过延伸)。
图10A示出了根据本公开的示例性分子和示例性反应方案。提供了下列的组合：(i)捕获寡聚体，其包括捕获序列的第一部分和第二部分(C1和C2)、内部延伸阻断序列(实心圆)、间隔序列的第一部分和第二部分(S1和S2)以及结合包括其3'端的靶链中的位点的靶杂交序列(THS)和(ii)互补寡聚体，其包括S1'和C2'。当捕获寡聚体与靶标杂交，并且靶标沿着捕获寡聚体延伸直至内部延伸阻断序列，从而将S'引入靶链时，互补寡聚体被置换。捕获寡聚体也沿着靶标延伸(注意，在本文所述的其他实施方案中，捕获寡聚体可能被阻断，因而不会发生这种延伸)。提供了第二捕获试剂，该第二捕获试剂包括通过接头(锯齿形曲线)与捕获序列的互补序列C'连接的结合配偶体或固体载体(带圆圈的B)。第二捕获试剂与结合至延伸的靶标的捕获寡聚体退火，而不与结合至互补寡聚体的捕获寡聚体退火，因为后者占据了C2，其为足够量的捕获序列以基本上阻止第二捕获试剂与捕获寡聚体退火。
图10B示出了一个实施方案，其中如果需要，寡聚体的组合可用于从组合物中捕获靶多核苷酸，组合物中包括一定量(例如，限制性量、或者小于或等于预定量的量)的靶多核苷酸。所述组合包括：捕获寡聚体，其从5'至3'包括捕获序列的第一部分C1、捕获序列的第二部分C2、任选的间隔序列S、靶杂交序列的第二部分THS2、靶杂交序列的第一部分THS1、以及任选的阻断部分(带圆圈的X)；单独的互补寡聚体，其从5'至3'包括THS2'、S'(任选的；当捕获寡聚体中存在S时可以使用或不使用)和C2'(其中元件的互补序列由“'”表示)以及位于3'端的任选的阻断部分(带圆圈的X)；和第二捕获试剂，其包括捕获序列的互补序列，该互补序列从5'至3'包括C2'、C1'(C1'或C2'可以与C1和C2的全长互补或不互补)以及结合配偶体(在该图示中用生物素分子举例说明，表示为带圆圈的B)。在不存在靶多核苷酸的情况下，互补寡聚体结合捕获寡聚体，并阻断完整捕获序列的可接近性至足以阻断第二捕获试剂中捕获序列的互补序列的结合的程度(参见图顶部的互补寡聚体与捕获寡聚体的复合物)。当存在靶标时，捕获寡聚体的THS1区域结合至靶标，随后结合THS2区域(这在能量方面是有利的)，因此从捕获寡聚体中置换了单独的互补寡聚体的THS2'区域。当发生这种情况时，单独的互补序列的C2'区域不再稳定到足以结合捕获寡聚体，因此变成未结合状态，从而产生如第一个箭头下方所示的可用于结合的完整捕获序列。然后，如第二个箭头下方所示，第二捕获试剂中捕获序列的互补序列结合至捕获寡聚体的捕获序列。然后可以从混合物中分离该复合物，例如，通过链霉亲和素包被的磁性微球(如本公开中别处所述)，从而捕获并纯化靶多核苷酸。任选地，捕获寡聚体可以以比第二捕获试剂更大的量存在于组合中。这样的寡聚体和组合可用于从组合物中捕获一定量(例如，限制性量或小于或等于预定量的量)的靶多核苷酸。
图11A至图11B示出了根据本公开的示例性分子和示例性反应方案。在图11A中，提供了一种捕获寡聚体，其包括基本上如图4A的捕获寡聚体所述的元件，不同之处在于，THS结合至不包括3'端的靶链(其可为如图所示的环形，或为线形)中的位点。提供了一种互补寡聚体，其包括(i)与捕获寡聚体的THS相邻序列退火的靶杂交序列和(ii)A4的至少一部分的互补序列。在不存在靶链的情况下，A4的至少一部分的互补序列不足以与捕获寡聚体退火。在图11B中，互补寡聚体经过延伸，这将置换C并使其可使用第二捕获试剂(未示出)进行捕获。该方案可用于捕获环形分子和/或表示使用不在靶链3'端处结合的捕获寡聚体的另一种方法。
图12示出了根据本公开的示例性分子和示例性反应方案。包括如图4A的捕获寡聚体中的元件且具有第二附加序列A2的捕获寡聚体在包括其3'端的位点处与靶链退火，所述第二附加序列可在C'与内部延伸阻断序列之间包括混合核苷酸节段。靶链在其5'端还包括序列A5，序列A5可为任意序列、在之前的扩增反应中使用的引物结合位点、或在之前的步骤(例如，扩增或连接)中添加的序列。靶链沿着捕获寡聚体的延伸将序列A4'、C和A2'添加至靶链的3'端。捕获寡聚体中A4和延伸的靶链中A4'的存在是任选的。然后，可以使延伸的靶链与包括序列A5'、A2、C'和A4的夹板寡聚体退火，其中当使延伸的靶链与夹板寡聚体退火时，靶链5'端和3'端紧邻。然后，可以通过连接将延伸的靶链环化。A2和A2'序列用于确保延伸的靶链的5'端和3'端的正确并置。当C和C'是重复序列(例如，poly-A和poly-T或反之亦然)时，这可能是有帮助的，否则所述重复序列可能倾向于滑移，这将抑制用于连接的底物的形成。该方案可用于捕获并随后环化靶分子，例如用于滚环扩增过程。
图13示出了根据本公开的示例性分子和示例性反应方案。提供了一种捕获寡聚体，其包括捕获序列C(包括第一部分C1第二部分和C2；未示出)、内部延伸阻断序列(实心圆)、间隔序列S(包括第一部分S1和第二部分S2；未示出)和靶杂交序列THS，并且提供了包括序列S2的反向扩增寡聚体。THS和S2用于产生扩增的靶标(例如，通过PCR)。添加互补寡聚体，其包括间隔序列的第一部分的互补序列S1'和捕获序列的第二部分的互补序列C2'。当S'与扩增靶标的另一条链S退火时，C2'不足以与扩增靶标的C退火。互补寡聚体退火以捕获未与扩增链退火的寡聚体。为了捕获扩增的靶标，添加包括C'和结合配偶体或固体载体(带圆圈的B)的第二捕获试剂。第二捕获试剂结合扩增的靶标，但不结合未与扩增链退火的捕获寡聚体，其中互补寡聚体的C2'以足够的程度阻断C。
图14示出了使用具有夹序列或没有夹序列的捕获寡聚体的方法的输出的倍数差异。
图15.图A–溶液介导的表面相重组酶聚合酶扩增(SM-RPA)正向引物存在于溶液中，而反向引物固定在表面。在模板与表面引物的初始杂交时，溶液引物、重组酶、单链DNA结合蛋白(ssDNA)和聚合酶的协同作用使得互补链合成。随后溶液相引物的重组和延伸使得一条链置换到溶液中。然后可以局部重新捕获这些链。图B–相比之下，在桥式RPA或ExAmp(例如)中，两种引物均被共同固定在表面，使得仅能进行表面相扩增。
图16描绘了在桥式RPA(图A)和有孔芯片上的SM-RPA(图B和C)中的簇形成的模型。在桥式RPA中(如在桥式PCR和ExAmp中)，簇很小(图A)。在SM-RPA中，使用溶液中引物的扩增能够实现簇的横向生长，簇的大小受到相邻簇的空间排斥的限制。在溶液中产生的扩增子在种子模板分子附近被重新捕获，促进了扩增子的克隆斑的形成，该克隆斑大于在桥式扩增中产生的克隆斑(图B；来自3个独立靶标的簇由*、◆和表示)。
图17是本发明的示例性表面(例如，芯片上)模板循环方法的示意图。首先，在文库制备中的PCR2过程中，给靶模板加接头，在其各端部上具有部分的第一和第二RCA引物结合位点。在工作流程的拷贝控制阶段，第二RCA引物结合位点延伸以包括拷贝控制衔接子和第一RCA引物结合位点的第二部分。模板与固定在表面上的第一RCA引物杂交，该引物起到夹板的作用。这形成了在相邻的5'端和3'端之间具有间隙的结构。添加连接酶填补了这一间隙，形成了能够促进原位RCA反应的环。
图18描述了使用滚环扩增(RCA)形成簇的一个实施方案。(A)将线性RCA模板的两端与固定的第一引物分子杂交，使得直接在表面上通过连接酶进行模板循环。(B)一旦间隙被连接酶封闭，即加入含有高度加工性链置换聚合酶的扩增混合物。(C)聚合酶使用环作为模板延伸第一引物的游离3'端。(D)伸长串联的第一链扩增子包含第二引物结合位点的重复单元。这些位点与固定的第二引物分子杂交，作为第二链合成的模板。(E)一旦合成达到下一个单元，伸长的第二链通过RCA聚合酶的链置换活性相互置换。(F)游离的第二链与剩余的游离固定的第一引物分子杂交，促进串联的第一链的进一步合成。相应地，伸长的第一链相互置换，并且循环继续。
图19示出了根据说明书中的实施方案#1的用于引入引物特异性关键序列的方法。Oligo 2的3'端的截短使段1A(Section 1A)的剩余已知序列能够用作关键序列。
图20示出了根据本说明书的实施方案#1的用于引入靶特异性关键序列的方法的另一变体，在这种情况下使用3'截短和5'延伸。Oligo 4的3'-端的截短使段3A的剩余已知序列能够用作关键序列。
图21示出了根据说明书中的实施方案#2的用于引入引物特异性关键序列的方法。在该实施例中，表面结合的捕获寡聚体/引物(Oligo 6)的5'端的合成、非特异性序列(段6B)可用作已知的通用关键序列。步骤(a)：在溶液中提供的测序模板(Oligo 5)与Oligo 6的互补序列的段6A杂交(表面结合)。步骤(b)：添加酶后，可以从Oligo 5的3'端到Oligo 6的段6B发生聚合。所得到的序列可以用于设置信号碱基调用参数。Oligo 6上的3'阻断部分防止从该末端聚合。步骤(c)：如上所述，Oligo 6的3'端解除阻断。步骤(d)：添加另外的聚合酶(如果需要)后，现在可以通过Oligo 5的未知区域进行测序反应。
图22是样本制备盒的一个优选的实施方案的俯视渲染图。图A和B描绘了主盒体中室的两种可能的试剂/测定配置。
图23是样本制备盒的一个优选的实施方案的俯视渲染图，描绘了主体加上2个附加功能翅片。图A和B描绘了Mag-Sep翅片的替代微流体配置。“Mag-Sep”是指磁分离。
图24A是样本制备盒的一个优选的实施方案的3D CAD渲染图。图24B是根据图A中的设计构建的实际原型盒的照片。
图25是文库制备盒的一个优选的实施方案的俯视渲染图，描绘了主体加上1个附加功能翅片。图A和B描绘了主盒体中室的两种可能的试剂/测定配置。“Mag-Sep”是指磁分离。
图26.图A是文库制备盒的一个优选的实施方案的3D CAD渲染图。图B是根据图A中的设计构建的实际原型盒的照片。
图27显示了簇生成/测序(CA-Seq)盒的一个优选的实施方案的俯视图。图A和B描绘了主盒体中室的两种可能的试剂/测定配置。
图28.图A是簇生成/测序(CA-Seq)盒的一个优选的实施方案的3D CAD渲染图。图B是根据图A中的设计构建的实际原型盒的照片。
图29示出了用于本发明的流动池组件的一个示例。可以将阀(显示了一种可能的配置)粘合或焊接到翅片上。膜可以是溶剂粘合、热焊接或激光焊接的，或者通过压敏粘合剂。流动池通过PCB(印刷电路板)进行热熔。膜和芯片之间的硅垫圈未示出。
图30是测序试剂盒的3D渲染图，此处所示的测序试剂盒连接到用于流体控制和其他所需功能的歧管以及簇生成/测序盒。示出了试剂瓶及其内容物的一种特定配置，但也可以设想其他配置。
图31是用于流体控制和其他所需功能的测序试剂盒的示例性歧管的3D渲染图。
图32描述了测序试剂输送系统的一个示例。
图33示出了集成测定盒的两个示例性设计。
图34显示了包含在前述图中所示的盒内的各种部件(并非所有部件均在该图中显示或描绘)。所显示的功能(例如STC、PCR1&2、CC等)仅是示例性的。这些部件可以用于特定应用所需的各种功能。编号的部件是(在本示例中)，1)样本输入端口(在本配置中为2个)；2)机械裂解单元；3)特异性靶捕获(STC)室；4)PCR1和PCR2等分室；5)PCR1和PCR2反应室；6)拷贝控制(CC)室；7)冷凝阱室(STC和CC)；8)簇生成和测序流动池；9)气动连接，用于流体控制；10)SPI，用于接入到不同室的流体连接；11)STC和CC翅片(多个热混合室和珠捕获区域)；12)扩增/稀释翅片(双面热控制)。
图35描述了在集成盒中进行的给定应用(例如，检测血液中的病原体)的示例性机械裂解(ML)过程的以下步骤：1)通过液体处理器从真空采血管中取出血液；2)将血液转移到特异性靶捕获(STC)室中，然后将液体试剂添加到血液中；3)流体在室之间来回混合，同时通过加热的仪器接口进行孵育；4)将血液和试剂溶液转移到机械裂解室，其中仪器上的电机使得桨快速旋转以实现裂解。请注意，为了便于查看特征部件，此图中并未显示盒的所有部件。
图36描述了在集成盒中进行的给定应用(例如，检测血液中的病原体)的示例性特异性靶捕获(STC)过程的以下步骤：1)将裂解的血液溶液从ML室转移回STC室；使用液体处理器经由端口1将捕获珠输送到室；2)在STC室中的加热培养步骤期间，将珠充分混合；3)对接磁体以在通过液体处理器抽取血液时接触蛇形通道以收集珠；通过端口(1)引入洗涤和洗脱缓冲液。请注意，为了便于查看特征部件，此图中并未显示盒的所有部件。
图37描述了在集成盒中进行的给定应用(例如，检测血液中的病原体)的示例性靶扩增(例如，用于靶向富集和标签/衔接子添加的PCR1和PCR2)过程的以下步骤：1)液体处理器从STC子模块提取靶核酸；2)液体处理器将靶溶液装载到PCR1室中，在流体路径中再水化冻干试剂；通过仪器在室上进行热循环；3)PCR1完成后，液体处理器提取PCR1产物并稀释；4)液体处理器将稀释的PCR1产物输送到PCR2室，在流体路径中再水化冻干试剂；通过仪器在室上进行热循环。请注意，为了便于查看特征部件，此图中并未显示盒的所有部件。
图38描述了在集成盒中进行的给定应用(例如，检测血液中的病原体)的示例性拷贝控制(CC)过程的以下步骤：1)通过液体处理器汇集PCR2产物；2)液体处理器将PCR2产物装载到拷贝控制室中；制备珠并通过液体处理器输送；3)通过加热的仪器接口混合和孵育流体和珠；4)磁体与盒蛇形件对接，以在流体被抽入液体处理器时收集珠；通过液体处理器将洗涤和洗脱缓冲液引入端口(2)。请注意，为了便于查看特征部件，此图中并未显示盒的所有部件。
图39描述了在集成盒中进行的给定应用(例如，检测血液中的病原体)的示例性簇生成和测序过程的以下步骤：1)通过液体处理器收集洗脱的模板；2)通过液体处理器将模板和簇生成试剂引入簇生成/测序流动池；3)通过加热的仪器接口孵育流动池；4)通过仪器流体歧管输送测序试剂，并进行测序。请注意，为了便于查看特征部件，此图中并未显示盒的所有部件。
图40突出显示了图45中所示仪器的示例性特征，此处所示为用于特定应用或一组应用。特征是灵活的，以适应广泛的应用。
图41是密封气动接口(SPI)端口的横截面示意图(左)和3D渲染图。
图42描述了试剂盒的两个示例性设计。可以通过多种方式访问和移动流体，包括通过液体处理器(LH；例如，移液器系统)和液体歧管(LM；例如，在仪器上)。可采用不同的阀设置方法，包括密封气动接口(SPI)端口。在中心图中，数字对应于，1)箔密封冻干试剂库(LH通道)：2)箔密封液体试剂库(LH通道)；3)所有测序废物(以及任选的测定盒废物)的废物体积；4)废物入口端口(歧管端口和SPI)；5)核苷酸室(各自具有SPI和用于流体和CO2洗涤的歧管端口)；6)洗涤室(SPI和歧管端口)；7)碱石灰室(用于CO2洗涤)。SPI和歧管端口覆盖有例如可去除的密封件或可刺穿的箔。
图43示出了试剂盒的另一个示例性设计。部分A容纳液体试剂，部分B容纳干燥试剂，部分C是测序试剂和其他散装试剂的接口，根据需要，部分W(试剂盒的负空间)用于废物储存(IM是与仪器歧管的连接)。液体和干燥试剂室/瓶用箔密封，箔由液体处理器的移液器吸头(pipette tip)刺穿，以重构(干燥试剂)并转移试剂。室和瓶子的设计允许在盒上存储的试剂具有很大的灵活性，允许在盒上进行大量不同的测定/处理。部分B模块可以在制造过程中分离，独立填充和干燥，也可以在低湿度环境中隔离储存。在一些实施方案中，部分A也可以在制造、填充和储存期间被分离。在优选的实施方案中，试剂盒中的一个或以上室包含磁性搅拌棒(见图)，当将盒装载到仪器中时，该磁性搅拌棒与仪器中的磁性搅拌马达对接(例如，可用于试剂的板载制备/混合)。
图44提供了关于试剂盒及其功能的更多细节。
图45是在本发明的系统中使用的一个示例仪器架构的3D渲染图。
图46突出显示了图I-1所示仪器的一些盒装载特征。
图47突出显示了图I-1所示仪器的其他的示例性特征(从另一边观察)，此处所示为用于特定应用或一组应用。特征是灵活的，以适应广泛的应用。
图48再次突出显示了图I-1所示仪器(从背面看)的其他示例性特征(侧重于电子器件)，此处所示为用于特定应用或一组应用。特征是灵活的，以适应广泛的应用。
图49突出显示了图I-1所示仪器的又一其他示例性特征(侧重于冷却)，此处所示为用于特定应用或一组应用。特征是灵活的，以适应广泛的应用。
图50是qPCR结果的图，显示了使用特异性靶捕获(STC)寡聚体直接从血液(DfB)中回收加标的抗微生物耐药性(AMR)靶标。
图51是证实ssDNA洗脱的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1：DNA ladder，泳道2：5ng的dsDNA P3靶标和100ng的ssDNA(IDT-ultramer)，泳道3：5ng的dsDNA P31靶标和100ng的ssDNA(IDT-ultramer)，泳道4：5ng的dsDNA P48靶标和100ng的ssDNA(IDT-ultramer)，泳道5；68.1ng来自PCR2反应的dsDNA，泳道6：70.3ng的多路复用(P3、P31和P48靶标)全捕获ssDNA材料，平行测定(replicate)1；泳道7：71.3ng的多路复用(P3、P31和P48靶标)全捕获ssDNA材料，平行测定2；泳道8：78.3ng多路复用(P3、P31和P48靶点)全捕获ssDNA材料，平行测定3。
图52是证实从NaOH洗出液中洗脱的ssDNA的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1：DNAladder，泳道2：ssDNA对照，泳道3和4：dsDNA对照，泳道5和6：NaOH ssDNA洗出液。
图53是显示使用SM-RPA的三种合成DNA模板的孔内扩增的荧光显微镜图像。这显示了合成DNA模板的三个不同起始拷贝，通过各自靶标的图像中看到的不同强度，可以看到扩增的靶DNA斑。
图54是使用RCA确认靶核酸的孔内克隆扩增产物的荧光显微镜图像。测试了模板的两个不同起始拷贝，各模板输入使用单独的芯片。对于给定的模板输入，对相同的区域进行成像，其显示在非重叠区域中可区分的扩增的靶DNA产物的离散簇(显示在各自荧光团的单独图像中)。
图55显示了直接固定在芯片表面上的合成DNA模板的测序结果。散点图显示了x轴上的“比对读长”与y轴上的“比对读长-错误”，相应的直方图分别位于顶部和右侧。
图56显示了使用直接杂交方法对合成DNA模板进行测序的结果。散点图显示了x轴上的“比对读长”与y轴上的“比对读长-错误”，相应的直方图分别位于顶部和右侧。
图57显示了全血中加标的病原体的自动样本应答测序的结果。顶部：散点图显示了x轴上的“比对读长”与y轴上的“比对读长-错误”(标记为“effectiveReadLen”)，相应的直方图分别位于顶部和右侧。底部分析：输出表明加标病原体被正确调用。
图58A示出了示例性仪器的透视图。
图58B示出了图58A的仪器的前视图。
图58C示出了图58A的仪器的侧视图。
图58D示出了图58A的仪器内的盒接口组件。
图58E示出了图58A的仪器内的示例性气动泵送子单元。
图58F示出了示例性功率子单元在图58A的仪器内的定位。
图58G示出了图58A的仪器内的示例性空气处理和试剂盒进气子系统。
图58H示出了图58A的仪器内的液体冷却子系统。
图58I示出了在图58A的仪器内的示例性冷凝管理子系统的定位。
图59显示了用于本文所述各种仪器的气动子系统。
图60示出了根据某些实施方案的示例性样本或测定盒。
图61示出了根据某些实施方案的示例性试剂盒。
图62示出了使用本文所述的仪器和盒进行测定的示例性工作流程。
图63示出了具有文库制备单元的示例性样本或测定盒。
图64示出了具有样本输入和机械裂解子单元的示例性样本或测定盒。
图65示出了具有特异性靶捕获子单元的示例性样本或测定盒。
图66示出了示例性测定盒内的示例性流动池和移液器存储器。
图67示出了配置用于1mL移液器吸头的示例性SPI端口。
图68示出了配置用于5mL移液器吸头的示例性SPI端口。
图69示出了根据某些实施方案的示例性特异性靶捕获子单元。
图70示出了示例性文库制备单元或PCR翅片。
图71示出了说明使用示例性盒兼容的机械裂解子单元成功地进行机械裂解和观察释放的靶核酸的PCR结果。
图72示出了说明使用示例性盒兼容子系统成功捕获特异性靶的PCR结果。
图73显示来自实施例R的各种PCR结果的电泳图叠加。
图74显示使用实施例S中的直接杂交方法从扩增的模板获得的测序结果。
具体实施方式
本公开提供了用于快速分析靶多核苷酸，包括确定其核苷酸序列的寡聚体、方法、组合物和套件。可以使用全自动系统从大范围的输入样本类型和量进行分析，该全自动系统包括盒、仪器以及操作和分析软件，在运行开始后无需人工干预(样本到报告)。此外，公开了完整的工作流程，举例说明了本发明的化学和机械以及其他方面。
一般来说，所述工作流程包括以下一个或以上部分：1)样本制备，2)文库制备，3)拷贝控制，4)簇生成或5)测序。公开了盒和仪器的设计和概念，其中各部分的所有化学工作流程步骤均可以以自动化的方式进行。公开了包括在半导体芯片的表面上进行测序的实施方案。已经编写了控制仪器所有功能的软件，以及从原始数据到最终报告的所有数据分析阶段的[软件控制]算法(即，运行测试的问题的答案是什么)。
1.样本类型
设想广泛的样本类型(“定义”部分提供了样本类型的示例性非详尽列表)均适用于所公开的发明。在优选的实施方案中，样本是液体形式，并且整个样本或其一部分被引入盒中。在另一个优选的实施方案中，样本为固体形式，但在引入盒之前进行处理以使样本或其一部分变成液体形式。或者，将固体处理成悬浮液、浆液、乳液或类似物，然后将其引入盒中。在另一个实施方案中，将固体样本直接引入盒中，并在工作流程开始时或接近工作流程开始时在盒中进行处理，以将样本呈现为液体、悬浮液、乳液等形式。或者，可以在引入盒之前或之后直接从固体样本中提取靶多核苷酸。在另一个实施方案中，样本在获得时已经是悬浮液、浆液、乳液或类似物的形式，并且直接引入盒中，或者在引入盒之前处理成液体、固体或气体形式。在另一个实施方案中，样本是气体。通常在气体样本中，靶多核苷酸以气溶胶或悬浮液的形式存在于样本中，与细胞缔合或不与细胞缔合。可以将气体样本直接引入盒中，并且可以收集、悬浮或以其他方式从气体样本中收获多核苷酸，然后将其引入盒中。设想样本输入端口将可容纳所述广泛范围的样本类型。为了实现这一点，样本输入端口可以以各种形式存在，包括但不限于，1)直接容纳所有样本类型的通用样本端口，2)为特定样本类型或一组样本类型设计的样本端口，其中具有不同样本输入端口的盒可用于不同的测定类型，3)准通用样本端口，其容纳为给定样本类型设计的适配器附件，使得根据要进行的测定将适当的适配器连接到盒。
优选的样本类型包括全血，例如，如在所公开的发明的优选实施方案中使用的，其中利用系统检测血流感染以及抗微生物药物耐药性基因(参见下文中的进一步详述)和血浆，例如，在优选的实施方案中用于检测细胞游离DNA(cfDNA)，包括循环肿瘤DNA(ctDNA)。其中包括全血的优选样本类型的另一个优选的实施方案是检测血浆中的靶标，例如但不限于cfDNA、ctDNA和各种病毒感染(例如HIV)。在这样的实施方案中，可以优选在测定盒中将血浆与全血分离，但也可以在样本采集管或理想地与样本输入端口直接对接的其他装置中进行。
2.样本制备
设想广泛的样本制备方法和组合物(在“定义”部分中提供了示例性的、非详尽的样本制备方法列表)适用于所公开的发明。
在一个优选的实施方案中，全血是样本，并且靶多核苷酸包含在全血中存在的各种传染原(例如，细菌、真菌、病毒)中(示例性应用是检测血流感染以及抗微生物药物耐药性基因)。该实施方案的示例性样本制备方法包括以下步骤：1)将全血样本与样本制备试剂(例如，包括用于样本均化和细胞裂解的试剂；在该优选的实施方案的该特征的一个方面，剧烈混合有助于溶解样本)混合；2)通过在高温下孵育并同时用蛋白酶K消化样本中的蛋白质来进一步均化样本；3)将均化的、消化的样本与撞珠(bashing beads)混合；4)使用例如旋转叶轮以相对高的速度(例如8000RPM)混合珠和样本，从而裂解感染剂并将其中包含的靶多核苷酸释放到溶液中；5)在高温(例如，95℃)下加热样本，使双链形式的靶多核苷酸变性(这一步骤也有助于剥离蛋白质以及围绕和/或结合靶多核苷酸的其他成分和/或结构)；6)将变性的靶多核苷酸样本与一组特异性靶捕获(STC)寡核苷酸混合(STC寡聚体可以设计为靶向例如特异性靶、一组特异性靶、大范围靶等，如下文中进一步讨论的)；7)加热STC寡聚体/靶混合物(例如，60℃)以促进STC寡聚体与其特异性靶序列的退火；8)将STC寡聚体/靶混合物与链霉亲和素衍生的顺磁颗粒混合；9)混合、然后孵育STC寡聚体/靶混合物(例如，45℃)，以促进STC寡聚体/靶混合物(STC寡聚体包括悬垂(appended)的生物素分子)与珠的结合；10)使用磁体固定STC寡聚体/靶混合物/珠复合物；11)洗涤STC寡聚体/靶混合物/珠复合物；12)洗脱靶多核苷酸，其现在准备好可以在工作流程中进行进一步处理。
上述优选的实施方案具有许多优点，包括但不限于：1)在全自动系统中的盒中自动化进行整个过程；2)当样本处理完成时，在封闭的盒中不间断地继续工作流程，因此不需要用户干预来继续处理测试/测定；3)盒中容纳了大量全血，提高了包括灵敏度在内的整体测试/测定性能；4)以快速有效的自动化方案将样本均化、进行细胞裂解和靶多核苷酸变性，准备进行进一步处理；5)特异性靶捕获(STC)过程在快速方案中提供了高度纯化；6)STC过程提供了高度的特异性，除其他参数外，通过捕获寡聚体设计和反应条件(混合物组成、温度等)进行调节；7)STC过程提供了高度的包容性，同样使用捕获寡聚体设计、反应条件等，其中所有沿着系统发育树的DNA序列可以根据需要被捕获或排除；8)洗脱的样本可以在不需要分析的情况下进行进一步处理。
在其他实施方案中，段落中所述的优选样本制备实施方案的各种特征可以以各种组合直接用替代特征/方法代替，包括例如，1)蛋白酶K可以被一种或以上替代酶、洗剂、离液剂(例如，GuSCN)、化学剂(包括还原剂)等取代或增强；2)在与裂解试剂混合后可能不需要进一步样本均化；3)通过锆珠用珠撞击进行的细胞裂解可以用替代性珠、球或其他研磨介质、超声处理、洗剂、离液剂、还原剂(DTT、β-巯基乙醇)和/或其他化学试剂代替或增强；4)均化和细胞裂解可以同时进行；5)如果靶标还可用于进一步处理，则可以省略使得双链靶多核苷酸变性的步骤；6)如果给定的应用不需要靶捕获/隔离/分离，则样本或其部分可以在这一点直接用于进一步处理；7)STC[单独]可以被替换为，例如，a)非特异性靶捕获(例如，Boom方法；参见“定义”部分中的其他示例性方法)，b)非特异性和特异性靶捕获方法的组合(例如，先Boom方法后STC方法)，c)使用适配体捕获，d)过滤，e)等电聚焦，f)“定义”部分列出的其他方法，g)其组合。
在一些实施方案中，靶捕获寡聚体(TCO)除了单独的靶捕获之外，还可以发挥其他作用。例如，TCO可以包括一个或以上可用于下游过程的标签(例如，唯一分子标识符(UMI)、通用扩增引物位点、启动子(例如，T7 RNA聚合酶启动子)、测序用衔接子等)。此外，TCO可以用作延伸和扩增的引物(其可以与一个或以上标签协同工作以实现期望的功能)。在一些工作流程中，TCO的退火及其通过聚合酶的延伸可以在同一反应混合物中同时或在不同时间(或重叠时间)进行。在其他情况下，TCO的退火可以首先发生，然后是TCO的延伸，例如，在添加或与另一试剂组合时。在其他情况下，退火后可以首先发生TCO/靶复合物的分离，然后在随后的步骤中延伸，例如，当TCO/靶复合物仍然固定在固体载体上时。在最后描述的这些工作流程中的一些中，可以进行延伸，然后对固定的TCO/靶复合物进行最终洗涤，然后进行洗脱。在这种情况下，例如，靶多核苷酸现在准备好移动到已经纯化、标记和延伸的过程的下一部分，从而在整个工作流程中节省时间、步骤等。
在一些实施方案中，不需要样本制备(即，靶多核苷酸可以在该方法的第一步中“从样本中直接”使用，例如扩增)。
由本发明盒公开或设想的广泛的反应室、储存室、流体互连、阀配置、试剂输送选择、功能(混合、搅拌、加热、运输、分离、包括磁力作用等)，这些样本制备工作流程选项中的每一个均可以包括在快速、全自动工作流程框架内。
3.文库制备
设想了适用于所公开的发明的广泛的文库制备方法和组合物(在“定义”部分中提供了文库制备法的示例性非详尽列表)。可以通过多种途径作为文库制备的输入提供靶多核苷酸，包括直接从样本提供或以多种样本制备方法的输出形式提供。在一个优选的实施方案中，使用扩增(例如支持靶向测序方法的扩增)选择性富集靶多核苷酸的一部分或多个部分。该优选的实施方案的其他可选特征包括标签的引入，任选地包括衔接子，两轮或多轮的单独扩增，任选地包括第二轮和/或(若有的)后续轮的嵌套引物的使用，以及拷贝控制(参见本文其他地方；描述为单独的特征，但也可以与文库制备叠用)。一个示例性应用是检测血流感染以及抗微生物药物耐药性基因。本实施方案的示例性文库制备方法包括以下步骤：1)将靶多核苷酸与第一扩增试剂混合(如本文其他地方所述，靶多核苷酸可以来自多种来源；一个优选来源是上述样本制备方法的输出，其利用全血作为样本类型)；2)使用PCR进行第一扩增；3)稀释第一扩增的产物；4)将稀释的第一扩增产物的等分试样与第二扩增试剂混合；5)使用PCR进行第二扩增；6)将第二扩增产物与捕获试剂(包括磁性捕获珠)结合和混合；7)将第二扩增产物/捕获试剂混合物在环境温度(约20-26℃)下孵育10分钟，并不断混合；8)使用磁体固定第二扩增产物/珠复合物；11)洗涤第二扩增产物/珠复合物；12)将洗脱试剂添加到洗涤的第二扩增产物/珠复合物中，混合并在环境温度(约20-26℃)下孵育1分钟。洗脱的文库分子现在可以在工作流程中进行进一步处理了。
以上段落中总结的文库制备工作流程优选的实施方案的重要特征和优点包括：1)可以接受非常广泛的样本输入类型和量；2)第一扩增反应(PCR1)被设计为具有高灵敏度和保真度；3)PCR1中使用的引物被设计为广泛扩增样本中可能包含的细菌和真菌靶标谱，靶向细菌16S和23S、真菌28S和特异性抗微生物药物耐药性(AMR)基因；4)在进入第二扩增(PCR2)之前不需要纯化PCR1扩增子，只需要简单的[自动]稀释(这与需要纯化步骤的现有技术方案不同)；5)用于PCR2的引物嵌套在用于PCR1的引物位点内，并且被设计为对目的靶多核苷酸或核苷酸具有高特异性；6)可以使用来自相同稀释度的PCR1产物的等分试样来进行多种不同的PCR2反应(例如，盒设计的一个实施方案(参见下面的“测定盒”部分)示出了10个专用于单独的PCR 2反应的单独的室)，通过降低系统的复杂性(即，在不同的10个反应而不是例如1个反应中覆盖所需数量的靶标，从而减少任何给定PCR2反应中引物的数量)和/或增加系统的多路复用能力来增加各反应的特异性；7)在该优选的实施方案的一种情况下，PCR2中使用的引物对的至少一个引物配备有一种或以上生物素分子，使得能够使用链霉亲和素缀合的微球(或类似物)固定其扩增子产物；8)可以在PCR1、PCR2或其组合中添加一个或以上标签，包括衔接子，如果需要，包括在扩增子的两端引入标签；9)可以在上面概括的文库制备工作流程步骤之后增加添拷贝控制过程，或者被设计为与PCR2步骤重叠/引入到PCR2步骤中，或者甚至在工作流程中更早的时候(参见下文其他地方的更多详细描述)。总之，该方法可以使用多种靶多核苷酸输入类型和量，具有高度敏感性和特异性，可以用于容易地引入标签，包括衔接子，可以容易地与拷贝控制过程对接(或重叠)，简单(例如，仅1个纯化步骤)，快速且易于自动化。
在其他优选的实施方案中，段落中所述的优选文库制备实施方案的各种特征可以以各种组合直接用替代特征/方法代替，包括例如，1)可以使用不同的嵌套扩增配置，例如，a)引物仅嵌套在靶区的1端，b)不使用嵌套，c)不同靶多核苷酸的嵌套模式不同，2)PCR可以用另一种扩增方法代替；3)可以进行一次扩增反应而不是2次扩增反应(当可以实现所需的性能，例如灵敏度、特异性、多路复用能力，并且如果需要，仍然可以引入标签，包括衔接子)，使工作流程更加简单和快速；4)文库制备的各个方面可与样本制备重叠(在下文中更详细地讨论)；4)标签，包括衔接子，包括唯一分子标识符(UMI)，可以使用扩增以外的方法附接(attached)到靶区，例如连接(ligation)；5)可以在上述实施方案中所述工作流程结束时紧接着加入拷贝控制方法，或者在即将进行纯化步骤之前加入，或[从]PCR2(或替代扩增方法)步骤[开始]，或者甚至从第二扩增步骤的最后一个或几个循环开始、或从PCR1(或替代扩增方法)步骤、或1扩增步骤(如果只有1个)，或者甚至早在样本制备(拷贝控制方面也在本文其他地方讨论)开始。在“定义”部分中列出可用于本文公开的方法中的其他文库制备方法。
如上所述，文库制备的各个方面可能与样本制备重叠。以下是一些例子来说明这一概念。1)可以作为引物的寡聚体在样本制备过程中与靶多核苷酸退火。引物也可以起到其他作用，如靶捕获寡聚体的作用。寡聚体可以以所需的特异性水平与靶多核苷酸退火，在该早期阶段(样本制备)增加测定的总体特异性，从而提高测定性能。如果需要，寡聚体可以还包括标签，包括衔接子，包括UMI、通用引物位点等。在某些时刻，例如，与退火同时，在第二步骤中退火后(例如，将退火反应混合物与延伸反应混合物合并)，在寡聚体/靶复合物固定后(例如仍固定时)，在洗脱后等，或者本质上作为文库制备的第一阶段的一部分，使寡聚体延伸。这种延伸产物现在可以进入工作流程的剩余部分，已经配备了标签，并且已经达到了一定的特异性水平，这可能会节省整个测定的步骤和时间。同样在这种模式下，第一(或唯一)扩增步骤可以利用特异性对向引物(具有任何所需的特异性水平，甚至通过使用随机引物可能是非特异性的)，如果需要，还可以利用与寡聚体的标签序列的[至少一部分]结合的通用引物。此外，在样本制备过程中引入标签，包括衔接子，包括UMI，可能会使[样本制备]产物绕过文库制备，直接进入工作流程的其他步骤，例如簇生成和/或测序(在灵敏度足够且不需要另外标签等的应用中)。2)紧接着使用上述方法1的变体，可以使寡聚体与双链靶多核苷酸的每条链退火，每条链均具有所需的特异性水平，并且一个或两个链均包括标签(包括衔接子，包括UMI)。这可能会在该早期阶段完成更多的工作流程，节省步骤和时间，并提高总体特异性。此外，文库制备的第一步(可能是唯一一步)可以是使用与靶标两端的标签序列退火的引物进行通用扩增。这些可以相同也可以不同。此外，在样本制备步骤和/或通用扩增步骤(使用配备有标签的通用引物)期间，可以将工作流程的其他步骤所需的其他元件引入靶标。3)标签(包括衔接子，包括UMI)可以在样本制备过程中连接到靶多核苷酸。
由本发明的盒公开或设想的广泛的反应室、储存室、流体互连、阀配置、试剂输送选择、功能(混合、搅拌、加热、运输、分离、包括磁力作用等)，这些文库制备工作流程选项中的每一个均可以包括在快速、全自动工作流程框架内。
4.拷贝控制
“拷贝控制”(CC)是指以预定的方式(例如，有限的量，即高达但不超过预定的量；或特定的预定量)控制作为给定过程输出的分子拷贝数的组合物和方法。此外，在某些工作流程中，希望将附加序列引入到靶多核苷酸(例如标签)中，例如将衔接子引入到测序文库中。这也可以在CC组合物和方法中实现(更多详细描述请参见“定义”以及附图及其相关简要说明)。在本文公开的许多工作流中包括CC。“用于分离靶多核苷酸的组合物、试剂盒和方法”(PCT/GB2021/050098)中公开了多种CC组合物和方法，通过引用将其全部并入本文。其中公开的所有CC组合物和方法均适用于本发明的工作流程。此外，CC方法的示例概括于本文所包括的图1-14中(参见“附图说明”中的所附说明)。
优选的CC实施方案包括捕获寡聚体，该捕获寡聚体在5'至3'方向上包括：捕获序列、内部延伸阻断序列、捕获序列的互补序列和靶杂交序列，其中捕获序列的互补序列被配置为在不存在与靶杂交序列和捕获序列的互补序列退火的延伸靶序列的情况下，与捕获序列退火。在一些这样的优选的实施方案中，捕获寡聚体具有式5'-A1-C-L-B-A2-C'-A3-RB-A4-THS-X-3'，其中A1是任选存在的第一附加序列，C是捕获序列，L是任选存在的接头，B是内部延伸阻断序列，A2是任选存在的第二附加序列，C'是捕获序列的互补序列，A3是任选存在的第三附加序列，RB是任选存在的可逆延伸阻断序列，A4是任选存在的第四附加序列，THS是靶杂交序列；并且X是任选存在的阻断部分。在这些优选的实施方案中的一些实施方案中，捕获序列包括poly A或poly T序列，并且捕获序列的互补序列包括poly T或poly A序列。
另一个优选的实施方案包括包括捕获寡聚体和互补寡聚体的组合，其中，(a)捕获寡聚体在5'至3'方向上包括：包括第一和第二部分的捕获序列、内部延伸阻断序列、包括第一和第二部分的间隔序列和靶杂交序列；并且(b)互补寡聚体在3’至5’方向上包括：捕获序列的第二部分的互补序列和间隔序列的至少第一部分的互补序列，其中捕获序列的第二部分的互补序列和间隔序列的至少第一部分的互补序列被配置为在不存在所述间隔序列的互补序列的情况下，同时与捕获寡聚体退火。在一些这样的优选的实施方案中，捕获寡聚体具有下式：5'-A1-C1-C2-B-A2-S1-S2-A3-RB-A4-THS-X-3'，其中A1是任选存在的第一附加序列，C1是捕获序列的第一部分，C2是捕获序列的第二部分，B是内部延伸阻断序列，A2是任选存在的第二附加序列，S1是间隔序列的第一部分，S2是间隔序列的第二部分，A3是任选存在的第三附加序列，RB是任选存在的可逆延伸阻断序列，A4是任选存在的第四附加序列，THS是靶杂交序列，并且X是任选存在的阻断部分。在一些这样的优选的实施方案中，互补寡聚体具有下式：5'-S1'-A2'-L-C2'-X-3'，其中S1'是间隔序列的至少第一部分的互补序列，A2'是任选存在于捕获寡聚体中的第二附加序列的任选存在的互补序列；L是任选存在的接头，C2'是捕获序列第二部分的互补序列，并且X是任选存在的阻断部分。
又一优选的实施方案包括包括捕获寡聚体和互补寡聚体的组合，其中，(a)捕获寡聚体在5'至3'方向上包括：包括第一和第二部分的捕获序列，以及包括第二和第一部分的靶杂交序列；并且(b)互补寡聚体在3'至5'方向上包括：捕获序列的第二部分的互补序列和靶杂交序列的第二部分的互补序列，其中捕获序列的第二部分的互补序列和靶杂交序列的第二部分的互补序列被配置为在不存在靶杂交序列的互补序列的情况下，同时与捕获寡聚体退火。在一些这样的优选的实施方案中，捕获寡聚体具有下式：5'-A1-C1-C2-A2-S-A3-THS2-THS1-X-3'，其中A1是任选存在的第一附加序列，C1是捕获序列的第一部分，C2是捕获序列的第二部分，A2是任选存在的第二附加序列，S是任选存在的间隔序列，A3是任选存在的第三附加序列，THS2是靶杂交序列的第二部分，THS1是靶杂交序列的第一部分，并且X是任选存在的阻断部分。在一些这样的优选的实施方案中，互补寡聚体具有下式：5'-THS2'-A3'-S'-A2'-C2'-X-3'，其中THS2'是靶杂交序列的第二部分的互补序列，A3'是任选存在于捕获寡聚体中的第三附加序列的任选存在的互补序列；S'是任选存在于捕获寡聚体中的间隔序列的任选存在的互补序列，A2'是任选存在于捕获寡聚体中的第二附加序列的任选存在的互补序列；C2'是捕获序列的第二部分的互补序列，并且X是任选存在的阻断部分。
另一个优选的实施方案是从组合物中捕获靶多核苷酸的方法，该方法包括：使靶多核苷酸与如上所述和PCT/GB2021/050098中公开的其他捕获寡聚体接触，其中捕获寡聚体的靶杂交序列在包括靶多核苷酸的3'端的位点处与靶多核苷酸退火；用具有链置换活性的DNA聚合酶延伸靶多核苷酸的3'端，从而形成捕获序列的互补序列的互补序列，其与捕获寡聚体退火，使得捕获寡聚体的捕获序列可用于结合；使捕获寡聚体的捕获序列与包括捕获序列的互补序列和(i)结合配偶体或(ii)固体载体的第二捕获试剂接触，从而形成包括靶多核苷酸、捕获寡聚体和第二捕获试剂的复合物；以及从组合物中分离复合物，从而捕获靶多核苷酸。
另一个优选的实施方案是从组合物中捕获靶多核苷酸的方法，该方法包括：使组合物与如上所述以及如PCT/GB2021/050098(权利要求28-30或34-51中的任一项)中公开所述的捕获寡聚体和互补寡聚体的组合接触，其中捕获寡聚体的靶杂交序列在包括靶多核苷酸的3'端的位点处与靶多核苷酸退火；用具有链置换活性的DNA聚合酶延伸靶多核苷酸的3'端，从而形成间隔序列的互补序列，间隔序列与捕获寡聚体退火，使得互补寡聚体被置换到足以使捕获寡聚体的捕获序列可用于结合的程度；使捕获寡聚体的捕获序列与包括捕获序列的互补序列和(i)结合配偶体或(ii)固体载体的第二捕获试剂接触，从而形成包括靶多核苷酸、捕获寡聚体和第二捕获试剂的复合物；以及从组合物中分离复合物，从而捕获靶多核苷酸。
在一些其他优选的实施方案中，提供了一种组合，该组合包括捕获寡聚体和互补寡聚体，其中：
(a)捕获寡聚体在5'至3'方向上包括：
捕获序列，其包括第一部分和第二部分，和
靶杂交序列，其包括第二部分和第一部分；并且
(b)互补寡聚体在3'至5'方向上包括：
捕获序列的第二部分的互补序列，以及
靶杂交序列的第二部分的互补序列，其中捕获序列的第二部分的互补序列和靶杂交序列的第二部分的互补序列被配置为在不存在靶杂交序列的互补序列的情况下，同时与捕获寡聚体退火。图10B提供了根据这些实施方案的示例性寡聚体的图示。可以如以上列出的进一步实施方案中所述和/或如图10B(例如，图10B中的任何单个元件或其任何组合)中所示，存在任选的附加元件。
该组合可用于进行有限的捕获，因为互补寡聚体可被配置为结合游离的捕获寡聚体，但不结合与靶多核苷酸结合的捕获寡聚体。例如，捕获寡聚体的靶杂交序列与靶多核苷酸的结合可以比捕获序列的第二部分的互补序列与靶杂交序列的第二部分的结合在能量上更有利。在不存在靶多核苷酸的情况下，互补寡聚体与捕获寡聚体结合，并阻断捕获序列(图10B中的C1+C2)的可及性至足以阻断捕获序列通过第二捕获试剂中捕获序列的互补序列结合的程度，第二捕获试剂可以是本文别处描述的任何第二捕获试剂。
因此，还提供了一种从组合物中捕获靶多核苷酸的方法，该方法包括：
使组合物与上述组合或本文所述的任何其他实施方案的组合接触，其中捕获寡聚体的靶杂交序列与靶多核苷酸退火；
在捕获寡聚体与靶多核苷酸退火之前或之后，使捕获寡聚体与互补寡聚体接触，其中互补寡聚体与游离的捕获寡聚体退火并部分占据其捕获序列，其中互补寡聚体不与包括与靶多核苷酸退火的捕获寡聚体的复合物退火，并且其中如果捕获寡聚体与互补寡聚体的接触发生在捕获寡聚体与靶多核苷酸退火之前，则靶杂交序列与靶多核苷酸的退火造成互补寡聚体从捕获寡聚体解离；
使与靶多核苷酸复合的捕获寡聚体的捕获序列与包括捕获序列的互补序列和(i)结合配偶体或(ii)固体载体的第二捕获试剂接触，从而形成包括靶多核苷酸、捕获寡聚体和第二捕获试剂的复合物；以及
从组合物中分离复合物，从而捕获靶多核苷酸。可以如以上列出的进一步实施方案中所述和/或如图10B(例如，图10B中的任何单个元件或其任何组合)中所示，存在任选的附加元件。
当前公开的发明中的另一种示例性CC方法包括以下步骤：1)将PCR2扩增子(参见下文其他地方的详细描述)与包括本文和PCT/GB2021/050098所述的CC捕获寡核苷酸的CC试剂混合，2)在高温(例如，约95℃)下孵育混合物约3-5分钟以使存在的双链靶核酸(扩增子)变性，3)将混合物在中等温度(例如，约60℃)下孵育约5-10分钟以促进CC捕获寡聚体与靶标退火，4)将扩增子的3'端沿CC捕获寡聚体延伸，从而置换靶捕获序列的互补序列(当适当的试剂存在于反应混合物中时，延伸可以在退火步骤期间发生，或者作为随后的步骤，在这种情况下，单独添加用于延伸的试剂)，5)将延伸反应混合物与包括以用户定义的量存在的捕获序列的互补序列、和(i)结合配偶体或(ii)固体载体的第二捕获试剂混合，6)在中等温度(例如，约45℃)下孵育约3-10分钟，从而形成包括靶核酸、捕获寡聚体和第二捕获试剂的复合物，7)从组合物中分离复合物，从而捕获靶多核苷酸，8)洗涤珠，9)将洗脱试剂加入经洗涤的珠中，混合并在环境温度(22-26℃)下孵育1分钟。洗脱的拷贝控制分子现在可以在工作流程中进行进一步处理。
上述示例性CC工作流程的替代方案包括但不限于，1)在PCR1之后进行上述步骤(即，当在给定的工作流程中不进行PCR2时)，2)用由除PCR之外的方法产生的靶扩增子进行上述步骤，3)在PCR 1或PCR2(或替代扩增方法)期间，添加通用序列位点作为标签；使用该通用标签作为CC捕获寡聚体的通用结合位点(优点包括但不限于，a)仅设计1个用于多个靶标的CC捕获寡聚体，b)更高的多路复用能力，c)跨靶扩增子的一致退火特性等)，4)在PCR1和/或PCR2(或其他扩增方法)期间使用基于CC的策略(如公开的)将标签(代替刚刚描述的通用序列标签或除了刚刚描述的通用序列标签之外)添加至扩增子，5)添加所有期望的标签，包括衔接子，作为CC过程的一部分。请注意，在GB2021/050098中更详细地公开了上文和其中其他地方一般性描述的CC方法(包括标签添加)。
5.簇生成
“簇”是指结合到固体载体上的分子的分组，例如结合到固体载体上的核酸分子。所谓“簇生成”是指生成簇的过程。簇生成过程的例子包括基于扩增的，例如克隆扩增，和基于非扩增的，如靶分子与固定在已知特定区域(例如点)中的固体载体上的寡核苷酸的杂交。簇可以是单克隆的(通常是本公开中的优选配置)或多克隆的。
一种广泛接受的簇生成方法是通过对珠进行乳液PCR，从而进行克隆扩增。在二代测序(NGS)应用中，在克隆扩增后，将珠排列在流动池的表面上(参见US8012690B2)。这项技术已被纳入多个NGS平台，包括Ion Torrent(Thermo)系统、ABI SOLiD和Roche 454。乳化将珠、扩增试剂和单个模板DNA分子封装在分离的水滴(胶束)中，防止交叉污染。虽然乳液PCR是一种经过验证的技术，但其工作流程复杂、耗时(许多个小时)，而且很难以盒的形式实现自动化。其他广泛接受的方法，如Illumina开发的方法(最初为Solexa和Manteia)，使用桥式扩增直接在流动池表面进行克隆扩增。使用桥式扩增的第一代簇生成方法基于由试剂流循环促进的等温聚合酶链式反应的形式(等温桥式PCR；参见US10370652B2和US7972820B2)。在这些方法中，将两个PCR引物共同固定在流动池的表面上，并将两端含有匹配衔接子的靶DNA分子群杂交。接下来，变性和延伸试剂流入连续的循环中，产生直径通常小于1微米的离散克隆簇。这些小簇包含相对较低数量的靶核酸拷贝，这使得它们无法用于需要更大量靶核酸以实现所需测序性能的平台。与乳液PCR类似，等温桥扩增耗时(通常超过4个小时)，并且需要高试剂量。使用桥式扩增的第二代方法基于称为排除扩增(ExAmp)的方法形式的重组酶聚合酶扩增(RPA)(参见US9169513B2)。RPA是一种等温DNA扩增方法，其使用与PCR设计相似的两个引物(参见US7270981B2)。在ExAmp中，两个引物均固定在阵列化(图案化)流动池的表面。扩增位点之间的区域没有引物，并用于防止克隆群之间的混合。代之以在扩增过程开始之前将模板DNA分子杂交到表面，将多个靶标与扩增混合物一起加入。作为结果，同时发生模板杂交和扩增，并且通过以比杂交更快的速率发生的扩增来实现簇克隆性。该过程仍然相对耗时(约3个小时)，但其结果是簇的密度更高，这有利于测序输出。然而，这些同样是包含相对较低数量的靶核酸拷贝的小簇。
除了乳液PCR和桥式扩增外，另一种创建克隆簇的方法是通过滚环扩增(RCA)。在这种方法中，模板DNA分子在与单个扩增引物杂交并延伸单个扩增引物之前被环化。这产生了含有靶序列的多联体的长扩增子分子，为下游分析提供了大量的DNA。BGI和CompleteGenomics开发的测序平台使用溶液相RCA的形式来创建DNA纳米球，然后将其与图案化阵列杂交(DOI:10.1126/science.1181498)。创建和操作DNA纳米球需要精确和适当的质量控制，这使快速、基于盒的形式的应用变得复杂。
除了溶液相方法外，QIAGEN还投资开发了用于他们的GeneReader平台的指数表面相RCA(US2018/0105871、US2018/0112251、EP1916311、US9683255B2、US2018/0087099)。该方法基于指数RCA，其中使用两个(或多个)扩增引物而不是一个(US5854033、US6143495、1101/gr.180501、US6323009)。在这种方法中，对多个靶标进行修饰，使其两端上均包含衔接子序列，然后将其用于使模板连接成环。然后将DNA环杂交到流动池的表面，在那里两个扩增引物被共同固定。扩增引物与环形模板中存在的衔接子互补，这使得可进行“支化(branched)”指数RCA反应(DOI:10.1093/biomethods/bpx007)。该协议包含许多步骤并且可能很耗时。需要更简单、更快的工作流程才能有效地应用于快速、基于盒的系统。
a.寡核苷酸的固定
在固体载体上的簇生成通常需要将一种或以上寡核苷酸或多核苷酸固定到所述固体载体。为本公开的目的，支持所公开的实施方案的相关一个或以上步骤的任何固定方法均是可接受的。这包括但不限于共价和非共价方法；直接和间接方法；附着在表面的特定区域(例如，斑点、阵列等)，并在整个表面上基本固定；附着到平面表面、包括特征的表面(例如，孔、柱、垫)、颗粒等；等等。
在其中公开的几个优选的实施方案中，将寡核苷酸附着到半导体芯片顶部制造的孔的表面。用于这种附着的常见方法包括Click Chemistry(例如参见Click Chemistry,aPowerful Tool for Pharmaceutical Sciences(2008)Hein,et al.；Pharm Res 25(10)：2216-2230以及A Hitchhiker’s Guide to Click-Chemistry with Nucleic Acids(2021)Fantoni et al.,Chem Rev,121:7122-7154)。在某些实施方案中，待附着的寡核苷酸包括5'-DBCO＝5'-端二苯并环辛基(DBCO)部分(例如参见实施例N，“使用孔内克隆扩增产生的模板的测序”)。在这样的实施方案中，一种优选的缀合方法包括用丙烯酰胺基聚合物涂层活化芯片表面，然后共价连接5′修饰的一个或以上寡核苷酸。示例性方案包括以下一般步骤：1)通过浸入2％的Decon 90溶液(Decon Laboratories LTD)中5分钟来清洁半导体芯片表面的表面；2)用18MΩ水漂洗该表面，然后在0.1M HCl中孵育5分钟，然后在18MΩ水中再次漂洗，并用氮气吹干；3)将芯片表面在0.6％wt/vol.的MCP点击聚合物溶液中孵育30分钟，该MCP点击聚合物溶液在7％硫酸铵(NH4)2SO4中具有5％叠氮化物含量4)在18MΩ水中漂洗，用氮气吹干，然后在80℃烘烤15分钟；5)将芯片冷却至室温；6)通过以下方式将一个或以上寡核苷酸缀合到表面：A)微阵列斑点-在表面斑点上沉积在150mM磷酸钠缓冲液pH 8.5(Na2HPO4和NaH2PO4)和蔗糖十二烷酸酯0.01％wt/vol.中的一个或以上寡核苷酸；在一些实施方案中，斑点体积为约200-300pL，寡核苷酸浓度为约40-200μM；将斑点化的样本在75％的相对湿度下孵育至少约16小时；B)溢流填充-将寡核苷酸溶液(与上述方法A中的缓冲液组成和寡核苷酸浓度相同)溢流在流动池中的芯片表面上；密封流动池的输入和输出端口，并将芯片孵育至少约16小时；7)在50℃下，在0.1M Tris缓冲液((HOCH2)3CNH2)(pH 9)中洗涤芯片(方法A或B)15分钟，然后在18MΩ水中漂洗，用氮气吹干，并在4％相对湿度的黑暗中储存，直到需要为止。
已成功证明与所选实施方案一起使用的其他缀合方法包括但不限于：1)含有琥珀酰亚胺基团的基于聚丙烯酰胺的涂层(例如，来自Surmodics IVD公司的CodeLink)，用于伯胺衍生的寡核苷酸的缀合，2)含有溴乙酰胺(反应性单体N-(5-溴乙酰胺基戊基)丙烯酰胺)的物理吸附聚合物涂层，用于缀合含硫代磷酸的寡核苷酸，和3)利用紫外线照射和Poly(T)poly(C)5'-标记寡核苷酸的缀合方法。
b.使用溶液介导的重组酶聚合酶扩增(SM-RPA)的簇生成
在此，我们公开了溶液介导的重组酶聚合酶扩增(SM-RPA)，其可用于在通常20-60分钟内从直接在固体载体上的多个靶标产生克隆核酸簇。这比现有技术中目前使用的基于RPA的方法(和其他方法)更快。此外，与其他方法产生的小簇相比，由此产生的簇产生了更大尺寸和更高分子数的克隆扩增核酸的“补丁”，这对于需要更大量固定化材料的应用是有益的。
在SM-RPA的优选的实施方案中，两个引物中的一个(例如反向引物)固定在固体载体上，而另一个引物(例如正向引物)存在于溶液相中。作为结果，在表面上发生扩增，链被释放到液相中，其可以局部重新杂交。图15示出了SM-RPA的引物配置和机制，将其与桥式扩增进行比较。所得到的克隆种群表现为固定的DNA的“拼凑”，如图16所示，其中示出了来自3个不同靶分子的克隆扩增的不同补丁。产物横向“生长”，在整个固体表面上向各个方向延伸，直到遇到相邻的“补丁”。该优选的实施方案已经从平面表面上的多个靶标(例如载玻片)和打孔半导体芯片上证明。使用多种方法分析得到的簇，包括使用荧光标记探针的扩增后杂交以及使用ISFET信号检测的测序。在实施例J“使用溶液介导的重组酶聚合酶扩增(SM-RPA)对靶核酸进行孔内扩增”中概括了说明SM-RPA的实验。
c.使用支化表面相滚环扩增(RCA)的簇生成
在此，我们公开了一种滚环扩增的方法和相关组合物，其可用于从直接在固体载体上的多个靶标产生克隆核酸簇。在优选的实施方案中，显然在工作流程的其他部分期间完成连接和扩增所需的衔接子的添加。此外，该方法允许直接在流动池的表面上产生环状模板，其中连接夹板寡聚体充当第一扩增引物。所有这些方面均简化并提高了工作流程的效率，同时缩短了整个工作流程的持续时间，产生了优于当前表面RCA方法的优势。
图17示出了一个优选的实施方案，其中显然在跨3个不同的工艺步骤中进行用于克隆扩增的环状模板的创建(参见图中图例的说明)。图18示出了实际的支化表面相RCA克隆扩增过程(参见图中图例的说明)。这种方法产生由靶序列的多联重复序列组成的克隆扩增DNA的离散簇，提供高信噪比。还注意的是，靶分子序列的两条链均是通过两个扩增引物的延伸产生的。在实施例K“使用滚环扩增(RCA)对靶核酸进行孔内扩增”中概括了说明该实施方案的具体实验。
d.使用杂交的簇生成
如本文其他部分所述，也可以使用基于非扩增的方法产生簇，例如使靶分子与固定在已知特定区域(例如，点)的固体载体上的寡核苷酸杂交。在本公开的优选的实施方案中，靶特异性寡核苷酸阵列被点(固定)在半导体芯片顶部的孔中。这些靶特异性寡核苷酸既可作为捕获寡聚体又可作为测序引物。靶多核苷酸序列流入孔中，并形成单克隆簇，其中给定序列的靶分子与互补的固定的寡核苷酸特异性杂交。然后使用固定的寡核苷酸作为测序引物对簇进行测序。在测序阶段的优选的实施方案中，半导体芯片包括ISFET传感器阵列，其用作测序反应中的检测模式。在实施例M“使用直接杂交方法对合成模板进行测序”中概括了说明该实施方案的具体实验。
在适用的情况下(即，在这种方法实现了分析/测定/测试的目标的情况下)，使用杂交的簇生成提供了一些明显的优势。首先，不需要克隆扩增步骤，从而通常节省步骤、试剂和时间。另一方面，在许多应用中也不需要拷贝控制步骤，同样通常节省了步骤、试剂和时间。在其他情况下，文库制备步骤可以简化，例如，需要更少的扩增，几乎不需要或不需要标签/衔接子步骤，有可能摒弃纯化步骤等。在靶多核苷酸充足且样本类型几乎不产生或不产生抑制的情况下，甚至可以直接从样本到簇生成，然后进行分析(例如测序)。此外，如果测序是选定的分析方法，则不需要通常在克隆扩增后进行的使靶标变性和使测序引物退火的步骤，因为捕获寡聚体也用作测序引物。
6.测序
本发明的优选的实施方案使用包括ISFET传感器阵列的半导体芯片进行测序(例如，参见US 7,686,929 B2)。该芯片通常还包括附着到芯片表面并定位在ISFET传感器上方的孔阵列。优选的测序方法通常包括以下步骤(边合成边测序法)：1)将待测序的核酸模板固定在一个或以上孔中(固定在孔中的方法包括克隆扩增和直接杂交；详见其他部分)；2)将测序引物与模板退火(在一些实施方案中，测序引物的退火是固定步骤的一部分；3)将测序酶(聚合酶)结合到模板/测序引物复合物上(下面公开的也是在相同步骤中添加测序引物和酶的新方法)；4)用给定的dNTP淹没孔(在一些情况下，多个dNTP可以一起包括在单个流中)；5)孵育(在一些情况下，停止dNTP的流动，而在其他情况下则不会停止)；如果互补核苷酸存在于模板中，则引入的dNTP将被引入并且质子(每个核苷酸引入1个)将被释放，并且一个或以上孔下的一个或以上ISFET将检测到这种释放；6)洗涤；对其他各个dNTP重复步骤4-6；这就完成了一个“循环”(也可以使用其他循环配置)；7)重复循环以获得模板的序列。
a.测序引物的同时退火和测序酶的结合
如上所概括的，在单独的步骤中进行测序引物与核酸模板的退火和测序酶与所得复合物的结合。这是因为退火步骤需要高温(高达约95℃)(通常还包括模板的变性，在工作流程的这一点上模板通常是双链的)，并且测序酶在这些温度下不稳定。我们公开了一种组合这两个步骤的方法，包括使用热稳定测序聚合酶(例如，来自Optigene的Tin(exo-)LFDNA聚合酶)。简言之，在一个反应混合物中组合测序引物和酶所需的所有组分与模板。升高温度(例如，(高达约95℃)使双链模板变性，然后降低温度(例如至约60℃)以支持测序引物的退火以及随后测序酶与引物/模板复合物的结合(如果和当温度低至更低时，例如在约20℃至45℃之间，还可能在该过程的后期发生至少一定程度的测序酶的结合)。
b.通过克隆扩增进行簇生成后的测序
在包括如上所述的半导体芯片的测序工作流程的一个优选的实施方案中，通过克隆扩增在簇生成后进行测序(参见上文第III.B.5节和本文其他部分)。同样如本文其他部分所述，簇生成之后是测序引物杂交和测序酶结合，然后测序。在一些实施方案中，测序引物对于所有潜在靶标可以是通用的，利用在该过程的早期步骤(例如文库制备)中引入到模板中的通用引物结合位点。或者，可以使用测序引物的多路复用从特异性靶开始测序。在实施例N“使用孔内克隆扩增生成的模板的测序”中概括了举例说明该模式的实验。
c.通过直接杂交进行簇生成后的测序
在包括如上所述的半导体芯片的测序工作流程的另一个优选的实施方案中，通过直接杂交在簇生成后进行测序(参见上文第III.B.5节和本文其他部分)。同样如本文其他部分所述，在直接杂交方法中，固定的捕获寡聚体也用作测序引物。因此，该方法在模板固定(杂交)后的步骤包括对酶结合进行测序，然后进行测序。在实施例M“使用直接杂交方法对合成模板进行测序”中概括了举例说明该模式的实验。
d.关键序列
i.引言
对于半导体测序，使用已知的DNA序列来校准碱基调用参数，例如设置零引入事件(即“0-mers”)、单碱基引入事件(即“1-mers”)和均聚物引入(即“2-mers”、“3-mers”等)的阈值，通常通过使用通用关键序列来实现(例如，参见Genome sequencing inmicrofabricated high-density picolitre reactors(2005)Marguilies,et al.,Nature,437:376-380)。这个已知序列可以在工作流程的早期阶段(例如，在文库制备过程中添加标签/衔接子)引入到模板中。尽管这种方法是常见的做法，但它们通常会增加试剂成本、复杂性和工作流程的时间。我们在此公开了用于将关键序列引入测序工作流程的两种替代方法。
ii.实施方案#1.靶特异性关键序列
在第一种方法中，靶本身的一部分可以用作校准关键序列。例如，在上游扩增步骤使用引物来富集特定区域(AKA靶向富集)的情况下，引物本身的序列通常是已知的。在这种情况下，可以使用引物的已知序列的一部分作为关键序列来确定阈值和其他信号处理参数。这可以通过截短将用作测序引物的寡核苷酸来实现，即在簇生成的直接杂交方法中的表面固定的捕获寡聚体/引物，然后进行半导体测序。
当靶特异性、表面固定的捕获寡聚体/引物的阵列用于直接杂交方法时，各个捕获寡聚体/引物可以在其3'端(即，表面远端)被x碱基截短。可以基于序列针对各种寡聚体具体地确定x的值。被截短的碱基将形成各特异性引物的关键序列，下文称为靶特异性关键序列。理想情况下，靶特异性关键序列将产生至少0-mer、1-mer和2-mer的输出(见上文“引言”段落)。然而，给定图中的每一个、实际上任何一个引物均不太可能具有能够产生这种输出的序列。因此，必须根据被认为是特定信号处理方法最需要的特性，在具体分析的情况基础上确定确切的靶特异性关键序列。
图19示出了基础靶特异性关键序列的示例。对于Oligo 1，段1A和段1C分别描述了用于靶向上游扩增的正向引物和反向引物结合位点。因此，这些部分的具体序列是已知的。Oligo 1的段1B示出了目的区域，即要进行测序的模板的未知部分。注意，为本示例的目的，Oligo 1的实际序列，段1B和段1C是不相关的，因此未进行描述。Oligo 2被设计为与Oligo1的段1A互补，3'端的核苷酸截短是值得注意的例外。在这里描述的实施方案中，Oligo 2固定在固体载体上。Oligo 1在溶液中提供，除5'端的关键序列核苷酸外，Oligo 1的段1A与Oligo 2特异性杂交。
下面的表E提供了在该实施方案中使用的示例序列。请注意，已知引物序列的最终碱基，即Oligo 1的段1A的5'端的最终碱基可能不能用作关键序列的一部分。这是因为该碱基有可能与待测序的未知部分(Oligo 1，段1B)的第一个碱基相同。因此，已知将存在所述碱基的引入，但是这将是1-mer引入还是均聚物引入事件是未知的，因此引入事件可能对阈值设置无效，并且不正确地这样使用它可能产生错误。
表E-适用于图19所示方案的寡核苷酸序列的实例。
在3'截短后，表面相引物可能不再具有与截短前相同的对与模板杂交很重要的特性，如核苷酸长度、熔解温度(Tm)和GC含量百分比(％GC)。特别地，由于碱基的去除，熔解温度现在将降低。如果一组引物被截短到不同的量以提供最佳的靶特异性关键序列，则模板杂交动力学和热力学可能被显著改变，从而杂交的总体效率可能会降低。当多重模板被设计为与多重表面捕获寡聚体/引物杂交时，改变的杂交特性可能导致整个组的不同杂交效率。在这种情况下，可能有必要对表面捕获寡聚体/引物进行进一步修饰，以抵消其3'截短的影响。修饰可以通过多种方式实现，包括但不限于：1)在5'端，即接近表面处添加碱基，以增加引物长度并提高熔解温度；2)在表面结合的捕获寡聚体/引物内使用核酸类似物，如锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)，以提高熔解温度。
图20提供了靶特异性关键序列方法的又另一个类似示例。Oligo3的段3A和段3C分别描述了用于靶向上游扩增的正向引物和反向引物结合位点。在本例中，在上游扩增过程中采用了加尾引物方法，以延伸Oligo 3和另外的合成段3D。该部分不是靶特异性的，因此，根据需要，段3D可以是：(a)通用的，或(b)靶特异性的。在该方法中，另外的段3D是专门设计的，以抵消生成靶特异性关键序列所需的3'截短的影响。Oligo 3的段3B示出了目的区域，即要测序的模板的未知部分。
Oligo 4被设计为与Oligo 3互补，包括与Oligo3的靶特异性部分(Oligo 2，段3A)和附加部分(Ologo 3，段3D)的互补性。3'端的截短使得能够生成靶特异性关键序列。在这里描述的实施方案中，Oligo 4固定在固体载体上。Ologo 3在溶液中提供，除5'端的关键序列核苷酸外，Ologo 3的段3A和段3D与Oligo 4特异性杂交。
下面的表F提供了用于在图20中描述的该实施方案的方面中的示例序列。
表F-适用于图20所示方案的寡核苷酸序列的实例。
iii.实施方案#2.固定通用关键序列
在第二种方法中，表面固定的捕获寡聚体/引物的另外5'部分可用于通过使能从杂交模板的3'端聚合而产生关键序列，同时暂时阻止从表面固定的寡聚体的3'端聚合。
在该实施方案中，表面结合的捕获寡聚体/引物的3'端没有被截短，而是配备有可逆的阻断化学基团以防止聚合。这种阻断基团的实例包括但不限于：3'-O-(2-硝基苄基)、3'-羟胺和3'-O-叠氮甲基。在5'端，表面结合的捕获寡聚体/引物包括与用作关键序列相关的另外的已知序列(参见上文对可能的关键序列元件的讨论)。由于该已知序列是附加的，它将最多对模板杂交对表面结合的捕获寡聚体/引物的序列特异性部分的特异性产生有限的影响。因此，它对组中所有表面结合的捕获低聚物/引物可以是共用或通用的。在模板杂交后，加入测序聚合酶。由于表面固定的捕获寡聚体/引物的3'-端被阻断，测序将不会从该末端开始。然而，模板的3'端是未修饰的，因此将使用固定的捕获寡聚体/引物的另外5'部分作为模板来启动测序反应。来自表面结合的捕获寡聚体/引物的这一另外5'部分的测序输出将用作设置相关信号处理和碱基调用参数的通用关键序列。
一旦5'部分的测序完成，则使用适当的方法逆转/去除3'阻断部分。例如，3'-O-(2-硝基苄基)基团可以在暴露于340nm光的情况下被光切割，3'羟胺可以用亚硝酸钠水溶液解除阻断，并且可以通过用三(2-羧乙基)膦还原来去除3'-O叠氮甲基。去除阻断部分后，添加另外的聚合酶以确保所有引物-模板复合物与聚合酶结合，并从表面结合的捕获寡聚体/引物的未阻断的3'端重新开始测序。使用信号处理和碱基调用参数来分析由此产生的测序数据，所述碱基调用参数使用来自捕获寡聚体/引物本身的通用5'部分的先前测序数据来设置。
该第二关键序列实施方案的示意图如图21所示。在步骤(a)中，测序靶Oligo 5与Oligo 6的完全互补的段6A特异性杂交。段6A可以与在工作流程上游用于扩增靶标的引物相同。Oligo 6在3'端被可逆地阻断，防止延伸。在加入聚合酶后，Oligo 5的3'端能够使用Oligo 6的段6B作为模板进行聚合。段6B可设计为用作关键序列，从而随着在该部分中的测序进展，根据需要报告0-mer和1-mer以及其他核苷酸引入事件。一旦段6B的测序完成，根据步骤(c)，去除Oligo 6的3'端的阻断部分。如果需要，在进一步添加聚合酶后，现在从Oligo6的3'-端通过Oligo 5的未知靶区进行测序。
7.系统
本文全文公开了可用于使用自动化系统从广泛的输入样本类型和量快速分析靶多核苷酸的实施方案，包括确定其核苷酸序列。该系统包括仪器和至少一个可移除地插入仪器内的测定盒。在优选的实施方案中，该系统还包括至少一个可移除地插入仪器内的试剂盒。还在进一步优选的实施方案中，该系统包括半导体芯片，其中在一些实施方案中该芯片嵌入到盒内。在特别优选的实施方案中，该系统还包括安装在芯片顶部(有孔或无孔)的流动池，该流动池可用于将流体输送到芯片并从芯片去除流体。在优选的实施方案中，该系统包括软件。在特别优选的实施方案中，软件包括操作软件(用于控制系统)和分析软件(用于接收、处理和分析系统的输出)。
a.半导体芯片
包括场效应晶体管(FET)阵列的半导体芯片用于检测化学和/或生物反应(包括测序反应)的用途在本领域是众所周知的(例如，US 7,686,929 B2；US 8,685,228 B2；US 8,986,525B2；US 2010/0137143 A1)。在本公开中，优选的实施方案包括半导体芯片，该半导体芯片包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)阵列，该阵列可用作各种反应(包括核酸测序反应)的检测装置。在特别优选的实施方案中，芯片还包括位于ISFET阵列上方并与其流体接触的孔阵列。在这些实施方案中，测序反应通常发生在孔内，并且离子的释放由ISFET传感器检测。在特别优选的实施方案中，芯片还进一步包括安装在芯片顶部(有孔或无孔)的流动池，该流动池可用于将流体输送到芯片/ISFET阵列并从中去除流体。在优选的工作流程/系统实施方案中，芯片集成到盒中，在盒中进行整个工作流程。
b.测定盒
如本文中所用，术语“测定盒”或“样本盒”是指进行特定测试、测定或其部分的步骤的装置。通常地，这种装置包括在不同程度上彼此流体连接的室。其中公开了用于进行从样本输入到结果的整个测序工作流程的测定盒的示例性设计。可以在这样公开的盒内进行多种基于测序的测定以及其他复杂的测定。在一组实施方案中，在“子系统”盒中进行工作流程的不同阶段，而在另一组实施方案中，工作流程的所有阶段均在集成盒中进行。在一些情况下，测定可以与试剂盒(示例性设计也封装内)结合进行。通常，在这种盒中结合仪器进行测试，但在某些情况下，可以进行不需要自动化或最低自动化程度的测试和盒配置。
i.子系统盒
其中公开了样本制备(例如参见图22至24)、文库制备(包括拷贝控制；例如参见图25至26)和簇生成/测序(例如，参见图27至28)的示例性设计。在某些情况下，这些过程(样本制备、文库制备、簇生成/测序)可以单独进行，也可以各种组合进行，这取决于所进行测试的总体目标和要求。在某些情况下，其中2或3个盒用于给定的测试，一个盒的输出可以手动转移到下一个盒中，或者可以在仪器的帮助下自动进行转移。
样本制备盒设计的关键特征包括但不限于：1)灵活的输入样本系统，其可容纳相对较大的样本体积；2)独特的设计室布局，使得能够在相对紧凑的盒中容纳相对较大的样本和测定体积；3)全集成的旋转阀，其可以将流体抽取并输送到大量的室和通道；4)独立但连接的附件或“翅片”，其可以进行复杂的操作，但在不同的测定类型之间提供灵活的盒设计；5)蛇形通道，改善加热和磁分离特性；6)室和相关特征，以使得能够在盒中存储液体和干燥试剂；7)大量的室，同样在相对紧凑的盒的情况下，因此使得能够进行大量的不同样本制备方案。
文库制备盒的主要特征包括但不限于：1)两个嵌入式旋转阀，支持复杂的测定流，在多个室和通道的组合中输送和抽取流体；2)多个扩增室/站，使得能够进行多种反应以适应复杂的工作流程、稀释的样本、高水平的多路复用等；3)容纳标签/衔接子添加的室和相关特征；4)容纳拷贝控制的室和特征；5)单独但连接的附件或“翅片”，可以进行复杂的操作，但在不同的测定类型之间提供灵活的盒设计(可以很容易地添加一个或以上另外的翅片)；6)蛇形通道，改善加热和磁分离特性；7)室和相关特征，以使得能够在盒中存储液体和干燥试剂；8)大量的室，同样在相对紧凑的盒的情况下，因此使得能够进行大量不同的文库制备方案。
簇生成/测序盒的关键特征包括但不限于：1)全集成的旋转阀，可以将流体抽取并输送到大量的室和通道；2)除了旋转阀外，还有板载“选择”阀，为流体输送提供了更大的灵活性和更多选择；3)相对紧凑的大量室，可以支持多种形式的簇生成和测序；4)室和相关特征，以使得能够在盒中存储液体和干燥试剂；5)与流动池的完全流体连通性，用于从固体载体输送和抽取流体(在优选的实施方案中，固体载体包括半导体芯片；例如参见图29)；6)当被选择为选项时，与试剂盒的全流体连通性(参见本文其他部分的公开)用于输送更大体积的所需流体，例如测序试剂(例如dNTP溶液)(例如参见图30、31和32)。
在实施例O“加标病原体的全血的自动样本应答测序”中给出了在上述整个3个子系统盒中进行的一种特定测定(在这种情况下是从血液中检测一种或以上病原体)的详细描述。
ii.集成盒
本文还公开了全集成盒的示例性设计，其中可以进行工作流程的所有步骤，包括样本制备、文库制备、拷贝控制、簇生成和测序(例如参见图33至39)。当与试剂盒和仪器结合使用时(参见本文其他部分)，可以从样本开始进行整个二代测序工作流程，从而在运行开始后形成完全自动化的格式，无需用户干预。这是在相对较小尺寸的盒和仪器系统中快速进行的，使其可用于各种设置中。到目前为止，这在本领域中还没有实现，因此代表了一种新且新颖的系统和相关工作流程。
集成盒设计包括几个关键特征。以下是关于其中一些特征的简要讨论。选择盒的三维设计以在相对较小的所占空间/体积中容纳大量所需的特征。在图33中，示出了用于这种盒的两个形状因数选项。两者均以相对较小的体积提供了良好的功能性。左侧所示的设计提供了更窄的形状因数，该形状因数在不增加仪器深度的情况下减小了仪器宽度。向内旋转STC翅片和相关的热接口也减小了仪器的宽度。将盒安装到仪器中的人体工程学是对于两个形状因数均为理想的选择。
在盒的一些优选的实施方案中，流体处理包括使用位于相关仪器中的紧凑的3自由度(DOF)台架的[直接]气动压力和精确移液(例如参见图40)。移液器吸头能够通过密封气动接口(SPI)端口进入盒中的室/通道(参见图41)。如图67和68所示，SPI端口可配置有帽6701，以使吸头与SPI端口对齐。帽6701开口的内径将决定了用于流体转移步骤指定的吸头尺寸(例如，图67中的1mL吸头和图68中的5mL吸头)。SPI端口可以包括如图67和68所示的阶梯式移液器吸头接口6703，以接受和密封不同尺寸的移液器吸头。如图33中的示例性设计所示，SPI阀紧密地聚集在一起，以最小化3-DOF台架所需的行程范围，从而降低工程复杂性、成本和仪器中固定部分(real estate)的使用。移液器吸头能够通过阀正上方的盒体中的开口进入SPI阀(见图)。此开口在使用前一直用可刺穿箔密封而被覆盖，以防止污染物进入盒。图中描绘了另外的圆孔，用于测定中使用的移液器吸头的临时工作台(staging)。样本输入端口(图33中所示的2个)被定位成使得能够在盒的顶部上进入。所示为2个容纳(以及其他样本管)真空采血管的圆柱体，表明该系统可以容纳大量输入样本。此外，各样本端口包括单独的SPI，使得能够在测定的任何点访问样本或样本的组合。此外，样本端口位于非常靠近裂解室的位置，以在化学工作流程中最小化样本到裂解室的行进路径(如果这样设置的话)。
图34更详细地描述了盒的特征。如本文其他部分所述，与该示例性图中的各个特征相关联的功能基于特定的测定或测定类型，但是功能性是灵活的，并且易于重新利用、重新编程或以其他方式调节以适应广泛的各种应用。将盒设计为子模块部分，各个部分均具有特定功能或各种功能的组合。这对于试剂的制造和装载来说不那么复杂并且更具成本效益。它还使得能够对不同应用的盒进行更简单的改进(例如，较于整个盒，为具有不同样本制备步骤的应用设计新的盒将仅包括重新设计和制造样本制备子模块)。然后，不同的子模块部分可以很容易地组装成单独的集成盒。还应当注意的是，使用移液器输送试剂的其他优点包括能够在移液器吸头中实现简单的样本稀释，通过将试剂移入和移出室/通道(如有必要，多次)进行有效混合，将压力输送到室/通道中(移液器吸头插入SPI并“分配”空气)以驱动流体移动等。
图35至39描述了工作流程/测定的一些基本步骤(例如，血液中的病原体检测)，因为它们将在盒上进行。图例概括了这些基本步骤。如图例所示，为了便于查看特征部件，并非所有盒的部件均显示在该图中。此外，并未对工作流程的所有步骤均进行概括。应当注意，测定化学/反应可以在通道中以及在室中进行。这里还应当注意的是(如在其他部分一样)，盒被设计成具有高度的灵活性，并且能够进行许多不同工作流程配置的所有处理步骤。此外，如上所述，在某些情况下，集成盒中的一个或以上子模块翅片可以互换，以适应更广泛的工作流程和应用。
图60和63-65示出了另一个示例性测定或样本盒，突出显示了主要的流体处理子系统、单元或“翅片”。图63示出了具有拷贝控制功能的示例性文库制备单元6300或PCR翅片。图64示出了示例性样本输入和机械裂解翅片6400，图65示出了示例性特异性靶捕获(STC)翅片6500。STC翅片6500可以包括用于在靶捕获和洗脱步骤期间根据需要加热的热区。在某些实施方案中，热能可以从一侧(例如，从盒内部)施加到STC翅片6500。文库制备单元6300可以包括用于PCR和拷贝控制热步骤的双面加热。在图69中更详细地示出了图65的STC翅片6500。STC室6901用于样本制备加热和混合，并且在所示实施方案中，STC室的体积可以为约9.3mL，并且被设计为容纳高达约6mL的体积。使用用于洗脱加热的洗脱室6903和可用于PCR 1稀释、PCR 2汇集和拷贝控制稀释的辅助室6905(如适用)来实现STC翅片6500的附加流体功能。冻干试剂袋6907可以定位成使得能够在翅片构造之后装载并用膜密封。STC翅片6500可以包括冷凝阱6909，以容纳在STC翅片中的加热和混合步骤期间形成的任何冷凝物。STC室入口通道6911向STC室6901进料，并在混合和加热步骤期间将流体保持在加热区域内。STC入口气动管线6913使得空气能够通过STC入口分配，例如，在不使用移液器吸头的情况下将流体推回STC室6901。包括STC和洗脱蛇形通道6915用于磁珠捕获步骤。
在图70中更详细地示出了图63的示例性文库制备单元6300或PCR翅片。根据需要，包括用于PCR热循环和直接杂交洗脱步骤的各种热室7001。热室7001被定位成使得能够从仪器内的盒的两侧加热，以根据PCR扩增的需要进行更快的热升温。冻干试剂袋7005可以使得能够在翅片构造之后装载所需的试剂，然后用膜密封。可以包括直接杂交室7003，用于混合和孵育(在指定的室温下)以用于使用直接杂交方法的测定。根据需要，还可以包括用于磁珠捕获的直接杂交磁性蛇形管7013。文库制备单元6300可以包括PCR2旁路通道7011，以使得PCR2通道能够从单个SPI阀直接被填充。可包括PCR光学传感器7007和计量控制器7009用于闭环控制，如用于流体定位和计量。
样本输入可以包括开口或对接接口6403，用于接收样本容器，例如真空采血管或小瓶，以使得盒能够接收样本进行测定。在测定使用机械裂解的情况下(例如，通过旋转桨)，可以包括机械接口6405，该机械接口使得仪器能够通过例如电机和轴来驱动裂解单元，该电机和轴在盒插入仪器时能够联接到接口。通常可以在样本制备步骤中组合样本输入、机械裂解和STC步骤，并且这些功能可以是样本盒内的样本制备单元的一部分。在文库制备单元中处理后(如图63所示)，扩增的核酸可被引导至测序单元，该测序单元包括例如本文所述的流动池，用于对来自原始样本的分离和扩增的靶核酸进行测序和分析。示例性测序单元/流动池6600显示为定位在图66中的样本盒内。可以根据任何测序步骤的需要从盒下方加热测序单元/流动池6600。此外，图66示出了测定或样本盒内的示例性移液储器6603。如本文所述，可以通过仪器使用例如如下所述的移液台架和SPI端口自动进行试剂盒或其他外部源与样本盒之间的样本盒内的各种流体转移操作。通过将与所需体积和系统中使用的SPI端口兼容的必要移液器吸头包括在密封盒内，增加了操作的便利性，同时降低了用户错误或污染的风险。
c.试剂盒
在优选的实施方案中，单独的试剂盒与测定盒结合使用以进行给定的测试/测定。在图42至44中描绘了试剂盒的示例性设计。可以通过多种方式接近和移动流体，包括通过液体处理器(LH；例如，移液器系统)和液体歧管(LM)。可采用不同的阀设置方法，包括密封气动接口(SPI)端口。储存在试剂盒中的试剂可以包括液体和干燥试剂、测定专用和通用试剂、散装试剂(通常需要大量的试剂)以及所需的其他试剂和组分(例如，用于选定试剂的CO2洗涤的碱石灰)。此外，试剂盒的主体提供了相对大的体积，其可以有效地用于在测试/测定的进行期间产生的废液。此外，可以根据需要进行修改储器/单元/孔/室的数量，以满足给定或一组测试/测定的要求。此外，试剂盒的给定配置可以填充有各种试剂，这些试剂将支持许多不同的测试/测定，即使并非所有试剂均将用于每次测试。
使用单独的试剂盒有几个优点，包括但不限于：1)将试剂储存在单独的试剂盒上大大降低了测定盒的尺寸和复杂性(在考虑到批量试剂(如测序试剂)所需的体积时尤其如此)，从而提高了测定盒的制造效率并降低了制造成本；2)测定和试剂盒可以单独制造、填充和储存，降低了复杂性和成本，提高了效率；3)与测定盒相比，当分配到试剂盒时，干燥试剂的制备和储存要高效得多，特别是当制造、填充、干燥并隔离储存试剂盒的部分B时(用于干燥试剂；参见图43和相关的图例)；4)与测定盒相比，当分配到试剂盒时，液体试剂的制备和存储更有效，特别是当单独制造、填充和存储试剂盒的部分A时(用于液体试剂；参见图43和相关图例)；5)在一些实施方案中，相同的试剂盒可以与不同的测定盒一起使用；6)对于给定的测试/测定特定应用，试剂盒可以与子部件快速组装(例如但不限于，部分A和B的填充、干燥(如适用)并单独储存；单独填充的散装试剂(如用于测序))，以便能够最有效地制造和储存子部件零件，以及以符合需求的体积进行制造；7)干燥试剂可以在转移到测定盒之前直接在试剂盒中重构；8)在优选的实施方案中，试剂盒中的大多数试剂是干燥形式的，从而试剂盒中的大部分液体(在一些实施方案中的所有液体)是水；9)在优选的实施方案中，试剂盒中的一个或以上室包括磁性搅拌棒，当盒被装载到仪器中时，室中的磁性搅拌棒与仪器中的磁性搅拌电机对接(例如，用于试剂的板载制备/混合)。在图61中示出了另一个示例性试剂盒。
d.仪器
在上文(e)节和本文其他部分公开了多种盒的实施方案。本节(以及本文其他部分)公开了可用于自动进行所述盒内的测试/测定的仪器实施方案。在图40、45至49以及相关的图例中给出了仪器设计和特征的例子。设计使得该仪器的所占空间相对较小，因此可用于许多设置中。此外，它能够以盒的形式自动进行从样本输入到最终报告的完整、复杂的工作流程所需的所有特征，包括在优选的实施方案中的核酸测序，所有这些均在运行一旦开始后则无需用户干预。在优选的实施方案中，仪器配备有紧凑的3自由度(DOF)移液器台架，利用该移液器台架输送到盒以及实现各种功能，包括混合、稀释、重构(干燥试剂)和移动流体/试剂。
如本文其他部分所述，在优选的实施方案中，移液器吸头经由SPI端口进入室和通道。在盒的优选的实施方案中，SPI阀紧密地聚集在一起，以最小化3-DOF台架所需的行程范围，从而降低工程复杂性、成本和仪器中固定部分的使用。仪器设计包括以下一种或以上功能：加热、冷却(包括CPU)、磁分离、磁力搅拌、裂解叶轮旋转(用于盒中的机械裂解)、产生和控制使用加压气体(气动系统)、检测(例如温度、压力、流量、液位等)。它还包括对功能和特征的完全CPU/计算机控制，包括对输出数据的收集和分析，例如来自包括ISFET阵列的半导体芯片的测序信号。在图和相关图例中突出显示了其他特征。
图58A-59中示出了另一个示例性仪器及其部件。图58A示出了示例性仪器的透视图，该示例性仪器具有显示器/用户界面、条形码扫描仪以及测定盒和试剂盒门。在图58B和58C的前视图和侧视图中示出示例性仪器的维度。示例性仪器的各种内部子系统的布局如图58D至58I所示。图58D中示出了用于接收样本或测定盒和试剂盒并与之对接的盒接口组件。盒接口可以包括门，这些门可以手动或自动地打开或关闭以使得用户能够插入盒，但使得在插入后能够形成用于测定处理的闭合受控环境。在各种实施方案中，盒接口可以包括流体连接和电子连接，以使得仪器能够控制盒内的流体移动并与盒和其中的各种单元连通(例如，控制测序和接收测序数据以进行处理)。在某些实施方案中，流体控制可以是气动的。图58E示出了定位在仪器内的示例性气动泵送子单元，用于提供将由分析器或仪器控制的气动压力以驱动盒内的流体移动。在图59中进一步说明了这种气动子系统，并且可以包括各种尺寸(例如，宏观和微观)的注射器，以使得其能够进行大体积流体移动及精细控制。图58F示出了用于向仪器提供电力的示例性电力子单元的定位。图58G示出了用于控制和处理进入仪器和盒的任何空气的示例性空气处理和试剂盒进气子系统。图58H示出了用于提供热管理的液体冷却子系统，例如，以冷却仪器内的处理器或其他发热单元。图58I示出了用于进一步控制系统内的环境的示例性冷凝管理子系统的定位。
8.使用所述系统的方法
如本文其他部分所述，现有技术的测序工作流程(准备用于测序的样本中包含的靶多核苷酸、进行测序和分析所得数据所需的过程)是乏味、耗时、复杂且成本高昂的。许多步骤仍然是手动进行的，并且需要高度熟练的人员。即使工作流程中的特定过程是自动化的，也需要多个仪器和辅助部件，并且需要在各个点进行熟练的人工干预来完成整个工作流程。此外，从样本到结果的时间是几个小时到几天或更长。此外，样本输入的最大允许量低，这代表了进一步的当前限制。因此，在实际使用中可能会大大降低测序的能力和价值(包括二代测序)。因此，需要一种完全自动化(样本到报告)的测序工作流程，一旦开始运行，就不需要用户干预，快速(样本在几个小时内得出可处理的结果)、灵敏、准确、经济高效，并可在需要时随时使用。
全文公开的实施方案可用于针对使用自动化系统从广泛的输入样本类型和量中快速分析靶多核苷酸，包括确定其核苷酸序列。同样如本文其它地方所公开的，该系统包括仪器和至少一个可移除地插入该仪器内的测定盒。在优选的实施方案中，该系统还包括至少一个可移除地插入仪器内的试剂盒。仍在进一步的优选的实施方案中，该系统包括半导体芯片，其中在一些实施方案中该芯片嵌入在盒内。在特别优选的实施方案中，该系统还进一步包括安装在芯片顶部(有孔或无孔)的流动池，该流动池可用于将流体输送到芯片并从芯片去除流体。在优选的实施方案中，该系统包括软件。在特别优选的实施方案中，软件包括操作软件(用于控制系统)和分析软件(用于接收、处理和分析系统的输出)。
在本节中公开了使用上述系统的许多方法。这些是示例性的，并不意味着限制潜在方法和相关应用的范围。下面的“实施例”部分公开了使用该系统这些方法中的一些实施的具体实施例。
a.示例性通用工作流程概述
如上以及本文其他部分所述，工作流程是指制备用于测序的样本中包含的靶多核苷酸、进行测序和分析所得数据所需的过程。更具体地，优选的实施方案可以包括一个或以上步骤(以各种组合)；样本处理；文库制备；拷贝控制；簇生成；测序；数据采集；一级、二级、三级数据分析；测定呼叫(回答进行测试/测定以回答的问题)；以及报告生成。对于迄今为止未解决的挑战，所公开的一个或以上的盒和仪器提出了一种新的和新颖的解决方案，即，在相对较小的仪器(包括盒)所占空间的范围内，以快速的时间实现工作流程的所有步骤的完全端到端自动化。
作为第一步，将含有靶多核苷酸的样本引入盒中。在优选的实施方案中，这是通过盒上的样本输入端口实现的。此外，该盒配备有内置或附着到盒上的部件，以便有助于以安全、高效和无污染的方式转移样本。例如，在一些实施方案中，该盒配备有圆柱形结构，其中插入含有样本的管(例如，标准真空采血管)。在优选的实施方案中，放置在圆柱体底部的是针，该针通过输入端口与盒中的至少一个室流体接触。
在这些实施方案中。例如，样本管可以自上而下放置在圆柱体中并推到针上，从而针穿透帽(在针周围形成紧密密封并保持帽和管之间的紧密密封)，并且管的内容物或其一部分被转移到盒中。有助于促进样本转移的另外的示例性部件包括但不限于：鲁尔锁(luerlock)；外部室/容器(其通过端口与试剂盒中的至少一个室流体连接)，液体样本可以被引入(例如，通过移液)其中，然后被密封(例如，经由盖)，并且当将盒插入仪器时，室/容器的内容物被转移到盒中；可刺穿隔膜，样本可通过该可刺穿隔膜经由配备有刺穿隔膜的针等的注射器而插入到盒中；在一些情况下，未处理的样本被装载到试剂盒中。在一些情况下，样本经过了用户选择的预处理(例如，作为分析前的标准实践，在样本采集管中进行的处理，或在对某些样本类型常规进行的处理)。在一些情况下，样本是用户选择的其他方法的输出，例如以下方法的输出：细胞培养、克隆和表达、扩增、核酸提取、拭子在运输介质中的表达、固体样本的液化/均质化、样本(包括气体如空气中的样本)介质的浓度、细胞裂解、分离(例如，相分离、沉淀、离心、分级(例如将全血分为血浆或血清、血沉棕黄层和红细胞)、过滤等。更进一步的非板载常规处理方法包括生物体的裂解，例如在基于裂解剂的液体(例如，作为收集管中的传输介质)中裂解衣原体网状体，通过使得在存在或不存在珠的情况下含有生物体的样本涡旋来裂解生物体，通过在收集管中冷冻/解冻进行裂解，将样本溶解在裂解剂、离液剂、有机溶剂、变性剂等中，进行或不进行加热和/或搅拌/涡旋等。这些只是选择范围的例子，但盒和仪器设计用于直接使用初始样本进行测试/测定。外部部件(如果使用的话)/样本进入端口/盒可以接受大范围的样本输入体积，例如在一些情况下为少数几个微升至一毫升，在一些情况中为2-10mL，在一些情况下为4-20ml，在一些情况下可以使甚至更高的量。同样，盒和仪器被设计成适应这个体积范围并成功地进行所需的测试/测定。这是通过多种方式实现的，包括独特的室设计(包括大和小的室以及独特形状的室的组合)、动态流体控制、当流体流过/流通/流经处理元件(例如加热器、磁体等)时进行的“即时”处理、优异的混合能力等。这种适应如此大范围的样本体积(包括相对高的体积)的独特能力满足了本领域的需要，并将本公开与现有技术区别开来。
在一些实施方案中，一旦装载到盒中，样本即经各种可能的处理步骤作用，以将其准备用于进一步的下游处理和/或分析(AKA，样本制备)。在其他实施方案中，例如在样本基质本身相对不复杂并且靶多核苷酸已经处于可进一步处理和/或检测的形式的情况下，样本可以绕过样本处理步骤并转移到整个工作流程中的后续步骤，例如文库制备。在一些测试/测定中，样本类型是全血且靶多核苷酸在细胞内，例如感染血液的病原生物(例如脓毒症)。在优选的实施方案中，样本制备包括以下通用步骤/过程：1)将血液与支持样本均化和细胞裂解的试剂混合。2)加热样本(进行或不进行连续移动和/或混合)。这有助于溶解样本(其中在另一个优选的实施方案中，该方法包括湍流混合；可以任选地包括盒的室/通道中的特征以改善湍流混合，例如三维特征，如混合室之间的柱、狭窄的接合处等)。在一些进一步优选的实施方案中，试剂包括酶，例如蛋白酶-K，其酶促分解样本的组分(对于蛋白酶-K来说，加热有助于激活酶)。3)裂解细胞。这可以利用多种方法实现(本文其他部分列出的例子)。在一个特别优选的实施方案中，使用机械裂解来实现裂解，包括在珠的存在下以相对高的速度混合样本。盒经过独特设计，可包括大容量机械裂解室，这些裂解室配备有叶轮，当盒装入仪器时，叶轮与仪器中的电机对接。4)核酸被释放并变性。根据细胞类型和确切的裂解方法，靶多核苷酸仍可通过细胞和/或样本中的特征而被缔合/结合/捕获。此外，靶核酸可以是双链形式，并且必须使其单链化(变性)以便过程的下一步能够正常运行。在一个优选的实施方案中，释放和变性均是通过加热到相对较高的温度(例如约95℃)来实现的。可以通过试剂组合物进一步辅助这些过程，例如包括一种或以上的裂解剂、离液剂或变性剂(或其组合)。这种/这些物质可以包括在裂解试剂中或在裂解后添加。此外，可以通过将整个裂解物作为整体加热或通过一次加热裂解物的一部分来加热到相对较高的温度，例如通过使其流过加热的通道，例如蛇形通道。5)分离靶多核苷酸。优选的实施方案是靶捕获一种或以上特异性靶捕获寡聚体(特异性靶捕获或STC)。将变性的裂解物与含有捕获寡聚体的杂交试剂混合，并将混合物在高温下(例如，在约60℃下)孵育，在此期间，捕获寡聚体以用户定义的特异性水平(通过捕获寡聚体设计)与一种或以上靶多核苷酸退火。在一些实施方案中，在释放/热变性之前，将裂解物与含有捕获寡聚体的杂交试剂混合。然后将样本加热至约95℃，例如用于释放/变性，然后将温度降低至约60℃，如用于捕获寡聚体的退火。在优选的实施方案中，在退火后，将靶多核苷酸/捕获寡聚体复合物捕获到磁性微球上，使用磁体从混合物中收集出微球，并去除剩余的裂解物(将其送至盒中的废物)。如何实现这一点的示例性步骤包括在本文的其他部分。然后任选地洗涤珠并且洗脱靶多核苷酸。现在靶多核苷酸已准备好用于进一步的下游处理和/或分析。
本文上述和其他部分描述和讨论的样本制备实施方案具有多种优点，这些优点将其与现有技术区别开来，包括但不限于：1)整个样本制备工作流程，包括从相对大体积的复杂生物样本(如血液)开始，以盒形式的全自动形式进行，其中盒是集成盒，也用于测试/测定的其他过程(即，制备的样本不需要转移到不同的盒、不同的装置等以继续该过程)；2)在盒上完成完全的机械裂解；3)即使大体积的情况，也可以通过使用基于盒的系统的优异加热技术在短时间内在试剂盒上实现(包括当样本通过通道(如蛇形通道)与有效加热元件接触时加热/孵育样本)靶多核苷酸的完全释放和变性；4)在公开的盒组合物中配置的特异性靶捕获本身提供了许多优点，包括高纯化效率、高体积减少能力、高特异性和甚至更广义上的高特异性控制(可以沿着系统发育树特异性地捕获，包括在亚种、种、属、科等水平上)(通过用户定义的寡聚体设计；此外，寡聚体可以设计为特异性地排除样本中不需要的多核苷酸如人DNA)；5)STC方法具有高度扩展性，并且支持高水平的多路复用；此外，STC方法非常灵活，因为可以通过简单地设计新的寡聚体集从而容易且快速地开发新的应用/测定；6)在整个过程中仅包括1个纯化步骤(用于二代测序的样本制备通常包括多个纯化步骤，这增加了时间、复杂性和成本)；7)分离的靶多核苷酸的整个洗脱体积可以直接进入该过程的下一步(例如，文库制备；对于通常的二代测序工作流程，在这一步需要对靶多核苷酸进行定量，并且只有一小部分制备的靶标进入文库制备过程)。
在一些实施方案中，在样本制备(或在一些其他实施方案中直接使用样本或其部分，如本文其他部分所述)之后，样本经各种可能的处理步骤作用，以将其制备用于进一步的下游处理和/或分析(通常称为文库制备)。在其他实施方案中，样本可以绕过文库制备步骤，并转移到整个工作流程中的后续步骤，例如簇生成或测序。如上所述，在一些测试/测定中，样本类型是全血，并且靶多核苷酸在细胞内，例如感染血液的病原生物(例如脓毒症)。在这些情况下，文库制备的输入是从全血样本内的细胞制备的靶多核苷酸(上文概括的优选样本制备方法的实施例)。在优选的实施方案中，文库制备包括以下通用步骤/过程：1)将输入样本与第一扩增试剂混合。在优选的实施方案中，第一扩增试剂作为干燥试剂存储在盒上(在测定或试剂盒中)，并在盒上重构(使用存储在盒(测定或试剂盒)上的液体，例如水)。2)在第一扩增反应中扩增靶多核苷酸中的目的区域(ROI)。与混合物中的其他多核苷酸和/或多核苷酸区域相比，这增加了样本中ROI的拷贝数，并增加了ROI的相对丰度。在优选的实施方案中，引物被设计为扩增广泛的致病生物(如果存在于样本中的话)。例如，取决于测试/测定的要求，引物被设计为扩增样本中的任何细菌或真菌，或各种细菌或真菌的子集。这将相对于人类序列或其他潜在干扰序列富集这些细菌和/或真菌ROI。在一些实施方案中，将一个或以上标签/衔接子引入到一个或以上扩增子产物中。一种示例性扩增方法是PCR。3)第一扩增反应的产物(AKA，PCR1扩增子)被稀释。4)在第二扩增反应中扩增稀释的PCR1扩增子的等分试样。示例性扩增方法是PCR(例如，在这种情况下为PCR2)。在优选的实施方案中，与PCR1中的相应引物相比，至少一种引物是嵌套的。这增加了另一层特异性。在另一个优选的实施方案中，进行多于一个的第二扩增反应(例如，PCR2.1、PCR2.2、PCR2.3；可以在盒上进行2-10个或更多的第二扩增反应)。在不同的第二扩增反应过程中，各个第二扩增反应均可以使用与第一扩增反应中不同的引物集(以覆盖广泛范围的靶多核苷酸)、或者使用与第一扩增反应中相同的引物集(例如，以制备更多的最终产物)或其任何组合。应当注意的是，第一扩增反应和/或一个或以上第二扩增反应可以被配置为扩增2个或更多个靶标(即多路扩增)。在一些实施方案中，将一个或以上标签/衔接子引入到一个或以上第二扩增反应的扩增子产物中。5)将所有第二扩增反应的扩增子产物汇集在一起。6)在一些实施方案中，直接纯化来自第二扩增反应的汇集产物(而在其他实施方案中首先进行拷贝控制过程；见下文)。将输出溶液与靶捕获试剂混合，孵育混合物，将所需扩增子与顺磁珠结合，使用磁体固定所述珠，洗涤所述珠并洗脱靶扩增子。在实施例O中给出了一种这样的程序的详细描述。在一些实施方案中，用生物素标记扩增子(例如，通过生物素化的引物)。在这样的实施方案中，在上面列出的孵育步骤中，靶扩增子与链霉亲和素包被的磁珠结合。在一些实施方案中，扩增子配备有通用标签(common tag)序列，并且设计与该通用序列互补的捕获寡聚体。在一些实施方案中，捕获寡聚体是生物素化的。在这样的实施方案中，生物素化的捕获寡聚体在第一孵育步骤中与包括通用标签序列的扩增子结合。然后将该反应混合物与包括链霉亲和素包被的磁珠的第二捕获试剂组合，并将所得混合物在第二孵育反应中孵育，在此期间扩增子/捕获寡聚体复合物与磁珠结合。在一些实施方案中，第一捕获试剂和第二捕获试剂的所有组分均在单个捕获试剂中，并且将第一孵育和第二孵育组合成仅1个孵育。
如上所述，在一些实施方案中，在汇集的PCR2扩增子上进行拷贝控制(CC)方案。在公开的发明中使用的可接受的CC方案包括可采用PCT/GB2021/050098中公开的任何CC方案中的一个(也可以考虑公开特征的各种组合)。在本文其他部分公开了各种CC组合和方法的详细描述。在优选的实施方案中，将来自PCR2反应的汇集输出与包括一种或以上CC寡聚体的CC试剂混合。然后将混合物在约92-95℃下加热以使靶扩增子变性。然后加热混合物以促进CC寡聚体和互补序列(如果存在)的退火以及CC寡聚体和靶扩增子的延伸(与CC寡聚体杂交的链的3'端；实施例部分、本文其他部分以及如PCT/GB2021/050098中所述，给出了各种加热方案以及组合物和反应方案的实施例)。然后将所得混合物与捕获寡聚体混合并孵育以促进与引入到靶扩增子/复合物中的捕获序列的杂交。然后将所得混合物与磁珠混合、孵育，使用磁体固定珠/靶标复合物，洗涤珠并洗脱靶标。在一些实施方案中，拷贝控制过程的一些、大部分或全部与第一扩增和/或一个或以上第二扩增反应同时进行。
上文和本文其他部分描述和讨论的文库制备实施方案(包括拷贝控制)具有将其与现有技术区别开来的多个优点，包括但不限于：1)在文库制备输入样本是其中公开的样本处理方法的输出的实施方案中，样本处理输出材料可以直接使用，而不需要定量或其他表征。在一些优选的实施方案中，样本处理输出的整个体积被用作输入，而在其他实施方案中将部分输出用作输入。在一些实施方案中，其一部分的初始样本用作文库制备的输入材料。2)该系统能够在整个过程中快速有效地混合初始输入样本和所需试剂以及试剂的其他组合。3)靶向富集方法提供了高度的杠杆作用，以实现广泛的测试/测定应用所需的选择性和特异性(两个连续扩增反应，在第二扩增中嵌套启动是一种选择，并且两个反应无缝整合(包括全自动稀释、等分和将等分试样分配到独立的反应室)以及灵活性(例如，在一些实施方案中，仅进行1次扩增反应；在一些实施方案中，配置各个单独的第二扩增反应(例如，通过引物设计)以产生不同的选择性、特异性、靶集等)。4)高多路复用能力。5)极大的灵活性和添加标签/衔接子的能力。例如，标签/衔接子可以通过任何组合的标记引物添加(例如，在一些实施方案中，同时进行PCR1和多个PCR2反应；各个反应可以是多路复用的，并且各个引物或引物集可以包括与另一个引物或引物集相同或不同的标签)。在其他实施方案中，可以通过连接添加标签/衔接子(在全自动系统中)。在其他实施方案中，通过连接和使用带标签引物的组合添加标签/衔接子。此外，加标签可以在预定程度上与拷贝控制过程相组合，从而进一步简化和精简整个过程，从而降低工作流程的复杂性并减少处理时间。5)该系统(盒+仪器)提供了将反应混合物(例如扩增反应，例如PCR1)稀释、等分并分配到多个新的反应混合物中(例如第二扩增反应，如PCR2)的新方法。6)在优选的实施方案中，整个过程仅利用单个纯化步骤(例如，在所公开的簇生成的直接杂交方法中下游使用的“直接纯化”、作为拷贝控制过程的一部分的纯化等)。此外，不需要对输入样本(例如来自各种公开的样本制备过程)或第一扩增反应及其稀释进行预分析(例如定量)。这些特征将所公开的方法与现有技术区别开来，现有技术需要多个纯化步骤并且[通常需要]预分析步骤。7)所公开的拷贝控制过程是新颖的，并且使用所公开的系统是清晰和完全自动化的。8)可以储存并最终重构(如果需要)所需试剂，并以各种组合和各种方法与其他反应物混合在测定和试剂盒中，从而为试剂储存和使用提供独特而有效的方法/路径。9)整个过程通过系统全集成和自动化。10)该过程是迅速的。
在一些实施方案中，在文库制备(进行或不进行拷贝控制)后，样本在固体载体的表面上进行簇生成。在其他实施方案中，样本可以绕过文库制备步骤并直接移动到簇生成。在优选的实施方案中，在半导体芯片的表面上进行簇生成。在进一步的实施方案中，半导体芯片包括ISFET传感器的阵列。仍在进一步的实施方案中，半导体芯片的表面包括孔。在一些实施方案中，簇生成包括靶多核苷酸与固体载体表面上的特异性靶捕获寡聚体阵列的直接杂交。在其一些实施方案中，当分析方法是测序时，捕获寡聚体也可以用作测序引物。在实施例M中概括了使用直接杂交方法生成簇的示例性方法(在这种情况下，随后进行测序)。在其他方法中，簇生成包括克隆扩增。在实施例J中概括了使用重组酶聚合酶扩增(RPA)进行克隆扩增的示例性方法。在实施例K中概括了利用滚环扩增(RCA)进行克隆扩增的示例性方法。
上文和本文其他部分描述和讨论的簇生成实施方案(包括拷贝控制)具有将其与现有技术区别开来的多个优点，包括但不限于：1)文库制备步骤的输出(进行或不进行拷贝控制)可以直接用于簇生成方法。在一些实施方案中，输出材料(溶液)被直接移动到覆盖固体载体的流动池中。在这种情况下，流动池的体积将指定在簇生成步骤中使用多少输出溶液。输出溶液不需要任何另外的操作，如定量、稀释、等分等。2)在优选的实施方案中，簇形成直接发生在半导体芯片的表面上，在半导体芯片的表面上也进行测序。这在现有技术中是前所未有的。3)如本文其他部分所描述和讨论的，所公开的使用RPA进行克隆扩增的方法是新颖的并且区别于本领域现有技术；4)如本文其他部分所描述和讨论的，所公开的环状模板形成(从文库制备阶段开始)和使用RCA进行克隆扩增的方法是新颖的并且区别于本领域现有技术；5)整个过程通过系统完全集成和自动化。6)该过程是迅速的。
在一些实施方案中，在簇生成后，通过测序分析靶核酸。在优选的实施方案中，在半导体芯片的表面上进行测序。在进一步的优选的实施方案中，半导体芯片包括ISFET传感器的阵列。在更进一步优选的实施方案中，半导体芯片的表面包括孔。在实施例L(直接固定在芯片表面上的合成模板测序)、实施例M(使用直接杂交方法的合成模板测序)、实施例N(使用孔内克隆扩增产生的模板测序)和实施例O(对加标至全血的病原体进行自动样本到应答测序；整个工作流程，从全血样本开始，到测序和结果分析结束)中概括了使用包括ISFET传感器阵列并且还包括表面上的孔的半导体芯片进行测序的示例性方法。
半导体测序的许多优点在现有技术中得到了很好的理解和证明。这些优点包括速度(比大多数合成测序方法的测序更快)、不需要修饰/标记的核苷酸、不需要光学检测、每个给定长度的序列需要更少的核苷酸和洗涤流体等。本文公开的测序实施方案具有多个另外的优点，包括但不限于：1)在包括盒和仪器的系统中，包括在半导体芯片表面上簇形成的整个过程以及在簇生成之前的所有样本和文库制备步骤(如果需要的话)是全自动的。2)测序所需的所有试剂均包含在一次性试剂盒中，测序运行后所有废液均包含在试剂盒中。这提供了简单有效的使用以及在运行后对使用过的部件的安全处置。3)所公开的同时测序引物退火和测序酶结合的方法提供了简单性和缩短的运行时间。4)所公开的关键序列引入和使用的方法提供了一种用于校准测序运行等的新方法。5)该系统能够对用于测序的试剂进行板载pH滴定，这对于基于ISFET的测序很重要。
本发明的进一步实施方案包括板载计算机和辅助设备/电子设备以及软件。计算机和软件的使用包括对系统的控制以及对系统生成的信号/数据的收集和分析。
通用工作流程的示例性用户接口步骤如图62所示。首先，用户可以使用仪器前面的条形码扫描仪将各种信息扫描到仪器中。例如，可以扫描ID标识以注册用户或准许能够访问某些测定/功能。用户信息可以与任何后续测定数据一起存储，以控制访问和/或用于质量控制或分析目的。可以扫描样品或样本容器以读取和记录用于测定的样本数据。例如，可以在真空采血管上的条形码上编码与血液样本相关的患者信息，通过在进入样本盒或测定盒之前用仪器扫描，系统可以将任何后续测定数据与特定样本或患者关联起来。用户然后可以扫描套件，套件可以向仪器提供关于要进行什么测定的信息。这可以通过自动生成所需测定的测定工作流程来消除用户错误，或者可以用作质量控制检查，以确保对于在用户界面中输入的用户选定的测定使用正确的套件。然后，用户可以从包装中取出一个或以上的盒，并为插入做好准备。在某些实施方案中，测定中涉及的唯一用户操作是打开盒，去除覆盖任何端口的无菌箔，以及装载(loading)样品，之后将盒插入仪器中用于测定的自动化处理。例如，用户可以通过专门设计用于接收特定尺寸/类型样本容器的样本输入子单元将真空采血管插入样本盒中。然后，可以例如通过自动打开的门将盒装入仪器。该仪器然后可以自动运行所需的测定，并通过用户界面(例如仪器上的显示器)或通过网络将结果提供给其他计算机。然后，该仪器可以弹出其中包含所有废物的盒。由此，减少了用户错误和任何污染的风险，并且仪器已准备好进行下一次测试，而无需清洁或板载试剂的重新填充，因为所有流体均包含在盒内。
b.通用工作流程中的选项
对于进行测试/测定，系统的设计具有前所未有的处理能力和灵活性，包括在分子测试领域，包括测序。单个集成系统包括一个或以上盒，其中具有许多不同的尺寸和功能的室，具有高度的流体连通性，具有大的体积容量，具有移动、输送、组合、混合、重构和以其他方式处理液体(以及气体和固体，如在重构干燥的、玻璃化的或其他固体试剂或组分时)的新颖多样的手段，具有加热、磁分离、扰动、混合、感测、滴定(例如pH滴定)、检测和分析的手段。所有这些均是通过板载计算机控制的，并且可按照不同的顺序、持续时间、条件(例如温度)等进行大量的处理步骤。在这种情况下，可以运行各种各样的不同测试/测定，并且各个测试/测定的不同步骤可有各种各样的选择。
在本发明的范围内，许多样本制备的选择是可行的。在一些样本中，例如，当样本太粘稠、不均匀、呈纤维状、凝胶状时，装入到仪器中的初始样本可能需要初始处理步骤。在本发明的范围内，用于样本初始处理的方法的实例包括但不限于：与试剂混合，包括湍流混合、曲折混合(tortuous mixing)、搅拌混合等，包括与试剂如裂解剂、变性剂、离液剂、有机溶剂、缓冲剂、盐等及其各种组合的混合；和/或酶促消化，例如用蛋白酶K(如以上通用工作流程中所述)和/或其他蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等；和/或化合物，包括二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、其他还原剂、氧化剂、酸、碱等。在初始处理步骤期间，可以对样本进行混合、加热、超声处理等。在一些样本中，不需要初始处理，样本可以直接进入下一步。在一些全血样本中，使用集成到盒中并在系统内无缝衔接地工作的分离系统将装入到盒中的全血分离成血浆和全血的其他成分。设想在所公开的系统的情境下能够实现上述所有内容。
在一些样本中，靶多核苷酸包含在细胞内，包括细胞核内和/或其他结构内。在本发明要求保护的的范围内，用于靶多核苷酸的细胞裂解/释放的方法的实例包括但不限于：机械裂解(如上所述)、存在或不存在珠(例如，珠撞击)、超声处理、加热、混合(例如，湍流混合)、剪切(例如，通过使其穿过小孔)等。这些过程中的每一个还可以包括与样本混合的试剂的作用，该试剂参与裂解机制(裂解剂、变性剂、溶剂等；更多选项见上文)。在靶多核苷酸被包括在细胞的细胞核中的情况下，可以首先进行细胞外膜的温和裂解，并将细胞的内容物与细胞核分离，然后使用更严格的方法裂解细胞核。在一些情况下，样本不需要裂解(例如，在样本被装入到盒中之前裂解细胞，在初始处理步骤中裂解细胞，或者靶核酸不在样本中的细胞中，等等)。在这些情况下，样本可以直接进入过程的下一步。设想以上所有内容均能够在所公开的系统的情境下实现。
在靶多核苷酸包含在细胞内(包括细胞核内)和/或其他结构内时使用的其他方案中，包括捕获完整细胞的方案(例如，通过使用磁珠的亲和捕获)。洗掉样本的剩余部分，然后裂解细胞(上文给出的裂解方法的实例)。设想以上所有内容均能够在所公开的系统的情境下实现。
在一些方案中，靶核酸必须变性(例如，双链到单链)和/或从与其他结构的缔合中释放出来(例如，缠绕在组蛋白周围的DNA)。变性的方法包括加热、用试剂(化学和/或生物)处理、混合、超声处理等。在一些情况下，这是不需要的，样本可以直接进入过程的下一步。设想以上所有内容均能够在所公开的系统的情境下实现。
在一些情况下，分离靶多核苷酸。在本发明要求保护的范围内，分离靶多核苷酸的方法的实例包括但不限于：1)如本文其他部分所述的特异性靶捕获(STC)。这包括如本文其他部分以及PCT/GB2021/050098中所述的有限靶捕获；2)非特异性捕获方法，例如固相萃取方法，其实例包括但不限于固相可逆固定(SPRI)、固相微萃取(SPME)、基于二氧化硅的方法，包括Boom方法、AMPure方法等；3)非特异性捕获(如固相萃取)和特异性靶捕获技术的组合(如这里所述的，首先是Boom方法，然后是STC)；4)混合捕获靶富集策略，如AgilentSureSelect方法，该方法利用RNA捕获探针或“诱饵”来拉下目的区域。存在许多不同的基于杂交的此类方法，以及用于靶向富集的其他策略，包括但不限于转座子介导的片段化(标记)、分子倒置探针(MIPs)和聚焦扩增程序(focused amplification procedures)(例如，如本文中其他部分所述)。应当注意的是，这些程序中的许多利用片段核酸靶标。还应当注意的是，这些程序中的许多可以与文库制备相结合或在文库制备之后使用，但本文中，在可用于所公开的系统中的样本制备阶段的方法的情境中对其进行了描述(它们也将在文库制备部分中提及)。还应当注意的是，可以在捕获到珠上的靶多核苷酸上(在样本制备、文库制备、拷贝控制和簇生成中)进行扩增或扩增的第一步骤或早期步骤。设想以上所有内容均能够在所公开的系统的情境下实现。
在一些情况下，在本发明要求保护的范围内，可以在工作流程的样本处理阶段期间进行其他过程，实例包括但不限于：1)靶多核苷酸的片段化；2)向靶多核苷酸添加标签/衔接子，例如，通过与靶多核苷酸退火并延伸(在样本制备和/或文库制备期间)或通过连接而对核苷酸加标签。3)唯一分子标识符可以引入到样本中的一些或全部靶多核苷酸中。在一些情况下，靶多核苷酸已经是片段形式的且在样本中也是非常短的片，例如尿液中的片段DNA、血液中的循环肿瘤DNA(ctDNA)、细胞游离DNA(各种样本类型)、小RNA(各种样本类型)等。可以在系统上进行处理这些多核苷酸样本的方法，包括但不限于添加标签/衔接子、扩增、重组、捕获等。设想以上所有内容均能够在所公开的系统的情境下实现。
在要求保护的本发明范围内，文库制备的许多选择是可行的。在一些实施方案中，文库制备过程的输入是样本制备方法的输出，并且在一些实施方案中，它是初始样本本身。本文其他部分描述了靶向富集的基于扩增的方法的优选的实施方案。设想在所公开的系统中使用的这些方法的变体包括但不限于：1)一个或三个(或更多个)单独的扩增反应；2)作为拷贝控制过程的一部分，在广泛的场景中引入的标签/衔接子(仅在扩增反应之一中，在扩增反应的组合中，在同一靶多核苷酸的端之间以及从靶多核苷酸到靶多核苷酸差异地引入(如本文其他部分和PCT/GB2021/050098中所述)，作为样本制备阶段(见上文)和文库制备阶段中的过程的组合)等。可以使用本领域已知的多种方法来实现扩增，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、反转录PCR、缺口内切酶扩增反应(NEAR)、转录介导的扩增(TMA)；环介导等温扩增(LAMP)；解旋酶依赖型扩增(HDA)；成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)；链置换扩增(SDA)；重组酶聚合酶扩增(RPA)、连接酶链式反应(LCR)等。本领域已知有多种其他文库制备方法，设想这些方法均可用于所公开的系统中。通用工作流程的几个实例包括但不限于：1)片段化、衔接子连接、扩增(通常包括另外的衔接子添加)；2)片段化、扩增(随机、半随机、特异性；可包括衔接子添加)、衔接子添加；任选的扩增(通常包括另外的衔接子添加)；3扩增(可以包括上面列出的实例以及全基因组扩增(例如，Picoseq、DOPlify、REPLI-g(基于多重置换扩增，或MDA)和Ampli-1 WGA)、长程PCR、使用半随机和/或简并引物的扩增等)、片段化、衔接子添加、任选扩增(通常包括另外的衔接子添加)；3)转座子介导的片段化(标记)；4)基于分子倒置探针的方法(MIPs)；等等。完成上述几种文库制备技术之后，可以进行靶向富集(上面列出的一些技术，如SureSelect)。如上所述，文库制备和样本制备过程的这些步骤可以重叠并在盒的不同单元上进行。同样如上所述，可以在样本制备和/或文库制备过程的各个阶段添加UMI(其中在该过程中取决于确切的方案)。设想以上所有内容均能够在所公开的系统的情境下实现。
可以在文库制备后进行拷贝控制，与文库制备过程重叠，也可以完全不进行(取决于应用)。在一些情况下，甚至可以在样本制备过程中引入拷贝控制过程中使用的标签/衔接子。已经描述了各种新颖的拷贝控制方法。此外，也可以在系统上进行本领域已知的其他拷贝控制方法。
本文已经描述了簇生成方法。也可以使用其他方法，包括使用不同的表面和/或表面几何形状、不同的表面固定化学物质和不同的扩增方法。我们已经证明了在所要求保护的发明中支持簇生成的其他方法包括PCR、HDA、SLAM(一种专有的表面相扩增程序；正在申请专利)和EM-Seq(一种专有的置换介导的扩增程序；正在申请专利)。
基本上可以使用任何靶向策略在在任何类型的测序文库上(参见上面的实例)进行在半导体芯片上的测序，即，不仅仅是对来自例如靶向富集的扩增子的测序。此外，可以在簇生成后使用与任何数量的靶标和靶源(不仅仅是用作实例的那些)的直接杂交(如上所述)进行测序。具有不同特异性程度的捕获寡聚体的高密度阵列可以应用于芯片的表面并在该方法中采用。
已经开发了多种数据分析方法，包括通过三角测量进行分析(三角测量策略也用于寡核苷酸设计，包括STC、靶向富集和关键序列开发)。
定义
应当理解，本公开不限于特定的组合物或方法步骤，因为这些可以变化。应当注意，如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确地指明，否则单数形式“一(a,an)”、“所述(the)”和“该(the)”包括复数指代物，并且诸如“一个或以上项目”的表达包括单数指代物。因此，例如，提及“寡聚体”包括多个寡聚体等。连接词“或”应当以包含性意义来解释，即，等同于“和/或”，除非包含性意义在上下文中不合理。当存在类别(例如，寡聚体)的“至少一个”成员时，提及“所述”成员(例如，寡聚体)是指存在的成员(如果仅一个)或存在的成员(例如，多个寡聚体)中的至少一者(如果多于一个)。
应当了解，在本公开中所论述的温度、浓度、量、时间等之前存在隐含的“约”，使得在本文教导的范围内包括微小且非实质性的偏差。通常，术语“约”表示组合物的组分的量的非实质性变化，对组合物的活性或稳定性没有任何显著影响，例如在10％、5％、2％或1％内。因此，除非有相反的说明，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的期望性质而变化。至少，并且并非旨在限制权利要求范围的等同原则的应用，每个数值参数应该至少考虑所述的有效数字的位数并通过应用常规舍入技术来解释。当没有诸如“不包括端点”之类的排除性表述时，所有范围应被解释为包括端点；因此，例如，“在10至15内”包括数值10和15以及所有中间整数和(在适当的情况下)非整数值。此外，“包含(comprise、comprises、comprising)”、“包括(contain、contains、containing)和“含有(include、includes、including)的使用不旨在限制。应当理解，前面的一般描述和详细描述都仅仅是示例性和说明性的，而不是对教导的限制。提供的段落标题仅仅是为了方便读者，而不是为了限制本公开。当通过引用并入的任何材料与本公开的表达内容不一致时，以本公开的表达内容为准。
除非特别指出，否则说明书中叙述“包括”各种部件的实施方案也被认为是“由所叙述的部件组成”或“基本上由所叙述的部件组成”。“基本上由……组成”是指本文所述的组合物或方法中可以包括不会实质上改变那些组合物和方法的基本特征和新颖特征的一个或多个附加的组分、成分或方法步骤。根据具体情况，这些特征包括(例如)如本文所述的与靶多核苷酸杂交并经过进一步结合和/或延伸反应的能力。
“样本”是指可包含靶多核苷酸的物质，包括但不限于生物样本、临床样本、环境样本和食品样本。环境样本包括环境材料，例如地表物质、土壤、水、污泥、空气和工业样本、以及从食品和乳品加工仪器、设备、装备、器皿、一次性和非一次性物品获得的样本。“生物”样本或“临床”样本是指可包含靶多核苷酸的、来自活的或死的人、动物或其他生物体的组织、液体或其他材料，例如包括组织样本、拭子、洗液、抽吸物、渗出物、活检组织或体液如血液、脊髓液、排泄物、精液或尿液。可以对样本进行处理以物理或机械地破坏组织或细胞结构，从而将细胞内核酸释放到可能含有酶、缓冲液、盐、裂解剂等的溶液中，以制备用于分析的样本。样本也可以是含水或有机溶剂的或其组合，具有或不具有包括靶多核苷酸的其他组分(例如缓冲液、盐、去垢剂、乳化剂、EDTA等)。这些实例不应被解释为限制可应用于本公开的样本类型。
样本制备是指一种方法或方法的组合，通过其对含有靶多核苷酸的样本进行操纵，以制备靶多核苷酸用于进行进一步的下游处理和/或分析。这些方法包括但不限于：释放、可及、消化、去除样本中结合组分、浓缩、富集、捕获、分离(separate和/或isolate)样本中靶多核苷酸的方法。这类方法还包括从含有靶多核苷酸的样本中去除、中和或以其他方式降低对下游分析物质、组分、污染物、生物体生物体(包括死的或活的和/或这些生物体的碎片)或其他生物、有机或无机材料的潜在竞争性、干扰性、遮蔽性或有害性的影响的方法。这类方法包括但不限于：1)溶解(solubilize，dissolve)、均质化、消化或以其他方式改变样本的物理或化学性质以帮助制备靶多核苷酸的方法，这些方法包括但不限于加热、冷却、冷冻、冻融、消化(包括使用化学或生物手段，包括酶促手段)、超声处理、使用溶剂、试剂和/或其他化学或生物手段溶解、搅拌、剪切、机械搅动等；2)过滤样本；3)浓缩样本；4)加标签、标记、捕获、浓缩、分离或以其他方式处理疑似含有靶多核苷酸的细胞，这些方法包括但不限于：用包括抗体、卵磷脂、核酸、蛋白质、肽、适配体、树枝状分子、其他细胞、病毒、巨噬细胞、其他生物成分等细胞特异性组分进行加标签，用荧光染料、放射性标记、发光标记、质量标记等标记细胞，使用沉淀、离心(包括使用密度梯度)、过滤、亲和捕获(包括通过上述加标签部分中列出的细胞特异性组分中的至少一种)对细胞进行捕获、浓缩或分离，包括直接或间接与固体载体结合、细胞分选等；5)裂解、消化、破裂、部分溶解、剪切或以其他方式操纵含有靶多核苷酸或以其他方式与靶多核苷酸缔合的细胞或其他结构，以使靶多核苷酸可被使用或以其他方式更容易用于进一步处理或分析，这些方法包括但不限于：加热、冷却、冷冻、冻融、煮沸、将细胞暴露于渗透冲击、用溶剂或化学品或其他试剂处理，包括联合使用加热、超声处理、超声处理同时加热、击打/撞击、酶处理、搅拌、剪切(包括机械剪切)等；6)溶解(solubilize，dissolve)、均质化、消化或以其他方式改变靶多核苷酸的物理或化学特性的方法，以帮助靶多核苷酸的进一步处理和/或分析，这些方法包括但不限于本段落上文部分(1)中列出的至少一种方法；7)加标签、标记、浓缩、富集、捕获、分离(separate和/或isolate)靶多核苷酸的方法，这些方法包括但不限于：通过直接或间接、共价或非共价地加标签、结合至、固定、偶联、引入或以其他方式附着至核酸、核酸节段、多个核酸节段、蛋白质、酶、适配体、卵磷脂、树枝状分子、元件、分子、或任何其他物质或部分，包括有助于靶多核苷酸的进一步制备、处理(包括扩增)和/或分析的化学、生物、有机和/或无机物质，包括本领域通常已知的所有加标签方法，用荧光染料、放射性标记、发光标记、质量标记等进行标记，沉淀、萃取(包括GuSCN、CTAB、Chelex(和其他树脂类型)和碱性萃取)、色谱法(包括柱层析)、过滤、离心(包括使用密度梯度)、等电聚焦和本领域已知的其他聚焦技术，在固体载体上直接和间接地捕获，包括磁性微球和本领域通常已知的其他固体载体材料，包括使用非特异性靶捕获方法，如固相萃取(SPE)、离子交换SPE、固相可逆固定(SPRI)、固相微萃取(SPME)、基于二氧化硅的方法，包括Boom法、AMPure法，以及使用随机或半随机靶捕获寡聚体来捕获样本中的各种靶标，特异性靶标捕获方法，包括利用一个或以上对目的靶多核苷酸或一组多核苷酸具有特异性的寡核苷酸的方法，其中寡核苷酸与靶核酸退火并且这个/这些复合物被固定在固体载体上，其中富集、捕获、分离(separate和/或isolate)靶多核苷酸或以任何其他方式纯化靶核酸的一些方法包括一个或以上洗涤步骤，一些这样的方法包括洗脱步骤，并且此外其中一些方法还使用直接来自样本的靶核酸进行进一步的下游处理(例如扩增)和/或分析；8)从样品中去除、中和或以其他方式降低对下游分析物质、成分、污染物、生物体(包括死的或活的和/或来自此类生物体的碎片)或其他生物、有机或无机材料的潜在竞争性、干扰性、遮蔽性或其他有害效果，此类方法包括去除非靶多核苷酸(包括基因组DNA，包括人类基因组DNA)，去除RNA(包括rRNA)，对蛋白质、酶、脂质、碳水化合物、生物材料、有机材料、无机材料、细胞(包括全细胞和部分或完全裂解或以其他方式降解的细胞)以及其他可能干扰下游处理和/或分析的成分进行去除、消化、灭活等处理。在如下文献描述样了本制备的其他方法：J.Dapprich,et al.,The next generation of targetcapture technologies-large DNA fragment enrichment and sequencing determinesregional genomic variation of high complexity(BMC Genomics(2016),17:486)和NAli,et al.,Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications toPoint-of-Care Diagnostics(BioMed Research International(2017),Article ID9306564,13pages)，其全部内容通过引用并入本文。
特异性靶捕获(STC)方法是指可用于在更广泛的多核苷酸混合物中加标签、分离(separate、isolate)或以其他方式区分特异性靶多核苷酸的方法或其组合。这与非特异性捕获方法形成对比，非特异性捕获方法通常对混合物中的所有多核苷酸进行操作(尽管可能存在某些类型的区分，例如基于长度)。STC方法通常基于核苷酸序列区分多核苷酸进行(尽管如果达到所需的特异性水平，则其他区别方法也是可接受的)。本公开中的优选方法是使用STC寡聚体(寡聚体)根据序列来区别靶标。设计寡聚体或一组寡聚体使得其与给定的靶标、一组靶标、靶标集合等特异性退火，而非以任何显著水平与样本混合物中可能存在的非靶多核苷酸退火。通过STC寡聚体设计与所选反应条件相结合，可以在整个分类谱中实现基本上任何水平的特异性。例如，可以在亚种/菌株、种、属、科、目、纲和/或门水平上，甚至在界和域水平上区别靶多核苷酸。在所公开的发明的优选的实施方案中，其中系统用于检测血流感染以及抗微生物药物耐药性基因，STC寡聚体被设计为结合并选择性地捕获广泛的细菌和真菌靶标以及特异性抗微生物药物耐药性(AMR)基因。一旦STC寡聚体与预期靶进行退火，就可以使用多种不同的方法捕获、固定、分离(separate、isolate)等处理得到的复合物，在本公开的其他部分讨论了其中的几个例子。
“核酸”和“多核苷酸”是指包含核苷或核苷类似物的多聚化合物，其具有连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物以形成多核苷酸，包括常规的RNA、DNA、混合的RNA-DNA和作为它们的类似物的聚合物。核酸“骨架”可以由多种键组成，包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT No.WO 95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或它们的组合中的一种或以上。核酸的糖部分可以是核糖、脱氧核糖或具有取代基(例如，2'甲氧基或2'卤素取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(例如肌苷或其他；参见The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36,Adams et al.,ed.,11th ed.,1992)、嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮嘌呤或氮杂嘌呤、脱氮嘧啶或氮杂嘧啶、在5或6位具有取代基的嘧啶碱基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基-嘧啶；美国专利No.5,378,825和PCT No.WO 93/13121)。核酸可以包括一个或以上“无碱基”残基，其中主链包括聚合物的无碱基位点(美国专利No.5,585,481)。核酸可以仅包含常规RNA或DNA糖、碱基和连接键，或可以包括常规组分和取代(例如，具有2'甲氧基连接键的常规碱基、或含有常规碱基以及一种或以上碱基类似物的聚合物)。核酸包括“锁核酸”(LNA)，其为包含一个或以上LNA核苷酸单体的类似物，所述LNA核苷酸单体具有锁定在模拟糖构象的RNA中的双环呋喃糖单位，其可增强对互补RNA和DNA序列的杂交亲和性(Vester和Wengel,2004,Biochemistry 43(42):13233-41)。能够影响杂交复合体稳定性的寡聚体的实施方案包括PNA寡聚体、包含2'-甲氧基或2'-氟取代的RNA的寡聚体、或影响杂交复合体的总体电荷、电荷密度或空间关系的寡聚体，包括含有带电子连接键(例如硫代磷酸酯)或中性基团(例如甲基膦酸酯)的寡聚体。除非另有说明，否则甲基化胞嘧啶如5-甲基胞嘧啶可以与任何前述骨架/糖/连接键、包括RNA或DNA骨架(或它们的混合物)结合使用。RNA和DNA等同物具有不同的糖部分(即，核糖相对于脱氧核糖)，并且可以因RNA中存在尿嘧啶而DNA中存在胸腺嘧啶而不同。RNA和DNA等同物之间的差异不会造成同源性差异，因为等同物与特定序列具有相同程度的互补性。应当理解，当提及寡核苷酸、扩增子或其他核酸的长度范围时，该范围包括所有整数(例如，19-25个连续核苷酸的长度包括19个、20个、21个、22个、23个、24个和25个)。除非另有说明，否则T残基被理解为可与U残基互换，反之亦然。核酸聚合物链的取向可以描述为加(+)义(或正义，或简称有义或编码链)或负(-)义(或减，或简称为反义或非编码链)。
“靶多核苷酸”是指使用本文所述的组合物或方法进行制备、分离(separate)、捕获、分离(isolate)、富集、扩增、检测、鉴定和/或测序等的多核苷酸。在一些实施方案中，靶多核苷酸包括来自生物体(例如，任何病毒、原核生物、真核生物、原生生物、植物、真菌、昆虫、动物、哺乳动物或其他生物实体，其可以是活的或以前是活的)的DNA或RNA的序列。示例性DNA包括基因组DNA、循环肿瘤DNA、游离型或质粒DNA以及线粒体DNA。示例性的RNA包括信使RNA、更通常为转录的RNA、核糖体RNA、转移RNA、小核RNA、调节RNA、转运-信使RNA、核仁小RNA、向导RNA、干扰RNA、微RNA、其他调节RNA、非编码RNA等(并且在适用的情况下，为基因组RNA，例如在某些病毒的情况下)。靶多核苷酸可以是正义、负义或正义和负义两者(例如，当多核苷酸的两条链均被靶向时)。靶多核苷酸还包括上文讨论的核酸的一个或以上拷贝，其中可以添加附加序列(例如本文所述的任何附加序列)。在一些实施方案中，靶多核苷酸包括非天然存在的序列，例如，由体外合成、连接、定点诱变、重组等产生的序列。
“寡聚体”或“寡核苷酸”是指通常少于1,000个核苷酸(nt)的核酸，包括在下限为约2nt至5nt且上限为约500nt至900nt的大小范围内的那些核酸。一些具体实施方案为在下限为约5nt至35nt且上限为约50nt至600nt的大小范围内的寡聚体，并且其他具体实施方案为在下限为约5nt至20nt且上限为约30nt至1500nt的大小范围内的寡聚体。寡聚体可以从天然存在的来源纯化，但可以通过使用任何熟知的酶促或化学方法合成。寡聚体可以用功能名称(例如捕获寡聚体、引物、启动子引物或检测探针)来表示，但是本领域技术人员将理解，这样的术语是指寡聚体。寡聚体可以通过自杂交或通过与其他寡核苷酸或多核苷酸杂交形成二级和三级结构。这样的结构可以包括但不限于双链体、发夹、十字型、弯曲型、三链体和四链体。寡聚体可以含有修饰，所述修饰包括本公开中其他部分描述的那些。在一些情况下，寡聚体可以指非基于核酸的聚合物，例如一些适配体和非基于核苷酸的结合配偶体(例如，参见Winnacker,M.,&Kool,E.T.(2013).Artificial Genetic Sets Composed ofSize-Expanded Base Pairs.ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION,52(48),12498–508)。可通过任何方式产生寡聚体，包括化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或它们的组合。在一些实施方案中，在反应(例如，通过在酶促延伸反应中引物的延伸)中产生了形成侵入性酶切(invasive cleavage)结构的寡聚体。
“任意序列”是指由用户(在有或没有计算机程序的帮助下)选择、选定、确定、设计等而得到的任何序列，通常用于在下游过程中提供期望的功能或目的。在优选的模式中，任意序列被设计成在给定的方法条件下与一个或以上靶序列不互补或不与其反应。在一些实施方案中，任意序列可以是随机产生的序列或序列的集合，例如用作唯一分子标识符或通用引物。
“捕获寡聚体”、“捕获寡核苷酸”、“捕获探针”、“靶捕获寡聚体”和“捕获探针寡聚体”可互换使用，是指包括以下序列的核酸寡聚体或其衍生物：其包括能够结合靶核酸中的一个或以上靶序列的靶结合序列(TBS)。根据系统的设计以及所需的应用和结果，可以以不同的、用户选择的特异性水平进行结合。一种结合模式包括与靶核酸杂交，同样具有不同的、用户选择的特异性水平，从高特异性到低特异性(包括设计捕获寡聚体以在分类顺序的任何点捕获所需靶标；参见本公开的其他部分所讨论的)。靶捕获寡聚体还可以包括随机或半随机序列的节段(或整个寡聚体)。捕获寡聚体还可以包括一个或以上：(i)可延伸的3'末端，(ii)不可延伸的(例如，阻断的)3'末端，(iii)可连接的5'末端；(iv)配体对的第一配体(例如，配体对生物素/链霉亲和素的生物素)，其可以有一个或以上拷贝，(v)3'端、5'端或两者上悬突的和/或插入到THS中的标签序列，(vi)一个或以上标签序列和一种或以上配体的组合。示例性标签序列包括能够与二级寡聚体杂交的捕获序列，所述二级寡聚体例如固定在固体载体上或固定在与结合配偶体连接的非固定二级寡聚体，以有利于包括捕获寡聚体、靶标和二级寡聚体的复合物与组合物中的其他分子的分离。以下“标签”定义部分介绍了其他示例性标签序列选项。捕获寡聚体的核酸组分包括上述“核酸”定义部分中描述的其任何形式或其组合。在某些情况下，捕获寡聚体可以不仅仅起到捕获试剂的作用，还包括但不限于起到以下作用：引物、扩增寡聚体、阻断序列、用于切割/消化的位点的一部分、置换序列、识别位点的部分等。捕获寡聚体也可以是“COMPOSITIONS,KITS AND METHODS FORISOLATING TARGET POLYNUCLEOTIDES”(PCT/GB2021/050098)中描述的任何捕获寡聚体，其全部内容通过引用并入本文。该文献详细描述了与拷贝控制相关的组合物、套件和方法(在本文其他部分讨论)。
“核酸扩增”或“扩增”(在核酸的明确背景下；“扩增”在不同背景下可以具有不同的含义，例如，产生1个或多个拷贝的非核酸分子，检测信号的增加，如荧光，电信号的增加等)是指产生1个或多个靶核酸(或靶多核苷酸、母体分子、模板、模板分子等)序列或其互补序列或其一部分(即含有少于完整靶核酸的扩增序列)的拷贝。核酸扩增程序的实例包括转录相关方法，例如转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)和其他方法(例如，美国专利No.5,399,491、5,554,516、5,437,990、5,130,238、4,868,105和5,124,246)、复制酶介导的扩增(例如，美国专利No.4,786,600)、聚合酶链式反应(PCR)(例如，美国专利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159)、滚环扩增(RCA)(例如，美国专利No.5,854,033和6,143,495)、重组酶聚合酶扩增(RPA)(例如美国专利No.7,666,598)、连接酶链式反应(LCR)(例如欧洲专利申请0320308)、环介导扩增(例如，Loop-mediated isothermalamplification of DNA(2000)Nucleic Acid Res,28(12)：e63)和链置换扩增(SDA)(例如美国专利5,422,252)。复制酶介导的扩增使用自复制的RNA分子和诸如QB复制酶之类的复制酶。PCR扩增使用DNA聚合酶、引物和循环步骤(通常是热循环，但也可以使用其他类型的循环，如化学循环)来合成DNA或cDNA的两条互补链的多个拷贝。两个互补链的拷贝可以以1:1以外的比率产生，例如在不对称PCR中(例如，Asymmetric PCR.In:Capinera J.L.(eds)Encyclopedia of Entomology,2008,Springer,Dordrecht)。LCR扩增使用至少四个单独的寡核苷酸通过使用多个杂交、连接和变性循环来扩增靶标及其互补链。SDA使用含有限制性内切酶识别位点的引物，该限制性内切酶将在包括靶序列的半修饰DNA双链体的一条链上产生切口，然后在一系列引物延伸和链置换步骤中进行扩增。具体的实施方案使用PCR，但对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，本文公开的寡聚体可以容易地用作其他扩增方法中的引物，并且通常可以使用其他扩增方法和引物。
“扩增子”或“扩增产物”是指在核酸扩增反应中产生的核酸分子，其来源于模板核酸。扩增子或扩增产物含有扩增核酸序列(例如，靶多核苷酸/核酸)，其可以与模板核酸同向或反向，包括DNA或RNA，并且包括单链或双链产物。在一些实施方案中，扩增子的长度为约100-30,000个核苷酸、约100-10,000个核苷酸、约100-5000个核苷酸、100-2000个核苷酸、约100-1500个核苷酸、约100-1000个核苷酸、约100-800个核苷酸、约100-700个核苷酸、约100-600个核苷酸或约50-500个核苷酸。
“扩增寡核苷酸”或“扩增寡聚体”是指与靶核酸或其互补序列或标签序列等杂交并参与核酸延伸或扩增反应的寡核苷酸，例如用作引物和/或启动子引物、置换序列(具有或没有延伸)、阻断序列(例如，阻断结合或延伸)，以帮助促进切割或降解，破坏结构等。一些捕获寡聚体也可用作扩增寡聚体(参见本说明书其他部分所述)，并且一些扩增寡聚体也可用作捕获寡聚体。扩增寡聚体还包括启动子提供序列，其包含可启动转录但不必通过DNA聚合酶延伸的启动子，并且可包含3'阻断部分。特定的扩增寡聚体包括至少约5个连续碱基和任选至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续碱基的靶杂交序列、互补杂交序列或标签杂交序列，其与靶核酸序列或标签序列的区域或其互补链互补。在本文其他部分描述了靶杂交序列或标签杂交序列的其他示例性长度或长度范围，并且可以应用于扩增寡聚体。连续碱基可以与结合扩增寡聚体的靶序列至少约70％、至少约80％、至少约90％或完全互补。在一些实施方案中，扩增寡聚体包括在互补序列的两个片段之间的插入接头或非互补序列，例如，其中寡聚体的两个互补片段共同包括至少约5个互补碱基，并且任选地共同包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个互补碱基。在一些实施方案中，扩增寡聚体的长度为约10至约80个碱基，并且任选地可以包括修饰的核苷酸。扩增寡聚体可以任选被修饰，例如通过包括与靶序列非互补的5'区域进行修饰。这种修饰可以包括功能性添加，例如标签、启动子、或者用于或可用于操纵、扩增、捕获、固定或以其他方式处理引物、标签或靶分子的其他序列或部分。
“引物”是指与模板核酸杂交并具有通过聚合延伸的3'端的寡聚体。引物可以任选地被修饰，例如通过包括与靶序列非互补的5'区域进行修饰。这种修饰可以包括功能性添加，例如标签、启动子或其他序列或其他部分，所有这些均可以用于或可用于操纵、扩增、捕获、分离、固定或以其他方式处理引物或靶寡核苷酸或其互补序列。“对向引物(Opposedprimers)”是指至少一个正(+)义引物和至少一个负(-)义引物，各个引物与靶多核苷酸的一条链或靶多核苷酸一条链的拷贝互补，从而当在扩增反应中一起使用时，它们参与扩增子的产生(例如，PCR中的引物对)。
在某些情况下扩增寡聚体或引物可以不仅仅作为扩增寡聚体和引物发挥作用，还作为包括但不限于：捕获寡聚体、阻断序列、用于切割、消化的位点的一部分、置换序列、识别位点的一部分等发挥作用。
除非另有相反说明，否则第一序列是第二序列的“互补序列”(或等同地，与第二序列“互补”)，其中第一序列具有足以在合理的结合条件下与第二序列退火的长度和含量，所述结合条件可以是但不必是本文所述的严格杂交条件，并且还包括(例如)在标准PCR和涉及引物或探针结合和延伸的其他技术中使用的退火条件。
“标签”是指除靶杂交序列之外的任何其他核酸序列，其可以包括在寡聚体中或添加到或插入到靶多核苷酸中。除了靶杂交序列之外，存在的任何任意序列均可以用作标签。在一些用途中，标签还可以指除附着到寡聚体或靶多核苷酸、或以其他方式包括在寡聚体或者靶多核苷酸中的核酸以外的部分。可以使用本领域已知的任何方法通过包括、添加、插入、悬垂等方式将标签引入到靶多核苷酸或其一个或以上片段中/引入至靶多核苷酸或其一个或以上片段，包括但不限于通过延伸或扩增、通过连接、通过转座化学方法引入，所述延伸或扩增利用含有一个或以上标签并且特异性、半特异性或非特异性与靶多核酸或其一个或以上片段杂交的寡聚体进行。标签包括但不限于衔接子(见下文)。标签的另外的实例是启动子、本文其他部分描述的混合核苷酸元件、用于样本制备和靶标捕获的元件以及包括夹的稳定序列。在上面的“样本制备”定义部分中给出了标签的其他另外示例，也在本文的其他部分进行了描述。
“衔接子”(adaptor、adapter)(这两个术语在本公开中可互换使用，并且定义是等同的)是一种使其加入的分子适应以提供一个或以上附加功能的序列。例如，衔接子为另一分子(例如扩增寡聚体、测序引物或捕获寡聚体)提供结合位点。结合位点可以是通用结合位点(例如，对于多个捕获寡聚体，均具有相同的结合位点特异性，例如，相同序列，多重形式，或对于通用引物)。结合位点的其他实例是置换序列寡聚体、探针或核酸修饰酶(例如RNA聚合酶、引发酶、连接酶、RNAse(如RNAse H)或限制酶)的结合位点，或用于附接至包括用于克隆扩增的固相(包括通过固相引物或捕获寡聚体)的结合位点，或在下游应用(例如富集、文库制备、克隆扩增或测序)中有用的其他一个或以上功能元件。因此，样本条形码或索引序列、关键序列或校准序列、分子条形码(包括唯一分子标识符)、下游克隆的位点和靶分子环化的位点是可以包括在衔接子中的元件的其他实例。
“文库制备”在最普遍的意义上是指将用于进一步下游处理和/或分析的一组靶多核苷酸准备完毕的过程。簇生成(包括通过克隆扩增)是下游处理步骤的一个实例。测序是下游分析的一个实例。文库制备方法通常包括将衔接子序列或其他标签序列添加到文库中的一些或全部分子的一个或以上步骤。然而，情况并非总是如此，因为一些公开的实施方案不需要将衔接子添加到文库分子中。这方面的实例包括直接杂交测序方法的一些模式，其在本公开的其他部分进行了描述。文库制备通常还包括一个或以上扩增步骤，例如，富集靶多核苷酸的一个或以上区域，向文库分子添加标签(包括衔接子)，并增加含有标签(包括衔接子)的靶区域和/或分子的拷贝数量。可以在没有扩增的情况下添加衔接子和标签，例如通过连接。文库制备步骤可以与样本制备步骤重叠(例如，可以在样本制备过程中添加标签(包括衔接子)和/或可以从靶向的区域制备第一个延伸产物(参见本文“样本制备”部分))，也可以与拷贝控制相关联/重叠(参见本文包括下文所述的其他部分)。
“拷贝控制”是指以预定方式控制作为给定过程输出的分子拷贝数的组合物和方法。例如，在某些工作流程中，需要捕获(或扩增和捕获)或以其他方式分离不超过预定量(例如，下游应用的最大期望值，如测序文库制备；在某些情况下可以称为“有限捕获”，其仍落入拷贝控制的总体定义)的靶多核苷酸(例如，可以是天然DNA或RNA或扩增子)。类似地，在某些工作流程中，期望捕获(或扩增和捕获)或以其他方式分离预定特定量(例如，特定数量的分子或分子拷贝)的靶多核苷酸(其例如可以是天然DNA或RNA、扩增子或测序文库)以用于下游应用(例如，克隆扩增，包括在二代测序工作流程中)。此外，在某些工作流程中，希望将附加序列引入到靶多核苷酸(标签)中，例如将衔接子引入到测序文库中。这也可以在拷贝控制组合物和方法中实现。本公开提供了可用于分离靶多核苷酸和/或附接标签(如衔接子)的寡聚体、组合物和套件。分离包括以有限的量分离(限量捕获)和以特定的量分离(拷贝控制)。
“克隆”或“单克隆”是指(至少一种)祖细胞分子、核酸、多核苷酸、基因、遗传物质、细胞等的相同单位或拷贝的种群。在本公开中，它最常指由相同核酸/多核苷酸模板的一个或以上拷贝制成的相同拷贝的种群。在本公开中，有时它可以指种群中相同分子的集合，例如，这些分子聚集在一起(见下文)。在最优选的实施方案中，单克隆性为约100％(即，所有或几乎所有拷贝均相同)。在其他优选的实施方案中，单克隆性为约90％或更高、约80％或更高、或70％或更高。在一些实施方案中，单克隆性在约50％和70％之间。所谓“多克隆”是指不完全相同的单位或拷贝的种群，这些单位或拷贝来源于至少2个不同的祖细胞分子等。所谓克隆扩增是指通常单个祖核酸分子(尽管在一些情况下它可以是2个或以上相同的祖细胞分子)的核酸扩增，以产生相同的拷贝集。所谓“簇”是指与固体载体结合的一组分子，例如核酸分子。所谓“簇生成”是指产生簇的过程。簇生成过程的实例包括基于扩增的(例如克隆扩增)，以及基于非扩增的，如靶分子与固定在已知特定区域(例如点)中的固体载体上的寡核苷酸的杂交。簇可以是单克隆的(通常是本公开中的优选配置)或多克隆的。
“接头”是将寡聚体的一部分连接到另一部分的序列或非序列元件或它们的组合。在一些实施方案中，序列接头包括不与组合或组合物中的靶多核苷酸和/或其他寡聚体杂交的序列。在一些实施方案中，非序列接头包括烷基、烯基、酰氨基或聚乙二醇基团[(-CH2CH2O-)n]。
“稳定序列”为夹、混合核苷酸区域或功能为增加双链区的稳定性和/或控制杂交叠合(例如，当位于倾向于滑动的序列附近时，例如含有重复核苷酸的序列，例如poly-dA或poly-dT序列)的其他序列。“对准序列”为控制杂交叠合的稳定序列。除了本文别处所述的夹和混合核苷酸区域之外，稳定序列包括富含GC的序列和含有增强亲和性的经修饰的序列。
“内部延伸阻断序列”是位于核酸序列内或与核酸结合的元件，其阻止互补链沿着核酸延伸。实例包括非核苷酸接头、或一个或以上脱碱基位点、非天然核苷酸或经化学修饰的天然核苷酸、以及下文论述的可逆延伸阻断序列。
“可逆延伸阻断序列”是内部延伸阻断序列，其阻断功能可以逆转，即允许互补链延伸。示例性的可逆延伸阻断序列为具有互补核苷酸的非天然核苷酸，所述互补核苷酸适合于聚合酶并且相对于天然核苷酸表现出特异性(即，聚合酶不会跨过可逆延伸阻断序列而添加天然碱基)。提供互补核苷酸会逆转阻断功能。非天然碱基对的实例为Iso-dC或Iso-dG；黄嘌呤或5-(2,4-二氨基嘧啶)；2-氨基-6-(N,N-二甲基氨基)嘌呤或吡啶-2-酮；4-甲基苯并咪唑或2,4二氟甲苯；7-氮杂吲哚或异喹诺酮；dMMO2或d5SICS；或dF或dQ，其中这些非天然碱基对的任一成员都可以作为可逆延伸阻断子。可逆延伸阻断序列的其他实例为经化学修饰的核苷酸，其中修饰为通过可逆连接键进行附接，并且连接键可以通过提供以下任意一者或以上而逆转：化学品、酶、温度变化、试剂组成变化等；可逆的核酸结构特征；或与捕获寡聚体可逆结合的分子，任选地，其中所述可逆结合的分子为蛋白质、酶、脂质、碳水化合物或化学部分。
所谓“杂交(hybridization或hybridize)”是指两条完全或部分互补的核酸链在特定的杂交试验条件下以平行或反平行的方向聚集在一起，以形成具有双链区的稳定结构的能力。“杂交”与“退火(annealing或anneal)”同义。这种双链结构(有时称为杂合体)的两个组分链通过氢键结合在一起。尽管这些氢键最通常在单个核酸链上的含有碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶(A和T或U)或胞嘧啶和鸟嘌呤(C和G)的核苷酸之间形成，但碱基配对也可在不是这些“规范”对的成员的碱基之间形成。非规范碱基配对是本领域公知的(例如参见R.L.P.Adams等人，The Biochemistry of the Nucleic Acids(第11版，1992))。此外，还可以通过Hoosteen碱基配对将第三链与B型DNA双链体杂交来形成三链区。
如本文所使用的，术语“特异性杂交”是指在给定杂交条件下，探针、引物或其他寡聚体(例如捕获寡聚体)基本上仅与包含一个或以上靶序列的样本中的其一个或以上靶序列可检测地杂交(即，与非靶序列几乎不发生杂交或没有可检测的杂交)。值得注意的是，寡聚体可以被配置为与一组靶标(例如，来自特定分类群组(例如，种、属或更高级)的生物体的序列)中的任一个靶标进行特异性杂交。在一些实施方案中，探针、引物或其他寡聚体(例如捕获寡聚体)可与其靶核酸杂交以形成稳定的寡聚体:靶标杂合体，但不形成足够数量的稳定的寡聚体:非靶标杂合体，以用于扩增或捕获，这视情况而定。与靶核酸特异性杂交的扩增寡聚体和捕获寡聚体可用于扩增和捕获靶核酸，但不可用于扩增和捕获非靶核酸，尤其是种系密切相关的生物体的非靶核酸。因此，寡聚体与靶核酸杂交的程度远大于寡聚体与非靶核酸杂交的程度，以使本领域普通技术人员能够准确地捕获、扩增和/或检测来源于特定靶标(例如，特定病原体)的核酸的存在(或不存在)。通常，降低寡核苷酸序列和其靶序列之间的互补性程度将降低寡核苷酸与其靶区域的杂交程度或速率。然而，包含一个或以上非互补核苷或核碱基可促进寡核苷酸对于非靶核酸序列的区分能力。
所谓“严格杂交条件”或“严格条件”是指这样的条件：(1)允许寡聚体优先与靶核酸杂交而不是与不同的核酸(例如，在同一性上，具有与靶核酸低至1个核苷酸差异的核酸)杂交或(2)仅允许具有较高亲和性的靶杂交序列的寡聚体(相对于具有较低亲和性的靶杂交序列的寡聚体)与靶标杂交，例如，其中较高亲和性的靶杂交序列比较低亲和性的靶杂交序列更长和/或较高亲和性的靶杂交序列包含增强亲和性的修饰而较低亲和性的靶杂交序列不包含该增强亲和性的修饰。虽然严格杂交条件的定义没有变化，但可用于严格杂交的实际反应环境可根据以下因素而变化，这些因素包括GC含量和寡聚体长度、寡聚体序列与测试样本中可能存在的靶核酸和非靶核酸序列之间的相似程度。杂交条件包括温度以及杂交试剂或溶液的组成。当单价阳离子浓度在约0.4M至1M的范围内、二价阳离子浓度在约0至10mM的范围内并且pH在约5至9的范围内时，使用本公开的寡聚体的示例性严格杂交条件对应于约40℃至75℃的温度，例如40℃至50℃、50℃至60℃或60℃至75℃。杂交条件的其他细节将在实施例部分中阐述。本领域普通技术人员可以容易地确定其他可接受的严格杂交条件。
“标记”或“可检测标记”是指直接或间接与被检测或产生可检测信号的寡聚体连接的部分或化合物。可以使用任何可检测的部分，例如放射性核素、诸如生物素或亲和素之类的配体、酶、酶底物、反应性基团、诸如染料之类的发色团或赋予可检测的颜色的颗粒(例如胶乳或金属珠粒)、发光化合物(例如生物发光、发磷光或化学发光化合物)和荧光化合物(即，荧光团)。荧光团的实施方案包括吸收(例如，峰值吸收波长为)约495nm至690nm范围内的光并且发射(例如，峰值发射波长为)约520nm至710nm范围内的光的那些荧光团，其包括被称为FAMTM、TETTM、HEX、CAL FLUORTM(橙色或红色)、CY和QUASARTM化合物的荧光团。荧光团可以与猝灭剂分子组合使用，当与荧光团紧密接近时，猝灭剂分子吸收光以减弱背景荧光。这样的猝灭剂是本领域熟知的，并且包括(例如)BLACK HOLE QUENCHAERTM(或BHQTM)、Blackberry (或)、或TAMRATM化合物。
“不可延伸的”寡聚体或包括“在其3'端的阻断部分”的寡聚体包括足够接近其3'末端(也称为3'端)以阻止延伸的阻断部分。出于本公开的目的，足够接近3'末端以阻断延伸的任何阻断部分被认为“位于”3'末端，即使其不与3'羟基或氧结合或代替3'羟基或氧存在。在一些实施方案中，靠近3'端的阻断部分在3'端的五个残基内，并且足够大以限制聚合酶与寡聚体的结合，并且其他实施方案包括共价连接至3'端的阻断部分。许多不同的化学基团可用于阻断3'端，例如烷基、非核苷酸接头、烷烃-二醇双脱氧核苷酸残基(例如3'-己二醇残基)和虫草素。阻断部分的其他实例包括3'-脱氧核苷酸(例如，2',3'-双脱氧核苷酸)；3'-磷酸化核苷酸；荧光团、猝灭剂或干扰延伸的其他标记物；反向核苷酸(例如，通过3'-至-3'磷酸二酯与前一核苷酸连接，任选地具有暴露的5'-OH或磷酸酯)；或与寡核苷酸连接从而阻止初期核酸链通过聚合酶进一步延伸的蛋白质或肽。本公开的不可延伸的寡核苷酸可以是至少10个碱基的长度，并且可以是多至15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个或更多个核苷酸的长度。包括可检测标记物的不可延伸的寡核苷酸可以用作探针。
“结合配偶体”为可用于形成非共价结合的一对部分中的成员。结合配偶体的示例性组为生物素和生物素结合剂。结合配偶体的其他实例包括但不限于地高辛配基/抗地高辛配基，并且更普遍地为抗体及其靶标。
“生物素结合剂”为能够特异性结合生物素的试剂(例如多肽)。链霉亲和素、亲和素和中性亲和素代表了生物素结合剂的实例。抗生物素抗体也被认为是生物素结合剂。
术语“抗体”囊括了任何包括具有互补性决定区和框架区(例如VH和VL结构域)的功能性抗原结合区的多肽，包括但不限于scFv、Fab和全长抗体(例如IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体)。
术语“唯一分子标识符(UMI)”、“唯一标识符(UID)”、“分子条形码”、“随机寡核苷酸”、“随机分子标签”、“随机条形码”、“引物ID”、“分子标记”、“单分子条形码”和“单分子标识符(SMI)”可互换使用，以指代多核苷酸序列，其序列可以是随机的、非随机、部分简并或简并的。UMI可用于在PCR或测序方法之前对DNA分子进行条形码编码，从而可以识别单个DNA链。假设含有相同UMI的扩增子来源于相同的DNA分子。UMI可以识别真实错误和由PCR或测序方法引起的错误。UMI的长度可以在约5至100个核苷酸之间，或者根据需要更长，以便于在更大量的DNA链之间进行区分，并且可以具有可变或均一的长度。在一些实施方案中，可以在前两个PCR循环中引入UMI，或者使用诸如连接、通过聚合酶的转座作用、核酸内切酶、转座酶或本领域已知的任何其他方法的方法引入UMI。
术语“三角测量”是指将独立分析的两个或以上结果或数据相结合，从而以提高的可信度来确定答案。
如本文所使用的，寡聚体的“组合”是指彼此接近的任何多种寡聚体，例如在套件中的不同容器或相同容器中、或在彼此并置的组合物或组合物集合中，例如在板、架或其他容器中。
除非另有定义，否则本文所使用的所有科学和技术术语的含义与相关领域技术人员通常理解的含义相同。一般定义可以在与分子生物学领域相关的技术书籍中找到，例如，第2版微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and MolecularBiology,2nd ed.(Singleton等人,1994,John Wiley&Sons,New York,NY))或哈珀柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology，(Hale&Marham,1991,HarperPerennial,New York,NY))。
实施例
提供以下实施例以说明某些公开的实施方案，但不应解释为以任何方式限制本公开的范围。
A.使用特异性靶捕获(STC)寡聚体直接从血液(DfB)中提取加标(Spiked)的抗微生物药物耐药性(AMR)靶标
寡聚体(均由IDT提供；3'invdT和3'invdC是3'末端上的反向核苷酸)
细菌靶生物体-肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，ATCC菌株BAA-1898；含有AMR碳青霉烯酶基因(KPC)；金黄色葡萄球菌，ATCC菌株BAA-2094；含有AMR-mecA基因(mecA)。
特异性靶捕获(STC)寡聚体-KCC STC寡聚体被设计为以以下序列与AMR-KPC基因结合：
KPC_STC_F(SEQ ID No.6):5’-生物素/AAAAACACCGCGCTGACCAACCTC/3’invdT
KPC_STC_R(SEQ ID No.7):5’-生物素/AAAAACACAGCGGCAGCAAGAAAGC/3’invdT
mecA STC寡聚体被设计为以以下序列与mecA结合：
mecA_STC_F-INT(SEQ ID No.8):
5’-生物素/AAAAAAGGTACTGCTATCCACCCTCAAACAGGT/3’invdT
mecA_STC_R2(SEQ ID No.9):
5’-生物素/AAAAATTGAGTTGAACCTGGTGAAGTTGTAATCTGG/3’invdT
STC寡聚体被设计为捕获具有以下序列的靶标：
mecA:5'-生物素/序列/3'invdC
使用具有以下序列的引物进行定量PCR(qPCR)：
PCR1
KPC_P28_PCR1_F(SEQ ID No.10)：5’-AACCATTCGCTAAACTCGAACAGG-3’
KPC_P28_PCR1_R(SEQ ID No.11)：5’-CCTTGAATGAGCTGCACAGTGG-3’
mecA_P40_PCR1_F(SEQ ID No.12)：5’-CATGAAAAATGATTATGGCTCAGGTAC-3’
mecA_P40_PCR1_R(SEQ ID No.13)：5’-TGGAACTTGTTGAGCAGAGGTTC-3’
PCR 2
KPC_P28_PCR2_F(SEQ ID No.14)：5’-CTTTGGCGGCTCCATCGG-3’
KPC_P28_PCR2_R(SEQ ID No.15)：5’-CTCCTCAGCGCGGTAACTTAC-3’
mecA_P40_PCR2_F(SEQ ID No.16)：5’-GCTATCCACCCTCAAACAGGTGAAT-3’
mecA_P40_PCR2_R(SEQ ID No.17)：5’-ATTCTTCGTTACTCATGCCATACATA-3’
方案/反应条件
向5mL全血中添加50μL、25μL或15μL病原体加标物(分别为10、5或3CFU/mL)、1mg蛋白酶K(20mg/mL，Promega MC5008)、30μL STC寡聚体池(20pmol/5μL)、100μL消泡剂Y-30乳液(Sigma Aldrich A6457-100ML)和1.667mL裂解NS4X缓冲制剂E(100mM Tris pH 8.0、16.675％SDS)，在15mL Falcon锥形聚丙烯管(Corning 352097)中进行反应。
通过每个样本涡旋和反转约15秒来混合反应混合物，并使用摆斗离心机(离心机5810，Eppendorf)脉冲旋转至700相对离心力(RCF)，总持续时间为10秒。
消化蛋白质，然后进行细胞裂解-将反应混合物在预先加热至75℃的定制的实验室加热块(定制，DNAe)中孵育15分钟，其中样本在孵育15分钟后内部温度达到约60℃。
然后将混合物转移到8mL聚丙烯螺旋盖管(Fischer Scientific，NC9691446)中，该管含有预先测量的4gr 0.1mm VHD ZrO机械裂解(ML)珠(GlenMills Grinding Media)，并使用OMNI Bead Ruptor Elite(OMNI International)使用“血液”程序(以6.6m/s的速度进行3次循环，启动(混合)90秒，停止(静止)20秒)进行机械裂解(ML)。
将机械裂解的样本在室温(约20-26℃)下冷却5分钟。然后将ML管在700RCF下离心1分钟，并将液体转移回原来的15mL管中，留下ML珠。样本管在离心机中脉冲旋转至700RCF，总时间为10秒。
蛋白酶K的失活和DNA变性-将管放置在预热至100℃的加热块上并孵育30分钟。
使用生物素标记STC寡聚体捕获靶DNA-然后将管转移到预热至60℃的加热块中并孵育40分钟。
用链霉亲和素珠捕获靶DNA-STC寡聚体-将管从60℃的加热块中取出，使内容物稍微冷却至环境温度(约20-26℃)，并加入1.2mg链霉亲和素珠(定制链霉亲和素球，DNAe)。然后将管在加热/冷却振荡培养箱(Benchmark Scientific，型号HC5000-HC)中在45℃孵育10分钟，并持续混合(1500RPM)。
珠分离-将样本在离心机中脉冲旋转至700RCF达10秒，将样本管置于磁力架(Invitrogen，DynaMag-15)中5分钟，吸出上清液并丢弃。
用Wash-S缓冲液洗涤珠–通过加入1mLWash-S缓冲液(50mM Tris pH 8.0，0.1％SDS，150mM NaCl)洗涤珠，并使用磁铁搅拌。然后将洗涤过的珠和缓冲液从15mL管转移到新的1.5mL管中，然后磁化2分钟，去除并丢弃Wash-S缓冲液。然后通过加入1mL Wash-S缓冲液再次洗涤珠，磁化2分钟，然后去除并丢弃Wash-S缓冲液。
用Wash-T缓冲液(10mM Tris pH 8.0，0.01％吐温20)洗涤珠-接下来用1mL Wash-T缓冲液洗涤样本，磁化2分钟，然后去除缓冲液并丢弃。然后再次重复用Wash-T缓冲液洗涤珠。
从珠洗脱靶标-从1.5mL管中取出磁铁，并加入50μL IDTE洗脱缓冲液(10mM TrispH 7.5，0.1mM EDTA；Integrated DNA Technologies)。然后将样本混合、脉冲旋转并在75℃孵育3分钟，以从链霉亲和素珠中洗脱靶DNA。然后将管磁化2分钟，然后将含有靶DNA的洗脱液转移到新的1.5mL管(DNA LoBind tube，022431021，Eppendorf)中。
定量-使用上述引物，使用两个qPCR反应确认从全血中捕获mecA和KPC靶标。
结果和结论
将两种含有AMR靶标的生物体(含有KPC的肺炎克雷伯菌和含有mecA的金黄色葡萄球菌)各自以10、5或3CFU/mL的浓度加标(spiked)至5mL全血中，并进行上述方案(上述步骤6-19)。图50中的qPCR数据显示从全血中捕获了期望的靶标。
B.多重全捕获方案
寡聚体
使用以下嵌套PCR2引物(均由IDT提供；“52 Bio”表示寡聚体5′端上的两个生物素基团)扩增各个指定的靶标：
16s rRNA靶标
P3F(SEQ ID No.18)：
5’-AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGCTTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA-3’
P3R(SEQ ID No.19)：
/52-Bio/ACCGTGCTGCCTTGGCTTCATTGTGGTCTTGACGTCATCCCCACCTTCCTC-3’
23s rRNA靶标
P31F1(SEQ ID No.20)：
5’-AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGCCGCATGTGTAGGATAGGTGGGAG-3’
P31F2(SEQ ID No.21)：
5’-AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGCCGCATGTACAGGATAGGTAGGAG-3’
P31R(SEQ ID No.22)：/52-Bio/GAGACCGCCCCAGTCAAACT-3’
CTX-M第1组靶标
P48F(SEQ ID No.23)：
/52-Bio/AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGCTGTTAGGAAGTGTGCCGCTG-3’
P48R(SEQ ID No.24)：
5’-ACCGTGCTGCCTTGGCTTCATTGTGGTCTCCCGACTGCYGCTCTAAT-3’
(“Y”是C和T的混合物)
方案/反应条件
将1000个基因组拷贝的大肠杆菌(E.Coli)基因组DNA(gDNA)加标至P3F和P3R、P31F1、P31F2和P31R以及P48F和P48R的PCR2单重反应中。根据表1中所示的配方，在0.2mL管中制备反应物。
表1
1在0.75μM的预混合物中分别使用P31F1和P31F2；2dATP、dCTP、dGTP和dTTP的等摩尔混合物；3混合物中各核苷酸的浓度
使用以下热程序进行PCR2扩增，步骤b、c和d按顺序重复进行40个循环：
a.98℃持续30秒，b.98℃持续5秒，c.58℃持续10秒，d.72℃持续30秒，e.保持在4℃。
反应汇集-汇集40μL的各单重PCR2反应物。
PCR产物的全捕获-将链霉亲和素珠(MyOne C1，ThermoFisher Scientific)以8.33mg/mL重悬于珠重悬缓冲液[1.50M NaCl(Invitrogen)、10mM Tris-HCl(pH 7.5)(Invitroen)、0.10％吐温20(ThermoFisher Scientific)]中。
将生物素标记的靶DNA与链霉亲和素珠结合-在0.2mL管中通过移液器混合而合并等体积(120μL)的重悬珠和PCR2产物。将管在室温(约20-26℃)下孵育5分钟，通过涡旋进行温和混合，然后使用磁力架收集珠。
用结合模板洗涤链霉亲和素珠-然后通过移液器混合200μL洗涤缓冲液(1M NaCl、5mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.05％吐温20、0.5mg/mL BSA)，将珠洗涤两次，在每次洗涤之间丢弃上清液。
用NaOH洗脱-将50μL的40mM NaOH加入0.2mL管中，涡旋10秒，并静置30秒。使用磁力架收集珠两分钟，然后将洗出液转移到0.2mL管中。
结果和结论
使用PCR反应富集靶DNA，并将所得生物素标记的PCR2产物汇集并使用链霉亲和素珠捕获，然后用NaOH洗脱ssDNA。在TBE(Tris-Borate-EDTA)凝胶上、在200V下确认从三种NaOH洗出液中洗脱所需的ssDNA，直到参比染料到达凝胶底部。然后将凝胶在1x SYBR Gold中染色至少20分钟，并在UV工作站上观察，如图51所示。
C.使用多重聚合酶链反应(PCR)的靶多核苷酸富集
寡聚体(均由IDT提供；“Y”是C和T的混合物，“W”是A和T的混合物，“S”是C和G的混合物，“R”是A和G的混合物)
使用以下聚合酶链式反应(PCR)1引物扩增各指定的靶标：
16s rRNA靶标
P1(SEQ ID No.25)：5’-TGTAGCGGTGAAATGCGYAGA-3’
P1(SEQ ID No.26)：5’-CGGTCGACTTAACGCGTTAGCT-3’
P1(SEQ ID No.27)：5’-CGGAGTGCTTAATGCGTTWGCT-3’
P2(SEQ ID No.28)：5’-CGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTG-3’
P2(SEQ ID No.29)：5’-CCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTG-3’
P2(SEQ ID No.30)：5’-GGGACTTAACCCAACATYTCAC-3’
P29(SEQ ID No.31)：5’-CCTGGCTCAGAATGAACGCT-3’
P29(SEQ ID No.32)：5’-CCTGGCTCAGGACGAACGCT-3’
P29(SEQ ID No.33)：5’-GAGTCTGGACCGTGTCTCAGT-3’
P29(SEQ ID No.34)：5’-GAGTCTGGGCCGTGTCTCAGT-3’
P3(SEQ ID No.35)：5’-CGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGG-3’
P3(SEQ ID No.36)：5’-CACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGG-3’
P3(SEQ ID No.37)：5’-TGTGTAGCCCTGGTCGTAAGG-3’
P3(SEQ ID No.38)：5’-TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT-3’
P3(SEQ ID No.39)：5’-CGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT-3’
P30(SEQ ID No.40)：5’-CTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’
P30(SEQ ID No.41)：5’-CCTCCGTATTACCGCGGCTG-3’
23S rRNA靶标
P31(SEQ ID No.42)：5’-GAAAGACCCCGTGAACCTTTACT-3’
P31(SEQ ID No.43)：5’-GAAAGACCCCGTGGAGCTTTACT-3’
P31(SEQ ID No.44)：5’-CCTTCGTGCTCCTCCGTTAC-3’
P31(SEQ ID No.45)：5’-CCTTTGAGCGCCTCCGTTAC-3’
P4(SEQ ID No.46)：5’-ACACAGGTCTCTGCTAAACCGTAAG-3’
P4(SEQ ID No.47)：5’-ACACAGGTCTCTGCAAAATCGTAAG-3’
P4(SEQ ID No.48)：5’-ACACAGCACTGTGCAAACACGAAAG-3’
P4(SEQ ID No.49)：5’-TACCCGACAAGGAATTTCGCTACC-3’
内部对照靶标
P25(SEQ ID No.50)：5’-TGGCAGCTTCACTTTCTCTTGC-3’
P25(SEQ ID No.51)：5’-CCAGCTCCAATCACACCAACA-3’
SHV靶标
P26(SEQ ID No.52)：5’-CAGCTGCTGCAGTGGATGGT-3’
P26(SEQ ID No.53)：5’-CCGGSGTATCCCGCAGATA-3’
KPC靶标
P28(SEQ ID No.54)：5’-AACCATTCGCTAAACTCGAACAGG-3’P28(SEQ ID No.55)：5’-CCTTGAATGAGCTGCACAGTGG-3’
mecC靶标
P32(SEQ ID No.56)：5’-GCCGTAATAGTACCTGGTTTGAA-3’
P32(SEQ ID No.57)：5’-GCCYTTYGGGTGTTTTGTTAGG-3’
MCR-1靶标
P33(SEQ ID No.58)：5’-TCTGCAACACCAATCCTTATAACG-3’
P33(SEQ ID No.59)：5’-CATCATATCGCTTAAAATACGCAGGC-3’
NDM靶标
P34(SEQ ID No.60)：5’-AGATTGCCGAGCGACTTGGC-3’
P34(SEQ ID No.61)：5’-CAACTTTGGCCCGCTCAAGG-3’
OXA-23-样靶标
P35(SEQ ID No.62)：5’-ACAGAATATGTGCCAGCCTCTACA-3’
P35(SEQ ID No.63)：5’-CATGGCTTCTCCTAGTGTCATGTCT-3’
OXA-48-样靶标
P36(SEQ ID No.64)：5’-GCGGTAGCAAAGGAATGGCA-3’
P36(SEQ ID No.65)：5’-TGCTTGGTTCGCCCGTTTA-3’
OXA-51-样
P37(SEQ ID No.66)：5’-AACGAAGCACACACTACGGGTGT-3’
P37(SEQ ID No.67)：5’-TGCTCAAGGCCGATCAAAGCATT-3’
gyrA靶标
P39(SEQ ID No.68)：5’-GCAATGACTGGAACAAAGCCTA-3’
P39(SEQ ID No.69)：5’-ACCAGCATGTAACGCAGCGA-3’
mecA靶标
P40(SEQ ID No.70)：5’-CATGAAAAATGATTATGGCTCAGGTAC-3’
P40(SEQ ID No.71)：5’-TGGAACTTGTTGAGCAGAGGTTC-3’
vanA靶标
P41(SEQ ID No.72)：5’-GGCTGCGATATTCAAAGCTCAG-3’
P41(SEQ ID No.73)：5’-CTGAACGCGCCGGCTTAAC-3’
vanB靶标
P42(SEQ ID No.74)：5’-GTATGGAAGCTATGCAAGAAGCC-3’
P42(SEQ ID No.75)：5’-CATGCAAAACCGGGAAAGCCA-3’
TEM_E1 04K靶标
P45(SEQ ID No.76)：5’-GCGGTATTATCCCGTGTTGACG-3’
P45(SEQ ID No.77)：5’-TCACTCATGGTTATGGCAGCA-3’
TEM_G238S靶标
P46(SEQ ID No.78)：5’-GATAAAGTTGCAGGACCACTTCTG-3’
P46(SEQ ID No.79)：5’-CCCCGTCRTGTAGATAACTACGA-3’
CTX-M第1组靶标
P48(SEQ ID No.80)：5’-CGGCARCCGTCACGCTGT-3’
P48(SEQ ID No.81)：5’-CATCAGCACGATAAAGTATTTGCGA-3’
CTX-M第2组靶标
P49(SEQ ID No.82)：5’-TGCATGCGCAGRCGAACA-3’
P49(SEQ ID No.83)：5’-CCTTACTGGTACTGCACATCGC-3’
P49(SEQ ID No.84)：5’-TTGCTGGTGCTGCACATCGC-3’
CTX-M第8-25组靶标
P50(SEQ ID No.85)：5’-TACCACCACGCCRTTAGCGA-3’
P50(SEQ ID No.86)：5’-ACAACCCACGATGTGGGTAG-3’
CTX-M第9组靶标
P51(SEQ ID No.87)：5’-GTGCTTTATCGCGGTGATGAAC-3’
P51(SEQ ID No.88)：5’-GTTAACCAGATCGGCAGGCT-3’
28S rRNA H13-20靶标
P52/53(SEQ ID No.89)：5’-ACTGTACTTGTGCGCTATCGGT-3’
P52/53(SEQ ID No.90)：5’-TCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGC-3’
28S rRNA H26-31
P54(SEQ ID No.91)：5’-CCGTCTTGAAACACGGACCA-3’
P54(SEQ ID No.92)：5’-GTTTCCTCTGGCTTCACCCTATTC-3’
28S rRNA H45-46靶标
P56(SEQ ID No.93)：5’-AACAACTCACCGGCCGAATG-3’
P56(SEQ ID No.94)：5’-ATGGAACCTTTCCCCACTTCAGT-3’
28S rRNA H78-79靶标
P57(SEQ ID No.95)：5’-CCCTGTTGAGCTTGACTCTAGTTTGA-3’
P57(SEQ ID No.96)：5’-CTGCGTTATGGTTTAACAGATGTGC-3’
IMP组区别Reg 1靶标
P59(SEQ ID No.97)：5’-GACGCCTATCTGATTGAYACTCCA-3’
P59(SEQ ID No.98)：5’-CATTTGTTAATTCAGATGCATAYGTGG-3’
P59(SEQ ID No.99)：5’-GAGGCTTACCTAATTGACACTCCA-3’
P59(SEQ ID No.100)：5’-CTGAAGCTTATCTAATTGACACTCCA-3’
P59(SEQ ID No.101)：5’-CTGATGCCTATATAATTGACACTCCA-3’
P59(SEQ ID No.102)：5’-CATTAGTTAATTCAGACGCATACGTGG-3’
IMP组区别Reg 2靶标
P60(SEQ ID No.103)：5’-GCAAATTTAGAAGCTTGGCCAAAGTCY-3’
P60(SEQ ID No.104)：5’-GCCTTTACTTTCATTTAGCCCTTTAA-3’
P60(SEQ ID No.105)：5’-AAATGTTGAAGCATGGCCACATTCG-3’
P60(SEQ ID No.106)：5’-GCCTTTTGCTTTCATTAAGCCCTTTTA-3’
VIM-组靶标
P61(SEQ ID No.107)：5’-GGTGTTTGGTCGCATATCGCAAC-3’
P61(SEQ ID No.108)：5’-GCGATCGTCATGAAAGTGCGT-3’
gyrB靶标
P62(SEQ ID No.109)：5’-TCCTATAAAGTGTCCGGCGGTC-3’
P62(SEQ ID No.110)：5’-TCTCGCCGGTAACCGCCA-3’
P63(SEQ ID No.111)：5’-AACCAGGCGATTCTGCCG-3’
P63(SEQ ID No.112)：5’-GCAGCTTGTCCGGGTTGTA-3’
P64(SEQ ID No.113)：5’-GCACCATTTAGTGTGGGAAATTGTCG-3’
P64(SEQ ID No.114)：5’-TAACTTCGACAGCTGGACGT-3’
P65(SEQ ID No.115)：5’-GGCGGTGGCGGATACAAAGTAT-3’
P65(SEQ ID No.116)：5’-ACCTGTCTTATCAGTTGTGCCAAC-3’
使用以下嵌套PCR2引物扩增各指定的靶标：
16S rRNA靶标
P1(SEQ ID No.117)：5’-TAGAACACCGATGGCGAAGGC-3’
P1(SEQ ID No.118)：5’-TCGTGGACTACCAGGGTATCTA-3’
P2(SEQ ID No.119)：5’-TTTCGATGCAACGCGAAGAACCT-3’
P2(SEQ ID No.120)：5’-TACGAGCTGACGACAGCCATG-3’
KPC靶标
P28(SEQ ID No.121)：5’-CTTTGGCGGCTCCATCGG-3’
P28(SEQ ID No.122)：5’-CTCCTCAGCGCGGTAACTTAC-3’
MCR-1靶标
P33(SEQ ID No.123)：5’-CGGTATGCTCGTTGGCTTAGATG-3’
P33(SEQ ID No.124)：5’-GTGATTGCCCATTTGGTGCAG-3’
vanA靶标
P41(SEQ ID No.125)：5’-TTGTATGGACAAATCGTTGACATACA-3’
P41(SEQ ID No.126)：5’-GTAGCTGCCACCGGCCTAT-3’
28S rRNA H45-46靶标
P56(SEQ ID No.127)：5’-AATGGATGGCGCTCAAGCGT-3’
P56(SEQ ID No.128)：5’-ACTGCCACCAAGATCTGCACTAG-3’
方案/反应条件
将各生物体的100个基因组拷贝加标至“PCR1预混合物”中(配方参见表2)。
表2
使用以下三步热法进行PCR1-PCR扩增，步骤b和c按顺序重复进行25个循环：
a.98℃持续30秒(初始变性步骤)，b.98℃持续5秒(变性步骤)，c.65℃持续25秒(退火/延伸步骤)。
样本稀释-然后使用分子级水(ThermoFisher Scientific)将样本稀释40倍，以降低脱靶的PCR扩增子水平。
添加PCR2试剂-将10μL稀释的PCR1材料添加到40μL的“PCR2预混合物”中，以产生1∶200的最终稀释度(PCR2预混合物配方参见表3)。在本实施例中，PCR2预混合物包括1.50μM的各引物对(P1、P28、P33和P56)。
表3
PCR2-使用以下三步热程序进行PCR2扩增，步骤b和c按顺序重复进行40个循环：
a.98℃持续30秒(初始变性步骤)，b.98℃持续5秒(变性步骤)，c.65℃持续25秒(退火/延伸步骤)。
使用Bioanalyzer测定和定量来确认PCR2产物。
结果和结论
使用两个多重PCR反应富集靶DNA。使用Bioanalyzer定量对得到的PCR2产物进行解析和定量。表4示出了成功的PCR扩增后来自PCR 2靶标的所得浓度。
表4
生物体加标 靶标 μM
肺炎克雷伯菌(K.Pneumoniae) P1 1.00
肺炎克雷伯菌(K.Pneumoniae) P28 1.26
白色念珠菌(C.Albicans) P56 1.23
大肠杆菌(E.Coli) P33 1.20
大肠杆菌(E.Coli) P1 1.15
总之，使用多重PCR富集各个生物体的100个基因组拷贝，得到了所需的dsDNA。
D.使用多重聚合酶链式反应(PCR)和全捕获的靶核酸富集
寡聚体(均由IDT提供；“52 Bio”表示寡聚体5′端的两个生物素基团；“Y”是C和T的混合物；“W”是A和T的混合物)
使用以下PCR1引物扩增指定的靶标：
16s rRNA靶标
P1(SEQ ID No.25)：5’-TGTAGCGGTGAAATGCGYAGA-3’
P1(SEQ ID No.26)：5’-CGGTCGACTTAACGCGTTAGCT-3’
P1(SEQ ID No.27)：5’-CGGAGTGCTTAATGCGTTWGCT-3’
P2(SEQ ID No.28)：5’-CGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTG-3’
P2(SEQ ID No.29)：5’-CCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTG-3’
P2(SEQ ID No.30)：5’-GGGACTTAACCCAACATYTCAC-3’
vanA靶标
P41(SEQ ID No.72)：5’-GGCTGCGATATTCAAAGCTCAG-3’
P41(SEQ ID No.73)：5’-CTGAACGCGCCGGCTTAAC-3’
使用以下嵌套PCR2引物扩增各16s rRNA靶标：
P2(SEQ ID No.129)：
5’-AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGCTTTCGATGCAACGCGAAGAACCT-3’
P2(SEQ ID No.130)：5’-/52-Bio/TACGAGCTGACGACAGCCATG-3’
方案/反应条件
将各生物体的100个基因组拷贝加标至“PCR1预混合物”中。根据表5中所示的配方，在0.2mL管中制备PCR1预混合物。
表5
1上述[02]中列出的引物的等摩尔混合物；2混合物中各引物的浓度
3dATP、dCTP、dGTP和dTTP的等摩尔混合物；4混合物中各核苷酸的浓度
使用以下三步热程序进行PCR1-PCR扩增，步骤b和c按顺序重复进行25个循环：
a.98℃持续30秒(初始变性步骤)，b.98℃持续5秒(变性步骤)，c.65℃持续25秒(退火/延伸步骤)。
样本稀释-然后使用分子级水(ThermoFisher Scientific)将样本稀释40倍，以降低脱靶的PCR扩增子水平。
添加PCR2试剂-将10μL稀释的PCR1材料添加到40μL的“PCR2预混合物”中，形成1:200的最终稀释液。根据表6中所示的配方制备PCR2预混合物。在本实施例中，PCR2预混合物包括1.50μM引物混合物(P2如[0487]所示)。
表6
PCR2–使用以下三步热程序进行PCR2扩增，步骤b和c按顺序重复进行45个循环：
a.98℃持续30秒(初始变性步骤)，b.98℃持续5秒(变性步骤)，c.65℃持续25秒(退火/延伸步骤)。
使用Bioanalyzer测定和定量来确认PCR2产物。
全捕获PCR产物-将链霉亲和素珠(MyOne C1，ThermoFisher Scientific)以8.33mg/mL的浓度重悬于珠重悬缓冲液[1.50M NaCl(Invitrogen)、10mM Tris-HCl(pH7.5)(Invitroen)、0.10％吐温20(ThermoFisher Scientific)]中。
生物素标记靶DNA与链霉亲和素珠的结合-将等体积(各120μL)的重悬珠和PCR2产物组合在0.2mL管中。将管在室温(约20-26℃)下孵育10分钟，通过涡旋进行温和混合，然后用磁力架进行珠结合。
用结合模板洗涤链霉亲和素珠-然后用200μL洗涤缓冲液[1M NaCl，5mM Tris-HCl(pH 7.5)、0.05％吐温20、0.5mg/mL BSA]洗涤珠三次，每次洗涤之间丢弃上清液。
用NaOH洗脱-将50μL的40mM NaOH加入0.2mL管中，涡旋10秒，并且静置30秒。将珠固定在磁力架上两分钟，然后将洗出液转移到新的0.2mL管中。
结果和结论
在200V下在TBE凝胶上确认从NaOH洗出液中的ssDNA洗脱，直到参比染料到达凝胶底部。然后将凝胶在1x SYBR Gold中染色至少20分钟，并在UV工作站上观察，如图52所示。
总之，在PCR1中扩增了来自三个靶生物体的DNA，然后在PCR2中扩增了一个靶标。然后进行PCR2产物的全捕获以产生所需的ssDNA，用于与结合到半导体芯片表面的引物杂交。
E.靶向富集(PCR1和嵌套PCR2)，然后进行拷贝控制
寡聚体(均由IDT提供；“iSP18”为六乙二醇(HEG)内部间隔子；3BiodT是连接到末端dT核苷酸的3'生物素分子；56-FAM/是6-FAM(荧光素)的5'附接物；/ZEN/是专有的IDTZEN淬灭剂分子；/3IABkFQ/是3'Iowa Black FQ淬灭剂)
以下聚合酶链式反应(PCR)1引物用于屎肠球菌(E.Faecium，EFM)靶标：
P41F(SEQ ID No.131)：5’-GGCTGCGATATTCAAAGCTCAG-3’
P41R(SEQ ID No.132)：5’-CTGAACGCGCCGGCTTAAC-3’
以下嵌套PCR2引物用于来自PCR1的EFM靶扩增子：
P41F(SEQ ID No.133)：
5’-AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGCTTGTATGGACAAATCGTTGACATACA-3’
P41R(SEQ ID No.134)：
5’-ACCGTGCTGCCTTGGCTTCATTGTGGTCGTAGCTGCCACCGGCCTAT-3’
使用以下发夹寡聚体序列(SEQ ID No.135)：
5’-CGCGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18/TTTTTTTTTTTTTTTCGCGCGAAAAACTCCTCTGGCACCGTGCTGCCTTGGCTTCATTGTGGTC-3’
使用发夹寡聚体和珠之间的插入寡聚体：
polydT寡聚体序列(SEQ ID No.136)：
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT/3BiodT/
以下引物用于定量PCR(qPCR)：
RPA1F(SEQ ID No.137)：5’-AAAACGAGACATGCCGAGCATC-3’
RPA1外部R(SEQ ID No.138)：5’-TCGCGCGAAAAACTCCTCTGG-3’
FAM探针(SEQ ID No.139)：
5’-/56-FAM/TGCTGGGAT/ZEN/AGCTACTCCCGCCTTTTGG/3IABkFQ/-3’
标准曲线的对照序列(SEQ ID No.140)：
方案/反应条件
样本稀释-EFM基因组DNA(gDNA)稀释至1000拷贝/μL
添加PCR1试剂-将10μL稀释的EFM gDNA添加到40μL PCR1预混合物中。根据表7中所示的配方制备PCR 1预混合物。
表7
使用以下三步热程序进行PCR1-PCR扩增，步骤b和c按顺序重复进行30个循环：
a.98℃持续30秒(初始变性步骤)，b.98℃持续5秒(变性步骤)，c.65℃持续25秒(退火/延伸步骤)。
样本稀释度-将2.5μL PCR1反应物在97.5μL水中稀释，稀释度1:40。
添加PCR2试剂-将5μL稀释的PCR1材料添加到20μL PCR2预混合物中，以产生1:200的最终稀释度。根据表8中所示的配方制备PCR2预混合物。
表8
PCR2–使用以下热程序进行PCR2扩增，步骤b、c和d按顺序重复进行45个循环。
a.98℃持续30秒(初始变性步骤)，b.98℃持续5秒(变性步骤)，c.55℃持续10秒(退火步骤)，d.72℃持续30秒(延伸步骤)，e.各个循环以0.5℃的速率从65℃升温到95℃(含端值)(熔解步骤)。
使用Bioanalyzer测定和定量来确认PCR2产物。发现储液浓度为800ng/μL，其相当于每40μL 1.88x1013个拷贝。该40μL样本被用作“纯(neat)”条件。
PCR2样本稀释度-样本也以1:10稀释，以获得单独的“1:10”输入，即每40μL1.88x1012个拷贝。
添加延伸预混合物-将60μL延伸预混合物添加到40μL“纯”或“1:10”PCR2输出材料中，并通过移液器混合，然后快速涡旋和快速旋转。根据表9中所示的配方制备延伸预混合物。
表9
延伸-使用热程序进行延伸：
a.92℃持续2分钟，b.64℃持续2分钟，c.68℃持续10分钟。
添加杂交混合物-向完成的延伸反应中添加50μL杂交混合物，并用移液器混合。根据表10中所示的配方制备杂交混合物。
表10
链霉亲和素偶联磁珠的制备和添加-在1x洗涤缓冲液(表11)中洗涤0.2mg链霉亲和素珠(内部制备)3次，并在0.2mL管中的50μL 1x洗涤缓冲液中重悬。然后将50μL的接合珠加入延伸/杂交混合物中，并用移液器混合。
表11
将反应在25℃孵育2分钟，然后将管放置在磁力支架上30秒。
吸取上清液，用移液器将珠与1x洗涤缓冲液混合(表5)，并将其放回磁力架上，直到澄清。
如上所述重复洗涤，总共洗涤3次。
第三次洗涤后，去除上清液，将珠重悬于30μL超纯水中。
将管在70℃孵育1分钟，轻轻搅拌混合，旋转并回到70℃1分钟。
使用qPCR去除洗出液(eluates)并进行定量，将2μL输入加入13μL根据表12所示配方制备的PCR定量预混合物中。所有反应运行三次。标准曲线的对照序列在2x107、2x106、2x102和2x104个拷贝运行。
表12
试剂 制造商 储液浓度 最终浓度 每13μL反应
PerfeCTa MM Quantabio 5x 1x 3.00μL
RPA1F IDT 100μM 1μM 0.15μL
RPA1外部R IDT 100μM 1μM 0.15μL
FAM探针 IDT 100μM 0.3μM 0.045μL
水 ThermoFisher NA NA 9.66μL
使用以下热程序进行qPCR反应，步骤b、c和d按顺序重复进行40个循环：
a.95℃持续60秒，b.95℃持续10秒，c.64℃持续25秒，d.72℃持续10秒。
结果和结论
使用PCR反应富集靶DNA。使用Bioanalyzer对PCR2输出进行量化，发现其为80.0ng/μL。这相当于每40μL 1.88x1013个拷贝(用作“纯”条件)。样本也以1：10稀释，以获得单独的“1：10”输入，即每40μL 1.88x1012个拷贝。
拷贝控制过程将具有10倍不同输入浓度的两个样本的输出标准化为几乎相等的值(仅6％的差值)，证明了该过程将大范围的输入浓度标准化为所需值的能力，如表13所示。
表13
CC结果 拷贝
纯 3.22E+09
1∶10 3.42E+09
差值 6％
F.利用包含捕获序列及其互补序列的捕获寡聚体捕获预定量的扩增子
寡聚体。
使用以下引物进行PCR以扩增来自大肠杆菌(E.coli)的uidA基因的片段：
Ec_uidA_F(SEQ ID No.141)：GTATCAGCGCGAAGTCTTTATACC
Ec_uidA_R(SEQ ID No.142)：GGCAATAACATACGGAGTGACATC
设计引物以产生具有以下序列的扩增子(SEQ ID No.143)：
提供了命名为uidA_PA_1.2的捕获寡聚体，其具有以下序列(SEQ ID No.144)：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCTCTA/iSp18/TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGACGCAAGCTACTGGTGATTTGGCAATAACATACGGAGTGACATCGGCTTC(iSp18＝六乙二醇(HEG)内部间隔子(IDT))
在该寡聚体中，5′poly-A序列为捕获序列。CCTCTA为接头序列。iSp18为内部延伸阻断序列。iSp18之后的poly-T序列为捕获序列的互补序列。AGACGCAAGCTACTGGTGATTT为第四附加序列。靶杂交序列(THS)为GGCAATAACATACGGAGTGACATCGGCTTC，其与靶扩增子中uidA基因序列的节段特异性杂交。在本实施例中，THS比与其重叠的反向PCR引物(见上述序列)长，以提高THS的Tm并使其在与靶标杂交方面具有超过反向引物的竞争优势。
使用具有以下序列的第二捕获试剂：
dT20-生物素(SEQ ID No.145)：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT/3′生物素
下列引物和探针用于拷贝控制产物的定量PCR(qPCR)分析：
Ec_uidA_F(SEQ ID No.141)：
GTATCAGCGCGAAGTCTTTATACC
uidA_探针(SEQ ID No.146)
56-FAM/TAGCCGCCCTGATGCTCCATCACTTCCTG/3’IowaBlack
TQ_R(SEQ ID No.147)：AGACGCAAGCTACTGGTGAT
方案/反应条件
(1)利用上述引物产生靶标uidA的PCR扩增子；扩增子用AMPure XP(BeckmanCoulter)按照生产商推荐的方案纯化，并用uidA正向引物和反向引物以及uidA_探针通过qPCR进行定量。
(2)捕获寡聚体退火和扩增子链的延伸-将纯化的uidA扩增子稀释2倍、10倍或100倍。将20μL扩增子的每种稀释液的等分试样添加到由0.07U/μL SDPol(Bioron)、1×SDPol反应缓冲液、0.17mM dNTP′s、3mM MgCl2、1mg/ml BSA和5×1010个拷贝的捕获寡聚体组成的最终体积为30μL的捕获寡聚体退火/延伸反应中。将捕获寡聚体退火至uidA扩增子的互补链的3′端，并且根据以下温控方式，使用热循环仪对扩增子链进行延伸：92℃持续2分钟，54℃持续2分钟，68℃持续10分钟，54℃持续2分钟，随后控制降温(0.3℃/秒)至20℃。在该实施例中，捕获寡聚体的3'端也被延伸。
(3)捕获寡聚体的捕获序列的互补序列的杂交-将整个捕获寡聚体/扩增子延伸反应混合物添加至10μL的4X浓度的第二捕获试剂，从而获得最终浓度为125mM NaCl、0.25mg/ml BSA和107个、108个或109个拷贝的捕获序列的互补序列(即，测试3个不同量)。通过将反应混合物在室温(20℃至24℃)孵育15分钟，从而进行杂交。
(4)扩增子和捕获寡聚体延伸产物/捕获寡聚体复合体的捕获-将5μL等分试样(50μg)的在250mM NaCl和1mg/ml BSA中的MyOneC1链霉亲和素珠粒(ThermoFisherScientific)添加至杂交混合物(上述步骤3)，将捕获寡聚体/扩增子延伸产物/捕获序列的互补序列复合体捕获在珠粒上，并根据制造商的建议洗涤珠粒。
(5)洗脱-在完成最后的洗涤并除去洗涤缓冲液后，将10μL的水添加至珠粒团中，将珠粒重悬并在70℃孵育2分钟。利用磁铁使珠粒成团，并除去洗脱液。
(6)定量-使用靶向uidA_F引物位点和TQ引物-衔接子位点的引物以及uidA_探针，通过qPCR对洗脱的产物以及捕获寡聚体延伸产物(参见上述步骤2)的量进行定量。
结果和结论：
使用107个、108个或109个拷贝的捕获寡聚体，对靶向富集步骤(参见上述步骤1)中产生的扩增子的2倍稀释液、10倍稀释液和100倍稀释液进行拷贝控制过程(参见上述步骤2至5)。如表14所示，回收的扩增子的量与每种PCR稀释液中添加的捕获寡聚体的量成比例(大约以预期的比例；参见表中的“比例”栏)。每个数据点的重复数据之间的差异小(参见“标准偏差”栏)。
表14
*3次平行测定的平均值
**将2倍稀释液的值设定为等于1
此外，尽管扩增子输入量存在50倍的差异，但对于107个、108个和109个拷贝的捕获寡聚体，输出量的变化分别为2.36倍、3.11倍和3.44倍(表1)。如上所述，重复数据之间的差异小。
这些数据表明，本文所述的捕获寡聚体可以用于由一系列不同的靶标输入量产生预定量的目标输出。
基本上如上所述，但以多重形式使用捕获寡聚体进行了另外的实验，其中THS区域被设计成靶向大肠杆菌的uidA基因、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的nuc基因、粪肠球菌(Enterococcus faecallis)的vanA基因或白色念珠菌(Candida albicans)的rpb7基因(即每个反应使用4个捕获寡聚体)。使用如上所示的针对uidA的引物以及针对nuc和vanA基因设计的其他引物，分别使用如上所述的PCR，各自扩增uidA、nuc和vanA基因。将所得的扩增子稀释10倍或100倍，并将各单独靶标的20μL等分试样的各稀释液添加至不同的捕获寡聚体退火和扩增子链的延伸反应，该反应含有5×1010个拷贝的上述4种捕获寡聚体中的每一种(即4重捕获寡聚体，但仅存在1个靶标)。反应条件与所描述的反应条件相同，不同之处在于使用以下温控方式：92℃持续2分钟，64℃持续2分钟，68℃持续10分钟，98℃持续2分钟，57℃持续2分钟，随后控制降温(0.3℃/秒)至20℃。在该反应完成后，将5×108个拷贝的捕获寡聚体的捕获序列的互补序列添加至每个反应。随后进行如上所述的捕获、洗涤、洗脱和定量步骤。
表15中示出了输入量相差10倍的扩增子捕获后的输出量，结果显示，对于以多重形式测试的3种单独的靶扩增子中的每一种，在控制拷贝后，扩增子输入水平的10倍差异被降低至平均输出水平的不超过1.4倍差异。此外，对于所有3种靶扩增子，控制拷贝后的平均输出水平范围跨度为约1.6倍，而它们的输入水平跨度超过270倍。
表15
*3次平行测定的平均值
基本上如上所述，以单重形式进行另外的实验，但是使用这样的捕获寡聚体，该捕获寡聚体中的THS退火至PCR扩增步骤期间引入目标靶标中的标签序列中的通用结合位点。设计引物以靶向细菌23S rRNA基因，并由细菌基因组DNA产生PCR扩增子。反向引物包含在PCR期间引入扩增子中的通用序列标签。如上所述进行捕获寡聚体退火和扩增子链的延伸，不同之处在于，向包含0.02U/μL SD聚合酶(Bioron)、0.4x SD聚合酶反应缓冲液(Bioron)、0.012mM的4dNTP′s、1.8mM MgCl2、0.6mg/mL BSA和5×1010个拷贝的捕获寡聚体的最终反应体积为100μL的反应混合物中添加40μL纯的等分试样(即，无稀释；约9×1012个拷贝)或50倍稀释液(约2×1011个拷贝)。所使用的温控方式为92℃持续2分钟，54℃持续2分钟，68℃持续10分钟，54℃持续2分钟，随后控制降温(0.3℃/秒)至20℃。将上述反应的全部体积添加至50μL含有1mg/ml BSA、125mM NaCl和5×108个拷贝的第二捕获试剂的3X退火混合物中。通过在25℃的热块(thermal block)上将反应混合物孵育10分钟来进行退火。将50μL体积(在该实验中为200μg)的在4X洗涤缓冲液中的MyOneC1链霉亲和素珠粒(ThermoFisherScientific)添加至上述150μL反应中，所述4X洗涤缓冲液由4M NaCl、20mM Tris-HClpH7.5、2mM EDTA、0.20％吐温20、2mg/mL BSA组成。将包括捕获寡聚体、扩增子延伸产物和捕获序列的互补序列的所得的复合体捕获在珠粒上，并按照制造商的建议洗涤珠粒(在这种情况下，使用1X洗涤缓冲液；参见上文的4X配方)。使用20μL体积的水进行洗脱(方案的其他方面与上述相同)。使用靶向通用标签的特异性正向引物和反向引物进行qPCR。
尽管扩增子输入水平有50倍的差异，但在捕获寡聚体退火和扩增子链延伸步骤后，输出的变化仅为2.5倍，并且在与第二捕获试剂接触并分离所得的复合体后，输出的变化仅为1倍(即，完全归一化)(参见表16)。此外，这些结果证明了本公开的实施方案，其中THS结合至通用标签序列。
表16
**纯的/50倍稀释液输出
基本上如以上刚刚所述(单重，通用THS)但以多重形式使用捕获寡聚体以进行另外的实验，捕获寡聚体中的THS退火至PCR扩增步骤期间引入目标靶标中的通用标签序列。在八个单独的单重反应中，由肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)基因组DNA产生靶向细菌16SrRNA基因、23S rRNA基因和抗生素抗性标记KPC中的区域的八种不同的扩增子。还产生了靶向合成的内标(Internal Control，IC)DNA的一种扩增子，总共九种单独的扩增子。合并等量的所有9种扩增子，并添加54μL纯的等分试样(即无稀释；约1×1013个拷贝)或10倍稀释液(约1×1012个拷贝)以分开捕获寡聚体退火和扩增子链的延伸反应混合物(各自为100μL最终体积)。基本上与上述相同地进行工作流程的其余部分，不同之处在于，使用5×1011个拷贝的捕获寡聚体和5×109个拷贝的第二捕获试剂。使用靶向通用标签的特异性正向引物和反向引物进行qPCR，以定量每个靶标(9次单独的PCR)。将每个单独的靶标的回收量相加以确定捕获过程的总回收率。
尽管扩增子输入水平有10倍的差异，但在捕获寡聚体退火和扩增子链延伸步骤后，总输出的变化仅为2.5，并且在与第二捕获试剂接触并分离所得的复合体后，总输出的变化仅为1.6(参见表17)。此外，这些结果证明了本发明的实施方案，其中THS以多重形式结合通用标签序列，从而捕获混合物中存在的所有靶扩增子。
表17
**纯的/50倍稀释液输出
G.利用包含捕获序列、其互补序列和夹序列的捕获寡聚体捕获预定量的扩增子
基本上如上文关于uidA所述制备靶扩增子，并用于没有或具有作为第一附加序列和第三附加序列嵌入的夹序列(GCGCGC)的捕获寡聚体的实验中(参见图3)。基本上如上所述使用未稀释的、10X稀释的和100X稀释的扩增子进行捕获。基本上如上所述对捕获的产物的量进行定量。结果示于图14中。使用含有夹序列的捕获寡聚体改进了对于不同的扩增子稀释倍数跨度进行输出量归一化的能力。
H.利用捕获寡聚体和互补寡聚体捕获预定量的扩增子
寡聚体。
使用以下引物进行PCR以扩增来自屎肠球菌(E.faecium)的vanA基因的节段：
Efm_vanA_F(SEQ ID No.148)：GGCTGCGATATTCAAAGCTCAG
Efm_vanA_R(SEQ ID No.149)：CTGAACGCGCCGGCTTAAC
设计引物以产生具有以下序列的扩增子(SEQ ID No.150)：
提供了命名为CC_Blo_vanA_001的捕获寡聚体，其具有以下序列(SEQ IDNo.151)：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18/CTCCTCTGGCACCGTGCTGCCTTGGCTTCATTGTGGTCCTGAACGCGCCGGCTTAAC(iSp18＝六乙二醇(HEG)内部间隔子(IDT))
该寡聚体包括图10A的示例性捕获寡聚体所示的元件。在该寡聚体中，5′poly-A序列为具有第一部分和第二部分的捕获序列。iSp18为内部延伸阻断序列。CTCCTCTGGCACCGTGCTGCCTTGGCTTCATTGTGGTC为具有第一部分和第二部分的间隔序列。靶杂交序列(THS)为CTGAACGCGCCGGCTTAAC，其与靶扩增子中的vanA基因序列的节段特异性杂交。
提供了命名为阻断序列_vanA_001的互补寡聚体，其包含图10A的示例性互补寡聚体所示的元件，具有下列序列(SEQ ID No.152)：CGGTGCCAGAGGAGTTTTTTTTTT/invdt/，其中invdt为反向的T核苷酸，其用作阻断部分。在该寡聚体中，CGGTGCCAGAGGAG为捕获寡聚体的间隔序列的第一部分的互补序列，并且TTTTTTTTTT为捕获序列的第二部分的互补序列
使用具有以下序列的第二捕获试剂：
dT20-生物素(SEQ ID No.145)：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT/3′生物素
下列引物和探针用于拷贝控制产物的定量PCR(qPCR)分析：
vanA_PCR2_Fwd(SEQ ID No.153):TTGTATGGACAAATCGTTGACATACA
Efm_探针_FAM(SEQ ID No.154):
5'FAM/TGCTGGGATAGCTACTCCCGCCTTTTGG/3'IowaBlack
CC_Univ_Inner_Rev(SEQ ID No.155):ACCGTGCTGCCTTGGCTTC
方案/反应条件。
(1)利用以上示出的Efm_vanA_F和Efm_vanA_R引物产生靶标vanA的PCR扩增子；使用Agilent BioAnalyzer通过基于芯片的毛细管电泳对扩增子进行定量。
(2)捕获寡聚体退火和扩增子链的延伸-在未稀释(纯的)或稀释10倍(分别为约2×1013个拷贝和2×1012个拷贝)的情况下使用vanA扩增子。将80μL各扩增子量(纯的和10倍稀释的)的等分试样与20μL的捕获寡聚体退火/延伸反应混合物合并，从而产生由0.02U/μLDeep Vent(exo-)Pol(NEB)、0.4x Deep Vent Vent Pol反应缓冲液、0.012mM dNTP's、1.8mM MgCl2、0.6mg/ml BSA、1×1011个拷贝的捕获寡聚体(CC_Blo_vanA_001)和1×1012个拷贝的互补寡聚体(阻断序列_vanA_001)组成的最终混合物，最终体积为100μL。将捕获寡聚体退火至vanA扩增子的互补链的3'端，并且根据以下温控方式，使用热循环仪对扩增子链进行延伸：92℃持续2分钟，64℃持续2分钟，68℃持续10分钟。在该实施例中，捕获寡聚体的3'端也被延伸。
(3)捕获寡聚体的捕获序列的互补序列的杂交-向整个捕获寡聚体/扩增子延伸反应混合物添加50μL的3X浓度的第二捕获试剂，从而获得最终浓度为42mM NaCl，0.33mg/mlBSA和109个拷贝的捕获序列的互补序列(dT20-生物素)。通过将反应混合物在30℃孵育10分钟，从而进行杂交。
(4)扩增子和捕获寡聚体延伸产物/捕获寡聚体复合体的捕获-将50μL等分试样(200μg)链霉亲和素包被的磁珠添加至整个杂交混合物(150μL)，从而产生最终浓度为1MNaCl、5mM TrisHCl(pH7.5)、0.5mM EDTA、0.05％吐温20和0.5mg/ml BSA的产物。在25℃将复合体捕获在珠粒上，使用具有与上文刚刚详述的相同组成的洗涤试剂洗涤珠粒。
(5)洗脱-在完成最后的洗涤并除去洗涤缓冲液后，将30μL的水添加到珠粒团中，将珠粒重悬并在70℃孵育2分钟。利用磁铁使珠粒成团，并除去洗出液。
(6)定量-使用靶向vanA_PCR2_Fwd引物位点和通用引物-衔接子位点(CC_Univ_Inner_Rev)的引物以及Efm_探针_FAM，通过qPCR对洗脱的产物以及捕获寡聚体延伸产物(参见上述步骤2)的量进行定量。
结果和结论：
使用109个拷贝的第二捕获寡聚体，对上述步骤1(PCR)中产生的扩增子的0倍(纯的)和10倍稀释液进行拷贝控制过程(参见上述步骤2至5)。如表18所示，尽管靶标输入量有10倍的差异，但输出水平基本上相同。
表18
PCR稀释液 输出(#拷贝) 倍数差异
纯的 3.24E+08 -
10倍 3.14E+08 1.03
这些数据表明，本文所述的捕获寡聚体和互补寡聚体可用于在靶标输入量跨越10倍差异时，产生预定的归一化的靶标输出量。
基本上如上所述进行了另外的实验，其具有以下不同之处：
(1)使用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒根据制造商的说明书纯化PCR扩增子，然后使用Agilent BioAnalyzer通过基于芯片的毛细管电泳进行定量。
(2)捕获寡聚体退火和扩增子链的延伸-在未稀释(纯的)、10倍稀释和100倍稀释(分别为约8×1011个拷贝、8×1010个拷贝和6×109个拷贝)的情况下使用vanA扩增子。以1×1012个拷贝/反应的捕获寡聚体使用捕获寡聚体(CC_Blo_vanA_001)，并且以零或1×1013个拷贝/反应使用互补寡聚体(阻断序列_vanA_001)。将捕获寡聚体退火至vanA扩增子的互补链的3'端，并且根据以下温控方式，使用热循环仪对扩增子链进行延伸：95℃持续2分钟，以及64℃持续15分钟。该步骤中的所有其他条件与上述步骤2相同。
(3至6)如以上步骤3至6所述进行步骤3至6，不同之处在于，在步骤4中，复合体在30℃而不是25℃被捕获在珠粒上。
结果和结论：
对上述步骤1(PCR)中产生的扩增子的0倍(纯的)、10倍和100倍稀释液进行拷贝控制过程(参见上述步骤2至5)。在该实验中，所用的各种核酸组分的量为大约8×1011个、8×1010个和6×109个拷贝的靶标、1×1012个拷贝的捕获寡聚体、0或1×1013个拷贝的互补寡聚体和1×109个拷贝的第二捕获寡聚体。表19示出了具有或没有互补寡聚体的结果。
表19
*步骤1中产生的靶扩增子
当缺乏互补寡聚体时，无论捕获寡聚体是否与靶标结合，第二捕获寡聚体(dT20-生物素)均可与任何捕获寡聚体分子结合。在该实验中，使用1×1012个拷贝的捕获寡聚体和1×109个拷贝的第二捕获寡聚体，即，在这些量中存在1000倍的差异。在最高的靶标水平(纯的)时，大部分捕获寡聚体将结合至靶标，因此大部分第二捕获寡聚体将结合至与靶标缔合的捕获寡聚体，并且捕获和洗脱后的输出拷贝将相对较高。这在纯的靶标输入(没有互补寡聚体)的数据中得到证实，其中观察到相对高的输出(9.3×107个拷贝)。然而，对于靶标的10倍稀释液，将有过量的捕获寡聚体，因此不是所有的捕获寡聚体都将结合至靶标。一些第二捕获寡聚体将结合至与靶标缔合的捕获寡聚体，但一些第二捕获寡聚体将捕获未结合至靶标的寡聚体。因此，如实际上观察到的，输出将下降(输出＝2.6×107个拷贝)。对于靶标的100倍稀释液，大部分捕获寡聚体将不与靶标结合，因此同样地，大部分第二寡聚体将与不和靶标缔合的捕获寡聚体结合。因此，在这些条件下的预期是显著降低的输出，这实际上被观察到(输出＝5.0×105个拷贝)。
在互补寡聚体的存在下，未结合至靶标的捕获寡聚体将与互补寡聚体结合，这进而将阻断第二捕获试剂的结合。相反地，已结合至靶标的捕获寡聚体将不与互补寡聚体结合(其已被置换)，这进而将使得第二捕获试剂能够结合。因此，在本实验中测试的所有靶标输入水平下，预计在互补寡聚体的存在下的输出均高于不存在互补寡聚体时的输出(其结果如上所述)。这正是所观察到的(参见表6)。此外，数据证明发生了归一化，在纯的靶标水平的输出与10倍稀释靶标水平的输出之间仅具有约2倍的差异，并且在纯的靶标水平的输出与100倍稀释靶标水平的输出之间仅存在略微超过14倍的差异。100倍靶标稀释液的输出略低于理论值，因为由于靶标的低水平，结合动力学较慢。如果孵育时间更长，则输出将提高，并且归一化因子将得到改善。
这些数据表明，本文所述的捕获寡聚体和互补寡聚体可用于在靶标输入量跨越100倍差异时，产生预定的归一化的靶标输出量。
I.使用捕获寡聚体、互补寡聚体、置换寡聚体和正向引物生成在靶序列两端包含附加序列(例如，衔接子)的可捕获产物
寡聚体。
使用以下引物进行PCR以扩增来自屎肠球菌的vanA基因的片段：
Efm_vanA_F(SEQ ID No.148):GGCTGCGATATTCAAAGCTCAG
Efm_vanA_R(SEQ ID No.149):CTGAACGCGCCGGCTTAAC
设计引物以产生具有以下序列的扩增子(SEQ ID No.150)：
提供了命名为PCR2R_衔接子_CC的捕获寡聚体，其具有以下序列(SEQ IDNo.156)：
(iSp18＝六乙二醇(HEG)内部间隔子(IDT))
该寡聚体包含图10A的示例性捕获寡聚体所示的元件。在该寡聚体中，5'poly-A序列为具有第一部分和第二部分的捕获序列。iSp18为内部延伸阻断序列。CTCCTCTGGCACCGTGCTGCCTTGGCTTCATTGTGGTC为具有第一部分和第二部分的间隔序列。靶杂交序列(THS)为GTAGCTGCCACCGGCCTAT，其与靶扩增子中vanA基因序列的节段特异性杂交。
提供了命名为阻断序列_vanA_001的互补寡聚体，其包含图10A的示例性互补寡聚体所示的元件，具有下列序列(SEQ ID No.152):CGGTGCCAGAGGAGTTTTTTTTTT/invdt/，其中invdt为反向的T核苷酸，其用作阻断部分。在该寡聚体中，CGGTGCCAGAGGAG为捕获寡聚体的间隔序列的第一部分的互补序列，并且TTTTTTTTTT为捕获序列的第二部分的互补序列。
Efm_vanA_R(上述序列)，其包含图8A的示例性置换寡聚体所示的元件。还提供了命名为PCR1F_衔接子的寡聚体，其包含图8A的具有衔接子的示例性正向引物所示的元件，PCR1F_衔接子具有以下序列(SEQ ID No.157):AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGCGGCTGCGATATTCAAAGCTCAG。
使用具有以下序列的第二捕获试剂：
dT20-生物素(SEQ ID No.145):TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT/3'生物素
以下引物和探针用于拷贝对照产物的定量PCR(qPCR)分析：
CCRPA_uni_F(SEQ ID No.158):AAAACGAGACATGCCGAGCATC
Efm_探针_FAM(SEQ ID No.154):5'FAM/TGCTGGGATAGCTACTCCCGCCTTTTGG/3'IowaBlack
CC_Univ_Inner_Rev(SEQ ID No.155):ACCGTGCTGCCTTGGCTTC
方案/反应条件
利用以上示出的Efm_vanA_F和Efm_vanA_R引物产生靶标vanA的PCR扩增子；使用QIAGEN QIAquick PCR纯化套件根据制造商的说明书纯化扩增子，然后使用AgilentBioAnalyzer通过基于芯片的毛细管电泳进行定量。
捕获寡聚体、置换寡聚体和具有衔接子的正向引物的退火和延伸-将含有约1×1012个拷贝的vanA扩增子的等分试样与退火/延伸反应混合物合并，从而产生由0.02U/μLDeep Vent(exo-)Pol(NEB)、0.4x Deep Vent Pol反应缓冲液、0.012mM dNTP's、1.8mMMgCl2、0.6mg/ml BSA、5×1013个拷贝的捕获寡聚体(PCR2R_衔接子_CC)、±1×1013个拷贝的置换寡聚体(Efm_vanA_R)和5×1013个拷贝的具有衔接子的正向引物(PCR1F_衔接子)组成的最终混合物，最终体积为100μL。捕获寡聚体和置换寡聚体与输入的扩增子的退火和延伸以及具有衔接子的正向引物与捕获寡聚体的延伸产物的退火和延伸都发生在相同的退火/延伸反应中，其中使用热循环仪根据以下温控方式进行：95℃持续5分钟，然后64℃持续20分钟。
定量-将每个退火延伸反应物的等分试样稀释100倍，并使用引物CCRPA_uni_F和CC_Univ_Inner_Rev(分别以正向和反向靶向通用衔接子区域)以及Efm_探针_FAM，通过qPCR对包含在每个等分试样中的产物的量进行定量。
结果和结论：
使用上述输入的靶标和寡聚体进行单循环退火和延伸反应(将单循环定义为仅1个变性步骤，例如在95℃孵育；另一个循环将以另一个热变性步骤开始)。如表20所示，如通过使用通用引物扩增所证明的，形成了在分子的两端含有通用衔接子的产物。
表20
置换寡聚体 输出(#拷贝)
+ 1.3E+11
- 2.8E+11
这些数据证明图8A中描述的本发明的实施方案可以用于使用单循环退火/延伸产生在分子的两端具有衔接子(或其他期望的序列)的产物。此外，这些数据表明，至少一种引物-衔接子寡聚体(在该情况中为PCR2R_衔接子_CC)可以结合至靶标中的内部位点，而不仅仅是结合至末端。这些数据还表明，可以在没有置换寡聚体的情况下产生期望的产物。不希望受任何特定理论的束缚，不同的机制可以在所公开的实施方案中起作用以产生期望的产物是可能的。在置换寡聚体存在的情况下，多种机制可能正在发挥作用以产生观察到的结果。
基本上如上所述进行了另外的实验，其具有以下不同之处。
(2)捕获寡聚体、置换寡聚体和具有衔接子的正向引物的退火和延伸-将包含大约1×1013个拷贝的vanA扩增子的等分试样与退火/延伸反应混合物混合，从而产生由0.02U/μL Deep Vent(exo-)Pol(NEB)、0.4x Deep Vent Pol反应缓冲液、0.012mM dNTP's、1.8mMMgCl2、0.6mg/ml BSA、5×1014个拷贝的捕获寡聚体(PCR2R_衔接子_CC)和5×1014个拷贝的具有衔接子的正向引物(PCR1F_衔接子)组成的最终混合物，最终体积为100μL。使用热循环仪根据以下温控方式进行该混合物的退火和延伸：95℃持续5分钟，然后64℃持续15分钟。此时，将5×1014个拷贝的置换寡聚体(Efm_vanA_R)添加至反应混合物的一些重复试样中，并且对于一些试样，仅添加缓冲液，并使用以下温控方式继续进行退火和延伸：64℃持续5分钟，75℃持续5分钟和72℃持续15分钟。
结果和结论：
使用上述输入的靶标和寡聚体进行单循环退火和延伸反应(将单循环定义为仅1个变性步骤，例如在95℃孵育；另一个循环将以另一个热变性步骤开始)。在整个过程的中途，将置换寡聚体添加至退火和延伸反应，以进一步优化性能。如表21所示，如通过使用通用引物扩增所证明的，形成了在分子的两端含有通用衔接子的产物。
表21
置换寡聚体 输出(#拷贝)
+ 3.2E+12
- 1.9E+12
如上所述，这些数据表明，图8A中描述的本发明的实施方案可以用于使用单循环退火/延伸产生在分子的两端具有衔接子(或其他期望的序列)的产物。同样如上所述，这些数据证明至少一个引物-衔接子寡聚体(在该情况中为PCR2R_衔接子_CC)可以结合至靶标中的内部位点，而不仅仅是结合至末端。此外，这些数据表明，通过调节退火和延伸温控方式，并且在该情况中通过在整个过程的中途添加置换寡聚体，可以改进总体性能。特别值得注意的是，在这些条件下，当置换寡聚体存在时，产生期望的产物的量大于当不存在置换寡聚体时产生期望的产物的量，从而表明置换方案如图8A所示运行。同样不希望受任何特定理论的束缚，不同的机制也可以在所公开的实施方案中起作用以产生期望的产物。
方案/反应条件(2)
利用以上示出的Efm_vanA_F和Efm_vanA_R引物产生靶标vanA的PCR扩增子；使用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒根据制造商的说明书纯化扩增子，然后使用AgilentBioAnalyzer通过基于芯片的毛细管电泳进行定量。
捕获寡聚体、置换寡聚体和具有衔接子的正向引物的退火和延伸-将含有约1×1012个拷贝的vanA扩增子的等分试样与退火/延伸反应混合物合并，从而产生由0.02U/μLDeep Vent(exo-)Pol(NEB)、0.4x Deep Vent Pol反应缓冲液、0.012mM dNTP's、1.8mMMgCl2、0.6mg/ml BSA、5×1013个拷贝的捕获寡聚体(PCR2R_衔接子_CC)、±5×1012个拷贝的置换寡聚体(Efm_vanA_R)和5×1013个拷贝的具有衔接子的正向引物(PCR1F_衔接子)组成的最终混合物，最终体积为100μL。捕获寡聚体和置换寡聚体与输入的扩增子的退火和延伸以及具有衔接子的正向引物与捕获寡聚体的延伸产物的退火和延伸都发生在相同的退火/延伸反应中，其中使用热循环仪根据以下温控方式进行：95℃持续5分钟，然后64℃持续20分钟。
捕获寡聚体的捕获序列的互补序列的杂交-向整个延伸反应混合物添加50μL的3X浓度的第二捕获试剂，从而获得最终浓度为42mM NaCl，0.33mg/ml BSA和5×1014个拷贝的捕获序列互补序列(dT20-生物素)。通过将反应混合物在30℃孵育10分钟，从而进行杂交。
扩增子和捕获寡聚体延伸产物/捕获寡聚体复合体的捕获-将50μL等分试样(200μg)链霉亲和素包被的磁珠添加至整个杂交混合物(150μL)，从而产生最终浓度为1M NaCl、5mM TrisHCl(pH 7.5)、0.5mM EDTA、0.05％吐温20和0.5mg/ml BSA。在30℃将复合体捕获在珠粒上，使用具有与上文刚刚详述的相同组成的洗涤试剂洗涤珠粒。
洗脱-在完成最后的洗涤并除去洗涤缓冲液后，将30μL的水添加到珠粒团中，将珠粒重悬并在70℃孵育2分钟。利用磁体使珠粒成团，并除去洗出液。
定量-使用引物CCRPA_uni_F和CC_Univ_Inner_Rev(分别以正向和反向靶向通用衔接子区域)以及Efm_探针_FAM，通过qPCR对洗脱的产物进行定量。
结果和结论：
使用上述输入的靶标和寡聚体进行单循环退火和延伸反应，对产物进行捕获、洗涤、洗脱，然后使用qPCR进行定量。如表22所示，如通过使用通用引物扩增所证明的，形成了在被捕获和洗脱的分子的两端含有通用衔接子的产物。
表22
置换寡聚体 输出(#拷贝)
+ 1.4E+09
- 1.5E+10
这些数据表明，图8A中描述的本发明的实施方案可以用于使用单循环退火/延伸产生在分子的两端具有衔接子(或其他期望的序列)的产物，并且该产物可以通过捕获至珠粒上、洗涤和洗脱，从而进行分离。此外，这些数据证明至少一个引物-衔接子寡聚体(在该情况中为PCR2R_衔接子_CC)可以结合至靶标中的内部位点，而不仅仅是结合至末端。这些数据还表明，当不存在置换寡聚体时，可以产生期望的产物。不希望受任何特定理论的束缚，不同的机制可以在所公开的实施方案中起作用以产生期望的产物是可能的。在置换寡聚体存在的情况下，多种机制可能正在发挥作用以产生观察到的结果。
基本上如上所述进行了另外的实验，其具有以下不同之处：
捕获寡聚体、置换寡聚体和具有衔接子的正向引物的退火和延伸-退火/延伸反应混合物与上述相同，不同之处在于，添加了还含有5×1014个拷贝的互补寡聚体(阻断子_vanA_001)的新样本。捕获寡聚体和置换寡聚体与输入的扩增子的退火和延伸、互补寡聚体与捕获寡聚体的退火以及具有衔接子的正向引物与捕获寡聚体的延伸产物的退火和延伸都发生在相同退火/延伸反应中，其中使用热循环仪按照以下示出的温控方式进行：
a.95℃持续5分钟，b.75℃持续30秒，c.74℃持续30秒，d.73℃持续30秒，e.72℃持续30秒，f.71℃持续30秒，g.70℃持续30秒，h.69℃持续2分钟，i.68℃持续2分钟，j.67℃持续2分钟，k.66℃持续2分钟，l.65℃持续12分钟。
捕获寡聚体的捕获序列的互补序列的杂交-条件与上述相同，不同之处在于，使用了1×109个拷贝的捕获序列的互补序列(dT20-生物素)。
结果和结论：
使用上述输入的靶标和寡聚体进行单循环退火和延伸反应，使用预定量的捕获序列的互补序列(dT20-生物素)捕获产物，洗涤，洗脱，然后使用qPCR进行定量。结果示于表23中。
表23
PCR稀释液 输出(#拷贝) 倍数差异
纯的 2.0E+06 -
10倍 4.3E+05 4.7
这些数据表明，图8A中描述的本发明的实施方案可以用于使用单循环退火/延伸产生在分子的两端具有衔接子(或其他期望的序列)的产物，并且该产物可以通过捕获至珠粒上、洗涤和洗脱，从而进行分离。此外，将输入的靶标水平的10倍差异归一化为4.7倍差异，这超过2倍归一化因子。此外，这些数据证明至少一个引物-衔接子寡聚体(在该情况中为PCR2R_衔接子_CC)可结合至靶标中的内部位点，而不仅仅是结合至末端。
基本上如上所述进行了另外的实验，其具有以下不同之处：
(2)捕获寡聚体、置换寡聚体和具有衔接子的正向引物的退火和延伸-退火/延伸反应混合物与上述相同，不同之处在于，使用了1E+13和1E+12(10倍稀释)个拷贝/反应的输入的靶标；添加了还含有5×1014个拷贝的互补寡聚体(阻断子_vanA_001)的新样本。捕获寡聚体与输入的扩增子的退火和延伸、互补寡聚体与捕获寡聚体的退火以及具有衔接子的正向引物与捕获寡聚体的延伸产物的退火和延伸都发生在相同的退火/延伸反应中，其中使用热循环仪根据以下温控方式进行：95℃持续5分钟，然后64℃持续15分钟。
(3)捕获寡聚体的捕获序列的互补序列的杂交-条件与上述相同，不同之处在于，使用了1×109个拷贝的捕获序列的互补序列(dT20-生物素)。在30℃进行杂交30分钟。
结果和结论：
使用上述输入的靶标和寡聚体进行单循环退火和延伸反应，使用预定量的捕获序列的互补序列(dT20-生物素)捕获产物，洗涤，洗脱，然后使用qPCR进行定量。结果如表24所示。
表24
这些数据表明，图8A中描述的本发明的实施方案可以用于使用单循环退火/延伸产生在分子的两端具有衔接子(或其他期望的序列)的产物，并且该产物可以通过捕获至珠粒上、洗涤和洗脱，从而进行分离。此外，当存在互补寡聚体时，将输入的靶标水平的10倍差异归一化为0.67倍差异(～1)。没有互补寡聚体，则产物的回收率降低超过10倍，正如预期的那样，而归一化是相似的。此外，这些数据证明至少一个引物-衔接子寡聚体(在该情况中为PCR2R_衔接子_CC)可以结合至靶标中的内部位点，而不仅仅是结合至末端。
J.使用溶液介导的重组酶聚合酶扩增(SM-RPA)的靶核酸的孔内扩增
寡聚体
使用具有以下序列的溶液引物(HDA72F)和固定在孔表面的引物(extHDA72R)进行孔内扩增：
HDA72F(SEQ ID No.159):5'-AAAACGAGACATGCCGAGCATCCGC-3'extHDA72R(SEQ IDNo.160):5'-AmmC12-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCCiSp18-iSp18-iSp18-iSp18-iSp18/-AAAAAAACTCCTCTGGCACCGTGCTGCCTTGGCTTCATTGTGGTC-3'(5'-AmmC12＝5'-末端C-12胺和iSp18＝六乙二醇(HEG)内部间隔子(均来自IDT))。使用代表来自金黄色葡萄球菌的微球菌核酸酶基因(nuc)、来自肺炎克雷伯菌的碳青霉烯酶基因(Kpc)和来自大肠杆菌的Qin原噬菌体蛋白YdfU基因(ydfU)的合成DNA模板，其各自具有以下序列(包括带下划线的衔接子序列)：
nuc模板(SEQ ID No.161)：
Kpc模(SEQ ID No.162)：
ydfU模板(SEQ ID No.163)：
合成DNA探针用于检测来自上述模板的扩增产物，各扩增产物具有以下序列：
nuc探针(SEQ ID No.164):
5'-Cy3-TCGAAAGGGCAATACGCAAAGAG-3'(5'-Cy3＝5'-末端Cy3荧光团)
Kpc探针(SEQ ID No.165):
5'-Alex488N-TAAACTCGAACAGGACTTTGGCG-3'(5'-Alex488N＝5'-末端Alexa488荧光团)
ydfU探针(SEQ ID No.166):
5'-Cy5-TGCGGGTATTACTTAGACCTGTTC-3'(5'-Cy5＝5'-末端Cy5荧光团)
半导体芯片
本实施例中使用的DNAe半导体芯片使用标准CMOS方法制造，并包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器阵列，其电压输出响应于IC上方孔中驻留的流体溶液中pH的变化。这些孔是微米尺寸的，并且通过标准的光刻工艺生产。将定制的流动池装置安装在IC和孔组件的顶部，以便于在芯片表面上输送流体。通过首先用丙烯酰胺基聚合物涂层活化孔表面，然后使用标准点击化学共价连接5'修饰的寡核苷酸，将寡核苷酸偶联到孔表面。
缓冲液/试剂制备
根据表25中所示的配方，在Eppendorf微量离心管中制备“缓冲混合物”。将20％Carbowax在65℃加热5分钟。加入水，将混合物涡旋至均匀，然后置于冷却块中5分钟。加入DTT和UvsX反应缓冲液，并将混合物涡旋至均匀。
表25
在单独的Eppendorf微量离心管中制备“能量混合物”，方法是依次加入表26中记录的每种组分(按所示顺序)，然后充分混合(无涡旋)。
表26
在单独的Eppendorf微量离心管中制备“核心混合物”，方法是依次加入表27中记录的每种组分(按所示顺序)，然后充分混合(无涡旋)。
表27
缓冲混合物、能量混合物和核心混合物在使用前均在4℃下储存。
方案/反应条件
流动池用1X RPA退火缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，5mM Mg(OAc)2，150mM NaCl，0.01％吐温)冲洗两次。
将1X RPA退火缓冲液中的合成DNA模板以25μL的体积上样到流动池中。在该实施例中，对于每个反应，各靶标以106、107或108个拷贝测试nuc、Kpc和YdfU的等摩尔混合物。
使用以下热程序使DNA模板与固定在孔表面上的引物(extHDA72R)退火：
a.95℃持续2分钟，b.60℃持续5分钟，c.25℃持续15分钟。
去除溶液，并用50μL RPA洗涤缓冲液(0.06x SSC+0.06吐温20)洗涤芯片两次。
将缓冲液混合物、酶混合物和核心混合物按表1-3中所示的比例(每25μL各反应的总量)在冷却块上组合，并将25μL上样到芯片上。
然后使用以下热程序进行扩增：
a.43℃持续25分钟，b.95℃持续3分钟。
然后将芯片在冷却块上孵育5-10分钟，去除反应混合物，并用50μL RPA洗涤缓冲液洗涤芯片两次。
通过将25μL 20mM NaOH上样到芯片中并在环境温度(约20-26℃)下孵育10分钟，去除所得扩增产物的非固定的链。去除NaOH溶液，并用50μL RPA洗涤缓冲液洗涤芯片两次。
然后制备含有1X RPA退火缓冲液和各2μM上述nuc、Kpc和ydfU荧光标记探针的探针溶液。然后将25微升的该溶液上样到芯片上，并使用以下热程序使探针与它们各自的靶标(如果存在的话)退火：
a.95℃持续2分钟，b.58℃持续5分钟，c.被动冷却至环境温度(约20-26℃)持续15分钟。
去除反应混合物，并用50μL RPA洗涤缓冲液洗涤芯片两次。使用氮枪干燥芯片，然后使用配备有过滤器的荧光显微镜成像，从而使得能够特异性检测Alexa488、Cy3和Cy5荧光团。
结果和结论
具有各合成DNA模板的106、107或108个起始拷贝的3个单独芯片的荧光显微镜图像显示扩增的靶DNA的斑块，可通过三种荧光团颜色区分(图53)。总之，SM-RPA在短短25分钟的扩增时间内就在半导体芯片表面上产生了克隆的、“可测序”的扩增产物。
K.使用滚环扩增(RCA)对靶核酸进行孔内扩增
寡聚体
使用具有以下序列的两个固定的引物(均购自ATDBio)进行孔内扩增：
DBCO_A10H1_Li-dev[1]_R/SplintXL(SEQ ID No.167):
5'-DBCO-AAAAAAAAAA-isp18-GCTCGAATCAGTCCTGTCAGTCT*T*T*T-3'
DBCO_A10H1_dev[1]-F(SEQ ID No.168):
5'-DBCO-AAAAAAAAAA-isp18-TCCGCGGGAGCTTCAACAT*C*G*C*G-3'
(对于两种寡聚体，5'-DBCO＝5'-末端二苯并环辛基，iSp18＝六乙二醇(HEG)内部间隔子和*＝硫代磷酸酯保护)
使用代表来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的D-丙氨酸-D-丙氨酸连接酶基因(ddl)和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的Qin原噬菌体蛋白YdfU基因(ydfU)的合成DNA模板(购自IDT Technologies)，各自具有以下序列(包括带下划线的衔接子序列)：
ddl模板(SEQ ID No.169):
ydfU模板(SEQ ID No.170):
合成DNA探针(购自IDT Technologies)用于检测来自上述模板的扩增产物，各个扩增产物具有以下序列：
ddl探针(SEQ ID No.171):
5'-Cy5-CAACGATTGCTCGAGAATCAT-3'(5'-Cy5＝5'-末端Cy5荧光团)
ydfU探针(SEQ ID No.172):
5'-Cy3-TGCGGGTATTACTTAGACCTGTTC-3'(5'-Cy3＝5'-末端Cy3荧光团)
半导体芯片
使用标准CMOS方法制造本实施例中使用的DNAe半导体芯片，并包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器阵列，其电压输出响应于IC上方孔中驻留的流体溶液中pH的变化。这些孔是微米尺寸的，并且通过标准的光刻工艺生产。将定制的流动池装置安装在IC和孔组件的顶部，以便于在芯片表面上输送流体。通过首先用丙烯酰胺基聚合物涂层活化孔表面，然后使用标准点击化学共价连接5'修饰的寡核苷酸，将寡核苷酸偶联到孔表面。
缓冲液/试剂制备
根据表28中所示的配方制备“10X RCA退火缓冲液”。
表28
试剂 供应商(目录编号) 储液浓度 最终浓度 每10mL
Tris-HCL pH 7.5 ThermoFisher 1000mM 500mM 5mL
MgCl2 Sigma 1000mM 150mM 1.5mL
NaCl Sigma 5000mM 1200mM 2.4mL
吐温20 Sigma 100％ 0.1％ 0.01mL
水 Sigma - - 1.09mL
方案/反应条件
用1X RCA退火缓冲液冲洗流动池两次。
将1X RCA退火缓冲液中的合成DNA模板以25μL的体积上样到流动池中。在该实施例中，对于每个反应，各靶标以5x107和5x108拷贝测试ddl和YdfU的等摩尔混合物。
使用表29中所示的以下热程序，使DNA模板与固定在孔表面上的反向引物(DBCO_A10H1_Li-dev[1]_R/SplintXL)退火。
表29
去除溶液，并用50μL RCA洗涤缓冲液(37.5mM Tris-HCl pH 7.5、10mM MgCl2、50mM KCl、2mM(NH4)2SO4)洗涤芯片两次。
根据表30中所示的配方，在Eppendorf微量离心管中制备“连接混合物”。
表30
试剂 供应商(目录编号) 储液 最终浓度 每25μL反应
水 Sigma - - 21.25μL
T4连接酶缓冲液 NEB 10X 1X 2.50μL
T4连接酶 NEB 2000U/μL 100U/μL 1.25μL
将25μL的连接混合物上样到芯片上，并在22℃孵育30分钟。去除溶液，并用50μLRCA洗涤缓冲液洗涤芯片两次。
根据表31中所示的配方，在Eppendorf微量离心管中制备“扩增混合物”。
表31
将25μL扩增混合物上样到芯片上，并在45℃孵育2小时。将溶液从芯片中取出，通过添加25μL“灭活混合物”(50mM Tris-HCl pH 7.5，50mM EDTA)并使用移液器上下操作两次来灭活反应。去除溶液，并用50μL RCA洗涤缓冲液洗涤芯片两次。
通过将25μL的20mM NaOH上样到芯片中并在环境温度(约20℃-26℃)下孵育5分钟，使扩增材料的链变性。去除NaOH溶液，并用50μL RCA洗涤缓冲液洗涤芯片两次。
然后制备含有1X RCA退火缓冲液和1μM上述004所述ddl和ydfU荧光标记探针的探针溶液。然后将25微升的这种溶液上样到芯片上，并使用以下热程序使探针退火与它们各自的靶标(如果存在的话)退火：
a.95℃持续2分钟，b.54℃持续15分钟，c.被动冷却至环境温度(约20-26℃)持续15分钟。
除去反应混合物，并用50μL RCA洗涤缓冲液洗涤芯片两次。使用氮枪干燥芯片，然后使用配备有能够特异性检测Cy3和Cy5荧光团的过滤器的荧光显微镜成像。
结果和结论
等摩尔双链支化表面相RCA测定的荧光显微镜图像显示，对于两个靶标中的各个靶标，扩增的靶DNA的离散簇可通过两个不同的荧光团区分(图54)。簇的密度取决于靶拷贝数输入。总之，支化表面相RCA在2小时的扩增时间内在半导体芯片表面产生了克隆的、“可测序”的扩增产物。
L.直接固定在芯片表面上的合成模板的测序
寡聚体
使用具有如下序列的固定在孔表面的合成DNA模板(Oligo 1；ATDBio)和与模板3'区域互补的测序引物(Oligo2；IDT)(Oligo-1中带下划线的核苷酸)进行测序：
Oligo 1(SEQ ID No.173):
(5'-DBCO＝5'-末端二苯并环辛基；下划线区域表示测序引物结合位点；非下划线区域是SARS-CoV-2的N基因的一部分)
Oligo 2(SEQ ID No.174):5'-GCCGACTAGATCCTCTG-3'(测序引物)
半导体芯片
使用标准CMOS方法制造本实施例中使用的DNAe半导体芯片，并包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器阵列，其电压输出响应于IC上方孔中驻留的流体溶液中pH的变化。这些孔是微米尺寸的，并且通过标准的光刻工艺生产。将定制的流动池装置安装在IC和孔组件的顶部，以便于在芯片表面上输送流体。通过首先用丙烯酰胺基聚合物涂层活化孔表面，然后使用标准点击化学共价连接5'修饰的寡核苷酸，将寡核苷酸偶联到孔表面。
缓冲液/试剂制备
使用去离子水(18MΩ；Merck Millipore)、1M氯化镁溶液、5M氯化钠溶液和TERGITOL NP-9(纯；Merck)在玻璃瓶中制备“测序溶液”(7.5mM MgCl2、200mM NaCl、0.02％TERGITOL NP-9)。简言之，将MgCl2和NaCl储备溶液加入去离子水中，分别产生7.5mM和200mM的最终浓度。加入磁力搅拌棒，并使用磁力搅拌板将溶液混合至均匀。通过将氮气供应管放置在瓶中(确保管到达底部)，用氮气(最低99.998％的氮气；BOC部件#44-W)对溶液进行鼓泡，氮气通过溶液鼓泡持续10分钟，从而确保去除溶解的二氧化碳。此后，将氮的供应保持在溶液上方以确保其保持不含CO2。使用外置活塞式移液器添加250μl TERGITOLNP-9，得到0.02％的最终浓度。将混合物(在氮气下)再搅拌10分钟以完全溶解TERGITOL。
通过将12.5μL所选核苷酸(Fisher Scientific，11843933)的100mM储液加入125mL测序溶液中，制备各单独天然核苷酸(dGTP、dCTP、dATP、dTTP)的10μM溶液。使用10mMNaOH(由10M NaOH储液制备；Merck，72068)、使用pH探针(Sentron SIMicroFET(92270-010))将各dNTP溶液的pH滴定至pH 8.05±0.01。所有dNTP溶液均是在无CO2、氮控制的环境中，通过使用磁力搅拌棒进行混合而制备的。
在无CO2、氮控制的环境中，使用磁力搅拌棒进行混合，通过使用10mM NaOH(由10MNaOH储液制备；Merck，72068)、使用pH探针(Sentron SIMicroFET(92270-010))将测序溶液的pH滴定至8.05±0.01而制备“洗涤溶液”。
1X退火缓冲液是通过使用分子级水(Sigma)将20倍的盐酸钠柠檬酸缓冲液(LifeTechnologies)的储液稀释至150mM NaCl和15mM柠檬酸钠的最终1X浓度来制备的。
通过将1.25μL Oligo 2(100μM储液)加入5μL 1X退火缓冲液中从而得到在0.8X退火缓冲液中的5μM测序引物的最终组合物，由此制备5μM Oligo 2(测序引物)的工作溶液。
通过在79μL测序溶液中以2kU/μL稀释1μL IsoPol BST+DNA聚合酶(ArcticZymes，定制制剂)，制备25.4U/μL“测序酶”工作储液(见上文制备详述)。通过上下移取20μL体积的溶液10次，将溶液充分混合。
方案/反应条件
用1x ThermoPol缓冲液[4.5mL 10X ThermoPol缓冲液(New England Biolabs)、27μL吐温20(100％储液，Merck Life Science，P9416)、40.5mL分子级水(Sigma)]冲洗流动池两次。
将测序引物(退火缓冲液中的5μM Oligo 2；参见上文的制备详述)上样到流动池中。流动池的入口和出口用定制的塞子密封，并使用以下热程序使引物与固定的模板(Oligo 1)退火：
a.95℃持续120秒，b.90℃持续30秒，c.85℃持续30秒，d.80℃持续30秒，e.78℃持续120秒，
f.以每30秒1℃的速率从77℃降温至64℃(含端值)，g.63℃持续120秒，h.以每30秒1℃的速率从62℃降温至59℃(含端值)，i.58℃持续15分钟，j.被动冷却至环境温度(约20-26℃)持续2分钟。
然后用200μL 1X ThermoPol缓冲液洗涤流动池，以去除任何多余的引物。
将测序酶(25U/μL IsoPol BST+；参见上文的制备详述)上样到流动池中，并在环境温度(约20-26℃)下孵育10分钟。用200μL 1x ThermoPol缓冲液冲洗流动池。
进行引发步骤(priming step)，其中洗涤溶液以5mL/min的速率流过芯片。通过以增加的电压阶跃偏置参比电极来进行电响应测试。使用通过IC上的ISFET测量的mV输出的结果变化确定参比电极电势和在ISFET上看到的相应电势之间的关系，然后将其用于确定实验的最佳参比电极电势。
然后一个循环接一个循环地进行测序。在各个测序循环中，依次将4个单独的dNTP溶液(每个10μM；见上文的制备详述)各自冲洗流过芯片(对于各核苷酸15秒@5ml/min)，用洗涤步骤分离各核苷酸流。洗涤步骤分两个阶段进行：1)“直通洗涤(through-wash)”以从流体通道和流动池中冲洗核苷酸溶液，以及2)吹扫洗涤，其中洗涤通道绕过核苷酸阀装置(nucleotide valving apparatus)以洗涤芯片，同时下一个核苷酸溶液通过吹扫通道被引导至废物容器。当引入核苷酸时，随后的质子释放被集成电路检测为电压变化。
测序完成后，使用内部专有算法对数据进行分析，用于碱基调用和生物信息学分析。
结果和结论
从固定的合成模板获得的测序结果如图55所示。单个reads(测序片段)在x轴上绘制为比对读长(ARL；从开始到结束位置的总比对长度)与比对读长-错误(ARL-e；从开始至结束位置的总体比对长度减去y轴上的错误数)。没有错误的read将位于对角线虚线上，其中ARL-e＝ARL。完美全长(56bp)read在图上的位置由十字准线符号表示。图55中所示的直方图部分表示reads在不同轴上的分布。图顶部的直方图表示reads沿x轴的分布，即ARL(bp)；图右侧的直方图表示reads沿y轴的分布，即ARL-e(bp)。在这个实施例中，reads的总数是5899。获得的ARL-e的中位数为54bp。共有read的比对长度为56个碱基，错误率为0％(表32)。这些数据表明，系统能够对固定的模板进行测序。
表32
M.使用直接杂交方法对合成模板进行测序
寡聚体
使用具有以下序列的溶液相模板(Oligo 3；IDT)和与模板的3'区(Oligo 3中带下划线的核苷酸)互补的固定在孔表面上的引物(Oligo 4；ATDBio)进行直接杂交，然后进行测序方法：
Oligo 3(SEQ ID No.175):
Oligo 4(SEQ ID No.176):
5'-DBCO-CCGTTGACGTCATCCCCACCT-3'(5'-DBCO＝5'-末端二苯并环辛基)
半导体芯片
使用标准CMOS方法制造本实施例中使用的DNAe半导体芯片，并包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器阵列，其电压输出响应于IC上方孔中驻留的流体溶液中pH的变化。这些孔是微米尺寸的，并且通过标准的光刻工艺生产。将定制的流动池装置安装在IC和孔组件的顶部，以便于在芯片表面上输送流体。通过首先用丙烯酰胺基聚合物涂层活化孔表面，然后使用标准点击化学共价连接5'修饰的寡核苷酸，将寡核苷酸偶联到孔表面。
缓冲液/试剂制备
所有缓冲液/试剂均按上述实施例中所述制备(Oligo 2工作溶液除外，其未用于本实验)。
通过将0.5μL Oligo 3(100μM储液)加入99.5μL 1X退火缓冲液中，制备0.5μM合成DNA模板(Oligo 3)工作溶液。
方案/反应条件
将合成DNA模板(退火缓冲液中的0.5μM Oligo 3；参见上文的制备详述)上样到流动池中。流动池的入口和出口用定制的塞子密封，并使用以下热程序使模板与固定的引物(Oligo 4)退火：
a.95℃持续120秒，b.90℃持续30秒，c.85℃持续30秒，d.80℃持续30秒，e.78℃持续120秒，f.以每30秒1℃的速率从77℃降温至64℃(含端值)，g.63℃持续120秒，h.以每30秒1℃的速率从62℃降温至59℃(含端值)，i.58℃持续15分钟，j.被动冷却至环境温度(20-26℃)持续2分钟。
如前述工作实施例中所述进行随后的步骤(添加测序酶、引发步骤、电响应测试、测序和分析)。
结果和结论
从与固定的引物杂交的溶液中合成模板(即直接杂交法)获得的测序结果如图56所示。单个reads绘制为x轴上的ARL与y轴上的ARS-e(参见上面实施例中对ARL和ARL-x的定义)。没有错误的read将位于对角线虚线上，其中ALR-e＝ARL。完美全长(91bp)reads在图上的位置由十字准线符号表示。图56中所示的直方图部分表示reads在不同轴上的分布。图顶部的直方图表示reads沿x轴的分布，即ARL(bp)；图右侧的直方图表示reads沿y轴的分布，即ARL-e(bp)。在这个实施例中，reads的总数是3829。获得的ARL-e的中位数为85bp。共有reads的比对长度为97个碱基，错误率为8.25％(表33)。这些数据表明，系统能够对与固定的引物杂交的模板进行测序。
表33
两个序列之间的符号表示以下内容：|＝完全匹配，>＝缺失，<＝插入，*＝不匹配。
N.使用孔内克隆扩增产生的模板的测序
寡聚体
使用以下寡聚体进行孔内克隆扩增：
Oligo W(待扩增的溶液相模板)(SEQ ID No.177):
Oligo X(表面相扩增引物)(SEQ ID No.178):
(5'-DBCO＝5'-末端二苯并环辛基)
Oligo Y(液相扩增引物)(SEQ ID No.179):
Oligo Z(溶液相测序引物)(SEQ ID No.180):
Oligo Y＝溶液相扩增引物；Oligo Z＝溶液相测序引物
半导体芯片
使用标准CMOS方法制造本实施例中使用的DNAe半导体芯片，包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器阵列，其电压输出响应于IC上方孔中驻留的流体溶液中pH的变化。这些孔是微米尺寸的，并且通过标准的光刻工艺生产。将定制的流动池装置安装在IC和孔组件的顶部，以便于在芯片表面上输送流体。通过首先用丙烯酰胺基聚合物涂层活化孔表面，然后使用标准点击化学共价连接5'修饰的寡核苷酸，将寡核苷酸偶联到孔表面。
缓冲液/试剂制备
所有缓冲液/试剂均按如下所述进行制备。
使用去离子水(18MΩ；Merck Millipore)、1M氯化镁溶液、5M氯化钠溶液和TERGITOL NP-9(纯；Merck)在玻璃瓶中制备“测序溶液”(5mM MgCl2、20mM NaCl、0.025％TERGITOL NP-9)。简言之，将MgCl2和NaCl储备溶液加入去离子水中，分别产生5mM和20mM的最终浓度。加入磁力搅拌棒，并使用磁力搅拌板将溶液混合至均匀。通过将氮气供应管放置在瓶中(确保管到达底部)，用氮气(最低99.998％的氮气；BOC部件#44-W)对溶液进行鼓泡，氮气通过溶液鼓泡持续10分钟，从而确保去除溶解的二氧化碳。此后，将氮的供应保持在溶液上方以确保其保持不含CO2。使用外置活塞式移液器添加250μl TERGITOL NP-9，得到的最终浓度为0.025％。将混合物(在氮气下)再搅拌10分钟以完全溶解TERGITOL。
通过向125mL测序溶液中加入12.5μL所选核苷酸的100mM储液(FisherScientific，11843933)，制备各种单独天然核苷酸(dGTP、dCTP、dATP、dTTP)的10μM溶液。使用pH探针(Sentron SIMicroFET(92270-010))、使用10mM NaOH(由10M NaOH储液制备；Merck，72068)将各个dNTP溶液的pH滴定至pH 8.00±0.01。所有dNTP溶液都是在无CO2、氮控制的环境中，通过使用磁力搅拌棒进行混合而制备的。
在无CO2、氮控制的环境中，使用磁力搅拌棒进行混合，通过使用pH探针(SentronSIMicroFET(92270-010))、使用10mM NaOH(由10M NaOH储液制备；Merck，72068)滴定测序溶液的pH至8.00±0.01，从而制备“洗涤溶液”。
根据以下配方制备“1x ThermoPol缓冲液”：4.5mL 10X ThermoPol缓冲液(NewEngland Biolabs)、27μL吐温20(纯，Merck Life Science，P9416)、40.5mL分子级水(Sigma)。
根据以下配方制备“5x退火缓冲液”：在分子级水中，10mM Tris pH 7.5(LifeTechnologies，15567)、25mM乙酸镁(Merck Life Sciences，63052)、750mM NaCl、0.05％吐温20、25％ DMSO(Merck LifeScience，D8418)。
通过将1.25μL Oligo 2(100μM储液)添加到用18.75μL分子级水稀释的5μL 5X退火缓冲液中以得到在1X退火缓冲液中的5μM测序引物的最终组合物，制备Oligo Z(测序引物)的5μM工作溶液。
通过在79μL 1X ThermoPol缓冲液中以2,000U/μL稀释1μL Bst大片段DNA聚合酶(New England Biolabs，定制制剂)，制备25U/μL“测序酶”的工作储液。通过上下移取20μL体积的溶液10次，将溶液充分混合。
方案/反应条件
使用如实施例F中所述的SM-RPA方法进行对向链(opposing strand)的克隆扩增和去杂交。
用1x ThermoPol缓冲液冲洗流动池两次。
将测序引物(退火缓冲液中的5μM Oligo Z；参见上文的制备详述)上样到流动池中。流动池的入口和出口用定制的塞子密封，并使用以下热程序使引物与扩增的模板退火：
a.95℃持续2分钟，b.58℃持续5分钟，c.被动冷却至环境温度(约20-26℃)持续15分钟。
然后用200μL 1X ThermoPol缓冲液洗涤流动池，以去除任何多余的引物。
将测序酶(25U/μL Bst大片段；参见上文的制备详述)上样到流动池中，并在环境温度(约20-26℃)下孵育10分钟。用200μL 1x ThermoPol缓冲液冲洗流动池，测序基本上如实施例H所述进行。
结果和结论
由芯片上单个ISFET得到的测序结果如表34所示。将reads与参比序列(REF)比对，两个序列之间的符号代表以下内容：|＝完全匹配，>＝缺失，<＝插入，*＝不匹配。这些数据表明，系统能够对通过公开的孔内克隆扩增方法产生的模板进行测序。
表34
O.对加标至全血的病原体进行自动样本到应答测序
细菌靶生物体
屎肠球菌(Enterococcus faecalis)，ATCC菌株BAA2318TM；含有抗微生物药物耐药性(AMR)基因万古霉素A+(vanA+)
寡聚体
特异性靶捕获(STC)寡聚体(IDT Technologies)(见下表35)
表35
在第一聚合酶链式反应(PCR1)中，使用以下引物扩增指定的各靶标：
P1(SEQ ID No.25)TGTAGCGGTGAAATGCGYAGA
P1(SEQ ID No.26)CGGTCGACTTAACGCGTTAGCT
P1(SEQ ID No.27)CGGAGTGCTTAATGCGTTWGCT
P2(SEQ ID No.28)CGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTG
P2(SEQ ID No.29)CCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTG
P2(SEQ ID No.30)GGGACTTAACCCAACATYTCAC
P3(SEQ ID No.35)CGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGG
P3(SEQ ID No.36)CACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGG
P3(SEQ ID No.37)TGTGTAGCCCTGGTCGTAAGG
P3(SEQ ID No.38)TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT
P3(SEQ ID No.39)CGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT
P4(SEQ ID No.46)ACACAGGTCTCTGCTAAACCGTAAG
P4(SEQ ID No.47)ACACAGGTCTCTGCAAAATCGTAAG
P4(SEQ ID No.48)ACACAGCACTGTGCAAACACGAAAG
P4(SEQ ID No.49)TACCCGACAAGGAATTTCGCTACC
P25(SEQ ID No.50)TGGCAGCTTCACTTTCTCTTGC
P25(SEQ ID No.51)CCAGCTCCAATCACACCAACA
P29(SEQ ID No.31)CCTGGCTCAGAATGAACGCT
P29(SEQ ID No.32)CCTGGCTCAGGACGAACGCT
P29(SEQ ID No.33)GAGTCTGGACCGTGTCTCAGT
P29(SEQ ID No.34)GAGTCTGGGCCGTGTCTCAGT
P30(SEQ ID No.40)CTCCTACGGGAGGCAGCAGT
P30(SEQ ID No.41)CCTCCGTATTACCGCGGCTG
P31(SEQ ID No.42)GAAAGACCCCGTGAACCTTTACT
P31(SEQ ID No.43)GAAAGACCCCGTGGAGCTTTACT
P31(SEQ ID No.44)CCTTCGTGCTCCTCCGTTAC
P31(SEQ ID No.45)CCTTTGAGCGCCTCCGTTAC
P28(SEQ ID No.54)AACCATTCGCTAAACTCGAACAGG
P28(SEQ ID No.55)CCTTGAATGAGCTGCACAGTGG
P40(SEQ ID No.70)CATGAAAAATGATTATGGCTCAGGTAC
P40(SEQ ID No.71)TGGAACTTGTTGAGCAGAGGTTC
P41(SEQ ID No.72)GGCTGCGATATTCAAAGCTCAG
P41(SEQ ID No.73)CTGAACGCGCCGGCTTAAC
P48(SEQ ID No.80)CGGCARCCGTCACGCTGT
P48(SEQ ID No.81)CATCAGCACGATAAAGTATTTGCGA
在第二聚合酶链式反应(PCR2)中，使用以下嵌套引物扩增指定的各靶标：
这些靶标的芯片表面结合引物如下：
P41(vanA)(SEQ ID No.126)：5’-GTAGCTGCCACCGGCCTAT-3’
样本制备、文库制备和测序盒的缓冲液/试剂制备和填充制备表36-38中所示的试剂，然后将其分别装载到在所提到的室中的样本制备、文库制备和测序盒上(参见图22、25、27C和30)。
表36
表37
表38
方案/反应条件
将500个含有vanA+基因的屎肠球菌集落形成单位(CFU)加标至10mL真空采血管中的5mL全血中。在密封人造的加标血液样本真空采血管后，抽取1mL空气以产生负压。在盒中使用18G针(Becton Dickinson)刺穿真空采血管的橡胶塞。
通过从大气中抽吸5mL空气并分配到真空采血管(VT)中，将加标的全血样本从VT转移到裂解缓冲室，然后重复一次，总加压体积为10mL空气。压力达到7psi。将盒通入大气30秒，以使VT中的血液从VT内部产生的局部高压自然排出至样本制备旋转阀1(SP-RV1)中的大气压。从VT中抽取1毫升，以尽抽吸可能多的体积，然后将SP-RV中的所有血液体积分配到裂解缓冲室中。在VT中有5mL血液的情况下，从该第一加压中排出约3-4mL。VT转移步骤进行了两次，从而按照相同的程序收集剩余的血液体积；用10mL空气加压，被动排放到SP-RV1中，并将该体积分配到裂解缓冲室中。
使用湍流混合使样本均化，以使血液在裂解缓冲室和裂解溢流室之间来回移动。抽吸整个样本(缓冲液和血液)并以50mL/分钟的速率分配，使其平衡10秒，然后再重复四次该过程，以样本在裂解缓冲室中结束。
在裂解缓冲室中，使用圆柱形电阻加热器加热样本并激活蛋白酶K(Pro K)。将加热器设置在110℃下10分钟(在该步骤的持续时间内，样本温度没有超过60℃)。
通过将样本从裂解缓冲室抽吸到SP-RV1中并将其分配到ML翅片中的ML室(其中包含锆珠)中来移动样本。使用以8000RPM旋转的叶轮将样本和珠混合2.5分钟，使得病原体细胞裂解。
使用SP-RV1，将样本移至裂解缓冲室，然后移入样本制备Mag-Sep翅片(位于矩形电阻加热器顶部的盒内的蛇形管线)。样本以0.45mL/分钟的流速通过蛇形管线并进入STC-Hyb 1缓冲室。样本在95℃孵育(加热器设置在110℃以计入热量损失)，使其通过该管线，使得在上述裂解步骤中从细胞释放的dsDNA变性。
STC寡聚体退火-然后将样本转移到STC Hyb 1缓冲室中，在STC Hyb 1缓冲室中快速冷却至25-30℃。然后将其转移到裂解缓冲室(包含STC寡聚体；预热至60℃)，并在60℃孵育30分钟，使得STC寡聚体与其靶DNA位点退火。
从裂解缓冲室抽吸1毫升样本，并将其分配到STC捕获珠室(包括顺磁性链霉亲和素珠)中。通过以10mL/分钟的速率将1mL样本部分从SP-RV1抽吸/分配到STC捕获珠室，将珠重悬并混合。这又重复一次。
将STC捕获珠室中的均化样本转移到裂解缓冲室，在裂解缓冲室中通过使用SP-RV1从一个室抽吸并分配到另一个室，将其与全样本体积重新引入。
通过(使用SP-RV1)以30mL/分钟的速率将4mL样本吸出和分配回到裂解缓冲室中以产生湍流混合，混合整个样本体积(在45℃的样本温度下进行)。重复14次，以确保珠完全分散在整个样本中，使得捕获寡聚体/靶复合物与链霉亲和素顺磁颗粒结合。
孵育后，将样本和磁珠吸入SP-RV1中，并分配到样本制备Mag-Sep翅片中。将四个N52级钕磁体(K&J Magnets,Inc.；以交替极性取向，垂直于蛇形通道)的阵列用带弹簧的端效应器压到盒顶表面上的膜上，从而从悬浮液中收集顺磁珠。
通过将Wash-S缓冲液抽吸到SP-RV1中，然后在四个磁体仍然对接的情况下以2mL/分钟的速率通过翅片分配而对珠进行洗涤(从而从翅片通道中去除样本废物)。然后使得磁体脱离，并将珠重悬于200μL的Wash-S缓冲液中。抽吸并分配100微升空气4次，以使样本整个珠捕获区域来回移动，以清洁珠上仍粘附在磁珠上的任何剩余样本废物。重新对接磁体以重新捕获珠，然后以2mL/分钟的速率推动另一份200μL的Wash-S缓冲液通过翅片。
基本上如所述重复上述步骤，不同之处在于用Wash-T缓冲液代替Wash-S缓冲液。
磁体回缩，从STC洗脱室抽取100μL洗脱缓冲液，并将其分配到样本制备Mag-Sep翅片中。抽吸少量空气(150μL)并将其分配到样本制备Mag-Sep翅片中。在捕获珠的区域重复进行此操作。重悬后，打开翅片加热器，并将其设定在110℃的温度下3分钟，以从珠中洗脱靶DNA(内部样本温度达到75℃)。
重新对接磁体以重新捕获珠，将洗脱的DNA(洗出液(eluate))留在溶液中。
使用约85μL的洗出液将冻干的PCR1试剂重悬在PCR1试剂室内。将所得样本从所述室抽吸并分配到PCR1-lyo室中。然后将该室加压至27psi以将样本推入热区域(图25中的PCR 1)，并使用以下四步热程序进行PCR扩增(PCR1)，其中步骤b、c和d按顺序重复进行25个循环：
a.98℃持续30秒(初始变性步骤)，b.98℃持续5秒(变性步骤)，c.58℃持续25秒(退火步骤)，d.72℃持续45秒(延伸步骤)。
PCR1完成后，抽吸样本并将其分配到PCR1产物室中。然后从该室中取出20微升并分配到PCR1稀释室中，该稀释室预先填充有3.98mL水(Invitrogen；超纯蒸馏水，不含DNase和RNase)(200倍稀释)和BSA(2mg/mL；Calbiochem；白蛋白，牛血清，第五组分，不含脂肪酸，不含核酸酶和蛋白酶)。然后通过从PCR1稀释室来回抽吸和分配2mL空气来混合样本。混合后，将总计250μL的稀释材料转移到PCR2试剂室中。
通过从PCR1/CC RV抽吸并分配200μL到PCR2试剂室来混合样本，然后抽吸并分配125μL到PCR1-lyo室并加压到27psi，然后抽吸并分配165μL到衔接子添加室并加压至27psi，并使用以下四步热法进行PCR扩增(PCR2)，其中步骤f、g和h按顺序重复进行40个循环：
a.98℃持续30秒(初始变性步骤)，b.98℃持续5秒(变性步骤)，c.58℃持续25秒(退火步骤)，d.72℃持续45秒(延伸步骤)。
从PCR 1和衔接子添加室抽吸样本，并将其分配到Hyb室，在Hyb室中将样本与预装载的Sav-MyOne C1珠结合。将样本在环境温度(约20-26℃)下孵育10分钟，并不断混合(从PCR1/CC RV来回抽吸和分配250μL至Hyb室)。用带弹簧的端效应器将四个N52级钕磁体阵列压到盒的顶面。使珠流入文库制备Mag-Sep翅片中，然后对接磁体以固定链霉亲和素珠。
通过使得磁体脱离，使得150μL的洗涤缓冲液流过珠，并通过抽吸/分配空气在翅片内的通道中来回移动而重悬所述珠，从而对珠进行洗涤。然后重新对接磁体，固定珠，并将洗涤缓冲液推到废物室。这个过程重复了三次。
洗涤过程后，通过使得磁体脱离、将60μL的40mM NaOH洗脱缓冲液推入翅片中并等待60秒来重悬珠并洗脱结合的DNA。磁体被重新对接并且珠被固定，将洗脱的DNA留在上清液中。
将消泡剂Y-30加入1L S2洗涤缓冲液中，得到0.0375％的最终浓度。
将四个150mL具45mm盖的传统型聚苯乙烯储瓶(Corning)分别填充100mLS2洗涤缓冲液，将剩余的600mL S2洗涤缓冲液倒入1L瓶中进行洗涤。
将50微升的各dNTP(Thermo Scientific)加入在四个150mL瓶各自中的100mL S2洗涤缓冲液中，使每种核苷酸的最终浓度为50μM。
将250毫升碱石灰添加到碱石灰瓶(500mL)中，碱石灰瓶的金属入口管被推到瓶的底部，以确保空气在碱石灰整体中循环。
将所有的瓶子和锥形管连接到BB3b盒，并将其装入BB3测序子系统中(图30)。
将两微升BST大片段聚合酶(New England BioLabs)与128μL1x ThermoPol缓冲液预混合，并将其添加到BB3a盒的Seq酶室中。
将25微升退火缓冲液预装入BB2输出室中。
将25微升洗脱的DNA(见上文)移液到BB2输出室中，并与预装入的退火缓冲液混合。然后，通过使用测序旋转阀1和选择阀进行抽吸和分配，将其移到芯片上。然后将芯片加压至15psi。
使用如下所示的热程序进行固定的引物的模板杂交：
a.95℃持续2分钟，b.芯片减压，c.68℃持续5分钟，d.63℃持续5分钟，e.58℃持续5分钟，
f.53℃持续5分钟，g.48℃持续5分钟，h.43℃持续5分钟。
在杂交步骤的同时，使用10mM NaOH将含有dNTP的150mL瓶和1L洗涤瓶滴定至pH8.00±0.01。
一旦杂交完成，将芯片设置为25℃，并用1x ThermoPol缓冲液洗涤芯片表面10秒。
将Seq酶室中的130微升试剂推入芯片，然后将芯片加压至12psi以防止气泡形成。将酶孵育2分钟。
打开芯片记录，并启动测序系统。
通过以增加的电压阶跃偏置参比电极来进行电响应测试。使用通过IC上的ISFET测量的mV输出的结果变化确定参比电极电势和在ISFET上看到的相应电势之间的关系，然后将其用于确定实验的最佳参比电极电势。用洗涤缓冲液预处理dNTP管线，芯片洗涤20秒以除去管线中的任何空气。
溶液按以下顺序在芯片表面上顺序流动25个循环：
a.洗涤溶液25秒，b.dTTP溶液10秒，c.洗涤溶液25秒，d.dGTP溶液10秒，e.洗涤溶液25秒，f.dCTP溶液10秒，g.洗涤溶液25秒，h.dATP溶液10秒。
再次洗涤芯片，并关闭芯片记录。
使用用于碱基调用和生物信息学分析的内部专有算法进行分析。
结果和结论
测序结果如图57所示。单独的reads绘制为x轴上的读长(输出read的总长度)(标记为“readLen”)与y轴上的有效读长(ERL；与预期序列的匹配数减去错误数)(标记为“effectiveReadLen”)。没有错误的read将位于对角线虚线上，其中readLen＝ERL。图57中所示的直方图部分表示reads在不同轴上的分布。图顶部的直方图表示reads沿x轴的分布，即读长(bp)；图右侧的直方图表示reads沿y轴的分布，即ERL(bp)。在这个实施例中，reads的总数是1442。在这些reads中，94.3％的ERL>30bp。图57中图下方的图形显示超过1300个或1442个reads与预期靶标比对，因此最终测定调用为vanA。因此，这些数据证明了所公开的系统的如下能力：即，能够通过在基于盒的自动化系统中在短时间内进行样本制备、文库制备、测序以及正确调用加标靶标而处理血液中的加标细菌样本的能力。
P.机械裂解
为了测试与如上所述的盒兼容的机械裂解系统，使用机械裂解子系统对靶生物体进行裂解。制备在15mL锥形管中的3mL血液等分试样的多个平行测定。一些管(样本阳性)中加入了15μL屎肠球菌(ATCC BAA-2318)，浓度为200CFU/μL。一些管(阴性对照)中没有添加样本。然后向各个管中加入1mL裂解缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.0，16.7％(w/v)十二烷基硫酸锂)，然后加入60μL 100％消泡剂Y30、30μL蛋白酶K(20mg/mL)和10μL特异性靶捕获寡核苷酸池(Oligo Pool 38Plex V2.0，DNAe)。将所有管剧烈涡旋30秒，倒置多次，再剧烈涡旋30秒，再倒置多次。将管以700rpm离心15秒，然后在75℃下孵育15分钟(蛋白酶K消化步骤)。
然后使用对照方法在台架上或在ML试机(coupon)(如上所述的与盒兼容的机械裂解子系统)中进行机械裂解，简述如下：1)台架上的对照方法。将来自上述的多个样本阳性管和阴性对照管的内容物转移到含有4g 0.1mm钇稳定氧化锆冲击珠的8mL机械裂解管中。然后将管放置在OmniRuptor Elite(SKU 19-042E)中，并以6.6m/s的速率进行3次90秒启动+20秒停止的循环)。然后将裂解管的内容物转移回其相应的15mL锥形管中。2)ML试机方法。使用10mL注射器将上述多个样本阳性管和阴性对照管的内容物转移到含有4g0.1mm钇稳定氧化锆冲击珠的ML试机中，并使用内部程序进行机械裂解。然后将ML试机的内容物转移回其相应的15mL锥形管中。
对所有样本(台架对照法和ML试机法)进行相同处理。简言之，将所有管在95℃孵育30分钟以使靶核酸变性，然后在60℃孵育40分钟以使特异性靶捕获寡聚体与靶退火。将1200微克链霉亲和素包被的磁珠(DNAe)添加到各个样本中，对管进行涡流处理，然后在45℃用恒定、温和的涡流(1500rpm)孵育10分钟。使用磁体收集珠，并丢弃上清液。通过涡旋将珠重悬于1mL洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，0.01％吐温20)中。将混合物转移到1.5mL管中，使用磁体收集珠并丢弃上清液。这个洗涤过程再重复3次。在最终洗涤后丢弃上清液后，将40μL洗脱缓冲液(与洗涤缓冲液的配方相同)添加到各个管顶部，对管进行涡旋，然后短暂离心，将内容物带到管底部。将所有管在75℃孵育3分钟，涡旋并短暂离心。使用磁力收集珠，并将上清液(即洗脱液(eluent))转移到0.5mL管中。
然后使用定量PCR对所有样本进行如下分析，通常如下：将10μL等分试样的每种洗脱液加入到PCR微量滴定板中的15μL预混合物(0.6μL SuperFi聚合酶、0.4μL dNTP混合物、5μL SuperFi缓冲液、8.2μL水、1μM引物混合物(vanA_PCR2_Fwd:(SEQ ID No.153):TTGTATGGACAAATCGTTGACATACA和vanA_PCR_2Rev(SEQ ID No.204):GTAGCTGCCACCGGCCTAT)和SYBR Green)中。然后在热循环仪中进行PCR(98℃持续30秒，然后进行40个循环：98℃持续5秒和65℃持续25秒)。在运行过程中测定荧光，并确定各个样本的出现时间。
结果如图71所示。数据表明，使用ML试机对血液中屎肠球菌的裂解相当于用台架金标法实现的裂解。使用上述详细方案对革兰氏阴性肺炎克雷伯菌(ATCC BAA-1898)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(ATCC BAA-2094)也获得了类似的结果(数据未显示)。
Q.直接从血液中自动捕获特异性靶
测试如上所述的与盒兼容的特异性靶捕获(STC)子系统或翅片，以评估从全血中提取和分离特异性靶DNA的效力，其结果与直接来自血液特异性靶捕捉过程的台架阳性对照相比较。
将STC子单元(如图69所示)装入固定装置中，然后使用作为内部程序一部分的命令，自动移液器将4mL加标有500份纯化的gDNA肺炎克雷伯菌(CDC AR0068)的血液吸入移液器吸头，然后将移液器吸头对接在密封移液器接口(SPI)端口中，并将血液分配到翅片中。所有移液步骤均能够使用例如如上所述的本发明仪器内的移液器台架自动进行。接下来，使用相同的移液器吸头，将1mL裂解缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 8.0，16.7％(w/v)十二烷基硫酸锂)、80μL 100％消泡剂B(JT-Baker)、50μL蛋白酶K(20mg/mL)和10μL特异性靶捕获寡核苷酸池(pool)分别添加到1.5mL管中，然后将所有4种试剂的混合物吸入移液器吸头并对接在SPI端口中以分配到翅片中。将血液和试剂的混合物置于混合室中，并通过在两个室之间来回将混合物混合至均匀。然后打开热电冷却器(TEC)，将样本在75℃孵育15分钟(蛋白酶K消化步骤)，在此期间继续进行来回混合，以均匀分配热量。利用SPI和移液器吸头，从翅片抽吸/排出样本，并将其分配到含有4g 0.1mm钇稳定氧化锆冲击珠的8mL机械裂解管中。然后将裂解管置于OmniRuptor Elite(SKU 19-042E)中，并以6.6m/s的速率进行3次90秒启动+20秒停止的循环。然后将样本离心以将裂解珠带到管的底部，并将样本通过筛网过滤器转移到5mL管中。使用固定装置上的移液器抽吸样本，并将移液器对接回SPI端口，以将样本转移回混合室。一旦进入混合室，然后TEC打开，并将样本在95℃孵育25分钟(变性步骤)，在此期间继续进行来回混合，以均匀分配热量。然后将样本在60℃孵育32分钟(退火步骤)，再次连续混合。
使用固定移液器和SPI端口将1200微克链霉亲和素包被的磁珠(DNAe)添加到样本中，并将样本在45℃孵育15分钟(与磁珠结合)，再次连续混合。通过将移液器吸头插入SPI端口并抽吸从而排出样本。磁体与蛇形区域对接，样本以0.5ml/min的流速通过，使得能够进行珠的收集和上清液的丢弃。通过使用移液器吸头和SPI端口在蛇形管中进行来回混合，将珠重悬在0.5mL洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，0.01％吐温20)中。使用磁体重新收集混合物中的珠，并丢弃上清液。该洗涤程序再重复1次。在第三次也是最后一次洗涤时，将重悬的珠从混合室蛇形SPI转移到洗脱SPI，用磁体重新捕获珠，并丢弃上清液。将用115μL洗脱缓冲液(与洗涤缓冲液的配方相同)重悬的珠通过洗脱SPI端口添加到翅片中，然后将样本推入洗脱室并在75℃孵育5分钟。将TEC设置为25℃，持续3分钟，以使液体在最终磁性捕获链霉亲和素珠之前冷却。将磁体对接在蛇形管上，收集珠，并使用移液器吸头抽吸上清液(即洗脱液)，然后将其分配到0.5mL管中。
将60微升洗出液(总计约100μL)加入预混合物(10μL SuperFi缓冲液10X，20μL39-plex引物池，1.6μL dNTP混合物(每个核苷酸0.4mM)，2.5μL SuperFi Enzyme@0.05U/μL，1.8μL MgSO4@1.75mM)中。将混合物添加到0.2mL PCR管中，并使用以下条件在AppliedBiosystemsTMVeritiTM96Well Thermal Cycler上循环：95℃持续30秒，然后进行25个循环：95℃持续5秒(变性)，55℃持续10秒(退火)和72℃持续30秒(延伸)。
在PCR后，将样本从热循环仪中取出，通过等分6.25μL样本并加入93.75μL水进行稀释，制备1:80稀释液。将10微升PCR1稀释的产物加入预混合物中(10μL SuperFi缓冲液5X，0.8μL正向引物@1.5nM和0.8μL反向引物@1.5nM，0.8μL dNTP混合物(每个核苷酸0.4mM)，1.3μL SuperFi Enzyme@0.05U/μL，0.9μL MgSO4@1.75mM和0.5μL SYBR Green@1X和25.1μL水)。将混合物添加到0.2mL PCR管中，并使用以下条件在CFX96 Touch Real-TimePCR Detection System上循环：在95℃持续30秒，然后进行40个循环：95℃持续5秒(变性)，55℃持续10秒(退火)和72℃持续30秒(延伸)。
如图72所示，基于盒的STC和台架标准对照之间的结果是可比较的。
R.带盒式PCR系统的自动化嵌套PCR
使用如上所述且如图63和70所示的与盒兼容的PCR子系统，使用PCR系统(A3.0PCR固定装置和PCR翅片)用1000个拷贝的金黄色葡萄球菌(S.aureus)gDNA测试嵌套PCR，该运行由如下组成：一个PCR1反应(39-plex)、稀释步骤(1:80)和10个PCR2反应(各4重)。
用水将金黄色葡萄球菌gDNA储液(127,325拷贝/μl)稀释至最终浓度为10拷贝/μl。总共使用100μl对插入PCR翅片的“lyo袋”中的冻干预混合物进行再水化，该翅片放置在A3.0 PCR固定装置上。使用KeySharp中的命令组合将样本(gDNA和MM)推到热区，以对样本测量、加压并将样本放置在正确的区域进行热循环。所有这些步骤均可以由本发明的仪器经由如上所述的与盒的接口通过气动压力来进行。使用的循环如下，热启动95℃持续60秒，然后是25个循环：95℃持续5秒(变性)，55℃持续10秒(退火)和72℃持续30秒(延伸)。
循环结束后，通过对室减压并抽吸样本来回收样本。通过手动等分15.6μl样本并加入1209.4μl水和25μl BSA对其稀释，进行1:80稀释。
通过仪器抽吸650μl稀释的PCR1样本，并在各个PCR2通道(n＝10)中计量50μl。从盒中去除过量样本，并使用KeySharp中的命令组合将计量样本移动通过含有Master Mix冻干试剂的lyo袋，以加压并将样本放置在热区中，开始热循环，使用的循环程序如下，热启动95℃持续60秒，然后是40个循环：95℃持续5秒(变性)，55℃持续10秒(退火)和72℃持续30秒(延伸)。
在热循环结束时，对室进行减压，并利用公共通道回收样本。回收所有10个反应，并将其汇集在一起，以获得最终的PCR2样本，该样本在Bioanalyzer上进行分析，并与台架阴性样本和台架阳性样本进行比较。
台架阳性样本使用与PCR翅片(如上所述)中使用的相同gDNA浓度和预混合物试剂(冻干形式)。对于阴性对照，用水与预混合物试剂(冻干形式)循环。PCR1和PCR2反应均在CFX Bio-Rad热循环仪上进行，该热循环仪模拟了A3 PCR固定装置上使用的相同循环。
如图73中提供的阳性台架对照、阴性台架对照(NTC)和A3.0PCR系统(AT-401-04)的电泳图叠加所示，在金黄色葡萄球菌(BAAC 2094)的图中观察到所有靶标(10/10)的靶扩增，观察到的峰与下表39中的预期靶标峰匹配：
表39
S.使用具有自动pH调节和CO2去除系统的直接杂交方法对扩增模板进行测序
寡聚体
使用单链DNA模板(Oligo 18和20；ATDBio)进行直接杂交，然后进行测序方法，该单链DNA模板使用与固定在孔表面上的引物杂交的PCR(测序模板1和测序模板2；内部制备)制备。固定的引物分别与测序模板1和2的3'区互补(见下划线部分)。
测序模板1(SEQ ID No.205)：
测序模板2(SEQ ID No.206)：
Oligo 18(SEQ ID No.207)：
5'-DBCO-GCCGTACGAGCTGACGACAG-3'(5'-DBCO＝5'-末端二苯并环辛基)
Oligo 20(SEQ ID No.208)：
5'-DBCO-CCGGGCATGCCTAACACA-3'(5'-DBCO＝5'-末端二苯并环辛基)
半导体芯片
使用标准CMOS方法制造本实施例中使用的DNAe半导体芯片，并包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器阵列，其电压输出响应于IC上方孔中驻留的流体溶液中pH的变化。这些孔是微米尺寸的，并且通过标准的光刻工艺生产。将定制的流动池装置安装在IC和孔组件的顶部，以便于在芯片表面上输送流体。通过首先用丙烯酰胺基聚合物涂层活化孔表面，然后使用标准点击化学共价连接5'修饰的寡核苷酸，将寡核苷酸偶联到孔表面。
方案/反应条件
简言之，扩增测序模板的制备包括以下步骤：PCR1；从PCR1纯化产物；PCR2；PCR2产物的捕获和单链DNA产物的洗脱。
PCR1方案
寡核苷酸详细描述如表40所示
表40
100μL PCR1预混合物(1X Platinum SuperFi PCR预混合物(Thermo Fisher)；1μMOligo 1(Integrated DNA Technologies(IDT))；1μM Oligo 2(IDT)；1μM Oligo 3(IDT)；3000拷贝DNA模板(IDT)；PCR级水)按照以下条件进行热循环(Mastercycler 50S，Eppendorf)：98℃持续5分钟，1个循环；98℃持续10秒，2个循环；68℃持续2分钟和72℃持续30秒；随后72℃持续2分钟。
PCR1纯化方案
用AMPure XP Beads(Beckman Coulter)如下纯化PCR1产物。将100μL的PCR1产物添加到150μL的AMPure珠中。将混合物涡旋并在室温下孵育5分钟并重复。然后将管放置在DynaMag磁体上5分钟，并丢弃上清液。带有颗粒珠的管保留在DynaMag磁体上，并用150μL80％乙醇洗涤。将洗涤过的珠在室温(20-22℃)下孵育30秒。再次丢弃上清液，并如上所述重复乙醇洗涤。去除乙醇上清液，然后将管留在DynaMag磁体上以空气干燥珠5分钟。将管从磁体中取出，并将54μL的TE pH 8.0低EDTA(AppliChem GmbH)直接添加到颗粒中。然后将混合物充分涡旋以分散珠，然后孵育5分钟并短暂离心以收集内容物。将管放置在磁力架上并再孵育2分钟。然后将50μL纯化的PCR产物转移到PCR2反应管中，如下所述。
PCR2方案
寡核苷酸详细描述如表41所示。
表41
如前所述制备的来自PCR1的PCR产物用作PCR2的输入模板材料。对112μL PCR2预混合物(1X Platinum SuperFi PCR预混合物(ThermoFisher)；1.5μM Oligo 4(IDT)；1.5μMOligo 5(IDT)；1.5μM Oligo 6(IDT)；50μL PCR1产物)按照以下条件进行热循环(Mastercycler 50S，Eppendorf)：98℃持续5分钟，1个循环；然进行以下30个循环：98℃持续15秒，68℃持续15秒和72℃持续30秒；随后72℃持续5分钟。
捕获和洗脱方案
如下进行捕获珠的制备，随后将PCR2产物捕获到珠上并进行单链DNA产物的洗脱。通过以下方法制备捕获珠：将110μL珠洗涤缓冲液(1M NaCl(Sigma-Aldrich)；5mM Tris-HCl(pH 7.5，PanReac)；0.5mM EDTA(Sigma-Aldrich)；0.05％吐温20(Sigma-Aldrich)；1mg/mL BSA(Sigma-Aldrich)；分子级水(Sigma-Aldrich))加入至110μL MyOne C1珠(Thermo Fisher)并涡旋5秒。将管盖上盖子并置于磁力架上。将珠洗涤缓冲液上清液去除、丢弃，并将管从磁架上取下。这一共进行3次。最后，将132μL重悬缓冲液(1.5mM NaCl；10mMTris-HCl(pH 7.5)；1mM EDTA；0.1％吐温20；1mg/mL BSA；分子级水(供应商如上所述))加入到洗涤过的珠中。这种混合物被称为捕获珠。
将110μL捕获珠与110μL PCR2产物在1.5mL管(Eppendorf)中组合。将管在室温下孵育10分钟，同时在旋转器(SB3，Stuart)上连续混合。来自PCR2的PCR产物由双链DNA组成，由于在PCR2反应混合物中使用了生物素标记的正向引物，双链体的单链在5'端被生物素标记(如前所述)。在PCR2产物与捕获珠孵育期间，DNA双链体的生物素标记链与链霉亲和素包被的MyOne C1珠结合。孵育后，将反应管置于磁力架上2分钟。去除上清液并丢弃，通过加入200μL 1X洗涤缓冲液并涡旋5秒洗涤珠。洗涤过程重复3次。将管从磁架上取下，将50μL的40mM NaOH移液到管中，并涡旋5秒以重悬珠。将重悬的珠在室温下孵育1分钟。40mM NaOH的存在使DNA双链体变性，使得生物素标记链保持与链霉亲和素包被的MyOne C1珠结合，而双链体的非生物素标记链解离从而在溶液中变为游离状态。然后将管置于磁力架上2分钟。将含有解离的ssDNA的上清液转移到收集管中，并制备用作测序反应的输入模板。从PCR2制备的用于测序的单链DNA在下文中称为扩增测序模板。在本实施例中使用的测序模板是测序模板1和测序模板2。
测序方案
使用Nanodrop 2000(ThermoFisher)对扩增测序模板的浓度进行定量，并通过添加不含DNA的水将每个样本的DNA总浓度调节至1.1μM。
通过将17.3μL扩增测序模板(1.1μM)加入6.7μL中和缓冲液(0.4M NaCl；75mMTris pH 7；分子级水)中，制备各个DNA模板的0.4μM终浓度。
将含有模板的中和缓冲液上样到如前所述组装在IC上的流动池中。流动池的入口和出口用定制的塞子密封，模板与表面固定的引物退火，与扩增测序材料(Oligo 18和20)互补，使用以下热程序：a)95℃持续120秒，b)90℃持续30秒，c)85℃持续30秒，d)80℃持续30秒，e)78℃持续120秒，f)以每30秒1℃的速率从77℃降温到64℃(含端值)，g)63℃持续120秒，h)以每30秒1℃的速率从62℃降温到59℃(含端值)，i)58℃持续15分钟，j)被动冷却至环境温度(20-26℃)2分钟。测序酶(IsoPol BST+，ArcticZymes)和测序溶液按实施例L中所述配制。
基于芯片的pH调节方案
使用专用的基于芯片的pH调节器(CBA)使用自动过程进行测序溶液(包括含核苷酸的溶液)的pH滴定。自动CBA模块使用IC的mV输出作为pH的相对测量值，采用反馈回路向测序溶液中供入适当体积的0.04mM NaOH，以达到靶pH(pH 8±0.1)。简言之，将参比pH溶液(Tris，pH 8.0)泵送通过IC的表面，并记录mV输出。然后将测序洗涤溶液泵送通过芯片，并记录mV输出。参比溶液和测序洗涤溶液之间mV输出的差值表明需要添加到测序洗涤溶液总体积中的适当NaOH剂量。使用自动注射泵将NaOH剂量添加到测序洗涤溶液的总体积中。重复该过程，直到测序洗涤溶液的mV输出与之前为参比pH溶液记录的mV输出相匹配。然后对各单独核苷酸溶液重复整个过程。
如实施例L所述进行后续步骤(添加测序酶、引发步骤、电响应测试、测序和分析)，以下除外：使用称为“CO2洗涤器”的专有CO2去除装置将测序溶液中的气氛保持为无CO2。简言之，CO2洗涤器使得无需在测序溶液上具有保持惰性气氛的压缩氮源，这是防止测序溶液发生不希望的酸化所必需的。CO2洗涤器采用碱石灰颗粒柱，使用标准设备将空气泵送至该柱上。碱石灰颗粒与大气中的CO2发生反应，将其从空气中去除。
结果和结论
使用直接杂交方法从扩增的模板获得的测序结果如图74所示。单个reads绘制为x轴上的ARL与y轴上的ARS-e(测量单位为碱基对；ARL和ARL-x的定义见上文实施例L)。没有错误的read将位于对角线虚线上，其中ALR-e＝ARL。图顶部的直方图表示reads沿x轴的分布，即ARL(bp)；图右侧的直方图表示reads沿y轴的分布，即ARL-e(bp)。在这个实施例中，reads的总数是6772。ARL-e的中位数为97bp。所示的共有reads具有97个碱基的比对长度，错误率为3.1％(表42)。这些数据表明，系统能够对与固定的引物杂交的模板进行测序。
表42
两个序列之间的符号表示如下：|＝完全匹配，>＝缺失，<＝插入，*＝不匹配；CONS＝共有序列。
T.用缩短的孵育方案从3mL全血中样本制剂靶捕获低拷贝数的细菌基因组
特异性靶捕获(STC)寡聚体
用与靶序列互补的修饰寡聚体从全血中进行特异性靶捕获，所述靶序列含有通过5腺苷(AAAAA)碱基核苷酸接头和用反向dT修饰的3'连接到5'端的生物素。从IDT(Integrated DNA Technologies)订购标准脱盐纯化STC寡聚体，并将其在IDTE缓冲液(IDT)中重构至100微摩尔浓度：
肺炎克雷伯菌菌株中kpc基因靶区的两条链的KPC靶STC寡聚体：KPC_STC_F2(SEQID No.215)：
/5BiosG/AAAAAACCTCGTCGCGGAACCATTCGCTAAACTCGAACAGG/3InvdT/KPC_STC_R2(SEQ ID No.216)：
/5BiosG/AAAAACAGCACAGCGGCAGCAAGAAAGCCCTTGAATGAGCT/3InvdT/
用于金黄色葡萄球菌菌株中mecA基因靶区的两条链的mecA靶STC寡聚体：
mecA_STC_F-INT(SEQ ID No.217)：
/5BiosG/AAAAAAGGTACTGCTATCCACCCTCAAACAGGT/3InvdT/
mecA_STC_R2(SEQ ID No.218)：
/5BiosG/AAAAATTGAGTTGAACCTGGTGAAGTTGTAATCTGG/3InvdT/
细菌靶基因组DNA制备
从CDC(肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1898，KPC+菌株)和ATCC(金黄色葡萄球菌BAA-2094，mecA+菌株)获得的细菌有机体菌株中分离样本制剂中用于捕获的靶基因组DNA。使得菌株储液生长，使用市售的细菌基因组DNA分离试剂盒分离基因组DNA，通过数字PCR对DNA进行定量，并进一步稀释至基因组当量(GE)拷贝。
链霉亲和素珠
用DNAe制造的链霉亲和素接合的顺磁珠通过生物素标记STC寡聚体从全血中捕获靶DNA。
蛋白酶K
使用市售的蛋白酶K酶(Roche/Sigma或Thermo Fisher Scientific)进行细胞裂解和蛋白质消化。
裂解缓冲液的制备
使用含有离子去垢剂的裂解缓冲液进行细胞裂解和蛋白质变性。
洗涤和洗脱缓冲液
洗涤链霉亲和素珠，并使用缓冲液中含有温和低浓度表面活性剂的洗涤和洗脱缓冲液洗脱靶DNA。
全血
全血得自BioIVT供应商。
消泡剂
为了减少样本制备过程中在台架或仪器盒上的泡沫，使用Antifoam B硅乳液(Sigma或J.T.Baker)。
机械裂解珠
对于难以裂解的生物体(如真菌细胞或革兰氏阳性细胞)的细胞裂解，使用极硬密度(VHD)氧化锆珠在OMNI International Bead Ruptor Elite仪器上剪切打开细胞。
样本制备反应设置
通过在室温下组合下表(表43)所示的以下试剂来准备样本制备反应。将反应混合物充分混合。对于台架和仪器盒过程，在5mL螺帽锥形管(Eppendorf，30122348)中准备反应设置。
表43
样本制备方案：通过靶/珠捕获进行裂解
样本制备程序需要几个加热/冷却和孵育步骤，如下表(表44)所示。将3mL血液样本与表1中的组分混合，表1中包括含有离子去垢剂和蛋白酶K的裂解缓冲液。将混合物在75℃孵育5分钟以进行蛋白酶K酶消化，然后使用氧化锆珠机械裂解难以裂解的细胞。
裂解和蛋白质消化完成后，将样本加热至95-100℃10分钟，以使蛋白酶K酶变性，并将双链DNA(dsDNA)转化为单链DNA(ssDNA)形式。
然后在5分钟内将样本从95-100℃逐渐冷却至60℃，以使生物素标记的STC寡聚体与其相应的ssDNA靶杂交。
杂交步骤后，将链霉亲和素顺磁珠加入样本中，并在45℃以1500RPM将样本混合10分钟，以通过生物素标记的STC寡聚体和链霉亲和素接合的顺磁珠之间的强生物素-链霉亲和素相互作用捕获STC寡聚体/靶杂交体以及游离STC寡聚体。
对于台架工艺，在热振荡仪(Benchmark Scientific，H5000-HC)上的5mL加热块(Benchmark Scientific,H5000-5MT)中进行加热/冷却和混合。
对于仪器过程，加热和冷却在盒中进行。
表44
样本制备方案：通过洗脱进行反应清理
珠洗涤
在珠捕获步骤之后，对珠进行清理。将反应管从加热孵育仪器(BenchmarkScientific H5000-HC)中取出，并将管置于5mL管磁力架(Thermo Fisher，Dynamag-5)上5分钟，以将链霉亲和素珠结合的靶DNA/STC寡聚体复合物吸引到管的侧面。在不干扰珠的情况下小心地去除并丢弃反应上清液。随后通过用1mL洗涤和洗脱缓冲液重悬珠来洗涤珠。离开磁力架，对反应管中的珠进行重悬。将重悬的珠转移到1.5mL反应管(Eppendorf，22431021)中。重悬后，将反应管放回磁力架(Thermo Fisher，Dynamag-2)上1分钟。将洗涤溶液上清液去除并丢弃。以与第一次洗涤相同的方式在相同的1.5mL管中再进行三次洗涤，总共洗涤4x 1mL。
靶洗脱
去除最终洗涤液后，将珠重悬于100μL洗涤和洗脱缓冲液中。然后将在1.5mL管中的重悬珠置于含有预热至75℃的1.5mL管加热块(Benchmark Scientific，H5000-CMB)的热振荡器(Benchmark Scientific,H5000-HC)上。通过在75℃孵育管3分钟来洗脱靶DNA。洗脱完成后，将1.5mL反应管移回1.5mL磁力架1分钟。然后将靶DNA洗出液转移到新的1.5mL管中。
样本制备洗出液中的靶DNA检测
使用SuperFi qPCR预混合物、SYBR Green染料和对目的靶区具有特异性的PCR引物，通过嵌套PCR进行样本制备洗出液中的靶DNA检测和定量，所述嵌套PCR具有为定量PCR(qPCR)的最终PCR。首次PCR扩增(PCR1)使用外部PCR引物扩增靶25个循环。使用具有40个扩增循环的内部“嵌套”PCR引物将1:80稀释的PCR1产物添加到第二定量PCR(PCR2)中。靶检测报告为来自PCR2的Cq值，其与无靶标阴性对照样本制备反应进行比较。此外，进行熔解曲线分析以确认qPCR扩增子的身份并排除引物二聚体产物。
表44：PCR1和PCR2引物序列：
结果和结论
定量PCR扩增数据表明，检测到了表45中抗微生物药物耐药性基因靶(mecA和KPC)，表中粗体值表示至少比背景信号高6个Cts，斜体值表示比背景信号高2到3个Cts。对于所进行的两个实验中的每一个，在右侧的PCR1+2和PCR2细胞中标注背景信号(带下划线的值)。
表45
数据还证实，样本制备盒部分不仅可以与台式方法等同进行，而且样本制备足够耐用，缩短了孵育过程步骤(消化、变性和杂交)，并且仍然能够回收并检测在3mL全血输入体积中以极低拷贝水平(9个基因组当量)存在的靶生物体的靶标。
U.盒测定/仪器运行
本文描述了使用图58A-61、63-66、69和70中例举的盒和仪器进行的示例性测定，其中移液器吸头存储在盒上并通过如上所述的台架致动。
各移液器吸头的测定步骤概述：
·吸头1，5mL：通过变性和杂交进行样本输入。
·吸头2，5mL：通过磁珠洗涤进行STC珠捕获。
·吸头3，1mL：通过拷贝控制延伸进行STC洗脱。
·吸头4，1mL：通过上样拷贝控制洗脱液制备另外的拷贝控制试剂。
·吸头5，1mL：通过RCA/RPA洗涤II制备克隆扩增试剂。
·吸头6，1mL：通过测序脱杂交洗涤制备扩增颗粒。
·吸头7，1mL：通过测序酶结合进行测序杂交。
SPI接口概述：
·SPI-V：连接至真空采血管室。
·SPI-ML：连接至机械裂解室。
·SPI-STC：连接至STC室和珠捕获蛇形管。
·SPI-PCR1：连接至PCR1室。
·SPI-AUX：辅助室将用于几个步骤(PCR1和CC稀释，PCR2汇集)。
·SPI-PCR2：连接至通道和室的PCR2网。
·SPI-CC：连接至拷贝控制室。
·SPI-FC：连接至流动池。
步骤#1：酶解和样本回收(Retrieval)
·移液器拾取吸头1(体积1-5mL)。
·吸头1移动到试剂盒上，刺穿在裂解缓冲液上的箔。
·抽吸裂解缓冲液。
·吸头1与SPI-STC(STC室)对接。
·将缓冲液分配到热混合室中，再加上另外的空气以清除入口通道，重新水化位于通道或室内的冻干试剂。
·吸头1与SPI-V(真空采血管)对接。
·通过移液器对真空采血管加压，并确认存在足够的样本。
·将样本吸入移液器吸头中。
·吸头1与SPI-STC对接。
·将样本分配到室中，再加上另外的空气以清除入口通道。
·在热混合室之间或在室和移液器吸头之间来回混合，以确保冻干试剂完全再水化和试剂混合。
·将所有流体推入热混合室。
·通过气动歧管端口在热混合室之间来回混合，同时加热Pro-K孵育。SPI定期推动，使流体保持在STC室中。
步骤#2：机械裂解
·将反应流体吸入吸头1。
·吸头1与SPI-ML(机械裂解室)对接。
·将流体推入ML室，再加上另外的空气以清除入口通道。
·吸头1与SPI-STC对接。
·将剩余的流体吸入吸头1。
·吸头1与SPI-ML(机械裂解室)对接。
·将流体推入ML室，再加上另外的空气以清除入口通道。
·机械裂解电机致动。
步骤#3：变性/杂交
·将反应流体吸入吸头1。
·吸头1与SPI-STC对接。
·将流体分配到热混合室中，再加上另外的空气以清除入口通道。
·在变性温度下孵育时，通过气动歧管端口在热混合室之间来回混合。
·继续来回混合，同时在杂交温度下孵育。SPI定期推动，使流体保持在STC室中。
·吸头1落在固定位置。
步骤#4：珠靶捕获
·移液器装入吸头2。
·吸头2移动到洗涤缓冲液T上方的试剂盒中，并刺穿箔。
·吸头2吸取一定体积的用于再水化磁性靶捕获冻干试剂的缓冲液。
·吸头2移动到磁性靶捕获冻干试剂并刺穿箔。
·将流体分配到冻干试剂袋中，以使珠再水化。
·必要时进行抽吸/分配循环，以确保试剂完全重悬。
·将磁性靶捕获试剂吸入吸头2。
·吸头2与SPI-STC对接。
·将磁性靶捕获试剂分配到热混合室中。
·血液溶液在室和吸头之间来回混合，以悬浮通道中可能丢失的任何珠。溶液最终被推回热混合室。
·在结合温度下孵育时，通过气动歧管端口在热混合室之间来回混合。SPI定期推动，使流体保持在STC室中。
·STC磁体相对于盒蛇形管致动。
·将液体吸入吸头2，珠相对于STC磁体成粒(pelleted)。
·将废液分配到机械裂解室。
步骤#5-6：磁珠洗涤
·重复4次：
ο将吸头2移动到洗涤缓冲液T中。
ο由吸头2抽吸洗涤缓冲液T。
ο吸头2对接SPI-STC。
οSTC磁体与盒脱离。
ο洗涤缓冲液T在移液器吸头和热混合室之间来回混合，以重悬珠。
οSTC磁体相对于盒致动。
ο将废液吸入吸头2，当珠穿过蛇形通道时，它们被压在STC磁体上成粒。
ο吸头2与SPI-ML对接。
ο将废液分配到ML室。
装入PCR1稀释室
·将吸头2移动到试剂盒上，并刺穿在水上的箔。
·将PCR1稀释液吸入吸头2。
·吸头2与SPI-AUX(辅助室)对接。
·将稀释剂分配到室中。
步骤#7：洗脱
·吸头2落在固定位置。
·移液器装入吸头3。
·将吸头3移动到洗涤缓冲液T上方的试剂盒中。
·抽吸洗涤缓冲液T。
·吸头3与SPI-STC对接。
·STC磁体与盒分离。
·在移液器吸头和热混合室之间来回混合洗脱液，以重悬珠。
·将洗脱液和珠推入热混合室。
·在洗脱温度下孵育时，通过气动歧管端口在热混合室之间来回混合洗脱液。SPI的定期推动可能是将流体保持在室中所需的。
·冷却时，通过气动歧管端口在热混合室之间来回混合洗脱液。
·STC磁体与盒对接。
·将STC洗出液吸入吸头3，当珠穿过蛇形通道时，将其相对于STC磁体成粒。
步骤#8：PCR 1包容性(Inclusivity)
·吸头3与SPI-PCR1对接。
·洗出液通过通道分配，使PCR1冻干试剂再水化，同时打开PCR1排气口。
·一旦流体进入反应室，PCR1排气口关闭。
·通过移液器吸头对室加压。
·对TEM进行热循环以进行PCR。
步骤#9：PCR 1稀释
·PCR1室通过移液器减压。
·由吸头3抽吸部分PCR1产物。
·吸头3与SPI-AUX对接。
·将PCR1产物分配到稀释室中。
·将PCR1产物和稀释剂在室和移液器吸头之间来回混合，以均匀稀释。
步骤#10：PCR 2排他性
·吸头3抽吸稀释的PCR1产物。
·吸头3与SPI-PCR2对接。
·将稀释的PCR1产物分配到共用管线通道中。
·在光学传感器和连接到排气管线的气动歧管上的阀控制的帮助下，填充各个计量通道。
·吸入剩余的流体以清除共用管线(旁路通道被排空，所有反应室均被排空并关闭)。
·通过打开排气阀并将流体从计量室抽到反应室，对冻干试剂进行再水化，而上样到反应室。
·吸头3与SPI-ML对接。
·将废液分配到ML室中。
·所有反应室排气口关闭。
·反应室通过旁路通道加压。
·对TEM进行热循环以进行PCR。
·当PCR2热循环发生时：
ο吸头3对接SPI-AUX。
ο吸入未使用的稀释PCR1产物。
ο吸头3对接SPI-ML。
ο将废液分配到ML室中。
ο可发生自动pH滴定(可能需要切换回吸头1或使用新吸头)。
·PCR2反应室通过旁路通道减压。
·吸头3与SPI-PCR2对接。
·将PCR2产物汇集到吸头内。
·吸头3与SPI-AUX对接。
·将PCR2产物分配到室中。
·在室和吸头之间来回混合，以充分混合PCR2产物，并合并回到单个流体段塞中。
·将汇集的PCR2产物的等分试样吸入吸头3。
步骤#11：拷贝控制延伸
·吸头3与SPI-CC对接。
·将汇集的PCR2产物分配到通道中，再加上另外的空气将流体推入热混合室，并在流体通过时对Hairpin冻干试剂进行再水化。
·流体通过气动歧管端口在热混合室之间来回混合，同时拷贝控制TEM进行热循环以进行延伸。
·当热循环发生时，移液器准备拷贝控制所需的另外试剂。
·吸头3与SPI-AUX对接。
·吸头3抽吸剩余的PCR2产物。
·吸头3与SPI-ML对接。
·将剩余的PCR2产物分配到ML室中。
·吸头3落在固定点。
·移液器装入吸头4。
·将吸头4移动到试剂盒上，并刺穿在磁珠洗涤上的箔。
·将吸头4移动至“水”。
·吸取杂交冻干试剂和磁性靶捕获冻干试剂再水化所需的流体体积。
·将吸头4移动到试剂盒中，并刺穿在杂交冻干试剂和磁性靶捕获冻干试剂上的箔。
·将再水化的流体分配到冻干试剂孔中，以再水化试剂。
·必要时进行抽吸/分配循环，以确保试剂完全重悬。
·将再水化的杂交冻干试剂吸入吸头4。
步骤#12：拷贝控制杂交
·吸头4与SPI-CC对接。
·将杂交试剂分配到室中，再加上清除入口通道所需的另外的空气。
·流体通过气动歧管端口在热混合室之间来回混合。
步骤#13：拷贝控制珠靶捕获
·将吸头4移动到试剂盒在先前再水化的磁性靶捕获试剂上。·将磁性靶捕获试剂吸入吸头4。
·吸头4与SPI-CC对接。
·将试剂分配到室中，再加上清除入口通道所需的另外空气。
·流体通过气动歧管端口在热混合室之间来回混合，同时将TEM设置为孵育温度。
·CC磁体与盒对接。
·将流体吸入吸头4，当珠穿过蛇形通道时，将其相对于CC磁体成粒。
·吸头4与SPI-ML对接。
·将废液分配到机械裂解室。
步骤#14：拷贝控制磁珠洗涤
·重复3次：
ο将吸头4移动到试剂盒中，并进行预穿刺磁珠洗涤。
ο将洗涤缓冲液吸入吸头4。
ο吸头4对接SPI-CC。
οCC磁体与盒脱离。
ο流体在移液器吸头和热混合室之间来回混合，以重悬珠。
οCC磁体相对于盒致动。
ο将流体吸入吸头4，当珠穿过蛇形通道时，将其相对于CC磁体成粒
ο吸头4与SPI-ML对接。
ο将废液分配到ML室
步骤#15：拷贝控制洗脱
·将吸头4移动到试剂盒至预穿刺水的上方。
·吸取洗脱液体积。
·将吸头4移动到测定盒中，并与SPI-CC对接。
·CC磁体与盒脱离。
·将洗脱液分配到室中，并在移液器吸头和CC室之间来回混合，以重悬珠。
·然后将珠溶液推入CC室，并通过气动歧管端口进行来回混合，同时将TEM保持在洗脱温度。
·当发生热混合时，移液器准备克隆扩增试剂。
·吸头4落在测定盒上的其固定位置。
·移液器装入吸头5。
·将吸头5移动到试剂盒中，并刺穿几个试剂箔。
·将吸头5移动至“水”。
·通过吸头5抽吸用于再水化杂交缓冲液冻干试剂的流体。
·将流体分配到含有RCA杂交缓冲液冻干试剂的孔中。
·必要时进行抽吸/分配循环，以确保试剂完全重悬。
·将预先穿刺的RCA连接缓冲液吸入吸头5。
·将流体分配到RCA连接冻干试剂中。
·必要时进行抽吸/分配循环，以确保试剂完全重悬。
·将杂交缓冲液吸入吸头5。
步骤#16：RCA/RPA引发
·将吸头5移动到测定盒上，并与SPI-FC(流动池盒)对接。
·分配缓冲液穿过流动池。
步骤#17：RCA/RPA杂交(包括拷贝对照稀释)
·辅助室洗涤过程可能需要多次重复。
·将吸头5移动到试剂盒至预穿刺水上方。
·由吸头5抽吸水。
·吸头5与SPI-AUX对接。
·将水分配到辅助室中，并在吸头和室之间来回混合，以稀释和漂洗任何剩余的PCR2产物。
·将水吸入吸头5。
·吸头5与SPI-ML对接。
·将废物分配到机械裂解室。
·将吸头5移动到试剂盒至杂交缓冲液上方。
·将杂交缓冲液吸入吸头5。
·将缓冲液分配到辅助室。
·吸头5与SPI-CC对接。
·将所有洗出液吸入吸头5。
·吸头5与SPI-AUX对接。
·将洗出液分配到辅助室中，并在室和移液器吸头之间来回混合，以确保与稀释剂充分混合。
·将稀释的CC洗出液吸入吸头5。
·吸头5与SPI-FC对接。
·分配稀释的CC洗出液穿过流动池。
·流动池TEM进行一个热循环。
步骤#17：RCA I洗涤(RPA取消此步骤)
·将吸头5移动到试剂盒至预穿刺RCA洗涤缓冲液上方。
·由吸头5抽吸洗涤缓冲液。
·将吸头5移回测定盒，并与SPI-FC对接。
·分配洗涤缓冲液穿过流动池芯片
·将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
步骤#17：RCA II循环(RPA取消此步骤)
·将吸头5移动到试剂盒至之前再水化的RCA连接上方。
·由吸头5抽吸RCA连接试剂。
·将吸头5移动到测定盒上，并对接SPI-FC。
·分配RCA连接试剂穿过流动池。
·流体在流动池中孵育。
步骤#18：RCA/RPA洗涤II
·将吸头5移回试剂盒至预穿刺RCA洗涤缓冲液上方。
·由吸头5抽吸洗涤缓冲液。
·将吸头5移回测定盒并与SPI-FC对接。
·分配洗涤缓冲液穿过流动池芯片。
·将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
步骤#19：RCA/RPA反应(该步骤具有用于RPA的多个冻干试剂)
·吸头5落在固定位置。
·移液器装入吸头6。
·将吸头6移动到试剂盒并刺穿在RCA扩增冻干试剂上方的箔。
·将RCA洗涤缓冲液吸入吸头6。
·流体被分配到RCA扩增冻干试剂中。
·必要时进行抽吸/分配循环，以确保试剂完全重悬。
·吸头6抽吸再水化RCA扩增试剂。
·由吸头6抽吸试剂。
·将吸头6移回测定盒并与SPI-FC对接。
·分配试剂穿过流动池。
·将芯片TEM设置为等温扩增温度。
步骤#20A：RCA/RPA洗涤
·TEM设置为冷却温度
·TEM和流动池冷却时：
ο将吸头6移动到试剂盒至预穿刺RCA洗涤缓冲液上方。
ο由吸头6抽吸洗涤缓冲液。
·冷却完成后，将吸头6移回测定盒并对接SPI-FC。
·分配缓冲液穿过流动池。
·将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
步骤#20B：RCA灭活(RPA取消此步骤)
ο将吸头6移动到试剂盒至预穿刺RCA灭活缓冲液上方。
ο由吸头6抽吸灭活缓冲液。
ο将吸头6移动到测定盒中，并与SPI-FC对接。
ο分配灭活缓冲液穿过流动池。
ο控制TEM温度。
步骤#20C：RCA洗涤II(RPA取消此步骤)
ο将吸头6移动到试剂盒至预穿刺RCA洗涤缓冲液上方。
ο由吸头6抽吸洗涤缓冲液。
ο将吸头6移回测定盒并与SPI-FC对接。
ο分配洗涤缓冲液穿过流动池芯片。
ο将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
步骤#21：去杂交
ο将吸头6移动到试剂盒至预穿刺的NaOH上方。
ο由吸头6抽吸NaOH。
ο将吸头6移动到测定盒，并与SPI-FC对接。
ο分配NaOH穿过流动池。
ο将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
步骤#22：洗涤
ο将吸头6移动到试剂盒至预穿刺预洗缓冲液上方。
ο由吸头6抽吸洗涤缓冲液。
ο将吸头6移动到移到测定盒，并与SPI-FC对接。
ο将洗涤缓冲液推动穿过流动池。
ο将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
步骤#24：测序杂交
ο将吸头6弹出到其固定位置。
ο移液器拾取吸头7。
ο将吸头7移动到试剂盒并在测序引物冻干试剂和测序杂交缓冲液上刺穿箔。
ο将测序杂交缓冲液吸入吸头7。
ο将缓冲液分配到测序引物冻干试剂中。
ο必要时进行抽吸/分配循环，以确保试剂完全重悬。
ο吸头7刺穿在测序酶上的箔。
ο吸头7移动到试剂盒至预穿刺预洗缓冲液上方。
ο由吸头7抽吸洗涤缓冲液。
ο将流体分配到测序酶中。
ο必要时进行抽吸/分配循环，以确保试剂完全重悬。
ο吸头7移动到之前再水化的测序引物冻干试剂中。
ο将测序引物吸入吸头7。
ο将吸头7移动到测定盒并与SPI-FC对接。
ο分配引物溶液穿过流动池。
ο分配另外的空气以对流动池加压。
ο芯片TEMS进行杂交热循环。
ο移液器减压。
ο将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
步骤#25：测序洗涤
ο将吸头7移动到试剂盒至预穿刺预洗缓冲液上方。
ο由吸头7抽吸洗涤缓冲液。
ο将吸头7移动到测定盒并与SPI-FC对接。
ο将洗涤缓冲液推动穿过流动池。
ο将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
步骤#26：酶结合
ο将吸头7移动到试剂盒至之前再水化的测序酶上方。
ο将测序酶吸入吸头7。
ο将吸头7移动到测定盒并对接SPI-FC。
ο吸头7分配试剂穿过流动池。
ο将废物通过测序歧管拉向试剂盒废物室。
ο将芯片TEM设置为酶孵育温度。
然后通过仪器/盒测序歧管以及相关的泵和阀控制测序。
附加实施方案
根据本发明的某些方面，设想了仪器、盒、系统和/或方法的各种进一步实施方案。
实施方案1是一种制备样本中的靶多核苷酸以用于进一步下游处理或分析的方法，该方法包括：
提供包括靶多核苷酸的样本；和
处理样本或靶多核苷酸以获得准备用于进一步下游处理或分析的靶核苷酸。
实施方案2是权利要求1所述的方法，其中靶多核苷酸包括至少一种DNA(例如，基因组DNA、cfDNA、ctDNA)和RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA)。
实施方案3是前述实施方案中任一项所述的方法，其中该方法包括过滤、浓缩、增溶、溶解、均化或消化样本，或以其他方式改变样本的物理或化学性质以有助于制备靶多核苷酸。
实施方案4是前述权利要求中任一项所述的方法，其中样本包括生物或临床样本。
实施方案5是实施方案4所述的方法，其中样本包括全血、血浆、血清、血沉棕黄层、白细胞、红细胞或血小板。
实施方案6是前述实施方案中任一项所述的方法，其中样本包括细胞，细胞包括靶多核苷酸。
实施方案7是实施方案6所述的方法，其中该方法还包括加标签、标记、捕获、浓缩、分离或以其他方式处理样本内的一个或以上细胞、细胞类型或细胞种群。
实施方案8是实施方案7所述的方法，其中该方法还包括加标签、标记、捕获、浓缩、分离或以其他方式处理怀疑含有靶多核苷酸的细胞。
实施方案9是实施方案6至8所述的方法，其中该方法包括裂解、消化、破裂、部分溶解、剪切或以其他方式处理含有靶多核苷酸或与靶多核苷酸缔合的细胞，以使靶多核苷酸可用于或以其他方式更可用于进一步处理或分析。
实施方案10是前述实施方案中任一项所述的方法，其中该方法包括裂解、消化、破裂、部分溶解、剪切或以其他方式处理含有靶多核苷酸或与靶多核苷酸缔合的结构，以使靶多核苷酸可用于或以其他方式更可用于进一步处理或分析。
实施方案11是前述实施方案中任一项所述的方法，其中该方法包括对靶多核苷酸进行加标签、标记、与寡核苷酸退火、浓缩、富集、捕获、分离(separating和/或isolating)。
实施方案12是实施方案11所述的方法，其中该方法还包括用唯一分子标识物(UMI)加标签或标记单个靶多核苷酸分子或靶多核苷酸分子的集合。
实施方案13是实施方案12所述的方法，其中通过连接引入UMI。
实施方案14是实施方案12所述的方法，其中通过将UMI-加标签的寡聚体与靶多核苷酸退火而延伸引入UMI。
实施方案15是实施方案11至14中任一项所述的方法，其中该方法还包括将至少一种捕获寡聚体与至少一种靶多核苷酸退火以产生至少一种捕获寡聚体/靶复合物。
实施方案16是实施方案15所述的方法，其中在跨多个不同物种的保守的靶基因座处所述至少一种捕获寡聚体与所述至少一种靶多核苷酸退火。
实施方案17是实施方案16所述的方法，其中靶基因座包括16S、23S或28S基因组DNA或5′-未翻译区中的至少一个。
实施方案18是实施方案11至17中任一项所述的方法，其中该方法还包括用聚合酶延伸至少一种捕获寡聚体/靶复合物中的至少一种捕获寡聚体的3′端。
实施方案19是实施方案11至18中任一项所述的方法，其中所述至少一种或以上捕获寡聚体包括本文所述的任何一种或以上捕获寡聚体。
实施方案20是实施方案11至19中任一项所述的方法，其中该方法还包括分离至少一种捕获寡聚体/靶复合物，从而分离靶多核苷酸。
实施方案21是实施方案20所述的方法，其中该方法还包括将至少一种捕获寡聚体/靶复合物固定在固体基质上。
实施方案22是实施方案11至21中任一项所述的方法，其中至少一种捕获寡聚体包括与其缀合的配体对的第一配体，所述配体对包括结合到固体基质的第二配体，并且分离至少一种捕获寡聚体-靶复合物包括将第一配体与第二配体结合以产生固定的配体复合物。
实施方案23是实施方案22所述的方法，其中配体对包括生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素。
实施方案24是实施方案22所述的方法，其中配体对包括核酸序列及其互补序列。
实施方案25是实施方案12至24所述的方法，其中至少一种捕获寡聚体包括标签序列，该标签序列包括在限定的一组条件下不与靶多核苷酸退火的核酸序列。
实施方案26是实施方案25所述的方法，其中提供至少一种另外的寡聚体，并且其中至少一种另外的寡聚体包括与所述至少一种捕获寡聚体的标签序列互补的核酸序列，并且还包括配体对的第一配体，将另外的寡聚体与捕获寡聚体/靶复合物的捕获寡聚体的标签退火，所述配体对包括结合到固体基质的第二配体，并且分离至少一种捕获寡聚体-靶复合物包括将第一配体与第二配体结合以产生固定的配体复合物。
实施方案27是实施方案26所述的方法，其中捕获寡聚体与靶多核苷酸结合，并且另外的寡聚体同时与捕获寡聚体的标签结合。
实施方案28是实施方案26至27所述的方法，其中以限定的和有限的量提供另外的寡聚体。
实施方案29是实施方案26至28所述的方法，其中配体对包括生物素/亲和素或生物素/链霉亲和素。
实施方案30是实施方案26至28所述的方法，其中配体对包括核酸序列及其互补序列。
实施方案31是实施方案21至30中任一项所述的方法，其中该方法还包括在固定包括靶多核苷酸的复合物后洗涤固体基质。
实施方案32是实施方案21至31中任一项所述的方法，其中该方法还包括从固体基质洗脱靶多核苷酸。
实施方案31是实施方案11至32中任一项所述的方法，其中该方法还包括退火一个或以上引物、阻断序列寡聚体、置换序列寡聚体或切割位点特异性寡聚体。
实施方案34是实施方案1至11中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸用于直接从样本进行分析的下游处理，而无需事先捕获、分离(separating和/或isolating)。
实施方案35是制备核酸文库所述的方法，该方法包括扩增靶多核苷酸的一部分以获得第一扩增子。
实施方案36是实施方案35所述的方法，其中靶多核苷酸是实施方案1至33中任一项所述的方法的产物。
实施方案37是实施方案35所述的方法，其中直接从样本使用靶多核苷酸。
实施方案38是实施方案35至37中任一项所述的方法，其中扩增包括用至少一种第一引物扩增靶多核苷酸的至少一部分以产生至少一个第一扩增子。
实施方案39是实施方案38所述的方法，其中至少一种第一引物包括至少一种实施方案14至33中任一项所述的捕获寡聚体或其他寡聚体类型。
实施方案40是实施方案38所述的方法，其中至少一种第一引物与引入到靶多核苷酸或其一个或以上片段中的至少一个标签序列杂交。
实施方案41是实施方案38至40中任一项所述的方法，其中至少一种第一引物包括至少一个标签。
实施方案42是实施方案38至41中任一项所述的方法，其中至少一种第一引物包括至少一个正(+)义引物和至少一个负(-)义引物。
实施方案43是实施方案42所述的方法，其中至少一个正义引物与至少一个标签序列杂交且至少一个负义引物与靶多核苷酸或其一个或以上片段杂交，至少一个负义引物与至少一个标签序列杂交，并且至少一个正义引物与靶多核苷酸或其一个或以上片段杂交，或者至少一个正义引物与至少一个标签序列杂交且至少一个负义引物与至少一个不同的标签序列杂交。
实施方案44是实施方案35至43中任一项所述的方法，其中产生一个以上的第一扩增子。
实施方案45是实施方案38至44中任一项所述的方法，其中至少一种第一引物包括本文所述的任何引物或一组或多组相反引物。
实施方案46是实施方案35至45中任一项所述的方法，其中扩增方法是PCR。
实施方案47是实施方案35至46中任一项所述的方法，其中至少一个第一扩增子被纯化。
实施方案48是实施方案35至47中任一项所述的方法，还包括用至少一种第二引物扩增至少一个第一扩增子的至少一部分以产生至少一个第二扩增子。
实施方案49是实施方案48所述的方法，其中至少一种第二引物与引入到至少一个第一扩增子或其一个或以上片段中的至少一个标签序列杂交。
实施方案50是实施方案48至49中任一项所述的方法，其中至少一种第二引物包括至少一个标签。
实施方案51是实施方案48至50中任一项所述的方法，其中至少一种第二引物被至少一种第一引物内的至少一个核苷酸嵌套。
实施方案52是实施方案48至51中任一项所述的方法，其中至少一种第二引物包括至少一个正(+)义引物和至少一个负(-)义引物。
实施方案53是实施方案52所述的方法，其中至少一个正义引物与至少一个标签序列杂交且至少一个负义引物与至少一个第一扩增子或其一个或以上片段杂交，至少一个负义引物与至少一个标签序列杂交且至少一个正义引物与至少一个第一扩增子或其一个或以上片段杂交，或者至少一个正义引物与至少一个标签序列杂交且至少一个负义引物与至少一个不同的标签序列杂交。
实施方案54是实施方案48至53中任一项所述的方法，其中产生一个以上的第二扩增子。
实施方案55是实施方案54所述的方法，其中至少一种第二引物嵌套在至少一种第一引物内，并且至少一种其他第二引物不嵌套在至少一种第一引物内。
实施方案56是实施方案48至55中任一项所述的方法，其中至少一种第二引物包括本文所述的任何引物或一组或多组相反的引物(opposed primers)。
实施方案57是实施方案48至56中任一项所述的方法，其中扩增方法是PCR。
实施方案58是实施方案48至57中任一项所述的方法，其中至少一种第一扩增子被纯化。
实施方案59是实施方案48至57中任一项所述的方法，其中至少一种第二扩增子被纯化。
实施方案60是实施方案58所述的方法，其中至少一种第二扩增子也被纯化。
实施方案61是制备核酸文库的方法，该方法包括将序列标签连接到靶多核苷酸。
实施方案62是实施方案61所述的方法，其中标签包括衔接子分子。
实施方案63是实施方案62所述的方法，其中标签还包括附加序列。
实施方案64是实施方案61至63中任一项所述的方法，其中直接从样本使用靶多核苷酸。
实施方案65是实施方案61至63中任一项所述的方法，其中靶多核苷酸是实施方案1至33中任一项所述方法的产物。
实施方案66是一种捕获寡聚体，其在5'至3'方向上包括：捕获序列、内部延伸阻断序列、捕获序列的互补序列和靶杂交序列，其中捕获序列的互补序列被配置为在不存在与靶杂交序列和捕获序列的互补序列退火的延伸靶序列的情况下与捕获序列退火。
实施方案67是实施方案66的捕获寡聚体，其中捕获寡聚体具有式5'-A1-C-L-B-A2-C'-A3-RB-A4-THS-X-3'，其中A1是任选存在的第一附加序列；C是捕获序列，L是任选存在的接头，B是内部延伸阻断序列，A2是任选存在第二附加序列，C'是捕获序列的互补序列，A3是任选存在的第三附加序列，RB是任选存在可逆延伸阻断序列、A4是任选存在第四附加序列，THS是靶杂交序列；并且X是任选存在的阻断部分。
实施方案68是包括捕获寡聚体和互补寡聚体的组合，其中：(a)捕获寡聚体在5'至3'方向上包括：包括第一部分和第二部分的捕获序列、内部延伸阻断序列、包括第一部分和二部分的间隔序列、和靶杂交序列；和(b)互补寡聚体在3'至5'方向上包括：捕获序列的第二部分的互补序列、和间隔序列的至少第一部分的互补序列，其中捕获序列的第二部分的互补序列和间隔序列的至少第一部分的互补序列被配置为在不存在间隔序列的互补序列的情况下同时与捕获寡聚体退火。
实施方案69是实施方案68的组合，其中捕获寡聚体具有下式：5'-A1-C1-C2-B-A2-S1-S2-A3-RB-A4-THS-X-3'，其中A1是任选存在的第一附加序列，C1是捕获序列的第一部分，C2是捕获序列的第二部分，B是内部延伸阻断序列，A2是任选存在的第二附加序列，S1是间隔序列的第一部分，S2是间隔序列的第二部分，A3是任选存在的第三附加序列，RB是任选存在的可逆延伸阻断序列，A4是任选存在的第四附加序列，THS是靶杂交序列，并且X是任选存在的阻断部分。
实施方案70是实施方案68或69中任一项的组合，其中互补寡聚体具有下式：5'-S1'-A2'-L-C2'-X-3'，其中S1'是间隔序列的至少第一部分的互补序列，A2'是任选存在于捕获寡聚体中的第二附加序列的任选存在的互补序列；L是任选存在的接头，C2'是捕获序列第二部分的互补序列，X是选择性存在的阻断部分。
实施方案71是一种从组合物中捕获靶多核苷酸所述的方法，该方法包括：使靶多核苷酸与实施方案66或67中任一项的捕获寡聚体接触，其中捕获寡聚体的靶杂交序列在包括靶多核苷酸3'端的位点处与靶多核苷酸退火；用具有链置换活性的DNA聚合酶延伸靶多核苷酸的3'端，从而形成捕获序列的互补序列的互补序列，其与捕获寡聚体退火，使得捕获寡聚体的捕获序列可用于结合；使捕获寡聚体的捕获序列与包括捕获序列的互补序列和(i)结合配偶体或(ii)固体载体的第二捕获试剂接触，从而形成包括靶多核苷酸、捕获寡聚体和第二捕获试剂的复合物；以及从组合物中分离复合物，从而捕获靶多核苷酸。
实施方案72是一种从组合物中捕获靶多核苷酸的方法，该方法包括：使组合物与实施方案68至70中任一项的组合接触，其中捕获寡聚体的靶杂交序列在包括靶多核苷酸3'端的位点处与靶多核苷酸退火；用具有链置换活性的DNA聚合酶延伸靶多核苷酸的3'端，从而形成间隔序列的互补序列，其与捕获寡聚体退火，使得互补寡聚体被置换到足以使捕获寡聚体的捕获序列可用于结合的程度；使捕获寡聚体的捕获序列与包括捕获序列的互补序列和(i)结合配偶体或(ii)固体载体的第二捕获试剂接触，从而形成包括靶多核苷酸、捕获寡聚体和第二捕获试剂的复合物；以及从组合物中分离复合物，从而捕获靶多核苷酸。
实施方案73是一种从组合物中捕获靶多核苷酸的方法，该方法包括：使靶多核苷酸与捕获寡聚体接触，该捕获寡聚体在5'至3'方向上包括：捕获序列、任选的内部延伸阻断序列、任选的间隔序列和被配置为与靶多核苷酸退火的靶杂交序列；使所述捕获寡聚体与包括所述捕获序列的互补序列的第一捕获试剂接触(在所述靶多核苷酸与所述捕获寡聚体接触之前、同时或之后)；提供第二捕获试剂，其包括捕获寡聚体中除捕获序列之外的序列的互补序列，其中如果捕获寡聚体中的一些或全部未与靶多核苷酸退火，则第二捕获试剂接触未与靶多核苷酸退火的捕获寡聚体；从组合物中分离第一复合物和第二复合物，其中第一复合物包括靶多核苷酸，并且第二复合物包括未与靶多核苷酸退火的捕获寡聚体；以及从第一复合物选择性洗脱靶多核苷酸或包括靶多核苷酸的亚复合物；任选地，其中(a)第一捕获试剂包括(i)结合配偶体和(例如，生物素)或(ii)固体载体(例如，珠或表面)和/或(b)第二捕获试剂包括(i)结合配偶体和(例如生物素)或(ii)固体载体(例如珠或表面)。
实施方案74是实施方案71至73中任一项所述的方法，其中输入材料是权利要求1至34中任一项所述的输出材料。
实施方案75是实施方案71至73中任一项所述的方法，其中输入材料是权利要求35至65中任一项的输出材料。
实施方案76是一种产生固定在固体载体上的核酸簇的方法，该方法包括在包括固体载体固定的第一引物和非固定的第二引物的反应混合物中扩增靶多核苷酸，以产生固体载体固定的靶核酸扩增子和游离靶核酸扩增子。
实施方案77是实施方案76所述的方法，其中反应混合物不含非固定的第一引物。
实施方案78是实施方案76所述的方法，其中反应混合物还包括非固定的第一引物。
实施方案79是实施方案78所述的方法，其中非固定的第二引物和第一引物的浓度的相对比率约为1:1。
实施方案80是实施方案78所述的方法，其中非固定的第二引物和第一引物的浓度的相对比率在约2:1和1000:1之间或更高。
实施方案81是实施方案78所述的方法，其中非固定的第一引物和第二引物的浓度的相对比率在约2:1和1000:1之间或更高。
实施方案82是实施方案76至81中任一项所述的方法，其中所述靶多核苷酸以接近固体载体上泊松分布水平的浓度添加到反应混合物中。
实施方案83是实施方案76至82中任一项所述的方法，其中该方法包括在开始扩增之前将靶多核苷酸与固体载体固定的第一引物杂交。
实施方案84是实施方案83所述的方法，其中在靶多核苷酸与固体载体固定的第一引物杂交后并且在扩增开始前洗涤固体载体。
实施方案85是实施方案76至84中任一项所述的方法，其中除了表面固定的靶核酸扩增子之外，还产生未固定的靶核酸扩增子。
实施方案86是实施方案85所述的方法，其中未固定的靶核酸扩增子的一条或多条链与固体载体固定的第一引物杂交，并被扩增以产生另外的固体载体固定的靶核酸。
实施方案87是实施方案86所述的方法，其中未固定到所述固体载体固定的第一引物的所述靶核酸扩增子的所述杂交发生在前述扩增阶段中紧邻固体载体-固定的靶核酸扩增子产生的位点处。
实施方案88是实施方案76至87中任一项所述的方法，其中簇是单克隆的。
实施方案89是实施方案76至88中任一项所述的方法，其中靶多核苷酸包括至少2种不同的靶多核苷酸，并且扩增包括：
在固体载体上空间间隔开的位置将不同的靶多核苷酸与与固体载体固定的第一引物杂交；
在各个空间间隔开的位置处及其周围产生各个杂交的靶多核苷酸的固体载体固定的靶核酸扩增子簇，其中各个簇的至少部分不与相邻簇的至少部分重叠。
实施方案90是实施方案76至89中任一项所述的方法，其中所述固体载体固定的第一引物和/或所述非固定的第二引物或第一引物包括本文所述的任何引物或一组或多组对向引物。
实施方案91为实施方案76至90中任一项所述的方法，其中扩增方法为重组酶聚合酶扩增。
实施方案92是实施方案76至91中任一项所述的方法，其中靶多核苷酸包括实施方案1至75中任一项要求保护的靶核酸输出。
实施方案93是实施方案76至91中任一项所述的方法，其中直接从样本中使用靶多核苷酸。
实施方案94是实施方案76至91中任一项所述的方法，其中靶多核苷酸包括作为实施方案22的标签序列或实施方案41或50中所述的标签序列添加的第一引物结合序列和/或第二引物结合序列。
实施方案95是实施方案76至93中任一项所述的方法，其中固体载体包括半导体芯片的表面。
实施方案96是实施方案94所述的方法，其中半导体芯片的表面还包括三维特征的阵列。
实施方案97是实施方案95所述的方法，其中三维特征包括孔。
实施方案98是实施方案94至96中任一项所述的方法，其中半导体芯片还包括ISFET传感器阵列。
实施方案99是一种产生固定在固体载体上的核酸簇的方法，该方法包括扩增靶多核苷酸，该方法还包括：
提供线性靶核酸，该线性靶核酸包括在线性靶核酸的第一部分上的第一引物结合序列的第一部分、在线性靶核酸的第二部分上的第一引物结合序列的第二部分、以及在线性靶核酸的第一部分和第二部分之间的第二引物序列；
提供固体载体，该固体载体包括固定在固体载体的表面上的第一引物和第二引物，其中第一引物包括第一引物序列，并且第二引物包括第二引物序列；
将靶核酸的第一引物结合序列的第一部分和第二部分与固定的第一引物之一杂交；
连接靶核酸的第一引物结合序列的第一部分和第二部分以产生包括第一引物结合序列和第二引物序列的环状靶核酸；
将固定的第一引物中的一个沿着作为模板的环状靶核酸延伸，以产生包括第一引物序列的至少一个拷贝和第二引物结合序列的至少一个拷贝的第一延伸靶核酸链；
将第一延伸靶核酸链上的第二引物结合序列的至少一个拷贝与至少一个固定的第二引物杂交；
沿着第一延伸靶核酸链延伸固定的第二引物之一的至少一个拷贝，以产生包括第二引物序列的至少一个拷贝和第一引物结合序列的至少一个拷贝的第二延伸靶核苷酸链；和
将第二延伸靶核酸链上的第一引物结合序列中的至少一个与固定的第一引物中的另一个杂交；和
将固定的第一引物中的另一个沿着作为模板的第二延伸靶核酸链延伸，以产生包括第一引物序列的至少一个拷贝和第二引物结合序列的至少一个拷贝的第三延伸靶核酸链。
实施方案100是实施方案99所述的方法，其中扩增方法为滚环扩增。
实施方案101是实施方案99至100中任一项所述的方法，其中靶多核苷酸包括实施方案1至75中任一项要求保护的靶核酸输出。
实施方案102是实施方案99至100中任一项所述的方法，其中直接从样本中使用靶多核苷酸。
实施方案103是实施方案99至102中任一项所述的方法，其中靶多核苷酸包括作为实施方案22的标签序列或实施方案41或50中所述的标签序列添加的第一引物结合序列和/或第二引物序列。
实施方案104是实施方案103所述的方法，其中添加到靶多核苷酸的一个或以上附加序列包括靶多核苷酸第一端上的第一引物结合序列的第一部分、靶多核苷酸内部区域中的部分或全部第二引物序列和靶多核苷酸第二端上的第一引物结合序列的第二部分。
实施方案105是实施方案99至104中任一项所述的方法，其中固体载体包括半导体芯片的表面。
实施方案106是实施方案105所述的方法，其中半导体芯片的表面还包括三维特征的阵列。
实施方案107是实施方案106所述的方法，其中三维特征包括孔。
实施方案108是实施方案105至107中任一项所述的方法，其中半导体芯片还包括ISFET传感器阵列。
实施方案109是一种产生固定在固体载体上的核酸簇的方法，该方法包括在包括固体载体固定的第一寡核苷酸的反应混合物中使靶多核苷酸杂交以产生固体载体固定的靶多核苷酸。
实施方案110是实施方案109所述的方法，其中所述固体载体固定的第一寡核苷酸包括捕获寡核苷酸、引物或栓连(tethering)寡核苷酸。
实施方案111是实施方案109至110中任一项所述的方法，其中所述固体载体固定的第一寡核苷酸固定在所述固体载体表面的离散区域中。
实施方案112是实施方案111所述的方法，其中固定包括在固体载体的表面上点样(spotting)或直接合成寡核苷酸。
实施方案113是实施方案109至112中任一项所述的方法，其中固定的核酸簇是单克隆的。
实施方案114是实施方案109至112中任一项所述的方法，其中该方法还包括至少第一和第二固体载体固定的寡核苷酸，并且进一步其中产生至少第一和第二核酸簇。
实施方案115是实施方案114所述的方法，其中至少第一和第二核酸簇是单克隆的。
实施方案116是实施方案109至115中任一项所述的方法，其中固体载体包括半导体芯片的表面。
实施方案117是实施方案116所述的方法，其中半导体芯片的表面还包括三维特征的阵列。
实施方案118是实施方案117所述的方法，其中三维特征包括孔。
实施方案119是实施方案116至118中任一项所述的方法，其中半导体芯片还包括ISFET传感器阵列。
实施方案120是一种产生固定在固体载体上的核酸簇种群的方法，该方法包括在包括固体载体固定的第一引物和非固定的第二引物的反应混合物中通过重组酶聚合酶扩增而扩增靶多核苷酸种群，以产生固体载体固定的靶核酸扩增子和游离靶核酸扩增子，其中各个簇的至少部分不与相邻簇的至少部分重叠。
实施方案121是实施方案120所述的方法，其中未固定的所述游离靶核酸扩增子的一条或以上链与固体载体固定的第一引物杂交，并被扩增以产生另外的固体载体固定的靶核酸。
实施方案122是实施方案120或121所述的方法，其中靶多核苷酸在3'和/或5'端具有通用区。
实施方案123是根据实施方案120至122中任一项所述的方法，其中固体载体包括孔，并且大多数孔含有克隆扩增子。
实施方案124是根据实施方案123所述的方法，其中对孔中的扩增子进行测序。
实施方案125是根据实施方案124所述的方法，其中使用包括ISFET传感器阵列的半导体芯片进行测序。
实施方案126是一种产生固定在固体载体上的核酸簇种群的方法，该方法包括在包括固体载体固定的第一引物和非固定的第二引物的反应混合物中通过重组酶聚合酶扩增而扩增靶多核苷酸种群，以产生固体载体固定的靶核酸扩增子和游离靶核酸扩增子，其中簇随机分布在固体载体上，并且各个簇的至少部分不与相邻簇的至少部分重叠。
实施方案127是实施方案126所述的方法，其中固体载体包括三维特征。
实施方案128是实施方案127所述的方法，其中三维特征是孔。
实施方案129是实施方案126至128中任一项所述的方法，其中固体载体包括半导体芯片。
实施方案130是实施方案129所述的方法，其中芯片包括ISFET传感器阵列。
实施方案131是一种确定靶多核苷酸的核苷酸序列的方法，该方法包括：
将靶多核苷酸或其衍生物固定到固体载体上；
任选地扩增固定的靶多核苷酸或其衍生物以产生簇；
将测序引物与固定的多核苷酸、其衍生物或其扩增子产物退火以产生靶核酸/测序引物复合物；
将测序酶与靶核酸/测序引物复合物结合；
依次添加核苷酸并在每次添加后测量信号以确定靶多核苷酸的核苷酸序列。
实施方案132是实施方案131中任一项所述的方法，其中直接从样本中使用靶多核苷酸。
实施方案133是实施方案131或132中任一项所述的方法，其中由样本制备靶多核苷酸。
实施方案134是实施方案133所述的方法，其中制备样本包括根据实施方案1至33、实施方案35至65、实施方案66至75、实施方案76至130中任一项所述的方法。
实施方案135是实施方案131至134中任一项所述的方法，其中固定的寡核苷酸是测序引物。
实施方案136是实施方案135所述的方法，其中固定步骤和测序引物杂交步骤是同一步骤。
实施方案137是实施方案131至134中任一项所述的方法，其中固定和任选扩增靶多核苷酸或其衍生物包括实施方案76至108中任一项所述的方法。
实施方案138是实施方案131至134或137中任一项所述的方法，其中将测序引物与固定的多核苷酸、其衍生物或其扩增子产物退火以产生靶核酸/测序引物复合物和将测序酶结合到靶核酸/测序引物复合物在同一步骤中发生。
实施方案139是实施方案131至138所述的方法，其中测序酶是热稳定的。
实施方案140是实施方案131至139中任一项所述的方法，其中该方法还包括流动池，该流动池有助于将流体输送到固体载体并从固体载体去除流体。
实施方案141是实施方案131至140中任一项所述的方法，其中固体载体包括半导体芯片的表面。
实施方案142是实施方案141所述的方法，其中半导体芯片的表面还包括三维特征的阵列。
实施方案143是实施方案142所述的方法，其中三维特征包括孔。
实施方案144是实施方案141至143中任一项所述的方法，其中半导体芯片还包括ISFET传感器阵列。
实施方案145是实施方案144所述的方法，其中在每次添加后测量信号以确定靶多核苷酸的核苷酸序列包括通过ISFET传感器进行检测。
实施方案146是实施方案131至145中任一项所述的方法，其中确定序列包括使用计算机化分析算法。
实施方案147是一种系统，包括仪器和可除移地插入仪器内的测定盒。
实施方案148是实施方案147的系统，其中测定盒包括以下任意一个或以上的任意组合：
样本输入单元；
孵育单元；
裂解单元；
磁分离单元(MSU)，
文库制备单元；
拷贝控制(CC)单元；和
簇生成/测序单元。
实施方案149是实施方案148的系统，其中样本输入单元包括样本入口、输入/输出阀以及在样本入口和输入/输出阀之间并与样本入口和输入/输出阀流体连接的流体通道。
实施方案150是实施方案148至149中任一项所述的系统，还包括流体通道，并在样本入口和盒中的至少一个室之间流体连接。
实施方案151是实施方案150的系统，其中盒中的至少一个室包括至少一个裂解室。
实施方案152是实施方案148至151中任一项所述的系统，其中样本输入是采血管(例如真空采血管(Becton Dickinson))输入。
实施方案153是实施方案148至152中任一项所述的系统，其中孵育单元包括至少一个孵育室、至少一个输入/输出阀、在至少一个孵育室和至少一个输入/输出阀之间并与之流体连接的流体通道，以及当存在两个或以上孵育室时，在至少一个孵育室和至少一个另外的孵育室之间并与它们流体连接的流体通道。
实施方案154是实施方案153所述的系统，其中当测定盒插入仪器内时，至少一个孵育室与加热元件对接。
实施方案155是实施方案153至154中任一项的系统，其中至少一个孵育室包括至少一个裂解室。
实施方案156是实施方案153至155中任一项所述的系统，其中系统包括一个以上的孵育单元。
实施方案157是实施方案147至156中任一项所述的系统，其中裂解单元包括至少一个裂解室、输入/输出阀、在至少一个裂解室和输入/输出阀之间并与至少一个裂解室和输入/输出阀流体连接的流体通道，以及当存在两个或以上裂解室时，在至少一个裂解室和至少一个另外的裂解室之间并与至少一个裂解室和至少一个另外的裂解室流体连接的流体通道。
实施方案158是实施方案157所述的系统，其中至少一个裂解室包括旋转桨或叶轮。
实施方案159是实施方案158所述的系统，其中当测定盒插入仪器内时，旋转桨或叶轮能够与仪器上的致动器对接。
实施方案160是实施方案147至159中任一项所述的系统，其中MS单元包括一个或以上MS室。
实施方案161是实施方案160所述的系统，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上MS室与仪器上的加热元件对接。
实施方案162是实施方案160至161中任一项所述的系统，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上MS室与仪器上的磁性元件对接。
实施方案163是实施方案160至162中任一项所述的系统，其中MS单元还包括输入/输出阀和流体通道，该流体通道位于一个或以上MS室和输入/输出阀之间并与之流体连接。
实施方案164是实施方案160至163中任一项所述的系统，其中MS单元还包括与一个或以上MS室流体连接的一个或以上气动端口，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上气动端口能够与仪器上的气动歧管对接。
实施方案165是实施方案164所述的系统，其中MS单元还包括一个或以上冷凝阱室，该冷凝阱室位于一个或以上MS室和一个或以上气动端口之间并与之流体连接。
实施方案166是实施方案164至165中任一项所述的系统，其中：
一个或以上MS室包括经由一个或以上流体通道与一个或以上输入/输出阀流体连接的两个或以上MS室，该一个或以上流体通道位于两个或以上MS室与一个或以上输入/输出阀之间；
两个或以上MS室中的各个MS室与单独的气动端口流体连接；和
任选地，两个或以上MS室中的各个MS室与设置在MS室与气动端口之间的单独的冷凝阱室流体连接。
实施方案167是实施方案147至166中任一项所述的系统，其中文库制备单元包括一个或以上扩增反应室。
实施方案168是实施方案167所述的系统，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上扩增反应室与仪器上的加热元件对接。
实施方案169是实施方案167至168中任一项所述的系统，其中文库制备单元还包括一个或以上输入/输出阀和一个或以上流体通道，流体通道位于一个或以上扩增反应室和一个或以上输入/输出阀之间并与之流体连接。
实施方案170是实施方案167至169中任一项所述的系统，其中文库制备单元还包括一个或以上扩增反应室中或一个或以上流体通道中的冻干扩增试剂。
实施方案171是实施方案167至170中任一项所述的系统，其中文库制备单元还包括与一个或以上扩增反应室流体连接的一个或以上气动端口，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上气动端口能够与仪器上的气动歧管对接。
实施方案172是实施方案171所述的系统，其中文库制备单元还包括一个或以上扩增等分室，扩增等分室位于一个或以上扩增反应室和一个或以上输入/输出阀之间并与之流体连接。
实施方案173是实施方案171至172中任一项所述的系统，其中：
一个或以上扩增反应室包括经由单个流体通道与单个输出/输入阀流体连接的两个或以上扩增反应室，该单个流体通道位于两个或以上扩增反应室和单个输入/输出阀之间；
两个或以上扩增反应室中的各个扩增反应室与单独的气动端口流体连接；和
任选地，两个或以上扩增反应室中的各个扩增反应室与设置在扩增反应室和单个输入/输出阀之间的单独的扩增等分室流体连接。
174实施方案174是实施方案173所述的系统，其中：
一个或以上扩增反应室包括与两个或以上扩增反应室分离的另外的扩增反应室；
另外的扩增反应室经由另外的扩增反应室和另外的输入/输出阀之间的另外的流体通道与另外的输入/输出阀流体连接，其中，另外的输入/输出阀和另外的流体通道与输入/输出阀和与两个或以上室流体连接的流体通道分离；和
任选地与设置在另外的扩增反应室和另外的输入/输出阀之间的另外的扩增等分室流体连接，其中另外的扩增等分室与与两个或以上扩增反应室流体连接的扩增等分室分离。
实施方案175是实施方案147至174中任一项所述的系统，其中CC单元包括一个或以上CC室。
实施方案176是实施方案175所述的系统，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上CC室与仪器上的加热元件对接。
实施方案177是实施方案175至176中任一项所述的系统，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上CC室与仪器上的磁性元件对接。
实施方案178是实施方案175至177中任一项所述的系统，其中CC单元还包括输入/输出阀和位于一个或以上CC室和输入/输出阀之间并与之流体连接的流体通道。
实施方案179是实施方案175至178中任一项所述的系统，其中CC单元还包括与一个或以上CC室流体连接的一个或以上气动端口，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上气动端口能够与仪器上的气动歧管对接。
实施方案180是实施方案179所述的系统，其中CC单元还包括一个或以上冷凝阱室，该冷凝阱室位于一个或以上CC室和一个或以上气动端口之间并与之流体连接。
实施方案181是实施方案179至180中任一项所述的系统，其中：
一个或以上CC室包括经由单个流体通道与单个输入/输出阀流体连接的两个或以上子CC室，该单个流体通道位于两个或以上CC室和输入/输出阀之间；
两个或以上CC室中的各个CC室与单独的气动端口流体连接；和
任选地，两个或以上CC室中的各个CC室与设置在CC室和气动端口之间的单独的冷凝阱室流体连接。
实施方案182是实施方案147至181中任一项所述的系统，其中簇生成/测序单元包括流动池，流动池能够将流体输送到固体载体并从固体载体去除流体，进一步地，其中固体载体的表面处于流动池的边界内并与流动池内的流体接触。
实施方案183是实施方案182所述的系统，其中流动池与一个或以上输入/输出阀流体连接。
实施方案184是实施方案182至183中任一项所述的系统，其中流动池与一个或以上测序歧管端口流体连接，其中当测定盒插入仪器内时，一个或以上测序歧管口与仪器上的测序歧管对接。
实施方案185是实施方案182至184中任一项所述的系统，其中当测定盒插入仪器内时，流动池或固体载体与仪器上的加热元件对接。
实施方案186是实施方案185中任一项所述的系统，其中固体载体还包括集成加热元件。
实施方案187是实施方案182至184中任一项所述的系统，其中固体载体还包括集成加热元件。
实施方案188是实施方案182至187中任一项所述的系统，其中流动池能够连接到半导体芯片，并且进一步其中芯片表面的至少一部分与流动池内的至少一部分流体接触。
实施方案189是实施方案188所述的方法，其中半导体芯片的表面还包括三维特征的阵列。
实施方案190是实施方案189所述的方法，其中三维特征包括孔。
实施方案191是实施方案188至190中任一项所述的方法，其中半导体芯片还包括ISFET传感器阵列。
实施方案192是实施方案147至191中任一项所述的系统，还包括在盒中的至少一个室和盒中的至少另一个室之间流体连接的流体通道。
实施方案193是实施方案147至192中任一项所述的系统，还包括在除盒中的废物室之外的至少一个室和盒中至少一个废物室之间流体连接的流体通道。
实施方案194是实施方案193所述的系统，还包括输入/输出阀、在除废物室之外的至少一个室和输入/输出阀之间并与之流体连接的流体通道，以及在至少一个废物室和输入/输出阀之间并与之流体连接的流体通道。
实施方案195是实施方案147至191中任一项所述的系统，还包括可移除地插入仪器内的试剂盒。
实施方案196是实施方案192所述的系统，其中试剂盒包括与一个或以上输入/输出阀流体连接的一个或以上试剂室。
实施方案197是实施方案147至193中任一项所述的系统，其中一个、一些或各个输入/输出阀是密封气动/移液器接口(SPI)阀。
实施方案198是实施方案147至194中任一项所述的系统，其中一个、一些或各个室与SPI阀流体连接。
实施方案199是实施方案147至195中任一项所述的系统，其中样本输入与SPI阀流体连接。
实施方案200是根据要求保护的实施方案194至196中任一项所述的系统，其中SPI阀包括柔性、实心的阀体，该阀体包括可分离部分，该可分离部分围绕移液器吸头分离并密封，以在移液器吸头插入其中时在阀的相对侧上保持压差，并在其自身上密封以在移液器吸头从其移除时保持阀的相对侧上的压差。
实施方案201是实施方案147至200中任一项所述的系统，其中仪器包括以下任意组合中的一个或多个：
测定盒接口；
试剂盒接口；
热装置和接口
磁体装置和接口
机械裂解装置和接口
超声处理装置和接口
测定盒流体歧管；
试剂盒流体歧管；
气动装置和接口
固体载体接口；
一个或以上传感器；
一个或以上CPU以及相关联的装置和电子设备；和
用户界面。
实施方案202是实施方案147至201中任一项所述的系统，其中仪器包括液体处理器，液体处理器包括移液器，移液器配置为从各个输入/输出阀转移材料。
实施方案203是实施方案202所述的系统，其中仪器包括至少一个能够在x、y和z维度上移动的台架机械臂。
实施方案204是在实施方案147至203中任一项要求保护的系统中实施根据实施方案131至146中任一项要求保护的分析样本中的靶多核苷酸的方法，该方法包括以下任意组合中的任意一种或多种：
a.在样本输入、孵育、裂解、拷贝控制和/或MS单元中的任一个或其任意组合(包括所有)中处理样本，以获得制备的靶多核苷酸；
b.在文库制备单元中扩增部分制备的靶多核苷酸以获得扩增的靶核酸；
c.控制拷贝控制单元中的输出拷贝的数量；
d.在簇生成/测序单元中生成一个或以上簇；
e.在簇生成/测序单元中对在步骤a)至d)中的任一个或其任意组合中制备的靶核酸进行测序。
实施方案204是在实施方案147至203中任一项要求保护的系统中实施实施方案131至146中任一项要求保护的分析样本中的靶多核苷酸的方法，该方法包括以下任意组合中的任意一种或多种：
a)在样本输入、孵育、裂解、拷贝控制和/或MS单元中的任一个或其任意组合(包括所有)中处理样本，以获得制备的靶多核苷酸；
b)在文库制备单元中扩增部分所制备的靶多核苷酸以获得扩增的靶核酸；
c)控制拷贝控制单元中的输出拷贝的数量；
d)在簇生成/测序单元中生成一个或以上簇；
e)在簇生成/测序单元中对在步骤a)至d)中的任一个或任意组合中制备的靶核酸进行测序。
实施方案205是实施方案204所述的方法，其中在样本中制备靶多核苷酸包括实施方案1至34中任一项所述的方法。
实施方案206是实施方案204至205中任一项所述的方法，其中在样本中制备靶多核苷酸包括：
在样本输入单元中输入样本；
将样本转移到孵育单元中的至少一个孵育室，其中至少一个孵育室预载有裂解试剂；
将样本与裂解试剂混合以产生样本裂解试剂混合物；
在至少一个孵育室中加热样本裂解试剂混合物；
将样本-裂解试剂混合物从至少一个孵育室转移到裂解单元中的至少一个裂解室，其中至少一个裂解室预装载有另外的裂解试剂；
裂解存在于样本裂解试剂混合物中的细胞以产生裂解物；
使裂解物从至少一个裂解室通过具有至少一个对接的加热元件的一个或以上第一MS室，并进入一个或以上第二MS室，其中一个或以上第二MS室预载有包括至少一种捕获寡核苷酸的靶捕获试剂；
将裂解物与靶捕获试剂混合以产生裂解物-靶捕获试剂混合物；
将裂解物-靶捕获试剂混合物转移到至少一个孵育室；
在至少一个孵育室中加热裂解物-靶捕获试剂混合物以使得捕获寡核苷酸能够与靶多核苷酸退火以产生捕获寡聚体-靶复合物；
将捕获寡聚体-靶复合物转移到一个或以上第三MS室中，其中一个或以上第三MS室预载有捕获珠(例如，磁性捕获珠)
混合捕获寡聚体-靶复合物和捕获珠以产生捕获寡聚体-靶-捕获珠复合物；
通过使捕获寡聚体-靶捕获珠复合物通过对接有至少一个磁性元件的一个或以上第一MS室而固定捕获珠，从固定的捕获珠中去除裂解物，向固定的捕获珠中添加洗涤缓冲液并然后从固定的捕获珠去除洗涤缓冲液以洗涤固定的捕获珠，以及将洗脱缓冲液添加到固定的捕获珠中以从固定的捕获珠洗脱靶多核苷酸，从而产生制备的靶多核苷酸。
实施方案207是实施方案206所述的方法，其中转移包括通过输入/输出阀。
实施方案208是实施方案206至207中任一项所述的方法，其中混合包括通过与之形成独立的流体连接的两个或以上气动端口选择性地对两个或以上室加压和减压。
实施方案209是实施方案206至208中任一项所述的方法，其中预载试剂包括冻干试剂。
实施方案210是实施方案206至209中任一项所述的方法，其中裂解试剂包括蛋白酶K。
实施方案211是实施方案206至210中任一项所述的方法，其中在至少一个孵育室中加热样本裂解试剂混合物包括在约60°℃加热。
实施方案212是实施方案206至211中任一项所述的方法，其中另外的裂解试剂包括锆珠。
实施方案213是实施方案206至212中任一项所述的方法，其中裂解存在于样本-裂解试剂混合物中的细胞包括使用旋转桨或叶轮进行混合。
实施方案214是实施方案206至213中任一项所述的方法，其中一个或以上第一MS室包括蛇形通道。
实施方案215是实施方案206至214中任一项所述的方法，其中使来自一个或以上裂解室的裂解物通过一个或以上MS室包括在约95℃加热。
实施方案216是实施方案215所述的方法，其中加热包括使双链核酸(如果存在)变性。
实施方案217是实施方案206至216中任一项所述的方法，其中在至少一个孵育室中加热裂解物-靶捕获试剂混合物包括在约60℃加热。
实施方案218是实施方案204至217中任一项所述的方法，其中扩增包括权利要求2.1至2.26中任一项所述的方法。
实施方案219是实施方案204至218中任一项所述的方法，其中扩增包括：
将分离的靶核酸从一个或以上STC室转移到一个或以上PCR室中的第一PCR室；
在一个或以上PCR室中的第一PCR室中产生第一靶核酸扩增子；
将第一靶核酸扩增子从一个或以上PCR室中的第一PCR室转移到一个或以上PCR室中的第二PCR室；
任选地稀释第一靶核酸扩增子；和
在一个或以上PCR室中的第二PCR室中产生第二靶核酸扩增子。
实施方案220是实施方案204至219中任一项的方法，还包括：
将扩增的靶核酸从PCR单元转移到CC单元；和
在CC单元中控制扩增的靶核酸的拷贝数以在其中获得接近预定拷贝水平的靶核酸。
实施方案221是实施方案220所述的方法，其中控制拷贝数包括实施方案66至75中任一项所述的方法。
实施方案222是实施方案204至221中任一项所述的方法，还包括将靶核酸从测定盒中的任何其他单元转移到簇生成/测序单元，并在簇生成/测序单元中生成固定在流动池边界内的表面上的靶核酸簇。
实施方案223是实施方案222所述的方法，其中生成簇包括实施方案76至130中任一项所述的方法。
实施方案224是实施方案204至223中任一项所述的方法，其中在初始引入样本并开始运行后，所有过程在系统内以自动化方式以连续工作流程进行，无需人工干预。
实施方案225是在实施方案147至203中任一项所述的系统中实施实施方案131至146中任一项要求保护的分析样本中的靶多核苷酸的方法，其中直接从样本中分析靶多核苷酸。
实施方案226是仪器，其包括以下任意组合中的任意一种或多种：
盒接口；
热装置和接口；
磁体装置和接口；
机械裂解装置和接口；
超声处理装置和接口；
盒流体歧管；
气动装置和接口；
固体载体接口；
一个或以上传感器；
一个或以上CPU以及相关联的装备和电子设备；和
用户界面。
实施方案227是一个或以上盒，其包括以下任意组合中的任意一种或多种：
样本输入单元；
孵育单元；
裂解单元；
磁分离单元(MSU)；
文库制备单元；
拷贝控制(CC)单元；
簇生成/测序单元；
废液单元；
干燥试剂存储单元；
液体试剂存储单元，用于测定特异性试剂；
液体试剂存储单元，用于批量和测序特异性试剂；和
废液单元。

Claims (105)

1.一种用于分析样本中的靶标的方法，所述方法包括：
将样本引入盒中；
将所述盒引入仪器，所述仪器能够自动操纵所述盒内的所述样本：
从所述样本中分离靶核酸；
扩增分离的靶核酸；和
使用二代测序对扩增的靶核酸进行测序，
其中在整个分离步骤、扩增步骤和测序步骤中，所述样本保持在所述盒内。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述样本引入所述盒中之后的8小时或更短时间内进行所述分离步骤、扩增步骤和测序步骤。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括以低至3个拷贝的水平存在于所述样本中的真菌核酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括以低至3个拷贝的水平存在于所述样本中的细菌核酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括以低至单个拷贝的水平存在于所述样本中的病毒核酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述盒具有约3升或以下的外部体积。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述盒具有约2.5升或以下的外部体积。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述盒具有约2.1升或以下的外部体积。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述盒具有约200mm或以下的最长线性维度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述盒具有约160mm或以下的最长线性维度。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本选自由生物样本、临床样本、环境样本和食品样本组成的组中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述样本是从受试者获得、并在引入所述盒之前未经处理的生物样本。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包括消化所述样本中的蛋白质。
14.根据权利要求13所述的方法，包括使用蛋白酶K消化蛋白质。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包括裂解生物体以释放所述靶核酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中裂解包括机械裂解。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述机械裂解包括使所述样本流入所述盒内的裂解室中，并使桨在所述裂解室内旋转。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述机械裂解还包括使所述桨在所述裂解室内旋转之前将锆珠添加到所述裂解室中。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包括使所述靶核酸变性。
20.根据权利要求19所述的方法，其中变性包括热变性。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤包括通过以下方式捕获所述靶核酸：
使靶捕获寡核苷酸与所述靶核酸进行退火以形成复合物；
将所述复合物结合在固体载体上；和
从所述固体载体去除未结合的材料。
22.根据权利要求21所述的方法，其中去除未结合的材料包括用洗涤试剂洗涤固体载体结合的复合物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中在固体载体结合的靶核酸上进行所述扩增步骤。
24.根据权利要求21所述的方法，其还包括从经洗涤的固体载体洗脱所述靶核酸以制备经分离的靶核酸。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述扩增步骤直接在洗脱的靶核酸上进行而无需介入步骤。
26.根据权利要求20所述的方法，其中所述分离步骤从体积在约1mL和约25mL之间的样本中自动分离所述靶核酸。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离步骤仅包括一个纯化步骤。
28.根据权利要求1所述的方法，其中在未定量的情况下扩增分离的核酸。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增步骤包括：
使用第一引物集对所述分离的靶核酸进行第一扩增以产生第一扩增产物；
稀释所述第一扩增产物并等分成多个等分试样；
使用多个第二引物集对所述多个等分试样中的所述靶核酸进行第二扩增，以产生多个第二扩增产物；和
汇集所述第二扩增产物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一引物集中的一个或以上引物与所述多个第二引物集中的一个或以上引物相同。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述扩增步骤还包括纯化汇集的第二扩增产物以产生所述扩增的靶核酸。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述第一扩增和所述第二扩增中的一个或以上包括PCR扩增。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述多个等分试样包括至少10个单独的等分试样。
34.根据权利要求30所述的方法，其中在未定量的情况下进行第一PCR扩增和第二PCR扩增。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述多个第二引物集中的一个或以上相对于所述第一引物集嵌套。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增步骤包括在所述测序步骤之前对所述扩增的靶核酸进行拷贝控制。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增步骤仅包括一个纯化步骤。
38.根据权利要求1所述的方法，其中在未定量的情况下对扩增的靶核酸进行测序。
39.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序步骤包括：
将扩增的靶核酸固定至在盒内的包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器的半导体表面上方。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述扩增步骤的所有产物在没有介入步骤的情况下流过所述半导体表面。
41.根据权利要求39所述的方法，其中通过结合在所述ISFET传感器上方的捕获寡聚体固定所述扩增的靶核酸，其中所述捕获寡聚体与所述靶核酸的一部分杂交。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述表面包括ISFET传感器的阵列，各ISFET传感器具有位于其上方的孔。
43.根据权利要求41所述的方法，其中至少一个孔被定位在所述ISFET传感器阵列中的多个ISFET传感器上方。
44.根据权利要求42所述的方法，其中一个或以上所述孔包括与所述靶核酸的一部分杂交的表面结合正向引物和与所述靶核酸的一部分杂交的表面结合反向引物，并且其中所述测序步骤包括双端测序。
45.根据权利要求42所述的方法，其中一个或以上所述孔或一个或以上所述孔之间的孔际间隙包括不与所述靶核酸杂交的多个结合的惰性寡聚体。
46.根据权利要求39所述的方法，其中通过结合在所述ISFET传感器上方的通用捕获寡聚体固定所述扩增的靶核酸，其中所述通用捕获寡聚体与通用结合位点杂交。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述扩增步骤包括使用包括所述通用结合位点的引物扩增所述分离的靶核酸。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述扩增步骤包括将衔接子连接到所述分离的靶核酸上，所述衔接子包括所述通用结合位点。
49.根据权利要求46所述的方法，其中所述测序步骤包括固定的靶核酸的克隆扩增。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述克隆扩增包括重组酶聚合酶扩增。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述克隆扩增包括滚环扩增。
52.根据权利要求49所述的方法，其中所述克隆扩增包括桥式PCR、链置换扩增或环介导等温扩增。
53.一种系统，包括：
样本盒，所述样本盒包括：
样本输入；
样本制备单元，其能够从所述样本输入接收样本并从所述样本中分离靶核酸；
文库制备单元，其能够从所述样本制备单元接收分离的靶核酸并扩增所述分离的靶核酸；和
测序单元，其能够从所述文库制备单元接收扩增的靶核酸并对所述扩增的靶核苷酸进行测序；和
仪器，包括：
盒接口，所述盒接口包括物理连接和电子连接，通过所述物理连接和所述电子连接所述仪器能够驱动所述盒内的所述样本和试剂移动并与所述测序单元通信。
54.根据权利要求53所述的系统，其中分离所述靶核酸、扩增所述分离的靶核酸以及对所述扩增的核酸测序所需的一种或以上试剂是干燥试剂，所述仪器能够重构所述一种或以上试剂。
55.根据权利要求53所述的系统，还包括一个或以上试剂盒，所述试剂盒包含分离所述靶核酸、扩增所述分离的靶核酸以及对所述扩增的核酸测序所需的一种或以上试剂；
所述仪器能够将试剂从所述一个或以上试剂盒转移到所述样本盒。
56.根据权利要求55所述的系统，其中所述样本盒和所述一个或以上试剂盒包括密封气动接口(SPI)端口，以及
其中所述仪器能够使用一个或以上移液器经由所述SPI端口将所述一种或以上试剂从所述一个或以上试剂盒转移到所述样本盒。
57.根据权利要求56所述的系统，其中所述仪器包括能够转移所述一种或以上试剂的3自由度移液器台架。
58.根据权利要求53所述的系统，其能够对所述样本中的低至3个拷贝水平的靶真菌核酸进行分离、扩增和测序。
59.根据权利要求53所述的系统，其能够对所述样本中存在的低至3个拷贝水平的靶细菌核酸进行分离、扩增和测序。
60.根据权利要求53所述的系统，其能够对所述样本中存在的低至单个拷贝水平的靶病毒核酸进行分离、扩增和测序。
61.根据权利要求53所述的系统，其中所述盒具有约3升或以下的外部体积。
62.根据权利要求61所述的系统，其中所述盒具有约2.5升或以下的外部体积。
63.根据权利要求62所述的系统，其中所述盒具有约2.1升或以下的外部体积。
64.根据权利要求61所述的系统，其中所述盒具有约200mm或以下的最长线性维度。
65.根据权利要求64所述的系统，其中所述盒具有约160mm或以下的最长线性维度。
66.根据权利要求53所述的系统，其中所述仪器具有约150升或以下的体积。
67.根据权利要求66所述的系统，其中所述仪器具有约135升或以下的体积。
68.根据权利要求53所述的系统，其中所述仪器具有约700mm或以下的最长线性维度。
69.根据权利要求68所述的系统，其中所述仪器具有约650mm或以下的最长线性维度。
70.根据权利要求53所述的系统，其中所述样本盒能够接收生物样本、临床样本、环境样本和食品样本。
71.根据权利要求53所述的系统，其中所述样本盒能够接收未经处理的生物样本。
72.根据权利要求53所述的系统，其中分离所述靶核酸包括消化所述样本中的蛋白质。
73.根据权利要求72所述的系统，其中所述仪器能够使所述样本在所述样本制备单元中暴露于蛋白酶K。
74.根据权利要求53所述的系统，其中所述样本制备单元能够裂解生物体以释放所述靶核酸。
75.根据权利要求74所述的系统，其中所述样本制备单元包括裂解室，所述裂解室包括旋转桨，所述仪器能够使所述样本流入所述裂解室内，并与所述样本盒对接以使所述旋转桨旋转以机械地裂解所述样本中的生物体。
76.根据权利要求75所述的系统，其还包括所述裂解室中的锆珠。
77.权利要求53所述的系统，其中分离所述靶核酸包括使所述靶核酸变性。
78.根据权利要求77所述的系统，其中所述仪器能够向所述样本制备单元提供热能以使所述样本制备单元中的核酸变性。
79.根据权利要求53所述的系统，其中所述仪器能够用于：
使所述样本暴露于所述样本制备单元中的靶捕获寡核苷酸和固体载体，以使所述靶捕获寡核苷酸与所述靶核酸进行退火，从而形成复合物并使所述复合物与所述固体载体结合。
80.根据权利要求79所述的系统，其中所述仪器还能够将洗涤缓冲液引入固体载体结合的复合物并将所述固体载体结合的复合物与未结合的样本分离。
81.根据权利要求80所述的系统，其中所述仪器能够将分离的固体载体结合的复合物转移到所述文库制备单元并扩增固体载体结合的靶核酸。
82.根据权利要求79所述的系统，其中所述仪器能够将洗脱缓冲液引入所述分离的固体载体结合的复合物以从所述固体载体洗脱所述靶核酸，并将洗脱的靶核酸转移到所述文库制备单元用于扩增。
83.根据权利要求79所述的系统，其中所述仪器能够将扩增试剂引入所述固体载体结合的复合物并扩增所述样本制备单元内的所述靶核酸。
84.根据权利要求53所述的系统，其能够自动容纳通过所述样本输入接收的体积在约1mL和约25mL之间的样本。
85.根据权利要求53所述的系统，其中所述仪器能够与所述样本盒的所述文库制备单元对接，以引入所需试剂并提供热能以：
使用第一引物集对所述分离的靶核酸进行第一扩增以产生第一扩增产物；
稀释所述第一扩增产物并将其等分成多个等分试样；
使用多个第二引物集对所述多个等分试样中的所述靶核酸进行第二扩增以产生多个第二扩增产物；和
汇集所述第二扩增产物。
86.根据权利要求85所述的系统，其中所述第一引物集中的一个或以上引物与所述多个第二引物集中一个或以上引物相同。
87.根据权利要求85所述的系统，其中所述仪器还能够纯化汇集的第二扩增产物以产生所述扩增的靶核酸。
88.根据权利要求85所述的系统，其中所述第一扩增和所述第二扩增中的一个或以上包括PCR扩增。
89.根据权利要求85所述的系统，其中所述多个等分试样包括至少10个单独的等分试样。
90.根据权利要求53所述的系统，其还能够对所述分离的靶核酸和所述扩增的靶核酸的一个或以上进行拷贝控制，并控制分别转移到所述文库制备单元或所述测序单元的输出拷贝的数量。
91.根据权利要求53所述的系统，其中所述测序单元包括半导体表面，所述半导体表面包括离子敏感场效应晶体管(ISFET)传感器阵列，各ISFET传感器具有位于其上方的孔，所述仪器能够将扩增的靶核酸固定在所述ISFET传感器阵列的上方，当将样本盒定位在其中时所述ISFET传感器阵列通过所述盒接口的电子连接与所述仪器进行电子通信。
92.根据权利要求91所述的系统，其中所述仪器能够使得来自所述文库制备单元的所有输出均流进在所述半导体表面上的所述孔中。
93.根据权利要求91所述的系统，其包括结合在所述ISFET传感器阵列上方的捕获寡聚体，其中所述捕获寡聚体被配置为与靶核酸的一部分杂交。
94.根据权利要求91所述的系统，其中至少一个所述孔被定位在所述ISFET传感器阵列中的多个ISFET传感器上方。
95.根据权利要求91所述的系统，其中一个或以上所述孔包括与所述靶核酸的一部分杂交的表面结合正向引物和与所述靶核酸的一部分杂交的表面结合反向引物，所述仪器能够进行双端测序。
96.根据权利要求91所述的系统，其中一个或以上所述孔和所述孔之间的孔际间隙包括不与所述靶核酸杂交的多个结合的惰性寡聚体。
97.权利要求91所述的系统，包括结合在所述ISFET传感器阵列上方的通用捕获寡聚体，其中所述通用捕获寡聚体被配置为与通用结合位点杂交。
98.根据权利要求97所述的系统，其中所述仪器能够与所述文库制备单元对接，从而使用包括所述通用结合位点的引物扩增所述分离的靶核酸。
99.根据权利要求97所述的系统，其中所述仪器能够将衔接子连接到所述样本制备单元或所述文库制备单元中的所述分离的靶核酸上，所述衔接子包括所述通用结合位点。
100.根据权利要求97所述的系统，其中所述仪器能够与所述测序单元对接以进行固定的靶核酸的克隆扩增。
101.根据权利要求100所述的系统，其中所述克隆扩增包括重组酶聚合酶扩增。
102.根据权利要求100所述的系统，其中所述克隆扩增包括滚环扩增。
103.根据权利要求100所述的系统，其中所述克隆扩增包括桥式PCR、链置换扩增或环介导等温扩增。
104.根据权利要求53所述的系统，其中所述物理连接和所述电子连接包括用于驱动所述样本盒内的流体运动的气动系统。
105.根据权利要求53所述的系统，其中所述盒接口还包括物理连接和电子连接，所述仪器能够通过所述物理连接和所述电子连接与一个或以上所述样本制备单元和所述文库制备单元通信。
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