CN119585443A - 原代模板定向扩增及其方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于高通量原代模板定向扩增(PTA)核酸扩增和测序方法的组合物和方法，以及其在研究、诊断和治疗中用于突变分析的应用。本文还提供了用于平行分析来自单细胞的DNA、RNA和/或蛋白质的方法。

Description

原代模板定向扩增及其方法

交叉引用

本申请要求于2022年5月5日提交的美国临时专利申请号63/338,669和于2022年9月15日提交的美国临时专利申请号63/406,862的权益，该两个申请通过引用以其整体并入本文。

背景技术

利用核酸扩增的研究方法(例如，下一代测序)提供了关于复杂样品、基因组和其他核酸来源的大量信息。在一些情况下，这些样品以小量从单细胞获得。对于涉及小样品的研究、诊断和治疗，需要高度准确、可扩展且有效的核酸扩增和测序方法，尤其是用于高通量分析的方法。

发明内容

本文提供了用于高通量样品分析的装置、方法和系统。

本文提供了从单细胞扩增的方法，其包括：(a)使单细胞与裂解缓冲剂接触，其中裂解缓冲剂包含至少一个扩增引物；(b)

同时向裂解缓冲剂添加：中和缓冲剂、至少一种核酸聚合酶和核苷酸混合物，其中核苷酸混合物包含至少一种终止子核苷酸，所述终止子核苷酸终止聚合酶的核酸复制；以及(c)扩增基因组中的至少一些以产生多个终止的扩增产物，其中复制通过链置换复制进行，其中如果裂解缓冲剂或中和缓冲剂包含TWEEN-20，则TWEEN-20的量不多于0.2％。本文提供了从单细胞扩增的方法，其包括：(a)从细胞群体分离单细胞；(b)使单细胞与裂解缓冲剂接触，其中裂解缓冲剂包含至少一种扩增引物；(c)使单细胞与中和缓冲剂、至少一种核酸聚合酶和核苷酸混合物接触，其中核苷酸混合物包含至少一种终止子核苷酸，所述终止子核苷酸终止聚合酶的核酸复制；以及(d)扩增基因组中的至少一些以产生多个终止的扩增产物，其中复制通过链置换复制进行。本文还提供了方法，其中裂解缓冲剂包括碱、缓冲剂和螯合剂中的一种或多种。本文还提供了方法，其中缓冲剂包括HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)。本文还提供了方法，其中裂解缓冲剂的一种或多种组分的浓度范围为约10mM至约500mM。本文还提供了方法，其中裂解缓冲剂的pH为约11至约14。本文还提供了方法，其中步骤(b)进行多于10分钟。本文还提供了方法，其中步骤(b)、步骤(c)或步骤(b)和步骤(c)两者进行少于10小时。本文还提供了方法，其中步骤(b)、步骤(c)或步骤(b)和步骤(c)两者进行少于1小时。本文还提供了方法，其中该方法进一步包括在步骤(c)之后直接添加ERAT和/或连接混合物。本文还提供了方法，其中终止子是不可逆终止子。本文还提供了方法，其中终止子核苷酸选自带有α基团修饰的核苷酸、C3间隔子核苷酸、锁核酸(LNA)、反向核酸、2’氟核苷酸、3’磷酸化核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸和反式核酸。本文还提供了方法，其中带有α基团修饰的核苷酸是α-硫代双脱氧核苷酸。本文还提供了方法，其中终止子核苷酸包含脱氧核糖的3’碳的r基团的修饰。本文还提供了方法，其中终止子核苷酸选自双脱氧核苷酸、反向双脱氧核苷酸、3’生物素化核苷酸、3’氨基核苷酸、3’-磷酸化核苷酸、3’-O-甲基核苷酸、包括3’C3间隔子核苷酸、3’C18核苷酸、3’己二醇间隔子核苷酸的3’碳间隔子核苷酸、无环核苷酸及其组合。本文还提供了方法，其中镁的浓度小于8mM。本文还提供了方法，其中核苷酸混合物包含至少一种dNTP。本文还提供了方法，其中至少一种dNTP以0.1-5mM的浓度存在。本文还提供了方法，其中至少一种dNTP以小于2.5mM的浓度存在。本文还提供了方法，其中至少一种终止子核苷酸以小于0.3mM的浓度存在。本文还提供了方法，其中聚合酶基本上不具有聚合酶活性直至加热到至少40℃。本文还提供了方法，其中该方法进一步包括对多个终止的扩增产物或其扩增子测序。本文还提供了方法，其中测序导致以下一种或多种：等位基因平衡为至少0.8；1X覆盖率为至少0.95；精确度为至少0.99；以及SNV灵敏度为至少0.85。本文还提供了方法，其中单细胞为NA12878。本文还提供了方法，其中该方法包括分析至少100个细胞。本文还提供了方法，其中该方法包括分析至少1000个细胞。

本文提供了组合物，其包含至少一种扩增引物、至少一种核酸聚合酶、缓冲剂和核苷酸混合物，其中核苷酸混合物包含至少一种dNTP和至少一种终止子核苷酸，所述终止子核苷酸终止聚合酶的核酸复制，其中缓冲剂包含镁，其中镁的浓度小于8mM。本文还提供了组合物，其中该组合物进一步包含靶核酸分子。本文还提供了组合物，其中镁的浓度为3-6mM。本文还提供了组合物，其中缓冲剂包含氯化镁。本文还提供了组合物，其中至少一种dNTP以0.1-5mM的浓度存在。本文还提供了组合物，其中至少一种dNTP以小于2.5mM的浓度存在。本文还提供了组合物，其中至少一种dNTP以0.5-2mM的浓度存在。本文还提供了组合物，其中dNTP和终止子与镁的浓度比为0.5-1.5。本文还提供了至少一种终止子核苷酸以小于0.3mM的浓度存在的组合物。本文还提供了至少一种终止子核苷酸以0.05-0.20mM的浓度存在的组合物。本文还提供了终止子是不可逆终止子的组合物。本文还提供了终止子核苷酸选自带有α基团修饰的核苷酸、C3间隔子核苷酸、锁核酸(LNA)、反向核酸、2’氟核苷酸、3’磷酸化核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸和反式核酸的组合物。本文还提供了带有α基团修饰的核苷酸是α-硫代双脱氧核苷酸的组合物。本文还提供了终止子核苷酸包含脱氧核糖的3’碳的r基团的修饰的组合物。本文还提供了终止子核苷酸选自双脱氧核苷酸、反向双脱氧核苷酸、3’生物素化核苷酸、3’氨基核苷酸、3’-磷酸化核苷酸、3’-O-甲基核苷酸、包括3’C3间隔子核苷酸、3’C18核苷酸、3’己二醇间隔子核苷酸的3’碳间隔子核苷酸、无环核苷酸及其组合的组合物。本文还提供了组合物，该组合物进一步包含裂解缓冲剂。本文还提供了裂解缓冲剂包括碱、缓冲剂和螯合剂中的一种或多种的组合物。本文还提供了缓冲剂包括HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO或TEA的组合物。本文还提供了裂解缓冲剂的一种或多种组分的浓度范围为约10mM至约500mM的组合物。本文还提供了组合物，其中镁的浓度为2-4mM。

援引并入

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同特别地且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考对在其中利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的以下详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：

图1A和图1B示出了与四步骤PTA方法(顶部)相比，使用两步骤PTA方法(底部)对单细胞进行高通量分析的工作流程。

图2A示出了包括裂解、中和、引发和PTA反应步骤的四步骤PTA的信号与循环的图表。

图2B示出了包括裂解/引发和中和/PTA反应步骤的两步骤PTA的信号与循环的图表。

图3示出了使用两步骤PTA的核酸(ng)的产量。NTC意为无模板对照。SC意为单细胞。不同颜色代表不显示扩增的复制。

图4示出了四步骤PTA(带有X的圆)与两步骤PTA(实心圆)的线粒体读段(％)与pre-seq值。所测试条件当中的最佳性能在加框区域中示出。x轴标记为0、0.01和0.02的染色体M比例；y轴以0.5x10⁹的间隔表示从0到4.5x10⁹的pre-seq值。

图5A示出了实时PTA图，显示对于使用对照的SB4B条件作为扩增循环函数的产量(以荧光测量)。x轴以20单位间隔标记为0到120的循环，y轴以50,000单位间隔标记为0到500,000的荧光。

图5B示出了实时PTA图，显示对于使用单细胞的SB4B条件作为扩增循环函数的产量(以荧光测量)。x轴以20单位间隔标记为0到120的循环，y轴以50,000单位间隔标记为0到500,000的荧光。

图5C示出了实时PTA图，显示对于使用对照的SB4W条件作为扩增循环函数的产量(以荧光测量)。x轴以20单位间隔标记为0到120的循环，y轴以50,000单位间隔标记为0到500,000的荧光。

图5D示出了实时PTA图，显示对于使用单细胞的SB4B条件作为扩增循环函数的产量(以荧光测量)。x轴以20单位间隔标记为0到120的循环，y轴以50,000单位间隔标记为0到500,000的荧光。

图5E示出了实时PTA图，显示对于样品A-P作为扩增循环函数的产量(以荧光测量)。x轴以20单位间隔标记为0到120的循环，y轴以25,000单位间隔标记为0到200,000的荧光。

图6A示出了Mg、dNTP、ddNTP、SB4中的KOH、Phi29、SEZ分离(S)或组合(C)的浓度改变(x轴的顶部至底部)对产量的影响。以ng/μL为单位的产量在y轴上以200单位间隔示出0到1000。不同条件在x轴上示出。标记了SB4W(实框)和SB4B(虚框)条件。

图6B示出了SB4B-nom、SB4D和SB4W条件的图，显示SB4B-nom(顶部)、SB4D(中部)和SB4W(底部)的片段大小。y轴以1000单位间隔标记为0到2000的样品强度[归一化的FU]；x轴表示大小(bp)，标记有15、100、250、400、600、1000、1500、2500、3500、5000和10000。

图6C示出了Mg、dNTP、ddNTP、SB4中的KOH、Phi29、SEZ分离(S)或组合(C)的浓度改变(x轴的顶部至底部)对Pre-seq值的影响。Pre-seq值在y轴上以10⁹单位间隔示出0到4x10⁹。不同条件在x轴上示出。标记了SB4W(实框)和SB4B(虚框)条件。

图6D示出了Mg、dNTP、ddNTP、SB4中的KOH、Phi29、SEZ分离(S)或组合(C)的浓度改变(x轴的顶部至底部)对嵌合体率的影响。嵌合体率在y轴上以5单位间隔示出0到40。不同条件在x轴上示出。标记了SB4W(实框)和SB4B(虚框)条件。

图7A示出了反应设置，包括将多个NTC、1ng gDNA、100pg gDNA和10pg gDNA对照添加到含有经分选单细胞的384孔板中。将1μL细胞缓冲剂分配到列2至列23的孔中。然后将细胞分选到这些孔(FACS/FANS等)中。在处理/PTA扩增之前，如所示的，将1μL对照样品添加到列1和列24中。

图8A描绘了使用2步骤PTA反应扩增之后原始DNA产量(ng)的图。y轴以100单位间隔标记为0至400ng的产量。

图8B描绘了从2步骤PTA反应获得的片段大小的图。y轴以500单位间隔标记为0至2000归一化的FU的样品强度。x轴以15、100、250、400、600、1000、1500、2500、3500、5000和10000标记为大小(bp)。

图9示出了来自单细胞使用各种反应缓冲剂制剂(L1-L5G)的PreSeq数据图。y轴以1x10间隔标记为1x10⁹至4x10⁹的PreSeq(估计的基因组大小)。x轴标记为L1、L2、L3、L4、L5F和L5G的反应条件。符号代表反应缓冲剂SB5中不同的镁离子浓度：圆(2.2mM)、上指三角形(2.2+0.2mM)、下指三角形(2.2+0.3mM)和菱形(2.45mM)。

图10A描绘了两步骤与四步骤PTA方法的扩增时间图。2步骤方法的时间减少了约4X，达到2.5小时。

图10B描绘了两步骤与四步骤PTA方法的产量图。两种方法都产生了足够的扩增基因组来制备NGS文库。

图11A-图11D描绘了四步骤(V1)和两步骤(V2)方法的测序指标图。在任一操作模式下，反应的等位基因平衡都较高并且偏差较小(自动与手动，图11A)。1X的基因组覆盖率也有改善(图11B)，其具有改善单核苷酸变异检测总体灵敏度的下游效应(图11C)，其检测事件的精确度未受影响(图11D)。

具体实施方式

需要开发新的可扩展、准确且有效的核酸扩增(包括单细胞和多细胞基因组扩增)和测序方法，其将通过以可再现的方式增加序列呈现、均匀性和准确性来克服当前方法的局限性。本文提供了用于提供准确且可扩展的原代模板定向扩增(PTA)和测序的组合物和方法。本文还提供了高通量PTA的方法。本文还提供了多组学分析的方法，所述方法包括与PTA组合分析来自单细胞的蛋白质、DNA和RNA，以及相应的转录后或翻译后修饰。尤其是对于高通量应用，存在对于减少处理时间的简化工作流程的需要。

定义

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与这些发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。

在整个本公开内容中，数字特征以范围格式表示。应理解，范围格式的描述仅为了方便和简洁，而不应被解释为对任何实施方案的范围的严格限制。因此，除非上下文另有明确指示，否则应认为对范围的描述已具体公开了所有可能的子范围以及在该范围内直至下限单位的十分之一的单个数值。例如，对范围如从1至6的描述应视为已具体公开了子范围，如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及该范围内的单个值，例如，1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的宽度如何，这都适用。这些中间范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包括在本发明内，受规定范围内任何明确排除的限制。当所述范围包括一个或两个限值时，除非上下文另外明确指出，否则排除所包括的那些限值中的一个或两个的范围也包括在本发明中。

本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制任何实施方案。如本文所用，单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确指出。还将理解，当在本说明书中使用术语“包括(comprises)”和/或“包含(comprising)”时，其指定了所述特征、整体、步骤、操作、要素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其他特征、整体、步骤、操作、要素、组件和/或其群组的存在或添加。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关联的所列项目的任何和所有组合。

除非特别说明或从上下文可以明显看出，否则如本文所用，术语“约”在提及数值或数值范围时应理解为是指所述数值+/-其10％，或对于一个范围中列出的值，则指从比列出的下限低10％到比列出的上限高10％。

如本文所用，术语“对象”或“患者”或“个体”是指动物，包括哺乳动物，例如人类、兽医动物(例如，猫、狗、牛、马、绵羊、猪等)和疾病实验动物模型(例如，小鼠、大鼠)。根据本发明，可以在本领域技术范围内使用常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York(本文中为“Sambrook等人,1989”)；DNA Cloning:A practicalApproach,第I和II卷(D.N.Glover编著1985)；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait编著1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编著(1985》；Transcription and Translation(B.D.Hames和S.J.Higgins编著(1984》；Animal CellCulture(R.I.Freshney编著(1986》；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,(1986》；B.Perbal,A practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编著),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)；等等。

术语“核酸”涵盖多链以及单链分子。在双链或三链核酸中，核酸链不需要是共延伸的(即，双链核酸不需要沿两条链的整个长度是双链的)。本文所述的核酸模板可以根据样品(从小的无细胞DNA片段至整个基因组)而具有任何大小，包括但不限于长度为50-300个碱基、100-2000个碱基、100-750个碱基、170-500个碱基、100-5000个碱基、50-10,000个碱基或50-2000个碱基。在一些情况下，模板的长度为至少50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000或大于1,000,000个碱基。本文所述的方法提供了核酸如核酸模板的扩增。本文所述的方法另外提供了分离的和至少部分纯化的核酸以及核酸文库的生成。在一些情况下，本文所述的方法提供了提取的核酸(例如，从组织、细胞或培养基中提取)。核酸包括但不限于包括以下的那些：DNA、RNA、环状RNA、mtDNA(线粒体DNA)、cfDNA(无细胞DNA)、cfRNA(无细胞RNA)、siRNA(小干扰RNA)、cffDNA(无细胞胎儿DNA)、mRNA、tRNA、rRNA、miRNA(微RNA)、合成多核苷酸、多核苷酸类似物、符合本说明书的任何其他核酸，或其任何组合。当提供时，多核苷酸的长度以碱基数描述并且进行缩写，如nt(核苷酸)、bp(碱基)、kb(千碱基)或Gb(千兆碱基)。

如本文所用，术语“液滴”是指液滴致动器上的一定体积液体。在一些情况下，例如，液滴是水性或非水性的，或者可以是包括水性和非水性组分的混合物或乳液。对于可经受液滴操作的液滴流体的非限制性示例，参见，例如，国际专利申请公开号WO2007/120241。在本文提出的实施方案中，可以使用任何适于形成和操纵液滴的系统。例如，在一些情况下，使用液滴致动器。对于可以使用的液滴致动器的非限制性示例，参见，例如，美国专利号6,911,132、6,977,033、6,773,566、6,565,727、7,163,612、7,052,244、7,328,979、7,547,380、7,641,779、美国专利申请公开号US20060194331、US20030205632、US20060164490、US20070023292、US20060039823、US20080124252、US20090283407、US20090192044、US20050179746、US20090321262、US20100096266、US20110048951、国际专利申请公开号WO2007/120241。在一些情况下，珠在液滴中、在液滴操作间隙中或在液滴操作表面上提供。在一些情况下，珠在位于液滴操作间隙外部或与液滴操作表面分开的储器中提供，并且该储器可以与流动路径相关联，该流动路径允许包括该珠的液滴进入液滴操作间隙或与液滴操作表面接触。用于固定磁响应珠和/或非磁响应珠和/或使用珠进行液滴操作方案的液滴致动器技术的非限制性示例在美国专利申请公开号US20080053205、国际专利申请公开号WO2008/098236、WO2008/134153、WO2008/116221、WO2007/120241中描述。珠特性可以在本文所述的方法的多路复用实施方案中采用。具有适合于多路复用的特性的珠的示例，以及检测和分析从这种珠发出的信号的方法，可以在美国专利申请公开号US20080305481、US20080151240、US20070207513、US20070064990、US20060159962、US20050277197、US20050118574中找到。

也可以将引物和/或模板切换寡核苷酸附连至固体基底以促进mRNA多核苷酸的逆转录和模板切换。在该布置中，RT或模板切换反应的一部分发生在装置的本体溶液中，其中反应的第二步骤接近于表面进行。在其他布置中，使模板切换寡核苷酸的引物从固体基底中释放以允许整个反应在溶液中的表面上方进行。在多组学方法中，在一些情况下，将用于多级反应的引物附连至到固体基底或与珠组合以实现多级引物的组合。

某些微流体装置也支持多组学方法。例如，以PDMS制造的装置通常具有用于每个反应步骤的连续腔室。此类多腔室化装置通常使用微型阀结构进行隔离，所述微型阀结构可以用空气或流体如水或惰性烃(即fluorinert)通过压力控制。在多组学方法中，可以将反应的每个级隔离并且允许其离散地进行。在完成特定级时，可以释放相邻腔室之间的阀，并且可以以串联方式添加用于后续反应的基底。结果是能够使用个体细胞作为输入模板材料来模拟反应的序列组，如反应的多组学(蛋白质/RNA/DNA/表观基因组学)组。各种微流体平台可用于分析单细胞。在一些情况下，通过流体动力学(液滴微流体、惯性微流体、涡旋、微型阀、微观结构(例如，微孔、微阱))、电方法(电泳(DEP)、电渗)、光学方法(光学镊子、光学诱导介电泳(ODEP)、光学热毛细)、声学方法或磁性方法操纵细胞。在一些情况下，微流体平台包括微孔。在一些情况下，微流体平台包括基于PDMS(聚二甲基硅氧烷)的装置。与本文所述的方法相容的单细胞分析平台的非限制示例是：ddSEQ单细胞分离器(Bio-Rad，Hercules，CA,USA和Illumina,San Diego,CA,USA))；Chromium(10x Genomics,Pleasanton,CA,USA))；Rhapsody单细胞分析系统(BD,Franklin Lakes,NJ,USA)；Tapestri平台(MissionBio,San Francisco,CA,USA))；Nadia Innovate(Dolomite Bio,Royston,UK)；C1和Polaris(Fluidigm,South San Francisco,CA,USA)；ICELL8单细胞系统(Takara)；MSND(Wafergen)；Puncher平台(Vycap)；CellRaft AIR系统(CellMicrosystems)；DEPArray NxT和DEPArray系统(Menarini Silicon Biosystems)；AVISO CellCelector(ALS)；以及InDrop系统(1CellBio)和TrapTx(Celldom)。

如本文所用，术语“独特分子标识码(UMI)”是指附接至多个核酸分子中的每一个的独特核酸序列。当并入核酸分子中时，在一些情况下，UMI被用于通过直接对扩增后测序的UMI进行计数来校正后续的扩增偏倚。UMI的设计、并入和应用描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO 2012/142213；Islam等人Nat.Methods(2014)11:163-166；Kivioja,T.等人Nat.Methods(2012)9:72-74；Brenner等人(2000)PNAS 97(4),1665；以及Hollas和Schuler,(2003)Conference:3rd International Workshop on Algorithms inBioinformatics,第2812卷。

如本文所用，术语“条形码”是指可用于鉴定核酸材料的样品或来源的核酸标签。因此，在核酸样品来自多个来源的情况下，在一些情况下，每个核酸样品中的核酸用不同的核酸标签标记，从而可以鉴定样品的来源。条形码，通常也称为索引、标签等，是本领域技术人员熟知的。任何合适的条形码或条形码组都可以使用。参见，例如，美国专利号8,053,192和国际专利申请公开号WO2005/068656中提供的非限制性示例。单细胞的条形码化可以例如如美国专利申请公开号2013/0274117中描述地进行。

本文中的术语“固体表面”、“固体支持物”和其他语法等同物是指适合于或可以被修饰以适合于本文所述的引物、条形码和序列的附接的任何材料。示例性基底包括但不限于玻璃和改性或功能化玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯，和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、特氟龙^TM等)、多糖、尼龙、硝酸纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅、二氧化硅基材料(例如，硅或改性硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、光纤束和各种其他聚合物。在一些实施方案中，固体支持物包括适于以有序模式固定引物、条形码和序列的图案化表面。

如本文所用，术语“生物样品”包括但不限于组织、细胞、生物流体及其分离物。在一些情况下，本文所述方法中使用的细胞或其他样品是从人类患者、动物、植物、土壤或包括如细菌、真菌、原生动物等微生物的其他样品中分离的。在一些情况下，生物样品来源于人类。在一些情况下，生物样品并非来源于人类。在一些情况下，细胞经历本文所述的PTA方法和测序。在整个基因组或特定位置检测到的变体可以与从该对象分离的所有其他细胞进行比较，以追踪细胞谱系的历史，以用于研究或诊断目的。在一些情况下，通过另外的分析方法如直接PCR测序确认变体。

高通量原代模板定向扩增

本文还提供了用于高通量原代模板定向扩增(PTA)的方法。在一些情况下，模板包括DNA、RNA或单细胞。在一些情况下，方法包括一个、二个、三个、四个或五个步骤。在一些情况下，方法包括两步骤PTA方法。如图1A和图1B中所示，两步骤PTA方法包括裂解(步骤1)和反应混合物添加(步骤2)。与四步骤PTA方法相比，在一些情况下，分别地，两步骤PTA方法将裂解和引发步骤组合成单个步骤(步骤1)，并且将中和与反应混合物添加步骤组合成单个步骤(步骤2)。在一些情况下，这消除了PTA后净化的需要，以将ERAT/连接直接添加至扩增产物。此外，两步骤PTA方法可以将许多反应合并到单管中用于纯化和PCR。在一些情况下，将步骤中使用的所有试剂一起添加至反应混合物。在一些情况下，将步骤中使用的所有试剂一起添加至来自先前步骤(即，顺序添加)的反应混合物。处理大量同时处理的样品可以需要许多液体处理步骤以及延长的设置时间，这可以有助于降低样品之间的效率和时间延迟。在一些情况下，顺序添加既减少了液体处理步骤的数目，又减少了总体工作流程时间。

本文提供了包括使单细胞与裂解缓冲剂接触的一个或多个步骤的方法，其中裂解缓冲剂包含至少一种扩增引物；同时向裂解缓冲剂添加：中和缓冲剂、至少一种核酸聚合酶和核苷酸混合物，其中核苷酸混合物包含至少一种终止子核苷酸，所述终止子核苷酸终止聚合酶的核酸复制；并且扩增基因组中的至少一些以产生多个终止的扩增产物，其中复制通过链置换复制进行。在一些情况下，当裂解缓冲剂或中和缓冲剂包含TWEEN-20时，TWEEN-20的量不多于0.2％(v/v)。在一些情况下，反应混合物中Tween-20的量不多于0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.5或不多于0.1％(v/v)。

在一些情况下，将裂解缓冲剂与本文所述的方法一起使用。在一些情况下，缓冲剂pH是约11、11.5、12、12.5、13、13.5或约14。在一些情况下，缓冲剂pH是12-14、12.5-14、12.5-13.5或13-14。在一些情况下，缓冲剂pH是至少11.5、12、12.5、13或至少13.5。在一些情况下，裂解缓冲剂的浓度是至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或多于100mM。在一些情况下，裂解缓冲剂的浓度是至少约100、200、300、400、500或多于500mM。在一些实施方案中，裂解缓冲剂的浓度是约10mM和约100mM、约20mM和约400mM、30mM和约300mM、约40mM和约200mM、约50mM和约100mM。在一些情况下，两步骤PTA方法中的裂解缓冲剂的浓度高于四步骤PTA方法。在一些情况下，两步骤PTA方法中的裂解缓冲剂浓度与四步骤PTA方法相当。

在一些情况下，缓冲剂包括表面活性剂/洗涤剂或变性剂(Tween-20、Triton X-1--(例如，100、114等)、Igepal或NP-40、DMSO、DMF、包括疏水基团的聚乙二醇化聚合物或其他表面活性剂)、盐(磷酸钾或磷酸钠(一元或二元)、氯化钠、氯化钾)、TrisHCl、氯化镁或硫酸镁、铵盐，如磷酸盐、硝酸盐或硫酸盐、EDTA)、还原剂(DTT、THP、DTE、β-巯基乙醇、TCEP或其他还原剂)或其他组分(甘油、亲水性聚合物，如PEG)。在一些情况下，裂解缓冲剂是磺酸缓冲剂。在一些情况下，裂解缓冲剂是两性离子型磺酸缓冲剂。在一些情况下，裂解缓冲剂是BES、MOPS、TES、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO或TEA。在一些情况下，裂解缓冲剂是HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)。在一些情况下，裂解缓冲剂包括碱或本文所述的用于细胞裂解的其他试剂。在一些情况下，本文所述的试剂或缓冲剂包括表面活性剂/变性剂。在一些情况下，表面活性剂/变性剂包括Tween-20、Triton X-1--(例如，100、114等)、Igepal或NP-40、DMSO、DMF、包括疏水基团的聚乙二醇化聚合物或其他表面活性剂。在一些情况下，表面活性剂/变性剂的量为0.1-5％、0.2-5％、0.3-5％、0.3-4％、0.3-3％、0.2-2％、0.1-0.5％、0.1-3％、0.1-2％、0.2-5％或0.2-0.8％(v/v)。在一些情况下，本文所述的缓冲剂中Tween-20的量不多于0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.5或不多于0.1％(v/v)。

在一些情况下，裂解缓冲剂的温度为1-30℃。在一些情况下，裂解缓冲剂的温度不高于10、15、20、25或不高于30℃。在一些情况下，裂解缓冲剂的温度为约2、5、10、15、20、25或约30℃。

在一些情况下，裂解缓冲剂还包含至少一种引物。在一些情况下，引物包含硫代膦酸酯键联。在一些情况下，裂解缓冲剂中样品的停留时间多于约5、10、15、20、25、30或多于30分钟。在一些情况下，裂解缓冲剂中样品的停留时间不多于60、50、40、30、20、10分钟或不多于10分钟。

在一些情况下，将反应混合物用于PTA反应。在一些情况下，反应混合物的温度为12-30、10-30、15-30、15-25、17-23或20-30℃。在一些情况下，反应混合物的温度为约15、17、20、22、25、27或约30℃。在一些情况下，反应混合物的温度开始于PTA开始时的第一温度，然后在PTA反应完成之后冷却至第二温度。在一些情况下，反应混合物的温度在PTA开始时为30℃，并且在PTA反应完成之后冷却至4-10℃。在一些情况下，使用染料实时测量PTA反应。在一些情况下，染料是嵌入染料。在一些情况下，反应混合物中样品的停留时间不超过10、8、6、4、3小时或不超过2小时。在一些情况下，反应腔室混合物中样品的停留时间是约10、8、6、4、3小时或约2小时。在一些情况下，反应混合物中样品的停留时间是2-10小时、2-8小时、1-8小时、4-10小时、4-8小时或6-10小时。在一些情况下，反应混合物中样品的停留时间基于产生的扩增产物的量确定。在一些情况下，反应混合物中样品的停留时间使得产生约50、60、75、80、90、100、110、125、150、200或500ng的扩增产物。在一些情况下，反应混合物中样品的停留时间使得产生约50-500、50-200、75-125、50-100、75-150、100-250、100-500或200-500ng的扩增产物。在一些情况下，反应混合物包含中和缓冲剂。在一些情况下，中和缓冲剂包括酸或本文所述的用于中和的其他试剂。在一些情况下，缓冲剂pH是约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5或约4。在一些情况下，缓冲剂pH是0.5-5、0.5-4、0.5-3、0.5-2.5、0.5-2或1-3。在一些情况下，反应混合物包含表面活性剂/变性剂。在一些情况下，表面活性剂/变性剂包括Tween-20、Triton X-1--(例如，100、114等)、Igepal或NP-40、DMSO、DMF、包括疏水基团的聚乙二醇化聚合物或其他表面活性剂。在一些情况下，表面活性剂/变性剂的量为0.1-5％、0.2-5％、0.3-5％、0.3-4％、0.3-3％、0.2-2％、0.1-0.5％、0.1-3％、0.1-2％、0.2-5％或0.2-0.8％(v/v)。

在一些情况下，缓冲剂包含一种或多种金属离子。在一些情况下，金属离子作为盐存在。在一些情况下，金属离子包括镁、钾、钙、钠、锰或锂。在一些情况下，盐包括抗衡离子。在一些情况下，盐包括无机抗衡离子。在一些情况下，所述抗衡离子包括氯离子、溴离子、碘离子、硫酸氢根、硫酸根、磷酸根、磷酸氢根、碳酸根、碳酸氢根或六氟磷酸根。在一些情况下，盐包括有机抗衡离子。在一些情况下，所述抗衡离子包括乙酸根、丙酸根或柠檬酸根。在一些情况下，金属离子以0.5-20、0.5-15、0.5-10、0.5-9、0.5-6、1-20、1-15、1-10、2-15、2-10、5-20、5-15、2-5、1-5、0.5-5、0.05-6、2-6或3-6mM的浓度存在于PTA反应中。在一些情况下，金属离子以不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或不超过0.2mM的浓度存在于PTA反应中。在一些情况下，金属离子包括镁。在一些情况下，镁以0.5-20、0.5-15、0.5-10、0.5-9、0.5-6、1-20、1-15、1-10、2-15、2-10、5-20、5-15、2-5、1-5、0.5-5、0.05-6、2-6或3-6mM的浓度存在于PTA反应中。在一些情况下，镁以不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或不超过0.2mM的浓度存在于PTA反应中。在一些情况下，以相对于NTP(例如，dNTP、终止子)的比率来使用镁。在一些情况下，dNTP和终止子与镁的浓度比为0.5-1.5、0.1-2、0.3-2、0.4-1.7、0.5-1.3、0.7-1.2、0.8-1.3、0.8-1.5、0.5-3、0.5-2.5、0.5-1.2或1-3。在一些情况下，dNTP与镁的浓度比为0.5-1.5、0.1-2、0.3-2、0.4-1.7、0.5-1.3、0.7-1.2、0.8-1.3、0.8-1.5、0.5-3、0.5-2.5、0.5-1.2或1-3。在一些情况下，终止子与镁的浓度比为0.5-1.5、0.1-2、0.3-2、0.4-1.7、0.5-1.3、0.7-1.2、0.8-1.3、0.8-1.5、0.5-3、0.5-2.5、0.5-1.2或1-3。

由多个步骤(例如，两步骤过程)组合的PTA反应可以包含许多不同试剂。

PTA反应可以包含缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂包括细胞缓冲剂、裂解缓冲剂或其他缓冲剂。在一些情况下，细胞缓冲剂从细胞分选或其他细胞采集过程保留。在一些情况下，细胞缓冲剂以0.1-0.5、0.05-0.3、0.05-0.5、0.2-0.3、0.2-0.5或0.2-0.8mM存在。在一些情况下，PTA反应包括BES、MOPS、TES、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO或TEA。在一些情况下，BES、MOPS、TES、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO或TEA以50-300、50-200、50-150、100-300、100-200、100-150、125-150、115-145或125-300mM的浓度存在。

PTA反应可以包含盐。在一些情况下，盐包括钠。在一些情况下，盐包括氯阴离子。在一些情况下，钠或氯阴离子的浓度为20-50、10-60、5-60、10-30、20-40、30-40或30-60mM。在一些情况下，盐包括硫酸铵。在一些情况下，硫酸铵的浓度为10-50、10-60、5-60、10-30、10-40、5-15或15-50mM。在一些情况下，盐包括镁。在一些情况下，镁的浓度为1-10、1-8、1-6、2-8、2-6或4-5mM。在一些情况下，盐包括EDTA。在一些情况下，EDTA的浓度为0.1-0.5、0.05-0.3、0.05-0.5、0.2-0.3、0.2-0.5或0.2-0.8mM。

PTA反应可以包含碱。在一些情况下，碱包括氢氧化物。在一些情况下，碱以10-100、10-80、10-70、10-50、25-100、25-75、30-60、40-75或40-60mM的浓度存在。在一些情况下，碱包括氢氧化物并且以10-100、10-80、10-70、10-50、25-100、25-75、30-60、40-75或40-60mM的浓度存在。

PTA反应可以包含还原剂。在一些情况下，还原剂包括DTT。在一些情况下，还原剂以5-20、5-15、5-10、7-20、7-15、7-10、9-12或10-20mM的浓度存在。

PTA反应可以包含报道染料。在一些情况下，染料包括Eva绿、SYBR绿或其他染料。在一些情况下，染料以0.01-0.1、0.01-0.2、0.02-2、0.05-0.1、0.05-0.2或0.8-0.9当量使用。

PTA反应可以包含表面活性剂/变性剂。在一些情况下，表面活性剂/变性剂包括Tween-20、Triton X-1--(例如，100、114等)、Igepal或NP-40。在一些情况下，表面活性剂的浓度为0.01-1.0、0.01-0.8、0.01-0.7、0.5-0.5、0.1-0.4、0.1-0.3或0.05-0.3(v/v)。在一些情况下，表面活性剂/变性剂的量为0.1-5％、0.2-5％、0.3-5％、0.3-4％、0.3-3％、0.2-2％、0.1-0.5％、0.1-3％、0.1-2％、0.2-5％或0.2-0.8％(v/v)。在一些情况下，Tween-20的浓度为0.01-1.0、0.01-0.8、0.01-0.7、0.5-0.5、0.1-0.4、0.1-0.3或0.05-0.3％(v/v)。在一些情况下，Tween-20的浓度的量为0.1-5％、0.2-5％、0.3-5％、0.3-4％、0.3-3％、0.2-2％、0.1-0.5％、0.1-3％、0.1-2％、0.2-5％或0.2-0.8％(v/v)。在一些情况下，本文所述的缓冲剂中Tween-20的量不多于0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.5或不多于0.1％(v/v)。

PTA反应可以包含dNTP。在一些情况下，dNTP包括dATP、dTTP、dGTP或dCTP。在一些情况下，dNTP的浓度为0.4-0.8、0.2-0.8、0.3-0.8、0.4-0.8、0.5-0.7、0.6-1.0、0.6-0.8或0.7-1.5mM。在一些情况下，PTA反应包含终止子。在一些情况下，终止子包括ddATP、ddTTP、ddGTP或ddCTP。在一些情况下，终止子包括α-硫代ddATP、ddTTP、ddGTP或ddCTP。在一些情况下，终止子的浓度为0.01-0.2、0.01-0.15、0.05-0.15、0.05-0.1、0.05-0.2或0.75-1.25mM。

一个或多个步骤可以与本文所述的方法一起使用。在一些情况下，样品或试剂移动通过反应腔室。在一些情况下，通过在每个步骤添加不同试剂来顺序处理样品。在一些情况下，通过在每个步骤添加不同试剂而不在步骤之间进行纯化来顺序处理样品。

在第一步骤中，可以将珠转移至珠捕获位点。在一些情况下，每个珠捕获位点捕获一个珠。珠从捕获位点通过毛细管(例如，通道)移动至分析物添加腔室中。在一些情况下，将细胞或其他样品从珠释放。在一些情况下，使用EDTA来将细胞从藻酸钙珠释放以形成液滴。在一些情况下，分析物添加腔室包含约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6或约7纳升的液体。在一些情况下，分析物添加腔室包含不超过0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6或不超过7纳升的缓冲剂。在一些情况下，分析物添加腔室包含0.5-10、0.5-7、0.5-5、0.5-3、1-4或2-4纳升的缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂pH是约5.5、6、6.5、7、7.5、8或约8.5。在一些情况下，缓冲剂pH是5.5-8.5、5.5-8、6-8、6.5-7.5或7-8。在一些情况下，分析物添加腔室的温度是1℃-10℃。在一些情况下，分析物添加腔室的温度不超过10℃。在一些情况下，裂解腔室的温度是约2、4、5、7、9或约10℃。在一些情况下，分析物添加腔室中样品的停留时间不超过10min、7min、5min、4min、3min或不超过3min。

在第二步骤中，在关闭外部阀的情况下，液滴移动至裂解腔室中。在一些情况下，裂解腔室包含至少一种引物。在一些情况下，引物包含硫代膦酸酯键联。在一些情况下，将引物预先点样在腔室中并且任选地干燥，然后将液滴添加至装置。在一些情况下，裂解腔室包含约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6或约7纳升的液体。在一些情况下，裂解腔室包含不超过0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6或不超过7纳升的缓冲剂。在一些情况下，裂解腔室包含0.5-10、0.5-7、0.5-5、0.5-3、1-4或2-4纳升的缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂pH是约11、11.5、12、12.5、13、13.5或约14。在一些情况下，缓冲剂pH是12-14、12.5-14、12.5-13.5或13-14。在一些情况下，缓冲剂pH是至少11.5、12、12.5、13或至少13.5。在一些情况下，裂解缓冲剂包括碱或本文所述的用于细胞裂解的其他试剂。

在一些情况下，裂解腔室包含裂解缓冲剂。在一些情况下，裂解缓冲剂包括表面活性剂/洗涤剂或变性剂(Tween-20、Triton X-1--(例如，100、114等)、Igepal或NP-40、DMSO、DMF，包括疏水基团的聚乙二醇化聚合物或其他表面活性剂)、盐(磷酸钾或磷酸钠(一元或二元)、氯化钠、氯化钾)、TrisHCl、氯化镁或硫酸镁、铵盐，如磷酸盐、硝酸盐或硫酸盐、EDTA)、还原剂(DTT、THP、DTE、β-巯基乙醇、TCEP或其他还原剂)或其他组分(甘油、亲水性聚合物，如PEG)。在一些情况下，裂解缓冲剂是磺酸缓冲剂。在一些情况下，裂解缓冲剂是两性离子型磺酸缓冲剂。在一些情况下，裂解缓冲剂是HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)。在一些情况下，裂解缓冲剂包括碱或本文所述的用于细胞裂解的其他试剂。在一些情况下，裂解缓冲剂的浓度是至少约100、200、300、400、500或超过500mM。在一些实施方案中，裂解缓冲剂的浓度是约10mM和约100mM、约20mM和约400mM、30mM和约300mM、约40mM和约200mM、约50mM和约100mM。在一些情况下，裂解腔室的温度是1℃-30℃。在一些情况下，裂解腔室的温度不超过10℃、15℃、20℃、25℃或不超过30℃。在一些情况下，裂解腔室的温度是约2℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或约30℃。在一些情况下，裂解腔室中样品的停留时间不超过10min、7min、5min、4min、3min或不超过3min。在一些情况下，裂解腔室中样品的停留时间超过约5、10、15、20、25、30分钟或超过30分钟。在一些情况下，裂解腔室中样品的停留时间不超过60、50、40、30、20、10分钟或不超过10分钟。在一些情况下，裂解腔室包含一种或多种引物。

在第三步骤中，在关闭外部阀的情况下，液滴移动至中和腔室中。在一些情况下，中和腔室包含用于PTA反应的至少一种引物，如可逆或不可逆引物。在一些情况下，不可逆引物包含硫代膦酸酯键联。在一些情况下，将引物预先点样在腔室中并且任选地干燥，然后将液滴添加至装置。在一些情况下，中和腔室包含约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6或约7纳升的液体。在一些情况下，中和腔室包含不超过0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6或不超过7纳升的缓冲剂。在一些情况下，中和腔室包含0.5-10、0.5-7、0.5-5、0.5-3、1-4或2-4纳升的缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂pH是约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5或约4。在一些情况下，缓冲剂pH是0.5-5、0.5-4、0.5-3、0.5-2.5、0.5-2或1-3。在一些情况下，缓冲剂pH不超过5、4、3、2.5、2、1.5、1或不超过0.5。在一些情况下，中和缓冲剂包括酸或本文所述的用于中和裂解缓冲剂的其他试剂。在一些情况下，中和腔室的温度是10℃-30℃、15℃-30℃、15℃-25℃、17℃-23℃或20℃-30℃。在一些情况下，中和腔室的温度是约15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃或约30℃。在一些情况下，中和腔室中样品的停留时间不超过10min、7min、5min、4min、3min或不超过3min。在一些情况下，中和腔室中样品的停留时间不超过10、8、6、4、3小时或不超过2小时。在一些情况下，中和腔室中样品的停留时间是约10、8、6、4、3小时或约2小时。在一些情况下，中和腔室中样品的停留时间是2-10小时、2-8小时、1-8小时、4-10小时、4-8小时或6-10小时。在一些情况下，用于中和和PTA扩增的试剂在单一腔室中使用。

在第四步骤中，在关闭外部阀的情况下，液滴移动至引物添加腔室中。在一些情况下，引物添加腔室包含约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6或约7纳升的液体。在一些情况下，引物添加腔室包含不超过0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6或不超过7纳升的缓冲剂。在一些情况下，引物添加腔室包含0.5-10、0.5-7、0.5-5、0.5-3、1-4或2-4纳升的缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂pH是约5.5、6、6.5、7、7.5、8或约8.5。在一些情况下，缓冲剂pH是5.5-8.5、5.5-8、6-8、6.5-7.5或7-8。在一些情况下，引物添加腔室包含用于PTA反应的引物，如可逆或不可逆引物。在一些情况下，不可逆引物包含硫代膦酸酯键联。在一些情况下，引物添加腔室的温度是10℃-30℃、15℃-30℃、15℃-25℃、17℃-23℃或20℃-30℃。在一些情况下，引物添加腔室的温度是约15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃或约30℃。在一些情况下，将引物预先点样在腔室中并且任选地干燥，然后将液滴添加至装置。在一些情况下，引物添加腔室中样品的停留时间不超过10min、7min、5min、4min、3min或不超过3min。

在第五步骤中，在关闭外部阀的情况下，液滴移动至反应(混合物)腔室中。在一些情况下，PTA反应在反应腔室内部进行。在一些情况下，反应腔室包含约5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或约10纳升的液体。在一些情况下，反应腔室包含不超过6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、10.5、11、11.5或不超过12纳升的缓冲剂。在一些情况下，反应腔室包含0.5-10、0.5-7、0.5-5、0.5-3、1-4或2-4纳升的缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂pH是约5.5、6、6.5、7、7.5、8或约8.5。在一些情况下，缓冲剂pH是5.5-8.5、5.5-8、6-8、6.5-7.5或7-8。在一些情况下，反应腔室包含用于PTA反应的引物，如可逆或不可逆引物。在一些情况下，反应腔室的温度是12℃-30℃、10℃-30℃、15℃-30℃、15℃-25℃、17℃-23℃或20℃-30℃。在一些情况下，反应腔室的温度是约15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃或约30℃。在一些情况下，将被配置用于原代模板定向扩增的一种或多种试剂(例如，dNTP、终止子、聚合酶或其他组分)预先点样在腔室中并且任选地干燥，然后将液滴添加至装置。在一些情况下，反应腔室的温度在PTA开始时以第一温度起始并且后来在PTA反应完成之后冷却至第二温度。在一些情况下，反应腔室的温度在PTA开始时以30C起始并且在PTA反应完成之后冷却至12C。在一些情况下，使用染色实时测量PTA反应。在一些情况下，染料是嵌入染料。在一些情况下，反应腔室中样品的停留时间不超过12、10、8、6、4、3小时或不超过2小时。在一些情况下，反应腔室中样品的停留时间是约12、10、8、6、4、3小时或约2小时。在一些情况下，反应腔室中样品的停留时间是2-12小时、2-10小时、2-8小时、1-8小时、4-10小时或6-12小时。在一些情况下，反应腔室中样品的停留时间基于产生的扩增产物的量确定。在一些情况下，反应腔室中样品的停留时间使得产生约50、60、75、80、90、100、110、125、150、200或500ng的扩增产物。在一些情况下，反应腔室中样品的停留时间使得产生约50-500、50-200、75-125、50-100、75-150、100-250、100-500或200-500ng的扩增产物。

在第六步骤中，在关闭外部阀的情况下，液滴移动至ERAT(末端修复和加A尾)腔室中。在一些情况下，ERAT腔室包含约40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或约95纳升的液体。在一些情况下，ERAT腔室包含不超过40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或不超过95纳升的缓冲剂。在一些情况下，ERAT腔室包含40-100、40-90、50-70、55-80、60-100或80-120纳升的缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂pH是约5.5、6、6.5、7、7.5、8或约8.5。在一些情况下，缓冲剂pH是5.5-8.5、5.5-8、6-8、6.5-7.5或7-8。在一些情况下，ERAT腔室的温度是10℃-72℃、15℃-80℃、10℃-50℃、5℃-90℃或10℃-60℃。在一些情况下，ERAT腔室的温度是约10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃或约90℃。在一些情况下，反应腔室的温度在ERAT反应开始时以第一温度起始并且后来在ERAT反应完成之后冷却至第二温度。在一些情况下，反应腔室的温度在ERAT反应开始时以12C起始并且在ERAT反应完成之后加热至72℃。在一些情况下，将用于ERAT的试剂(例如，聚合酶、激酶、ATP、dNTP或其他试剂)预先点样在腔室中并且任选地干燥，然后将液滴添加至装置。在一些情况下，ERAT腔室中样品的停留时间不超过60min、50min、40min、30min、20min、15min、10min、5min或不超过3min。在一些情况下，ERAT腔室中样品的停留时间是5-40、5-30、5-20、5-60、10-60、10-50或20-40分钟。

在第七步骤中，液滴移动至连接腔室中。在一些情况下，在连接腔室中将测序衔接子连接至末端修复的核酸以产生衔接子连接的文库。在一些情况下，衔接子包含唯一地标识样品来源或唯一地标识样品中的每种分子的一种或多种样品条形码。在一些情况下，连接腔室包含约80、90、100、120、130、140、150、160或约170纳升的液体。在一些情况下，连接腔室包含不超过80、90、100、120、130、140、150、160或不超过170纳升的缓冲剂。在一些情况下，连接腔室包含40-200、60-200、100-130、80-160、100-200或80-200纳升的缓冲剂。在一些情况下，缓冲剂pH是约5.5、6、6.5、7、7.5、8或约8.5。在一些情况下，缓冲剂pH是5.5-8.5、5.5-8、6-8、6.5-7.5或7-8。在一些情况下，连接腔室的温度是10℃-72℃、15℃-80℃、10℃-50℃、5℃-90℃或10℃-60℃。在一些情况下，连接腔室的温度是约5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或约40℃。在一些情况下，将用于连接的试剂(例如，连接酶、衔接子或其他试剂)预先点样在腔室中并且任选地干燥，然后将液滴添加至装置。在一些情况下，将衔接子以100μM至1mM的浓度预先点样在连接腔室中，并且后来干燥。在一些情况下，连接腔室中衔接子的量是0.1-5、0.2-2、0.5-2、1-2或1-3皮摩尔。在一些情况下，将衔接子以约1、2、3、4、5、6、7、8或约9个点样预先点样在连接腔室中。

本文所述的方法可以在连接之后包括另外的步骤。在一些情况下，对衔接子连接的文库进一步扩增。在一些情况下，对衔接子连接的文库(进行或未进行扩增)进行测序。在一些情况下，将通过本文所述的装置处理的样品在移动通过最后腔室之后合并。在一些情况下，合并了至少5、10、20、50、75、100、200、500或超过500个样品。在一些情况下，从每个装置合并的样品的总数目包括至少1000、2000、5000、7000或至少10,000个细胞。

本文还描述了用于减小本文所述的一个或多个步骤的反应体积的方法。在一些情况下，本文所述的方法包括降低PTA反应的体积。在一些情况下，方法包括零体积细胞分选。在一些情况下，分选细胞并且将其以不超过25、50、75、100、125、150、200或不超过250纳升递送至本文所述的腔室。在一些情况下，分选细胞并且将其以100-500、50-500、150-250、200-500或75-150纳升递送至本文所述的腔室。在一些情况下，从PTA反应中省去细胞缓冲剂。在一些情况下，从单细胞的PTA反应中省去细胞缓冲剂。在一些情况下，PTA反应的总体积不超过1、0.5、0.2、0.1、0.05或不超过0.01纳升。在一些情况下，PTA反应的总体积是5-500、5-250、10-250、5-50、5-15或5-25纳升。在一些情况下，PTA反应的总体积不超过200、100、50、25、10或不超过5纳升。

本文还描述了用于实时测量PTA的方法。在一些情况下，使用染料来监测PTA反应的程度。在一些情况下，染料包括嵌入染料。在一些情况下，染料是Eva绿、SYBR绿、SYTO染料(例如，13、16、80或82)、BRYT绿或其他染料。在一些情况下，染料是Eva绿。在一些情况下，使用分子信标染料。在一些情况下，染料包括FRET对。在一些情况下，染料包括荧光团和淬灭剂。在一些情况下，染料包括FAM、SUN、Hex、Cy3、德克萨斯红或Cy5荧光团。在一些情况下，染料包括ZEN/Iowa Black、TAO或其他淬灭剂。

本文还描述了允许减少的处理时间的方法。在一些情况下，本文所述的方法从样品添加至样品合并或测序花费5-12、5-10、3-12、4-15、4-10、6-8或6-12小时。

阵列装置可以用于高通量细胞分析方法。在一些情况下，使包括微孔的阵列装置加载有样品。在一些情况下，样品包括细胞、珠、液滴或其他样品类型。在一些情况下，通过扩散、离心或其他加载方法使阵列加载有样品。在一些情况下，使阵列加载至约1％、5％、7％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、75％或约90％占有率。在一些情况下，使阵列加载至至少1％、5％、7％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、75％或至少90％占有率。在一些情况下，使阵列加载至不超过1％、5％、7％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、75％或不超过90％占有率。在一些情况下，根据图15B-15C中所示的工作流程中的一个或多个步骤使用阵列进行PTA反应。在一些情况下，方法包括以下中的一种或多种：将样品捕获在微孔中；在加载之后干燥每个微孔中的样品；使样品与DNA酶/RNA酶混合物接触；添加裂解试剂、中和试剂、PTA反应混合物、ERAT试剂、珠(包含测序衔接子)以及连接混合物(具有或不具有EDTA)中的一种或多种。在一些情况下，依序添加试剂并且干燥。在一些情况下，将每个微孔在真空下干燥，然后在真空下或通过离心重新填充有下一试剂。在一些情况下，将条形码添加至从每个样品(例如，细胞)获得的核酸。在一些情况下，将条形码在引发步骤时与珠一起添加或在连接步骤时与索引一起添加。在一些情况下，使用阵列产生的文库经受合并、纯化、扩增和测序中的一种或多种。

单细胞多组学

本文描述了用于高通量分析单细胞的方法、装置和组合物。大量细胞的分析提供有关细胞群体的一般信息，但通常无法在背景上检测低频率突变体。此类突变体可以包括重要特性，如抗药性或与癌症相关的突变。在一些情况下，使用本文所述的装置平行分析来自相同单细胞的DNA、RNA和/或蛋白质。分析可以包括鉴定表观遗传的翻译后修饰(例如，糖基化、磷酸化、乙酰化、泛素化、组蛋白修饰)和/或转录后修饰(例如，甲基化、羟甲基化)。此类方法可以包括“原代模板定向扩增”(PTA)，以获得用于测序的核酸文库。在一些情况下，将PTA与另外的步骤或方法组合，所述另外的步骤或方法如RT-PCR或蛋白质组/蛋白质定量技术(例如，质谱、抗体染色等)。在一些情况下，在各个分析步骤期间，细胞的各种组分在物理或空间上彼此分离。在一些情况下，首先将蛋白质用抗体标记。在一些情况下，至少一些抗体包含标签或标记物(例如，核酸/寡核苷酸标签、质量标签或荧光标签)。在一些情况下，抗体的一部分包含寡核苷酸标签。在一些情况下，抗体的一部分包含荧光标记物。在一些情况下，抗体被两个或更多个标签或标记物标记。在一些情况下，基于荧光标记物分选抗体的一部分。在RT-PCR之后，产生第一链mRNA产物，且然后取出以进行分析。然后由RT-PCR产物和存在于蛋白质特异性抗体上的条形码产生文库，随后对其进行测序。同时，对来自同一细胞的基因组DNA进行PTA，产生文库，并且进行测序。在一些情况下，将来自基因组、蛋白质组和转录物组的测序结果使用生物信息学方法合并。在一些情况下，本文所述的方法包括标记、细胞分选、亲和分离/纯化、特定细胞组分(例如，外膜、核等)的裂解、RNA扩增、DNA扩增(例如，PTA)或与蛋白质、RNA或DNA分离或分析相关的其他步骤的任何组合。在一些情况下，本文所述的方法包括一种或多种富集步骤，如外显子组富集。

本文描述了单细胞分析的第一方法，所述第一方法包括分析来自单细胞的RNA和DNA。在一些情况下，所述方法包括分离单细胞、裂解单细胞和逆转录(RT)。在一些情况下，用模板切换寡核苷酸(TSO)进行逆转录。在一些情况下，TSO包含分子TAG如生物素，从而允许随后下拉cDNA RT产物，并且PCR扩增RT产物以产生cDNA文库。可替代地或组合地，使用离心来将上清液中的RNA与细胞沉淀中的cDNA分离。在一些情况下，将剩余的cDNA片段化并且用UDG(尿嘧啶DNA糖基化酶)除去，并且使用碱性裂解来降解RNA并使基因组变性。在中和、添加引物和PTA之后，在一些情况下，将扩增产物在SPRI(固相可逆固定)珠上纯化，并且连接至衔接子以产生gDNA文库。

本文描述了单细胞分析的第二方法，所述第二方法包括分析来自单细胞的RNA和DNA。在一些情况下，所述方法包括分离单细胞、裂解单细胞和逆转录(RT)。在一些情况下，用模板切换寡核苷酸(TSO)进行逆转录。在一些情况下，TSO包含分子TAG如生物素，从而允许随后下拉cDNA RT产物，并且PCR扩增RT产物以产生cDNA文库。在一些情况下，然后使用碱性裂解来降解RNA并使基因组变性。在中和、添加随机引物和PTA之后，在一些情况下，将扩增产物在SPRI(固相可逆固定)珠上纯化，并且连接至衔接子以产生gDNA文库。在一些情况下，将RT产物通过下拉，如用链霉亲和素珠的下拉分离。

本文描述了单细胞分析的第三方法，所述第三方法包括分析来自单细胞的RNA和DNA。在一些情况下，所述方法包括分离单细胞、裂解单细胞和逆转录(RT)。在一些情况下，在终止子核苷酸的存在下用模板切换寡核苷酸(TSO)进行逆转录。在一些情况下，TSO包含分子TAG如生物素，从而允许随后下拉cDNA RT产物，并且PCR扩增RT产物以产生cDNA文库。在一些情况下，然后使用碱性裂解来降解RNA并使基因组变性。在中和、添加随机引物和PTA之后，在一些情况下，将扩增产物在SPRI(固相可逆固定)珠上纯化，并且连接至衔接子以产生DNA文库。在一些情况下，将RT产物通过下拉，如用链霉亲和素珠的下拉分离。

本文描述了单细胞分析的第四方法，所述第四方法包括分析来自单细胞的RNA和DNA。在一些情况下，所述方法包括分离单细胞、裂解单细胞和逆转录(RT)。在一些情况下，用模板切换寡核苷酸(TSO)进行逆转录。在一些情况下，TSO包含分子TAG如生物素，从而允许随后下拉cDNA RT产物，并且PCR扩增RT产物以产生cDNA文库。在一些情况下，然后使用碱性裂解来降解RNA并使基因组变性。在中和、添加随机引物和PTA之后，在一些情况下，使用封闭且经标记的引物使扩增产物经受RNA酶和cDNA扩增。将gDNA在SPRI(固相可逆固定)珠上纯化，并且连接至衔接子以产生gDNA文库。在一些情况下，将RT产物通过下拉，如用链霉亲和素珠的下拉分离。

本文描述了单细胞分析的第五方法，所述第五方法包括分析来自单细胞的RNA和DNA。将细胞群体与抗体文库接触，其中将抗体标记。在一些情况下，将抗体用荧光标记、核酸条形码或两者标记。经标记的抗体与群体中的至少一种细胞结合，并且将此类细胞分选，每个容器(例如，管、小瓶、微孔等)放置一个细胞。在一些情况下，容器包括溶剂。在一些情况下，将容器表面的区域用捕获部分包被。在一些情况下，捕获部分是能够与一个或多个细胞、细胞器或其他细胞组分结合的小分子、抗体、蛋白质或其他药剂。在一些情况下，至少一个细胞、单细胞、或其组分与容器表面的区域结合。在一些情况下，核与容器的区域结合。在一些情况下，将细胞的外膜裂解，从而将mRNA释放至容器中的溶液中。在一些情况下，含有基因组DNA的细胞的核结合至容器表面的区域。接下来，通常使用溶液中的mRNA作为模板来进行RT以产生cDNA。在一些情况下，模板切换引物从5’至3’包含TSS区域(转录起始位点)、锚定区域、RNA BC区域和聚dT尾。在一些情况下，聚dT尾与一个或多个mRNA的聚A尾结合。在一些情况下，模板切换引物从3’至5’包含TSS区域、锚定区域和聚G区域。在一些情况下，聚G区域包括核糖G。在一些情况下，聚G区域与mRNA转录物上的聚C区域结合。在一些情况下，通过末端转移酶将核糖G添加至mRNA转录物。在取出RT PCR产物以进行后续测序之后，通过UNG除去细胞中的任何剩余RNA。然后将核裂解，并且使用随机引物和等温聚合酶对释放的基因组DNA进行PTA方法。在一些情况下，引物的长度为6-9个碱基。在一些情况下，PTA产生长度为100-5000、200-5000、500-2000、500-2500、1000-3000或300-3000个碱基的基因组扩增子。在一些情况下，PTA产生平均长度为100-5000、200-5000、500-2000、500-2500、1000-3000或300-3000个碱基的基因组扩增子。在一些情况下，PTA产生长度为250-1500个碱基的基因组扩增子。在一些情况下，本文所述的方法产生具有约500、约750、约1000、约5000或约10,000倍扩增的短片段cDNA池。在一些情况下，本文所述的方法产生具有500-5000、750-1500或250-10,000倍扩增的短片段cDNA池。任选地对PTA产物进行另外的扩增，并且进行测序。

另外的装置和方法可以用于分析单细胞。在一些情况下，将细胞打印与PTA组合使用。在一些情况下，细胞打印包括使用点矩阵打印机。在一些情况下，细胞打印机包括D100单细胞分配器。在一些情况下，细胞打印机包括D300数字试剂分配器。在一些情况下，将细胞打印与PTA组合用于药物组合研究、生物化学测定、基于细胞的测定、DMPK、测定开发、次级筛选、合成生物学、点样、qPCR测定建立、酶谱分析、抗体疗法和/或SAR。

单细胞的样品制备和分离

本文所述的方法可能需要分离单细胞以进行分析。任何单细胞分离方法可以与PTA一起使用，如口腔移液、微移液、流式细胞术/FACS、微流体、分选核(四倍体或其他)的方法或手动稀释。此类方法通过另外的试剂和步骤辅助，所述另外的试剂和步骤例如基于抗体的富集(例如，循环肿瘤细胞)、基于其他小分子或蛋白质的富集方法或荧光标记。在一些情况下，本文所述的多组学分析方法包括将细胞从较大组织中的机械或酶促解离。

细胞组分的制备和分析

本文所述的包括PTA的多组学分析方法可以包括处理细胞组分如DNA、RNA和/或蛋白质的一种或多种方法。在一些情况下，将核(包含基因组DNA)与胞质溶胶(包含mRNA)物理分离，然后是膜选择性裂解缓冲剂以溶解膜，但保持核完整。然后使用包括微移液、离心或抗体缀合的磁性微珠的方法将胞质溶胶与核分离。在另一种情况下，寡dT引物包被的磁珠结合聚腺苷酸化mRNA以便与DNA分离。在另一种情况下，同时预扩增DNA和RNA，并且然后分离以进行分析。在另一种情况下，将单细胞拆分成两个相等部分，其中从一半处理mRNA并且从另一半处理基因组DNA。

使用PTA方法(例如，两步骤方法)可以在测序指标方面带来益处。在一些情况下，测序指标以已知细胞系诸如NA12878为基准。在一些情况下，测序导致等位基因平衡为至少0.5、0.6、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或至少0.95。在一些情况下，测序导致1X覆盖率为至少0.8、0.85、0.9、0.92、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或至少0.995。在一些情况下，测序导致精确度为至少0.8、0.85、0.9、0.92、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或至少0.995。在一些情况下，测序导致SNV灵敏度为至少0.6、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.92、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或至少0.995。

多组学

本文所述的方法(例如，PTA)可以用作本领域中用于单细胞测序(多组学等)的任何数目其他已知方法的替代物。PTA可以代替基因组DNA测序方法，如MDA、PicoPlex、DOP-PCR、MALBAC或靶特异性扩增。在一些情况下，PTA替代多组学方法中的标准基因组DNA测序方法，包括DR-seq(Dey等人,2015)、G&T seq(MacAulay等人,2015)、scMT-seq(Hu等人,2016)、sc-GEM(Cheow等人,2016)、scTrio-seq(Hou等人,2016)、RNA和蛋白质同时多路复用测量(Darmanis等人,2016)、scCOOL-seq(Guo等人,2017)、CITE-seq(Stoeckius等人,2017)、REAP-seq(Peterson等人,2017)、scNMT-seq(Clark等人,2018)或SIDR-seq(Han等人,2018)。在一些情况下，本文所述的方法包括PTA和聚腺苷酸化mRNA转录物的方法。在一些情况下，本文所述的方法包括PTA和非聚腺苷酸化mRNA转录物的方法。在一些情况下，本文所述的方法包括PTA和总(聚腺苷酸化和非聚腺苷酸化)mRNA转录物的方法。

在一些情况下，将PTA与标准RNA测序方法组合以获得基因组和转录物组数据。在一些情况下，本文所述的多组学方法包括PTA和以下之一：Drop-seq(Macosko等人2015)、mRNA-seq(Tang等人,2009)、InDrop(Klein等人,2015)、MARS-seq(Jaitin等人,2014)、Smart-seq2(Hashimshony等人,2012；Fish等人,2016)、CEL-seq(Jaitin等人,2014)、STRT-seq(Islam等人,2011)、Quartz-seq(Sasagawa等人,2013)、CEL-seq2(Hashimshony等人2016)、cytoSeq(Fan等人,2015)、SuPeR-seq(Fan等人,2011)、RamDA-seq(Hayashi等人2018)、MATQ-seq(Sheng等人,2017)或SMARTer(Verboom等人,2019)。

各种反应条件和混合物可用于产生用于转录物组分析的cDNA文库。在一些情况下，使用RT反应混合物来产生cDNA文库。在一些情况下，RT反应混合物包含拥挤试剂、至少一种引物、模板切换寡核苷酸(TSO)、逆转录酶和dNTP混合物。在一些情况下，RT反应混合物包含RNA酶抑制剂。在一些情况下，RT反应混合物包含一种或多种表面活性剂。在一些情况下，RT反应混合物包含Tween-20和/或Triton-X。在一些情况下，RT反应混合物包含甜菜碱。在一些情况下，RT反应混合物包含一种或多种盐。在一些情况下，RT反应混合物包含镁盐(例如，氯化镁)和/或四甲基氯化铵。在一些情况下，RT反应混合物包含明胶。在一些情况下，RT反应混合物包含PEG(PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000或其他长度的PEG)。

本文所述的多组学方法可以提供来自单细胞的基因组信息和RNA转录物信息两者(例如，组合或双重方案)。在一些情况下，来自单细胞的基因组信息从PTA方法获得，并且RNA转录物信息从用于产生cDNA文库的逆转录获得。在一些情况下，使用全转录物方法来获得cDNA文库。在一些情况下，使用3’或5’端计数来获得cDNA文库。在一些情况下，未使用UMI获得cDNA文库。在一些情况下，多组学方法提供来自单细胞的关于至少500、1000、2000、5000、8000、10,000、12,000或至少15,000个基因的RNA转录物信息。在一些情况下，多组学方法提供来自单细胞的关于约500、1000、2000、5000、8000、10,000、12,000或约15,000个基因的RNA转录物信息。在一些情况下，多组学方法提供来自单细胞的关于100-12,000、1000-10,000、2000-15,000、5000-15,000、10,000-20,000、8000-15,000或10,000-15,000个基因的RNA转录物信息。在一些情况下，多组学方法提供关于单细胞的基因组的至少80％、90％、92％、95％、97％、98％或至少99％的基因组序列信息。在一些情况下，多组学方法提供关于单细胞的基因组的约80％、90％、92％、95％、97％、98％或约99％的基因组序列信息。

多组学方法可以包括对来自细胞群体的单细胞的分析。在一些情况下，分析了至少5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000或至少8000个细胞。在一些情况下，分析了约5、10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000或约8000个细胞。在一些情况下，分析了5-100、10-100、50-500、100-500、100-1000、50-5000、100-5000、500-1000、500-10000、1000-10000或5000-20,000个细胞。

多组学方法可以基于单细胞的类型从PTA反应产生基因组DNA的产量。在一些情况下，从单细胞产生的DNA的量是约0.1、1、1.5、2、3、5或约10微克。在一些情况下，从单细胞产生的DNA的量是约0.1、1、1.5、2、3、5或约10飞克。在一些情况下，从单细胞产生的DNA的量是至少0.1、1、1.5、2、3、5或至少10微克。在一些情况下，从单细胞产生的DNA的量是至少0.1、1、1.5、2、3、5或至少10飞克。在一些情况下，从单细胞产生的DNA的量是约0.1-10、1-10、1.5-10、2-20、2-50、1-3或0.5-3.5微克。在一些情况下，从单细胞产生的DNA的量是约0.1-10、1-10、1.5-10、2-20、2-4、1-3或0.5-4飞克。

甲基化组分析

本文描述了包括PTA的方法，其中使用PTA方法确定单细胞中甲基化DNA的位点。在一些情况下，这些方法还包括平行分析同一细胞的转录物组和/或蛋白质组。检测甲基化基因组碱基的方法包括用甲基化敏感性内切核酸酶进行选择性限制，然后用PTA方法处理。根据测序确定被此类酶切割的位点，并且鉴定甲基化碱基。在另一种情况下，基因组DNA文库的亚硫酸氢盐处理将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。然后在一些情况下，用选择性地退火至甲基化序列的甲基化特异性引物扩增文库。可替代地，进行非甲基化特异性PCR，然后进行用于区分亚硫酸氢盐反应的碱基的一种或多种方法，包括直接焦磷酸测序、MS-SnuPE、HRM、COBRA、MS-SSCA或碱基特异性切割/MALDI-TOF。在一些情况下，将基因组DNA样品拆分以用于基因组(或其富集部分)和甲基化组分析的平行分析。在一些情况下，基因组和甲基化组的分析包括富集基因组片段(例如，外显子组或其他靶标)或全基因组测序。

生物信息学

可以将从本文所述的利用PTA的单细胞分析方法获得的数据编译成数据库。本文描述了生物信息学数据整合的方法和系统。在一些情况下将来自蛋白质组、基因组、转录物组、甲基化组或其他数据的数据组合/整合为数据库并分析。在一些情况下，生物信息学数据整合方法和系统包括蛋白质检测(FACS和/或NGS)、mRNA检测和/或基因组变异检测中的一种或多种。在一些情况下，该数据与疾病状态或病症相关。在一些情况下，将来自多个单细胞的数据编译以描述较大细胞群体(如来自特定样品、区域、生物体或组织的细胞)的特性。在一些情况下，从与细胞上的蛋白质选择性结合的经荧光标记的抗体获取蛋白质数据。在一些情况下，蛋白质检测的方法包括基于荧光标记物将细胞分组并且在分选后报告样品位置。在一些情况下，蛋白质检测的方法包括检测样品条形码、检测蛋白质条形码、与设计的序列进行比较并且基于条形码和拷贝数将细胞分组。在一些情况下，从与细胞上的蛋白质选择性结合的条形码化抗体获取蛋白质数据。在一些情况下，从样品和RNA特异性条形码获取转录物组数据。在一些情况下，mRNA检测的方法包括检测样品和RNA特异性条形码、与基因组比对、与RefSeq/Encode比对、报告外显子/内含子/基因间序列、分析外显子-外显子连接点、基于条形码和表达变异将细胞分组以及聚类分析变异和靠前可变基因。在一些情况下，从样品和DNA特异性条形码获取基因组数据。在一些情况下，基因组变异检测的方法包括检测样品和DNA特异性条形码、与基因组比对、确定基因组回收率和SNV映射率、过滤外显子-外显子连接点上的读段、产生变体判定文件(VCF)和聚类分析变异和靠前可变突变。

突变

在一些情况下，本文所述的方法(例如，多组学PTA)导致突变检测的较高检测灵敏度和/或较低假阳性率。在一些情况下，突变是分析序列(例如，使用本文所述的方法)与参考序列之间的差异。在一些情况下，参考序列从其他生物体、相同或相似物种的其他个体、生物体群体或同一基因组的其他区域获得。在一些情况下，突变在质粒或染色体上鉴定。在一些情况下，突变是SNV(单核苷酸变异)、SNP(单核苷酸多态性)或CNV(拷贝数变异或CNA/拷贝数异常)。在一些情况下，突变是碱基取代、插入或缺失。在一些情况下，突变是转变、颠换、无义突变、沉默突变、同义或非同义突变、非致病性突变、错义突变或移码突变(缺失或插入)。在一些情况下，当相比于诸如经由计算机模拟预测、ChIP-seq、GUIDE-seq、环状-seq、HTGTS(高通量全基因组易位测序)、IDLV(整合缺陷型慢病毒)、Digenome-seq、FISH(荧光原位杂交)或DISCOVER-seq的方法时，PTA导致突变检测的较高检测灵敏度和/或较低假阳性率。

原代模板定向扩增

本文描述了核酸扩增方法，如“原代模板定向扩增(PTA)”。在一些情况下，将PTA与其他分析工作流程组合用于多组学分析。在PTA方法中，使用聚合酶(例如，链置换聚合酶)优先从原代模板(“直接拷贝”)生成扩增子。因此，与MDA相比，在随后的扩增过程中，错误以较低的速率从子扩增子传播。结果得到一种易于执行的方法，与现有的WGA方案不同，所述方法可以以准确且可再现的方式扩增低输入量的DNA(包括单细胞的基因组)，且具有高覆盖范围和均匀性。在一些情况下，PTA能够动力学控制扩增反应。在一些情况下，PTA导致拟线性扩增反应(而不是指数扩增)。此外，终止的扩增产物可以在除去终止子后进行定向连接，允许细胞条形码附接至扩增引物，从而可以在进行平行扩增反应后合并来自所有细胞的产物。在一些情况下，模板核酸未结合至固体支持物。在一些情况下，模板核酸的直接拷贝未结合至固体支持物。在一些情况下，一种或多种引物未结合至固体支持物。在一些情况下，没有引物未结合至固体支持物。在一些情况下，引物附接至第一固体支持物，并且模板核酸附接至第二固体支持物，其中第一固体支持物和第二固体支持物不是相同的。在一些情况下，使用PTA来于分析来自较大细胞群体的单细胞。在一些情况下，使用PTA来分析来自较大细胞体的多于一种细胞、或整个细胞群体。

本文描述了采用具有链置换活性的核酸聚合酶进行扩增的方法。在一些情况下，这种聚合酶具有链置换活性和低错误率。在一些情况下，这种聚合酶具有链置换活性和校对核酸外切酶活性，如3’->5’校对活性。在一些情况下，核酸聚合酶与其他组分结合使用，所述其他组分如可逆或不可逆终止子，或其他链置换因子。在一些情况下，聚合酶具有链置换活性，但不具有核酸外切酶校对活性。例如，在一些情况下，这些聚合酶包括噬菌体phi29(Φ29)聚合酶，其也有非常低的错误率，这是3’->5’校对核酸外切酶活性的结果(参见，例如，美国专利号5,198,543和5,001,050)。在一些情况下，链置换核酸聚合酶的非限制性示例包括，例如，经基因修饰的phi29(Φ29)DNA聚合酶、DNA聚合酶I的Klenow片段(Jacobsen等人,Eur.J.Biochem.45:623-627(1974))、噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto等人,Gene84:247(1989))、噬菌体phiPRD1 DNA聚合酶(Jung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8287(1987)；Zhu和Ito,Biochim.Biophys.Acta.1219:267-276(1994))、Bst DNA聚合酶(例如，Bst大片段DNA聚合酶(Exo(-)Bst；Aliotta等人,Genet.Anal.(Netherlands)12:185-195(1996))、exo(-)Bca DNA聚合酶(Walker和Linn,Clinical Chemistry 42:1604-1608(1996))、Bsu DNA聚合酶、包括Vent_R(exo-)DNA聚合酶的Vent_R DNA聚合酶(Kong等人,J.Biol.Chem.268:1965-1975(1993))、包括Deep Vent(exo-)DNA聚合酶的Deep Vent DNA聚合酶、IsoPol DNA聚合酶、DNA聚合酶I、Therminator DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶(Chatterjee等人,Gene 97:13-19(1991))、测序酶(U.S.Biochemicals)、T7 DNA聚合酶、T7-测序酶、T7 gp5DNA聚合酶、PRDIDNA聚合酶、T4 DNA聚合酶(Kaboord和Benkovic,Curr.Biol.5:149-157(1995))。另外的链置换核酸聚合酶也与本文所述的方法相容。给定聚合酶进行链置换复制的能力可以被确定，例如，通过在链置换复制测定中使用该聚合酶(例如，如美国专利号6,977,148中所公开)。在一些情况下，此类测定是在适合于所用酶的最佳活性温度下进行的，例如，phi29 DNA聚合酶的所述温度为32℃，exo(-)Bst DNA聚合酶的所述温度为46℃至64℃，或来自超高温生物的酶的所述温度为约60℃至70℃。选择聚合酶的另一种有用的测定法是在Kong等人,J.Biol.Chem.268:1965-1975(1993)中所述的引物阻断测定。该测定包括在存在或不存在寡核苷酸的情况下使用M13 ssDNA模板进行的引物延伸测定，该寡核苷酸在延伸引物的上游杂交，以阻断其进程。在该测定中，能够置换阻断引物的其他酶在一些情况下对所公开的方法有用。在一些情况下，聚合酶以近似相等的比率并入dNTP和终止子。在一些情况下，本文所述聚合酶的dNTP和终止子的并入比率为约1:1、约1.5:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约10:1、约20:1、约50:1、约100:1、约200:1、约500:1或约1000:1。在一些情况下，本文所述聚合酶的dNTP和终止子的并入比率为1:1至1000:1、2:1至500:1、5:1至100:1、10:1至1000:1、100:1至1000:1、500:1至2000:1、50:1至1500:1或25:1至1000:1。在一些情况下，使用“热”或“温”启动聚合酶。在一些情况下，聚合酶基本上没有聚合酶活性直至加热到至少40℃。在一些情况下，当处理多个样品时，此类聚合酶允许统一控制扩增启动时间。

本文用于PTA的多核苷酸混合物可以包含dNTP。在一些情况下，dNTP包括dA、dT、dG和dC中的一种或多种。在一些情况下，dNTP的浓度不超过10、8、7、5、4、3、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05或不超过0.01mM。在一些情况下，dNTP的浓度是0.5-10、0.5-5、0.5-3、0.5-2.5、0.5-2、0.5-1.5、0.5-1、0.1-5、0.1-3、0.1-3、1-3、0.5-2.5或1-2mM。在一些情况下，此类混合物还包含一种或多种终止子。

本文用于PTA的多核苷酸混合物可以包含终止子。在一些情况下，终止子包括ddNTP。在一些情况下，终止子包括不可逆终止子。在一些情况下，不可逆终止子包括α-硫代双脱氧核苷酸。在一些情况下，终止子的浓度不超过1、0.8、0.7、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005或不超过0.001mM。在一些情况下，dNTP的浓度是0.05-1、0.05-0.5、0.05-0.3、0.05-0.25、0.05-0.2、0.05-0.15、0.05-0.1、0.01-0.5、0.01-0.3、0.01-0.3、0.1-0.3、0.05-0.25或0.1-0.2mM。

本文描述了扩增方法，其中可以通过使用链置换因子例如解旋酶来促进链置换。在一些情况下，这些因子与另外的扩增组分结合使用，所述另外的扩增组分如聚合酶、终止子或其他组分。在一些情况下，链置换因子与不具有链置换活性的聚合酶一起使用。在一些情况下，链置换因子与具有链置换活性的聚合酶一起使用。不受理论的约束，链置换因子可以增加较小的双链扩增子被重新引发的速率。在一些情况下，可以在存在链置换因子的情况下进行链置换复制的任何DNA聚合酶都适用于PTA方法，即使该DNA聚合酶在不存在这种因子的情况下无法进行链置换复制。在一些情况下，可用于链置换复制的链置换因子包括(但不限于)BMRF1聚合酶辅助亚基(Tsurumi等人,J.Virology 67(12):7648-7653(1993))、腺病毒DNA结合蛋白(Zijderveld和van der Vliet,J.Virology 68(2):1158-1164(1994))、单纯疱疹病毒蛋白ICP8(Boehmer和Lehman,J.Virology 67(2):711-715(1993)；Skaliter和Lehman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(22):10665-10669(1994))；单链DNA结合蛋白(SSB；Rigler和Romano,J.Biol.Chem.270:8910-8919(1995))；噬菌体T4基因32蛋白(Villemain和Giedroc,Biochemistry 35:14395-14404(1996)；T7解旋酶-引发酶；T7gp2.5 SSB蛋白；Tte-UvrD(来自腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis))，小牛胸腺解旋酶(Siegel等人,J.Biol.Chem.267:13629-13635(1992))；细菌SSB(例如，大肠杆菌SSB)，真核生物中的复制蛋白A(RPA)，人类线粒体SSB(mtSSB)和重组酶(例如，重组酶A(RecA)家族蛋白、T4 UvsX、T4 UvsY、噬菌体HK620的Sak4、Rad51、Dmc1或Radb)。促进链置换和引发的因子组合也符合本文所述方法。例如，将解旋酶与聚合酶结合使用。在一些情况下，PTA方法包括使用单链DNA结合蛋白(SSB、T4 gp32或其他单链DNA结合蛋白)、解旋酶和聚合酶(例如，SauDNA聚合酶、Bsu聚合酶、Bst2.0、GspM、GspM2.0、GspSSD或其他合适的聚合酶)。在一些情况下，将逆转录酶与本文所述的链置换因子结合使用。在一些情况下，将逆转录酶与本文所述的链置换因子结合使用。在一些情况下，使用聚合酶和切口酶(例如，“NEAR”)(如US 9,617,586中所述的那些)进行扩增。在一些情况下，切口酶是Nt.BspQI、Nb.BbvCi、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、Nb.Bpu10I或Nt.Bpu10I。

本文描述了扩增方法，其包括使用终止子核苷酸、聚合酶和另外的因子或条件。例如，在一些情况下，这些因子在扩增过程中用于使一种或多种核酸模板或扩增子片段化。在一些情况下，这些因子包括核酸内切酶。在一些情况下，因子包括转座酶。在一些情况下，在扩增过程中使用机械剪切来使核酸片段化。在一些情况下，在扩增过程中添加核苷酸，可以通过添加其他蛋白质或条件使其片段化。例如，将尿嘧啶并入扩增子中；用尿嘧啶D-糖基化酶的处理使核酸在含尿嘧啶位置处片段化。在一些情况下，还采用了选择性核酸片段化的另外体系，例如，切割经修饰的胞嘧啶-芘碱基对的工程化DNA糖基化酶。(Kwon等人ChemBiol.2003,10(4),351)

本文描述了包括使用终止子核苷酸的扩增方法，所述终止子核苷酸终止核酸复制，从而减小扩增产物的大小。在一些情况下，这些终止子与本文所述的聚合酶、链置换因子或其他扩增组分结合使用。在一些情况下，终止子核苷酸减少或降低了核酸复制的效率。在一些情况下，这些终止子将延伸率减少至少99.9％、99％、98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或至少65％。在一些情况下，这些终止子将延伸率减少50％-90％、60％-80％、65％-90％、70％-85％、60％-90％、70％-99％、80％-99％或50％-80％。在一些情况下，终止子将平均扩增子产物长度减少至少99.9％、99％、98％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或至少65％。在一些情况下，终止子将平均扩增子长度减少50％-90％、60％-80％、65％-90％、70％-85％、60％-90％、70％-99％、80％-99％或50％-80％。在一些情况下，包括终止子核苷酸的扩增子会形成环或发夹，从而降低聚合酶将这些扩增子用作模板的能力。在一些情况下，终止子的使用通过并入终止子核苷酸(例如，经过修饰以使其抵抗核酸外切酶从而终止DNA延伸的双脱氧核苷酸)而减慢起始扩增位点处的扩增速度，从而产生较小的扩增产物。通过比当前使用的方法产生更小的扩增产物(例如，PTA方法的平均长度为50-2000个核苷酸，而MDA方法的平均产物长度为>10,000个核苷酸)，PTA扩增产物在一些情况下可直接进行连接衔接子而无需片段化，从而允许细胞条形码和独特分子标识码(UMI)的有效并入。

终止子核苷酸以各种浓度存在，这取决于如聚合酶、模板或其他因子的因子。例如，在一些情况下，在本文所述的方法中，终止子核苷酸的量表示为非终止子核苷酸与终止子核苷酸的比率。在一些情况下，这些浓度允许控制扩增子的长度。在一些情况下，针对存在的模板量或模板的大小改变终止子核苷酸与非终止子核苷酸的比率。在一些情况下，对于较小的样品大小(例如，飞克至皮克范围)降低终止子核苷酸与非终止子核苷酸的比率。在一些情况下，非终止子核苷酸与终止子核苷酸的比率为约2:1、5:1、7:1、10:1、20:1、50:1、100:1、200:1、500:1、1000:1、2000:1或5000:1。在一些情况下，非终止子核苷酸与终止子核苷酸的比率为2:1-10:1、5:1-20:1、10:1-100:1、20:1-200:1、50:1-1000:1、50:1-500:1、75:1-150:1或100:1-500:1。在一些情况下，在使用本文所述的方法扩增期间存在的至少一种核苷酸是终止子核苷酸。每种终止子不必以约相同的浓度存在；在一些情况下，对于特定的一组反应条件、样品类型或聚合酶，可以优化本文所述方法中存在的各种终止子的比例。不受理论的约束，每种终止子在响应与模板链上相应核苷酸的配对时，并入扩增子的生长多核苷酸链中的效率可以不同。例如，在一些情况下，与胞嘧啶配对的终止子的浓度比平均终止子浓度高约3％、5％、10％、15％、20％、25％或50％。在一些情况下，与胸腺嘧啶配对的终止子的浓度比平均终止子浓度高约3％、5％、10％、15％、20％、25％或50％。在一些情况下，与鸟嘌呤配对的终止子的浓度比平均终止子浓度高约3％、5％、10％、15％、20％、25％或50％。在一些情况下，与腺嘌呤配对的终止子的浓度比平均终止子浓度高约3％、5％、10％、15％、20％、25％或50％。在一些情况下，与尿嘧啶配对的终止子的浓度比平均终止子浓度高约3％、5％、10％、15％、20％、25％或50％。在一些情况下，能够终止通过核酸聚合酶的核酸延伸的任何核苷酸在本文所述的方法中用作终止子核苷酸。在一些情况下，可逆终止子用于终止核酸复制。在一些情况下，不可逆终止子用于终止核酸复制。在一些情况下，终止子的非限制性示例包括可逆和不可逆核酸和核酸类似物，例如，包括核苷酸的3’封闭的可逆终止子、包括核苷酸的3’未封闭的可逆终止子、包括脱氧核苷酸的2’修饰的终止子、包括对脱氧核苷酸的含氮碱基的修饰的终止子或其任何组合。在一个实施方案中，终止子核苷酸是双脱氧核苷酸。终止核酸复制并且可以适用于实施本发明的其他核苷酸修饰包括但不限于脱氧核糖的3’碳的r基团的任何修饰，如反向双脱氧核苷酸、3’生物素化核苷酸、3’氨基核苷酸、3’-磷酸化核苷酸、3’-O-甲基核苷酸、包括3’C3间隔子核苷酸、3’C18核苷酸、3’己二醇间隔子核苷酸的3’碳间隔子核苷酸、无环核苷酸，及其组合。在一些情况下，终止子是长度为1、2、3、4或更多个碱基的多核苷酸。在一些情况下，终止子不包括可检测的部分或标签(例如，质量标签、荧光标签、染料、放射性原子或其他可检测的部分)。在一些情况下，终止子不包括允许可检测部分或标签附接的化学部分(例如，“点击”叠氮化物/炔烃、共轭加成剂或用于标签附接的其他化学处理)。在一些情况下，所有终止子核苷酸都包括相同的修饰，该修饰减少核苷酸的某区域(例如，糖部分、碱基部分或磷酸部分)处的扩增。在一些情况下，至少一种终止子具有减少扩增的不同修饰。在一些情况下，所有终止子都具有基本相似的荧光激发或发射波长。在一些情况下，未修饰磷酸基团的终止子与不具有核酸外切酶校对活性的聚合酶一起使用。终止子在与具有可以除去终止子核苷酸的3’->5’校对核酸外切酶活性的聚合酶(例如，phi29)一起使用时，在一些情况下，还需要进一步修饰使其抵抗核酸外切酶。例如，双脱氧核苷酸被α-硫基团修饰，产生硫代膦酸酯键，使这些核苷酸对核酸聚合酶的3’->5’校对核酸外切酶活性具有抗性。在一些情况下，这种修饰使聚合酶的核酸外切酶校对活性降低至少99.5％、99％、98％、95％、90％或至少85％。在一些情况下，提供对3’->5’核酸外切酶活性的抗性的其他终止子核苷酸修饰的非限制性示例包括：带有α基团修饰的核苷酸，如产生硫代膦酸酯键的α-硫代双脱氧核苷酸、C3间隔子核苷酸、锁核酸(LNA)、反向核酸、2’氟碱基、3’磷酸化、2’-O-甲基修饰(或其他2’-O-烷基修饰)、丙炔修饰的碱基(例如，脱氧胞嘧啶、脱氧尿苷)、L-DNA核苷酸、L-RNA核苷酸、具有反向连接的核苷酸(例如，5’-5’或3’-3’)、5’反向碱基(例如，5’反向的2’,3’-二脱氧dT)、甲基膦酸酯骨架和反式核酸。在一些情况下，具有修饰的核苷酸包括具有游离3’OH基团的碱基修饰的核酸(例如，2-硝基苄基烷基化的HOMedU三磷酸，包含具有大化学基团(如固体支持物或其他较大部分)的修饰的碱基)。在一些情况下，将具有链置换活性但不具有3’->5’核酸外切酶校对活性的聚合酶与经历或未经历使其具有核酸外切酶抗性的修饰的终止子核苷酸一起使用。此类核酸聚合酶包括但不限于Bst DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Deep Vent(exo-)DNA聚合酶、Klenow片段(exo-)DNA聚合酶、Therminator DNA聚合酶和Vent_R(exo-)。

引物和扩增子文库

本文描述了由至少一种靶核酸分子的扩增产生的扩增子文库。在一些情况下，这些文库是使用本文所述方法生成的，如使用终止子的文库。这些方法包括使用链置换聚合酶或因子、终止子核苷酸(可逆或不可逆)或本文所述的其他特征和实施方案。在一些情况下，可逆终止子能够通过核酸外切酶(例如，或具有核酸外切酶活性的聚合酶)去除。在一些情况下，不可逆终止子不能够通过核酸外切酶(例如，或具有核酸外切酶活性的聚合酶)基本上去除。在一些情况下，使用本文所述的终止子产生的扩增子文库在随后的扩增反应(例如，PCR)中进一步扩增。在一些情况下，随后的扩增反应不包括终止子。在一些情况下，扩增子文库包括多核苷酸，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少98％的多核苷酸包括至少一种终止子核苷酸。在一些情况下，扩增子文库包括衍生出扩增子文库的靶核酸分子。扩增子文库包括多种多核苷酸，其中至少一些多核苷酸是直接拷贝(例如，直接从靶核酸分子如基因组DNA、RNA或其他靶核酸复制)。例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过95％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，至少5％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，至少10％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，至少15％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，至少20％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，至少50％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，3％-5％、3-10％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、5％-30％、10％-50％或15％-75％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，至少一些多核苷酸是靶核酸分子的直接拷贝或子代(靶核酸的第一拷贝)。例如，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或超过95％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝或子代。在一些情况下，至少5％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝或子代。在一些情况下，至少10％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝或子代。在一些情况下，至少20％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝或子代。在一些情况下，至少30％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝或子代。在一些情况下，3％-5％、3％-10％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、5％-30％、10％-50％或15％-75％的扩增子多核苷酸是至少一种靶核酸分子的直接拷贝或子代。在一些情况下，靶核酸的直接拷贝的长度为50-2500、75-2000、50-2000、25-1000、50-1000、500-2000或50-2000个碱基。在一些情况下，子代的长度为1000-5000、2000-5000、1000-10,000、2000-5000、1500-5000、3000-7000或2000-7000个碱基。在一些情况下，PTA扩增产物的平均长度为25-3000个核苷酸，为50-2500、75-2000、50-2000、25-1000、50-1000、500-2000或50-2000个碱基。在一些情况下，从PTA产生的扩增子的长度不超过5000、4000、3000、2000、1700、1500、1200、1000、700、500或不超过300个碱基。在一些情况下，从PTA产生的扩增子的长度为1000-5000、1000-3000、200-2000、200-4000、500-2000、750-2500或1000-2000个碱基。在一些情况下，使用本文所述方法产生的扩增子文库包括至少1000、2000、5000、10,000、100,000、200,000、500,000或超过500,000个包括独特序列的扩增子。在一些情况下，文库包括至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000或至少3500个扩增子。在一些情况下，长度小于1000个碱基的扩增子多核苷酸的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或超过30％是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，长度不超过2000个碱基的扩增子多核苷酸的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或超过30％是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，长度为3000-5000个碱基的扩增子多核苷酸的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％或超过30％是至少一种靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，直接拷贝扩增子与靶核酸分子的比例为至少10:1、100:1、1000:1、10,000:1、100,000:1、1,000,000:1、10,000,000:1或大于10,000,000:1。在一些情况下，直接拷贝扩增子与靶核酸分子的比例为至少10:1、100:1、1000:1、10,000:1、100,000:1、1,000,000:1、10,000,000:1或大于10,000,000:1，其中直接拷贝扩增子的长度不超过700-1200个碱基。在一些情况下，直接拷贝扩增子和子扩增子与靶核酸分子的比例为至少10:1、100:1、1000:1、10,000:1、100,000:1、1,000,000:1、10,000,000:1或大于10,000,000:1。在一些情况下，直接拷贝扩增子和子扩增子与靶核酸分子的比例为至少10:1、100:1、1000:1、10,000:1、100,000:1、1,000,000:1、10,000,000:1或大于10,000,000:1，其中直接拷贝扩增子的长度为700-1200个碱基，并且子扩增子的长度为2500-6000个碱基。在一些情况下，文库包括约50-10,000、约50-5,000、约50-2500、约50-1000、约150-2000、约250-3000、约50-2000、约500-2000或约500-1500个扩增子，这些是靶核酸分子的直接拷贝。在一些情况下，文库包括约50-10,000、约50-5,000、约50-2500、约50-1000、约150-2000、约250-3000、约50-2000、约500-2000或约500-1500个扩增子，这些是靶核酸分子的直接拷贝或子扩增子。在一些情况下，直接拷贝数可以通过扩增循环数控制。在一些情况下，使用不超过30、25、20、15、13、11、10、9、8、7、6、5、4或3个循环来产生靶核酸分子的拷贝。在一些情况下，使用约30、25、20、15、13、11、10、9、8、7、6、5、4或约3个循环来产生靶核酸分子的拷贝。在一些情况下，使用3、4、5、6、7或8个循环来产生靶核酸分子的拷贝。在一些情况下，使用2-4、2-5、2-7、2-8、2-10、2-15、3-5、3-10、3-15、4-10、4-15、5-10或5-15个循环来产生靶核酸分子的拷贝。在一些情况下，使用本文所述方法产生的扩增子文库经受另外步骤，如衔接子连接和进一步扩增。在一些情况下，这些另外步骤在测序步骤之前。在一些情况下，循环是PCR循环。在一些情况下，循环代表退火、延伸和变性。在一些情况下，循环代表在等温或基本上等温条件下发生的退火、延伸和变性。

本文所述的方法可以另外包括一个或多个富集或纯化步骤。在一些情况下，在本文所述的方法期间富集一种或多种多核苷酸(如cDNA、PTA扩增子或其他多核苷酸)。在一些情况下，使用多核苷酸探针捕获一种或多种多核苷酸。在一些情况下，探针被配置为捕获一个或多个基因组外显子。在一些情况下，探针文库包括至少1000、2000、5000、10,000、50,000、100,000、200,000、500,000或超过1百万个不同的序列。在一些情况下，探针文库包括能够与至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、5000、10,000或超过10,000个基因结合的序列。在一些情况下，探针包含用于固体支持物的捕获的部分，如生物素。在一些情况下，富集步骤在PTA步骤之后进行。在一些情况下，富集步骤在PTA步骤之前进行。在一些情况下，探针被配置为结合基因组DNA文库。在一些情况下，探针被配置为结合cDNA文库。

在一些情况下，由本文所述的PTA方法和组合物(终止子、聚合酶等)产生的多核苷酸的扩增子文库具有增加的均匀性。在一些情况下，均匀性使用洛伦兹曲线或其他此类方法来描述。在一些情况下，这种增加使得覆盖所期望的靶核酸分子(例如，基因组DNA、RNA或其他靶核酸分子)所需的测序读段更少。例如，多核苷酸的累积分数的不超过50％包括靶核酸分子的序列的累积分数的至少80％的序列。在一些情况下，多核苷酸的累积分数的不超过50％包括靶核酸分子的序列的累积分数的至少60％的序列。在一些情况下，多核苷酸的累积分数的不超过50％包括靶核酸分子的序列的累积分数的至少70％的序列。在一些情况下，多核苷酸的累积分数的不超过50％包括靶核酸分子的序列的累积分数的至少90％的序列。在一些情况下，均匀性使用基尼指数描述(其中指数0表示文库的完全相等，指数1表示完全不等)。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.55、0.50、0.45、0.40或0.30。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.50。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.40。在一些情况下，这种均匀性度量取决于所获得的读段数。例如，获得的读段不超过1亿、2亿、3亿、4亿或不超过5亿。在一些情况下，读段的长度为约50、75、100、125、150、175、200、225或约250个碱基。在一些情况下，均匀性度量取决于靶核酸的覆盖深度。例如，平均覆盖深度为约10X、15X、20X、25X或约30X。在一些情况下，平均覆盖深度为10-30X、20-50X、5-40X、20-60X、5-20X或10-20X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.55，其中获得了约3亿个读段。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.50，其中获得了约3亿个读段。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.45，其中获得了约3亿个读段。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.55，其中获得了不超过3亿个读段。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.50，其中获得了不超过3亿个读段。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.45，其中获得了不超过3亿个读段。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.55，其中测序覆盖的平均深度为约15X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.50，其中测序覆盖的平均深度为约15X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.45，其中测序覆盖的平均深度为约15X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.55，其中测序覆盖的平均深度为至少15X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.50，其中测序覆盖的平均深度为至少15X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.45，其中测序覆盖的平均深度为至少15X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.55，其中测序覆盖的平均深度不超过15X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.50，其中测序覆盖的平均深度不超过15X。在一些情况下，本文所述的扩增子文库的基尼指数不超过0.45，其中测序覆盖的平均深度不超过15X。在一些情况下，使用本文所述方法生成的均匀扩增子文库需要经受另外步骤，如衔接子连接和进一步的PCR扩增。在一些情况下，这些另外步骤在测序步骤之前。

引物包括用于引发本文所述的扩增反应的核酸。在一些情况下，这些引物包括但不限于具有或不具有使其抵抗核酸外切酶的修饰的任何长度的随机脱氧核苷酸，具有或不具有使其抵抗核酸外切酶的修饰的任意长度的随机核糖核苷酸，经修饰的核酸，如锁核酸、靶向特定基因组区域的DNA或RNA引物，以及由诸如引发酶的酶引发的反应。在全基因组PTA的情况下，优选使用具有随机或部分随机核苷酸序列的一组引物。在非常复杂的核酸样品中，不需要知道样品中存在的具体核酸序列，并且不需要将引物设计为与任何特定序列互补。相反，核酸样品的复杂性导致样品中大量不同的杂交靶序列，它们将与随机或部分随机序列的各种引物互补。在一些情况下，用于PTA的引物的互补部分是完全随机的，仅包括随机的部分，或是选择性地随机的。在一些情况下，例如，引物的互补部分中的随机碱基位置数为引物的互补部分中的核苷酸总数的20％至100％。在一些情况下，引物的互补部分中的随机碱基位置数为引物的互补部分中的核苷酸总数的10％至90％、15-95％、20％-100％、30％-100％、50％-100％、75-100％或90-95％。在一些情况下，引物的互补部分中的随机碱基位置数为引物的互补部分中的核苷酸总数的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。在一些情况下，使用标准技术合成具有随机或部分随机序列的引物组，这是通过允许在每个位置随机添加任何核苷酸。在一些情况下，引物组由具有相似的长度和/或杂交特性的引物组成。在一些情况下，术语“随机引物”是指在每个位置均可表现出四倍简并性的引物。在一些情况下，术语“随机引物”是指在每个位置均可表现出三倍简并性的引物。在一些情况下，本文所述方法中使用的随机引物包括长度为3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个碱基的随机序列。在一些情况下，引物包括长度为3-20、5-15、5-20、6-12或4-10个碱基的随机序列。引物也可以包括不可延伸的元件，其限制产生的扩增子的后续扩增。例如，在一些情况下，具有不可延伸元件的引物包括终止子。在一些情况下，引物包括终止子核苷酸，如1、2、3、4、5、10或超过10种终止子核苷酸。引物不需要局限于从外部添加至扩增反应的组分。在一些情况下，通过添加促进引发的核苷酸和蛋白质来原位产生引物。例如，在一些情况下，将与核苷酸组合的引发酶样酶用于产生本文所述方法的随机引物。在一些情况下，引发酶样酶是DnaG或AEP酶超家族的成员。在一些情况下，引发酶样酶是TthPrimPol。在一些情况下，引发酶样酶是T7 gp4解旋酶-引发酶。在一些情况下，这些引发酶与本文所述的聚合酶或链置换因子一起使用。在一些情况下，引发酶用脱氧核糖核苷酸启动引发。在一些情况下，引发酶用核糖核苷酸启动引发。在一些情况下，引物是不可逆引物。在一些情况下，不可逆引物包括硫代膦酸酯键联。

在PTA扩增后可以选择扩增子的特定子集。在一些情况下，这种选择取决于大小、亲和力、活性、与探针的杂交或本领域中其他已知的选择因子。在一些情况下，选择在本文所述的另外步骤如衔接子连接和/或文库扩增之前或之后进行。在一些情况下，选择基于扩增子的大小(长度)。在一些情况下，选择较小的扩增子，其不太可能经历指数扩增，从而富集了从原代模板衍生的产物，同时进一步将扩增从指数形式转化为拟线性扩增过程。在一些情况下，选择长度为50-2000、25-5000、40-3000、50-1000、200-1000、300-1000、400-1000、400-600、600-2000或800-1000个碱基的扩增子。在一些情况下，通过使用方案来进行大小选择，例如，在羧化顺磁珠上利用固相可逆固定化(SPRI)以富集特定大小的核酸片段，或本领域技术人员已知的其他方案。任选地或组合地，选择通过在制备测序文库的同时在PCR期间优先连接和扩增较小片段来进行，也作为在测序(例如，合成测序、纳米孔测序或其他测序方法)期间优先由较小测序文库片段形成簇的结果来进行。选择较小片段的其他策略也符合本文所述的方法并且包括但不限于在凝胶电泳后分离特定大小的核酸片段，使用结合特定大小的核酸片段的硅胶柱，以及使用可以更强地富集较小片段的其他PCR策略。可以将任何数量的文库制备方案与本文所述的PTA方法一起使用。在一些情况下，将通过PTA产生的扩增子连接至衔接子(任选地在除去终止子核苷酸的情况下)。在一些情况下，通过PTA产生的扩增子包含由基于转座酶的片段化产生的同源区域，其用作引发位点。在一些情况下，通过以机械或酶促方式片段化核酸来制备文库。在一些情况下，经由转座体使用标签化来制备文库。在一些情况下，经由衔接子，如Y-衔接子、通用衔接子或环状衔接子的连接来制备文库。

PTA中使用的引物的非互补部分可以包括可用于进一步操纵和/或分析扩增序列的序列。这种序列的一个示例是“检测标签”。检测标签具有与检测探针互补的序列，并使用其同源检测探针进行检测。引物上可以有一个、两个、三个、四个或超过四个的检测标签。除引物的大小外，对引物上可能存在的检测标签的数目没有基本限制。在一些情况下，引物上只有一个检测标签。在一些情况下，引物上有两个检测标签。当有多个检测标签时，它们可以具有相同的序列，也可以具有不同的序列，每个不同的序列与不同的检测探针互补。在一些情况下，多个检测标签具有相同的序列。在一些情况下，多个检测标签具有不同的序列。

可以包括在引物的非互补部分中的序列的另一个示例是“地址标签”，所述地址标签可以编码扩增子的其他细节，如组织切片中的位置。在一些情况下，细胞条形码包括地址标签。地址标签具有与地址探针互补的序列。地址标签被并入扩增链的末端。如果存在，引物上可以有一个或多于一个地址标签。除引物的大小外，引物上可能存在的地址标签的数目没有基本限制。当有多个地址标签时，它们可以具有相同的序列，也可以具有不同的序列，每个不同的序列都与不同的地址探针互补。地址标签部分可以是支持地址标签与地址探针之间特异性且稳定的杂交的任何长度。在一些情况下，来自多于一个来源的核酸可以并入可变标签序列。该标签序列的长度可以高达100个核苷酸，优选地长度为1至10个核苷酸，最优选地为4、5或6个核苷酸，并且包括核苷酸的组合。在一些情况下，标签序列的长度为1-20、2-15、3-13、4-12、5-12或1-10个核苷酸例如，如果选择六个碱基对形成标签并且使用四个不同核苷酸的排列，则可以制成总共4096个核酸锚(例如，发夹)，每个锚具有独特的6碱基标签。在一些情况下，标签标识样品或分析物的来源。在一些情况下，标签唯一地标识群体中的每种分子。

本文所述的引物可以存在于溶液中或固定在固体支持物上。在一些情况下，带有样品条形码和/或UMI序列的引物可以固定在固体支持物上。例如，固体支持物可以是一个或多个珠。在一些情况下，使个体细胞与一个或多个具有独特的一组样品条形码和/或UMI序列的珠接触，以鉴定个体细胞。在一些情况下，将来自个体细胞的裂解物与一个或多个具有独特的一组样品条形码和/或UMI序列的珠接触，以鉴定个体细胞裂解物。在一些情况下，将来自个体细胞的提取的核酸与一个或多个具有独特的一组样品条形码和/或UMI序列的珠接触，以鉴定来自个体细胞的提取的核酸。珠可以以本领域已知的任何合适方式来操纵，例如，使用本文所述的液滴致动器。珠可以是任何合适的大小，包括例如，微珠、微粒、纳米珠和纳米颗粒。在一些实施方案中，珠是磁响应的；在其他实施方案中，珠没有明显的磁响应。合适的珠的非限制性示例包括流式细胞术微珠、聚苯乙烯微粒和纳米颗粒、官能化的聚苯乙烯微粒和纳米颗粒、包覆的聚苯乙烯微粒和纳米颗粒、二氧化硅微珠、荧光微球和纳米球、官能化的荧光微球和纳米球、包覆的荧光微球和纳米球、颜色染色微粒和纳米颗粒、磁性微粒和纳米颗粒、超顺磁性微粒和纳米颗粒(例如，可从Invitrogen Group,Carlsbad,CA获得的)、荧光微粒和纳米颗粒、包覆的磁性微粒和纳米颗粒、铁磁性微粒和纳米颗粒、包覆的铁磁性微粒和纳米颗粒，以及在美国专利申请公开号US20050260686、US20030132538、US20050118574、20050277197、20060159962中所描述的。珠可以与抗体、蛋白质或抗原、DNA/RNA探针或任何其他对所需靶标具有亲和力的分子预偶联。在一些实施方案中，带有样品条形码和/或UMI序列的引物可以在溶液中。在某些实施方案中，可以提供多个液滴，其中多个液滴中的每个液滴都具有对于液滴来说独特的样品条形码和对于分子来说独特的UMI，从而使得UMI在液滴集合内重复多次。在一些实施方案中，使个体细胞与具有独特的一组样品条形码和/或UMI序列的液滴接触，以鉴定个体细胞。在一些实施方案中，使来自个体细胞的裂解物与具有独特的一组样品条形码和/或UMI序列的液滴接触，以鉴定个体细胞裂解物。在一些实施方案中，将来自个体细胞的提取的核酸与具有独特的一组样品条形码和/或UMI序列的液滴接触，以鉴定来自个体细胞的提取的核酸。

PTA引物可以包括序列特异性或随机引物、细胞条形码和/或独特分子标识码(UMI)(例如，线性引物和发夹引物)。在一些情况下，引物包括序列特异性引物。在一些情况下，引物包括随机引物。在一些情况下，引物包括细胞条形码。在一些情况下，引物包括样品条形码。在一些情况下，引物包括独特分子标识码。在一些情况下，引物包括两个或更多个细胞条形码。在一些情况下，这些条形码鉴定独特的样品来源或独特的工作流程。在一些情况下，这些条形码或UMI的长度为5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30或超过30个碱基。在一些情况下，引物包括至少1000、10,000、50,000、100,000、250,000、500,000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹或至少10¹⁰个独特条形码或UMI。在一些情况下，引物包括至少8、16、96、384或1536或更多个独特条形码或UMI。在一些情况下，然后在测序前将标准衔接子连接至扩增产物上；测序后，首先根据细胞条形码将读段分配给特定细胞。可以与PTA方法一起利用的合适衔接子包括，例如，可从Integrated DNA Technologies(IDT)获得的Dual Index UMI衔接子。然后，使用UMI将来自每个细胞的读段分组，并将具有相同UMI的读段合并为共有读段。使用细胞条形码允许在制备文库之前合并所有细胞，因为它们之后可以通过细胞条形码鉴定。在一些情况下，使用UMI形成共有读段校正PCR偏倚，从而改善拷贝数变异(CNV)检测。此外，可以通过要求来自同一分子的固定百分比的读段在每个位置具有相同的检测到的碱基变化来校正测序错误。这种方法已被用于改善CNV检测并校正大量样品中的测序错误。在一些情况下，UMI与本文所述的方法一起使用，例如，美国专利号8,835,358公开了在附接随机可扩增条形码后的数字计数原理。Schmitt等人和Fan等人公开了校正测序错误的类似方法。在一些情况下，产生文库以使用引物进行测序。在一些情况下，文库包括长度为200-700个碱基、100-1000、300-800、300-550、300-700或200-800个碱基的片段。在一些情况下，文库包括长度为至少50、100、150、200、300、500、600、700、800或至少1000个碱基的片段。在一些情况下，文库包括长度为约50、100、150、200、300、500、600、700、800或约1000个碱基的片段。

本文所述的方法还可以包括另外的步骤，包括对样品或模板进行的步骤。在一些情况下，这些样品或模板在PTA之前要经过一个或多个步骤。在一些情况下，对包括细胞的样品进行预处理步骤。例如，使用冻融、Triton X-1--(例如，100、114等)、Tween 20和蛋白酶K的组合对细胞进行裂解和蛋白水解，以增加染色质的可及性。其他裂解策略也适用于实施本文所述的方法。这些策略包括但不限于使用洗涤剂和/或溶菌酶和/或蛋白酶处理，以及/或细胞物理破坏如超声和/或碱裂解和/或低渗裂解的其他组合进行裂解。在一些情况下，对原代模板或一种或多种靶分子进行预处理步骤。在一些情况下，使用氢氧化钠使原代模板(或靶标)变性，然后中和溶液。其他变性策略也可适用于实施本文所述的方法。这些策略可以包括但不限于将碱裂解与其他碱性溶液组合，提高样品温度和/或改变样品中的盐浓度，添加添加剂如溶剂或油，其他修饰或其任何组合。在一些情况下，另外的步骤包括按大小对样品、模板或扩增子进行分类、过滤或分离。在一些情况下，将细胞用机械(例如，高压均化器、珠研磨)或非机械(物理、化学或生物)裂解。在一些情况下，物理裂解方法包括加热、渗透压休克和/或空化。在一些情况下，化学裂解包括碱和/或洗涤剂。在一些情况下，生物裂解包括使用酶。裂解方法的组合也与本文所述的方法相容。裂解酶的非限制示例包括重组溶菌酶、丝氨酸蛋白酶和细菌溶素。在一些情况下，用酶的裂解包括使用溶菌酶、溶葡球菌酶、消解酶、纤维素、蛋白酶或聚糖酶。例如，在用本文所述的方法扩增后，扩增子文库富集具有期望长度的扩增子。在一些情况下，扩增子文库富含长度为50-2000、25-1000、50-1000、75-2000、100-3000、150-500、75-250、170-500、100-500或75-2000个碱基的扩增子。在一些情况下，扩增子文库富含长度不超过75、100、150、200、500、750、1000、2000、5000或不超过10,000个碱基的扩增子。在一些情况下，扩增子文库富含长度为至少25、50、75、100、150、200、500、750、1000或至少2000个碱基的扩增子。

本文所述的方法和组合物可以包括缓冲剂或其他制剂。在一些情况下，此类缓冲剂用于PTA、RT或本文所述的其他方法。在一些情况下，这些缓冲剂包括表面活性剂/洗涤剂或变性剂(Tween-20、DMSO、DMF，包括疏水基团的聚乙二醇化聚合物或其他表面活性剂)、盐(磷酸钾或磷酸钠(一元或二元)、氯化钠、氯化钾)、TrisHCl、氯化镁或硫酸镁、铵盐，如磷酸盐、硝酸盐或硫酸盐、EDTA)、还原剂(DTT、THP、DTE、β-巯基乙醇、TCEP或其他还原剂)或其他组分(甘油、亲水性聚合物，如PEG)。在一些情况下，将缓冲剂与诸如聚合酶、链置换因子、终止子或本文所述的其他反应组分等组分结合使用。在一些情况下，将缓冲剂与诸如聚合酶、链置换因子、终止子或本文所述的其他反应组分等组分结合使用。缓冲剂可以包含一种或多种拥挤剂。在一些情况下，拥挤试剂包括聚合物。在一些情况下，拥挤试剂包括聚合物如多元醇。在一些情况下，拥挤试剂包括聚乙二醇聚合物(PEG)。在一些情况下，拥挤试剂包括多糖。非限制地，拥挤试剂的示例包括ficoll(例如，ficoll PM 400、ficoll PM 70或其他分子量ficoll)、PEG(例如，PEG1000、PEG 2000、PEG4000、PEG6000、PEG8000或其他分子量PEG)、右旋糖酐(右旋糖酐6、右旋糖酐10、右旋糖酐40、右旋糖酐70、右旋糖酐6000、右旋糖酐138k或其他分子量右旋糖酐)。

根据本文所述的方法扩增的核酸分子可以使用本领域的技术人员已知的方法进行测序和分析。在一些情况下，使用的测序方法的非限制性示例包括，例如，杂交测序(SBH)、连接测序(SBL)(Shendure等人(2005)Science 309:1728)、定量增量荧光核苷酸添加测序(QIFNAS)、逐步连接和切割、荧光共振能量转移(FRET)、分子信标、TaqMan报告基因探针消化、焦磷酸测序、荧光原位测序(FISSEQ)、FISSEQ珠(美国专利号7,425,431)、摆动测序(国际专利申请公开号WO2006/073504)、多重测序(美国专利申请公开号US2008/0269068；Porreca等人,2007,Nat.Methods 4:931)、聚合克隆(POLONY)测序(美国专利号6,432,360、6,485,944和6,511,803，以及国际专利申请公开号WO2005/082098)、纳米网格滚环测序(ROLONY)(美国专利号9,624,538)、等位基因特异性寡核苷酸连接测定(例如，寡核苷酸连接测定(OLA)，使用连接的线性探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA，连接的挂锁探针和/或使用连接的圆形挂锁探针和滚环扩增(RCA)读出的单模板分子OLA)、高通量测序方法，例如，使用Roche 454、Illumina Solexa、AB-SOLiD、Helicos、Polonator平台等的方法，以及基于光的测序技术(Landegren等人(1998)Genome Res.8:769-76；Kwok(2000)Pharmacogenomics1:95-100；以及Shi(2001)Clin.Chem.47:164-172)。在一些情况下，将扩增的核酸分子进行鸟枪法测序。在一些情况下，测序文库的测序用任何适当的测序技术进行，所述测序技术包括但不限于单分子实时(SMRT)测序、Polony测序、连接测序、可逆终止子测序、质子检测测序、离子半导体测序、纳米孔测序、电子测序、焦磷酸测序、Maxam-Gilbert测序、链终止(例如，Sanger)测序、+S序列或合成测序(基于阵列/集落基或基于纳米球)。

可以对使用本文所述的方法(例如，PTA或RNAseq)产生的测序文库进行测序以获得所需数目的测序读段。在一些情况下，从单细胞或包含单细胞的样品产生文库(单独或多组学工作流程的一部分)。在一些情况下，对文库进行测序以获得至少0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.5、2、5或至少10百万个读段。在一些情况下，对文库进行测序以获得不超过0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.5、2、5或不超过10百万个读段。在一些情况下，对文库进行测序以获得约0.1、0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.5、2、5或约10百万个读段。在一些情况下，对文库进行测序以每样品获得0.1-10、0.1-5、0.1-1、0.2-1、0.3-1.5、0.5-1、1-5或0.5-5百万个读段。在一些情况下，读段数目取决于基因组的大小。在一些情况下，对包含细菌基因组的样品进行测序以获得0.5-1百万个读段。在一些情况下，对文库进行测序以获得至少2、4、10、20、50、100、200、300、500、700或至少900百万个读段。在一些情况下，对文库进行测序以获得不超过2、4、10、20、50、100、200、300、500、700或不超过900百万个读段。在一些情况下，对文库进行测序以获得约2、4、10、20、50、100、200、300、500、700或约900百万个读段。在一些情况下，对包含哺乳动物基因组的样品进行测序以获得500-600百万个读段。在一些情况下，在测序期间鉴定测序文库的类型(cDNA文库或基因组文库)。在一些情况下，在测序期间用独特的条形码鉴定cDNA文库和基因组文库。

当关于聚合酶介导的扩增反应使用时，术语“循环”在本文中用于描述以下步骤：双链核酸(例如，来自扩增子的模板、或双链模板)的至少一部分的解离(变性)、引物的至少一部分与模板的杂交(退火)和引物的延伸以产生扩增子。在一些情况下，在扩增循环期间温度保持恒定(例如，等温反应)。在一些情况下，循环数与产生的扩增子数直接相关。在一些情况下，等温反应的循环数通过使反应进行的时间量控制。

高通量方法和应用

本文所述的高通量装置和方法可以用于多种应用。本文描述了用多组学分析PTA方法如单细胞鉴定细胞中的突变的方法。在一些情况下使用PTA方法会导致对已知方法(例如，MDA)的改进。在一些情况下，与MDA方法相比，PTA的假阳性和假阴性变体判定率较低。在一些情况下，将基因组，如NA12878铂基因组，用于确定PTA的更大的基因组覆盖和均匀性是否会导致较低的假阴性变体判定率。不受理论的约束，可以确定PTA中错误传播的缺失降低了假阳性变体判定率。在一些情况下，通过比较已知阳性基因座处杂合突变判定的等位基因频率来估算用这两种方法在等位基因之间的扩增平衡。在一些情况下，通过PCR进一步扩增使用PTA产生的扩增子文库。在一些情况下，将PTA与另外的分析方法，如RNAseq、甲基化组分析或本文所述的其他方法一起用于工作流程中。

在一些情况下，使用本文所述的方法分析的细胞包括肿瘤细胞。例如，循环肿瘤细胞可以从取自患者的体液中分离，如但不限于血液、骨髓、尿液、唾液、脑髓液、胸膜液、心包液、腹水或房水。然后，使细胞经历本文所述的方法(例如，PTA)并测序，以确定每个细胞的突变负荷和突变组合。在一些情况下，这些数据用于诊断特定疾病或用作预测治疗应答的工具。类似地，在一些情况下，恶性潜能未知的细胞是从取自患者的体液中分离的，所述体液如但不限于血液、骨髓、尿液、唾液、脑髓液、胸膜液、心包液、腹水、房水、囊胚腔液或培养中细胞周围的收集培养基。在一些情况下，样品从胚细胞周围的收集培养基获得。在利用本文所述的方法和测序后，这些方法还用于确定每个细胞的突变负荷和突变组合。在一些情况下，这些数据用于诊断特定疾病或用作预测恶性前状态发展为显性恶性肿瘤的工具。在一些情况下，可以从原发性肿瘤样品中分离细胞。然后，细胞可以经历PTA和测序，以确定每个细胞中的突变负荷和突变组合。这些数据可以用于诊断特定疾病或用作预测患者恶性肿瘤对可用抗癌药物的抗药性的工具。通过将样品暴露于不同的化疗药物，已发现主要和次要克隆对特定药物具有不同的敏感性，这些敏感性不一定与已知的“驱动突变”的存在相关，这表明克隆种群中的突变组合决定了它对特定化疗药物的敏感性。不受理论的约束，这些发现表明，如果检测到尚未扩展并且可演化为基因组修饰数目增加的克隆而使其更有可能对治疗产生抗性的癌前病变，则可能更容易根除该恶性肿瘤。参见，Ma等人,2018,“Pan-cancer genome and transcriptome analyses of 1,699pediatric leukemias andsolid tumors”。在一些情况下，单细胞基因组学方案用于检测从患者样品中分离的正常和恶性细胞混合物内的单个癌细胞或克隆型中的体细胞遗传变体组合。在一些情况下，该技术还用于鉴定在体外和/或患者体内暴露于药物后经历阳性选择的克隆型。通过比较暴露于化疗的存活克隆与诊断时鉴定的克隆，可以创建癌症克隆型目录，所述目录记录它们对特定药物的抗性。在一些情况下，PTA方法检测由多种克隆型组成的样品中的特定克隆对现有药物或新药及其组合的敏感性，其中该方法可以检测特定克隆对药物的敏感性。在一些情况下，这种方法显示了药物对特定克隆的功效，而当前的药物敏感性测量在一次测量中考虑了所有癌症克隆的敏感性，因此可能无法检测到这种功效。当将本文所述的PTA应用于诊断时收集的患者样品以检测给定患者癌症中的癌症克隆型时，可以随后使用药物敏感性目录来查找这些克隆，从而告知肿瘤学家哪种药物或药物组合无效，哪种药物或药物组合最有可能对患者的癌症有效。PTA可用于分析包含成群细胞的样品。在一些情况下，样品包含神经元或神经胶质细胞。在一些情况下，样品包含核。

本文描述了测量与环境因子致突变性组合时的基因表达改变的方法。例如，细胞(单细胞或细胞群体)暴露于潜在的环境条件。例如，在一些情况下，该方法使用诸如源自器官(肝脏、胰腺、肺、结肠、甲状腺或其他器官)、组织(皮肤或其他组织)、血液或其他生物来源的细胞。在一些情况下，环境条件包括热、光(例如，紫外线)、辐射、化学物质或其任何组合。在一定量的环境条件暴露后，在一些情况下，这是几分钟、几小时、几天或更长时间，分离出单细胞并进行PTA方法。在一些情况下，分子条形码和独特分子标识码用于标记样品。对样品进行测序，然后进行分析，以鉴定基因表达改变和或暴露于环境条件所导致的突变。在一些情况下，将这种突变与对照环境条件进行比较，如已知的非诱变物质、媒介物/溶剂或缺乏环境条件。在一些情况下，这种分析不仅提供了由环境条件引起的突变总数，而且还提供了这种突变的位置和性质。在一些情况下，模式从数据中鉴定，并且可以用于诊断疾病或病症。在一些情况下，模式用于预测未来的疾病状态或病症。在一些情况下，本文所述的方法测量在暴露于环境药剂，例如，潜在的诱变剂或致畸剂后细胞的突变负荷、位置和模式。在一些情况下，该方法用于评估给定药剂的安全性，包括其诱发可能导致疾病发展的突变的可能性。例如，该方法可用于预测暴露于特定浓度的特定药剂后该药剂对特定细胞类型的致癌性或致畸性。

本文描述了鉴定与已经历基因组编辑(例如，使用CRISPR技术)的动物、植物或微生物细胞中的突变组合时的基因表达改变的方法。在一些情况下，可以将这些细胞分离并进行PTA和测序，以确定每个细胞的突变负荷和突变组合。在一些情况下，将由基因组编辑方案产生的每细胞突变率和突变位置用于评估给定基因组编辑方法的安全性。

本文描述了确定与用于细胞疗法的细胞中的突变组合时的基因表达改变的方法，所述细胞疗法如但不限于诱导多能干细胞的移植、尚未被操纵的造血细胞或其他细胞的移植、或经过基因组编辑的造血细胞或其他细胞的移植。然后，细胞可以经历PTA和测序，以确定每个细胞中的突变负荷和突变组合。细胞疗法产品中的每细胞突变率和突变位置可用于评估产品的安全性和潜在功效。

用于与PTA方法一起使用的细胞可以是胎儿细胞，如胚细胞。在一些实施方案中，将PTA与非侵入性植入前选遗传学测试(NIPGT)结合使用。在另一个实施方案中，细胞可以从体外受精产生的卵裂球分离。然后，细胞可以经历PTA和测序，以确定每个细胞中潜在疾病易感遗传变体的负荷和组合。然后，可以将细胞的基因表达改变与突变谱的组合用于在植入前推断卵裂球对特定疾病的遗传易感性。在一些情况下，培养中的胚胎脱落核酸，将所述核酸用于使用低通量基因组测序评估胚胎的健康状态。在一些情况下，将胚胎冷冻解冻。在一些情况下，核酸从胚细胞培养条件培养基(BCCM)、囊胚腔液(BF)或其组合获得。在一些情况下，使用胎儿细胞的PTA分析来检测染色体畸变，如胎儿非整倍体。在一些情况下，使用PTA来检测诸如唐氏(Down's)或帕陶(Patau)综合征的疾病。在一些情况下，在获得用于分析的核酸(例如，培养基、BF或细胞活检)之前，将冷冻胚细胞解冻并培养一段时间。在一些情况下，在获得用于分析的核酸之前，将胚细胞培养不超过4、6、8、12、16、24、36、48小时或不超过64小时。

在另一个实施方案中，微生物细胞(例如，细菌、真菌、原生动物)可以从植物或动物(例如，微生物群样品[例如，GI微生物群、皮肤微生物群等]或体液，例如，血液、骨髓、尿液、唾液、脑脊液、胸膜液、心包液、腹水或房水)分离。此外，微生物细胞可以从留置的医疗装置分离，如但不限于，静脉导管、导尿管、脑脊髓分流器、假体瓣膜、人工关节或气管导管。然后，细胞可以经历PTA和测序，以确定特定微生物的身份，并检测预测对特定抗菌剂的应答(或抗性)的微生物遗传变体的存在。这些数据可用于诊断特定的传染病和/或用作预测治疗应答的工具。

本文描述了使用本文所述的PTA方法从包含短核酸的样品产生扩增子文库的方法。在一些情况下，PTA可以提高短核酸扩增的保真度和均匀性。在一些情况下，核酸的长度不超过2000个碱基。在一些情况下，核酸的长度不超过1000个碱基。在一些情况下，核酸的长度不超过500个碱基。在一些情况下，核酸的长度不超过200、400、750、1000、2000或5000个碱基。在一些情况下，包括短核酸片段的样品包括但不限于古DNA(年龄为数百年、数千年、数百万甚至数十亿年)、FFPE(福尔马林固定的石蜡包埋的)样品、无细胞DNA或其他包括短核酸的样品。

实施例

提出以下实施例以更清楚地向本领域技术人员说明本文公开的实施方案的原理和实践，并且该实施例不应被解释为限制任何要求保护的实施方案的范围。除非另有说明，否则所有份数和百分比均以重量计。

实施例1：原代模板定向扩增

通过FACS分选进行的单细胞捕获。将低结合96孔PCR板放置于PCR冷却器上。将3μL细胞缓冲剂添加至将要分选细胞的所有孔。用密封膜密封板并且将其保持在冰上直至准备使用。在单细胞分选之后，密封板。将板在室温下以1400RPM在PCR板热混合器上混合10秒，短暂旋转，并且放置于冰上。可替代地，将含有分选细胞的板在密封下储存在干冰上或-80℃下直至准备好。

采用PTA的单细胞全基因组扩增。在将试剂添加至含有细胞的板之后，将RPM控制的混合器与设定至-20℃下持续2hr并且解冻10min的PCR冷却器一起使用，或者可替代地在冰上进行以下反应。将反应在无DNA的预PCR罩中组装。将所有试剂均在冰上解冻直至准备使用。使用前，将每种试剂涡旋10sec并短暂旋转。在不接触细胞悬液的情况下将试剂分配至管壁。将含有细胞的96孔PCR板放置于PCR冷却器上。如果细胞储存在-80℃下，则将细胞在冰上解冻5分钟，旋转10秒，然后将板放置于PCR冷却器(或冰)上。通过稀释12X混合物、在涡旋器上混合并且短暂旋转管来制备1X试剂混合物。通过将1X试剂混合物和裂解缓冲剂组合，在涡旋器上混合并且短暂旋转管来制备MS混合物。将3μL MS混合物添加至板的每个孔，并且用密封膜密封板。旋转10sec后，在室温下以1400rpm(板混合器)混合1min，并且旋转10sec，将板放回PCR冷却器(或冰)上持续10分钟。然后添加3μL中和缓冲剂，并且用板膜密封板。旋转10sec后，在室温下以1400rpm(板混合器)混合1min，旋转10sec，将板放回PCR冷却器上。添加3μL缓冲剂，并且用板膜密封板。接下来，将板旋转10sec，在室温下以1400rpm(板混合器)混合1min，并且旋转10sec，之后在室温下孵育10min。在孵育步骤期间，通过以下方式来制备反应混合物：按顺序组合组分(核苷酸/终止子试剂，5.0μL；1X试剂混合物，1.0μL；Phi29聚合酶，0.8μL；单链结合蛋白试剂，1.2μL)，之后通过上下移液10次进行轻轻充分混合，然后短暂旋转。当孵育完成时，将板放置于PCR冷却器(或冰)上。在板仍在PCR冷却器(或冰)上时将8μL反应混合物添加至每个样品，并且在室温下在板混合器中以1000rpm混合1min，然后短暂旋转。将板放置于具有如下程序的热循环仪上(盖设定至70℃)：30℃持续10hr，65℃持续3min，4℃保持。

扩增DNA净化。使捕获珠平衡至室温持续30min。将珠充分混合，并且然后将40μL珠添加至每个反应孔(涡旋和旋转)。将珠在每个分配步骤之前吸出，在室温下孵育10分钟，并且对样品板进行短暂离心。将板在磁体上放置3分钟或直至上清液澄清。在磁体上时，将上清液取出并丢弃，注意不要干扰含有DNA的珠。在磁体上时，将200μL新鲜制备的80％乙醇添加至珠，并且在室温下孵育30秒。仍在磁体上时，将第一次乙醇洗涤液取出并丢弃，注意不要干扰珠。再将200μL新鲜制备的80％乙醇添加至珠，并且然后在室温下孵育30秒。然后将第二次乙醇洗涤液取出并丢弃，注意不要干扰珠。孔中任何剩余的乙醇都被丢弃。然后将珠在室温下孵育5分钟以风干珠，然后将板从磁体移开。然后将珠重悬于40μL洗脱缓冲剂中，在室温下孵育2分钟，并且在磁体上放置3分钟，或直至上清液澄清。将38μL经洗脱的DNA转移至新板以进行DNA定量。然后将DNA准备用于下游应用如PCR或实时PCR中。

DNA定量。根据制造商，使用高灵敏度dsDNA测定试剂盒(Qubit)定量DNA。完成大小片段分析以确保正确的扩增产物大小。通过在E-Gel EX上运行1μL PTA产物或在高灵敏度生物分析仪DNA芯片中运行1μL 2ng/μL来确定片段大小分布。

末端修复和加A尾。将500ng扩增DNA添加至PCR管。用RT-PCR级水将DNA体积调节至35μL。将末端修复A尾反应在PCR冷却器(或冰)上如下组装：扩增DNA(500ng总DNA/Rxn，35μL)、RT-PCR级水(10μL)、片段化缓冲剂(5μL)、ER/AT缓冲剂(7μL)、ER/AT酶(3μL)，至总体积为60μL，将所述物质充分混合并短暂旋转。然后将混合物在具有105℃下的盖的热循环仪上在65℃下孵育30分钟。

衔接子连接。通过将54μL 10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA(pH8.0)添加至每个孔，将多用途文库衔接子储备液板稀释至1x。在进行末端修复和加A尾的同一板/管中，每个衔接子连接反应如下组装：ER/AT DNA(60μL)、1x多用途文库衔接子(5μL)、RT-PCR级水(5μL)、连接缓冲剂(30μL)和DNA连接酶(10μL)，至总体积为110μL。在充分混合并短暂旋转后，将混合物在热循环仪上在20℃下孵育15分钟(不需要加热盖)。

连接后净化。使珠平衡至室温持续30分钟，然后在临移液之前充分混合。在同一板/管中，如下组装0.8X SPRI净化：衔接子连接的DNA(110μL)和珠(88μL)，至最终体积为198μL。将混合物充分混合并且在室温下孵育10min，并且将板/管在磁体上放置2分钟，或直至上清液澄清。在磁体上时，将上清液取出并丢弃，注意不要干扰任何珠，之后对珠用200μL新鲜制备的80％乙醇洗涤并且在室温下孵育30秒。仍在磁体上时，将第一次乙醇洗涤液取出并丢弃，注意不要干扰珠。再将200μL新鲜制备的80％乙醇添加至珠，并且然后在室温下孵育30秒。然后将第二次乙醇洗涤液取出并丢弃，注意不要干扰珠。孔中任何剩余的乙醇都被丢弃。然后将珠在室温下孵育5分钟以风干珠，然后将板从磁体移开。然后将珠重悬于20μL洗脱缓冲剂中，在室温下孵育2分钟，并且在磁体上放置3分钟，或直至上清液澄清。

文库扩增。在含有DNA-珠浆液的同一板/管中，如下组装每个文库扩增反应：衔接子连接的文库(20μL)、10X KAPA文库扩增引物混合物(5μL)、2X KAPA HiFi Hotstartready混合物(25μL)，至总体积为50μL。在充分混合并短暂旋转后，使用循环方案进行扩增：初始变性98℃@45sec(1个循环)，变性98℃@15sec；退火60℃30sec；和延伸72℃30sec(10个循环)，最终延伸72℃@1min，进行1个循环，以及无限期保持4℃。将加热盖设定至105℃。将板/管在4℃下储存长达72小时，或直接用于扩增后净化。

扩增后净化。使珠平衡至室温持续30分钟。在临移液之前充分混合珠，并且在同一板/管中，如下组装0.55X SPRI净化：扩增文库(50.0μL)和珠(27.5μL)，至总体积为77.5μL，之后充分混合并且在室温下孵育10min。将板/管在磁体上放置3分钟，或直至上清液澄清。在磁体上时，将上清液转移至新板/管，注意不要转移任何珠。在板/管中，如下组装0.25XSPRI净化：0.55X净化上清液(77.5μL)和珠(12.5μL)，至总体积为90.0μL。在充分混合后，将混合物旋转沉降并且在室温下孵育10min。将板/管在磁体上放置3分钟或直至上清液澄清。在磁体上时，将上清液取出并丢弃，注意不要干扰任何珠，之后对珠用200μL新鲜制备的80％乙醇洗涤并且在室温下孵育30秒。仍在磁体上时，将第一次乙醇洗涤液取出并丢弃，注意不要干扰珠。再将200μL新鲜制备的80％乙醇添加至珠，并且然后在室温下孵育30秒。然后将第二次乙醇洗涤液取出并丢弃，注意不要干扰珠。孔中任何剩余的乙醇都被丢弃。然后将珠在室温下孵育5分钟以风干珠，然后将板从磁体移开。然后将珠重悬于42μL洗脱缓冲剂中，在室温下孵育2分钟，并且在磁体上放置3分钟，或直至上清液澄清。将40μL经洗脱的DNA转移至新板以进行DNA定量。

文库定量。根据制造商使用Qubit dsDNA试剂盒定量扩增文库。通过在E-Gel EX上运行1μL文库或在生物分析仪DNA芯片中运行1μL 2ng/μL来确定片段大小分布。

实施例2：用于高通量原代模板定向扩增的方法

按照实施例1的通用方法，用修饰对单细胞进行分析：使用两步骤PTA方案进行亚组实验，涉及裂解细胞和引发，然后直接添加包含中和缓冲剂的PTA反应混合物(图1A-图1B)。中和缓冲剂包含HEPES。使用两步骤方案所获得的结果导致扩增产物的产量相当(图2A-图2B)。检查了不同量的模板或使用单细胞的不同复制(图3)。显示没有扩增的单细胞复制可能没有接收细胞。如表1和图4中示出的，还测量了Pre-seq值和％线粒体读段，证明了对于两步骤方法和四步骤方法两者的最佳性能(最大Pre-seq值和最小化线粒体读段之间的平衡)。

表1

样品名称	Pre-Seq值	％线粒体读段
			H3KVN3-Jay-4步骤-SC1	2993719098	0.0016
H3KVN3-Jay-4步骤-SC10	3785178288	0.0051

H3KVN3-Jay-4步骤-SC4	3691627375	0.0046
			H3KVN3-Jay-4步骤-SC5	3856769543	0.0031
H3KVN3-Jay-4步骤-SC8	3544172893	0.0069
			H3KVN3-Jeff-2步骤-A6	3557702262	0.0039
H3KVN3-Jeff-2步骤-A7	3851783864	0.0049
			H3KVN3-Jeff-2步骤-A8	3740390108	0.0083
H3KVN3-Jeff-2步骤-B7	3241762990	0.0051
			H3KVN3-Jeff-2步骤-B8	3886454651	0.0032
H3KVN3-Jeff-2步骤-B9	3954709876	0.0049
			H3KVN3-Jeff-2步骤-C6	3970269923	0.005

实施例3：用于高通量原代模板定向扩增的方法

按照实施例1和2的通用方法，用修饰对单细胞进行分析：MgCl、dNTP和ddNTP的浓度在4步骤和2步骤条件下都有所不同(表2)。反应以2-5微升运行，以3微升最多。

表2

试剂Rxn浓度(mM)	4-步骤	[SB4B 2-步骤]	[SB4W 2-步骤]
				氯化镁	8	8	4.4
dNTP	2.8	2.8	1.25
				ddNTP	0.3	0.3	0.15

对照(SB4B和SB4W)的实时PTA结果分别在图5A和图5C中示出，并且单细胞(SB4B和SB4W)的实时PTA结果分别在图5B和图5D中示出。还从对图5E的另外八个样品进行了测序。通过Qubit Flex以1:10稀释度测量未清洁的PTA。产量受反应中Phi29浓度/量的强烈驱动，尽管当结合SEZ1和SEZ2时没有观察到产量差异。尽管通过C进行了早期扩增，但SB4W的产量并未超出范围。后期扩增的样品总体上具有较低产量(如果反应时间也减少，则在此分离程度更高)。还将未清洁的PTA反应物以1:100稀释度(～1-8ng/μL)放在tapestation上。SB4W片段大小与所测量的其他PTA制剂没有实质性差异。(图6B)。

还对使用这些条件所获得的样品进行了文库制备。文库制备使用Tecan d300/HPd100进行，将1μL 1:10稀释的PTA反应物稀释到3μL洗脱缓冲剂中，添加2μL ERAT混合物，而不添加增强子(补充H₂O+0.4％ Tween，

ERAT孵育，从衔接子板添加1μL文库衔接子，以2X典型浓度添加1μL连接混合物，并进行连接孵育。然后将样品用36μL的36mM EDTA复合(8个样品)成1个。进行珠净化，扩增文库，并使用双侧珠净化。测序结果(pre-seq和嵌合体率)分别在图6C-图6D中示出。SB4W条件产生了高度多样化的文库，并且增加的酶也增加了序列多样性。其他样品表现得不如先前观察到的好，但实时PTA(F14，J14)预测了测序失败。高质量SB4W样品是嵌合率较低的样品，并且没有增加的SEZ1与嵌合增加相关。在不受理论约束的情况下，一些嵌合可能与文库制备过程相关。

实施例4：2步骤PTA反应

根据图1A和实施例1-3中的通用方法进行两步骤PTA反应。简言之，将细胞分离，用裂解缓冲剂/引物溶液(“MS混合物”)处理，在室温下孵育，用中和/PTA混合物(“反应混合物”)处理，在30℃下孵育2.5小时，并且然后转化为测序就绪文库用于分析。与四步骤方法相比，裂解和引发步骤相结合，并且中和与PTA反应步骤相结合(图1B)。

组分：本实施例中所使用的组分包括细胞缓冲剂(1000μL)、SM3试剂(500μL)、12XSS2试剂(500μL)、SDXT试剂(360μL)、SB5试剂(1200μL)、SEZC试剂(100μL)、无DNA/核酸酶的水(500μL)和对照基因组DNA(50ng/μL，10μL)。在使用前，将试剂储存在-20℃。试剂的一般功能和组分在表3A中示出。

表3A

还评估了SB5及其变体制剂。这些在表3B中描述(浓度以mM为单位，体积以微升为单位)。

表3B

对照。使用了表4中的以下对照：

表4

每个对照以一式两份运行，以对每个实验进行基线检查。NTC有助于检测污染诸如来自相邻孔或实验室环境的遗留物，这是由于PTA对样品中超低水平核酸的高灵敏度而有用。大量gDNA对照有助于评估方案的正确执行和定量准确性。

手动移液技术：为了避免反应中的物质损失，避免了手动添加试剂期间移液器尖端与细胞悬浮液、裂解物或其他反应中间体之间的直接接触。只要允许移液器尖端与反应混合物接触，就不可避免地损失少量液体。所有试剂添加物都分配到管壁上。

温和且充分的混合：一旦将试剂添加至管中，就对反应组分采用温和且充分的混合。反应中的不均匀性可以导致效率低下并降低性能。为了确保每种试剂添加物都充分混合到反应中，将板/管密封并在离心机/板旋转器中短暂旋转(以～750X g 10秒足以)。使用刚好足够的力将添加的液滴与管底部的物质结合。

一旦添加的液滴与管底部的反应组分结合，就将反应板/管置于可编程热混合器中并轻轻混合。在混合之后，将反应物再次旋转以确保在混合过程期间所产生的任何液滴在板/管的底部重新组合。

在管的侧面完成移液器试剂添加，避免与管底部的物质的任何接触，然后密封-旋转-混合-旋转。在这些步骤之后，进行孵育或下一试剂添加。

定量：使用具有扩增产物和测序文库的荧光定量方法(诸如Qubit)。

针对单个活哺乳动物细胞优化了方案，并且相应地，超低量的DNA输入(4pg–10ng)也得以优化。输入可以是单个细胞或多个细胞，通过常见的细胞收集方法获得，所述细胞收集方法包括荧光激活细胞分选(FACS)、荧光激活细胞核分选(FANS)、激光捕获显微切割(LCM)和其他细胞捕获技术。尚未设立多个细胞输入的上限，但理论上每反应数十至数百个细胞是可行的。将有生存力的单细胞置于1μL细胞缓冲剂中，然后对其进行PTA方法或在-80℃冷冻用于短期储存。

实验准备

此示例允许通过PTA介导的基因组扩增过程处理单个或多个细胞(或细胞核)。使用自动化液体处理器最佳地进行试剂添加，以便利于每次运行多至384个样品的通量。基因组扩增在持续2.5小时的等温孵育中进行，该孵育在热循环仪中进行。经由FACS/FANS或其他方法将细胞直接置于含有1μL细胞缓冲剂的384孔板的孔中。如果需要，也可以将细胞“干”分选到空孔中。在将细胞“干”分选的情况下，在开始方案之前，向每个孔添加1μL细胞缓冲剂。如果孔含有少于1μL，则添加细胞缓冲剂以使体积达到1μL。

示例方案在无DNA的预扩增工作空间或PCR罩外壳中进行，以避免可能引入来自操作者或实验室环境的外源性DNA。进一步使用无模板对照(NTC)来鉴定核酸的外来来源。阳性对照反应在一定范围的输入浓度下运行。在方案期间，对细胞、裂解物和其他反应中间体使用传统涡旋混合器可以导致性能不佳。涡旋可以导致反应物混合不均匀，导致性能变化和管内容物飞溅到封板物或管盖上，导致基因组覆盖率的损失。除SEZC试剂外，所有试剂在解冻之后都使用涡旋混合器充分混合。除非另有说明，否则所有反应物和试剂都保存在冰上。当提到“短暂旋转沉降”时，目的是确保任何分散在管中的液滴被收集。在台式微量离心机上快速脉冲(3-5秒)通常是足够的。

方案I：试剂取回和对照设置

程序：从-20℃储存中取回组分。将12X SS2、对照gDNA、无DNA/核酸酶的水和细胞缓冲剂置于室温来解冻。将SM3、SDXT和SB5置于冰上来解冻30分钟至1小时。将SEZC留在-20℃储存中直至需要。一旦试剂解冻，将其涡旋5秒，短暂旋转沉降，并且置于冰上。重要：一旦12X SS2解冻，将其充分涡旋直至完全溶解任何沉淀物，短暂旋转沉降，并且置于冰上。

对照设置：通过在经标记的微量离心管中向49μL细胞缓冲剂添加1μL的对照gDNA来制备1ng/μL gDNA储备液。将1ng/μL gDNA涡旋5秒，短暂旋转沉降，并且置于冰上。任选地，使用Qubit荧光计验证1ng/μL对照gDNA储备液为预期浓度。注意：如果浓度偏离预期浓度1ng/μL多于10％，则修改后续稀释中的稀释因子以达到所期望的100pg/μL和10pg/μL浓度。设置了另外两个微量离心管并标记其为100pg/μL和10pg/μL。根据表5将以上制备的1ng/μL gDNA连续稀释。通过从1ng/μL gDNA溶液提取2μL并添加18μL细胞缓冲剂来制备100pg/μL溶液。类似地，使用来自100pg/μL溶液的2μL并添加18μL细胞缓冲剂以生成10pg/μL溶液。在每次稀释之后，进行充分涡旋5秒，将溶液短暂旋转沉降，并置于冰上，然后继续下一稀释步骤。

表5.对照连续稀释设置

管标记	gDNA	细胞缓冲剂
			1ng/μL gDNA	1μL的对照gDNA	49μL
100pg/μL gDNA	2μL的1ng/μL gDNA	18μL
			10pg/μL gDNA	2μL的100pg/μL gDNA	18μL

用所安装的384孔块对热循环仪编程，以运行DNA扩增程序(表6)。

表6.DNA扩增(盖温度105℃，反应体积4μL)

步骤	温度	时间
			保持1	30℃	2.5小时
保持2	65℃	3分钟
			保持3	4℃	∞
总时间	-	～2.6小时

将含有样品的板置于冰上。如果细胞储存在-80℃，则将细胞在冰上解冻5分钟，旋转10秒，并且置于冰上。如果细胞是新鲜的，则将其维持在冰上并迅速进行扩增步骤。如果细胞悬浮在小于1μL中，则添加细胞缓冲剂以使其多至1μL。

分配DNA对照。向每个阴性对照(NTC)孔添加1μL细胞缓冲剂。向每个10pg对照gDNA孔添加1μL 10pg/μL gDNA稀释物。向每个100pg对照gDNA孔添加1μL 100pg/μL gDNA稀释物。向每个1ng对照gDNA孔添加1μL 1ng/μL gDNA稀释物。板布置在图7中示出。

对于2步骤PTA过程的“步骤1”，通过在微量离心孔中组合以下试剂来制备MS混合物(表7)。

表7.MS混合物中用于384孔板中反应的组分体积

在混合之后，将管涡旋5秒以混合，短暂旋转沉降，并且置于冰上。使用自动化液体处理器，向每个孔添加1μL的MS混合物。将板密封并旋转沉降约10sec以合并组分。在热混合器中，混合在室温下以1,400rpm进行20min。在孵育期间完成了以下步骤：在热循环仪上启动DNA扩增方案(参见表6)并允许块达到30℃的孵育设定点。然后暂停热循环仪。随后，通过在冰上以表8中列出的顺序将组分合并来制备反应混合物。

表8.反应混合物中的组分体积

对于2步骤PTA过程的“步骤2”，将反应混合物上下移液10次，移液器设置为总体积的50％以混合，短暂旋转沉降，并且置于冰上。当移液器混合时注意避免产生气泡。将板从热混合器移出，旋转沉降10秒，并且置于冰上。使用自动化液体处理器，向每个孔添加2μL反应混合物。然后将板密封并旋转沉降10秒，在室温下在热混合器中以1000rpm混合1min，旋转沉降10秒，并且置于冰上。将板保持在冰上，直到热循环仪达到30℃，然后将板加载并取消暂停热循环仪程序。在程序完成之后，将板移出，旋转沉降10秒，并且置于冰上。然后进行下文所描述的质量控制程序或将样品在-20℃储存过夜。III.方案III：质量控制检查点

对PTA扩增产物进行了DNA定量和片段大小分布分析。如果使用384反应、半自动化方案来运行4μL反应物，则不需要纯化扩增的DNA。

程序：1.为了评估DNA产量，通过添加16μL洗脱缓冲剂将每个反应物稀释5倍。然后将2μL稀释的反应混合物添加至198μL Qubit试剂，并按照制造商的说明书测量浓度。单个人细胞的平均DNA扩增产量为260ng左右，范围在220ng与350ng之间(图8A)。新鲜PCR板中的2ng/μL稀释物通过将扩增的DNA样品移液到洗脱缓冲剂中来制备，将板密封，短暂涡旋，并且旋转沉降。片段大小分布通过使用Tapestation HSD5000 Screentape或其他片段分析仪器(使用制造商的说明书)运行每2ng/μL稀释样品中的2μL来确定。接下来，进行测序文库制备。代表扩增样品的电泳图在图8B中示出，其已经标准化为2ng/μL，并使用D5000 HSScreentape在Tapestation上运行。平均片段大小为1275bp。

测序文库制备

使用制备试剂盒(Bioskryb Genomics)从为用于下一代测序准备而产生的扩增的DNA制备下一代测序文库。文库制备过程增加了测序衔接子和条形码，用于在测序平台上进行多重测序。

初始低通测序

进行了初始轮次的低深度测序(每细胞2-5百万个读段)以检查文库复杂性，并确保单细胞文库按需要统一扩增，以及在进行高深度测序之前估计数据质量。通常，测序到此水平的样品适用于拷贝数变异(CNV)分析。总体上，合适的数据包括多至5百万个读段/细胞用于CNV分析。对于单核苷酸变异分析(SNV)和其他基因组结构变异的分析(诸如融合和插入缺失的检测)，使用了深度测序(25-30X基因组覆盖率)。

用于样品QC的数据分析和用于深度测序的分流

BioSkryb生物信息学平台含有分析管线PreSeq，其利用设计为评估低深度测序数据的算法来预测在更高深度测序水平的基因组覆盖率，并用于可视化其他一般性能指标。以下管线功能用于分析测序数据：

PreSeq(质量控制)：返回的指标当中是文库复杂性、错误率、染色体覆盖率、文库异常和读段计数。在转至更长、更昂贵的分析之前，这快速确定测序数据的质量(通过下采样)。用于SB5的各种制剂的低通数据在图9中示出。图9中L3和L4之间的圆系列(表3A，4333-5.1)提供了高基因组大小(指示测序质量)和测试细胞当中的高一致性。

WGS管线：基因组管线分析了单核苷酸变异(SNV)、小插入或缺失(Indel)和拷贝数变异(CNV)，(数据未示出)。外显子组或其他靶向的面板(panel)捕获方法可以用于针对感兴趣区域将这些数据置于上下文中考虑。

实施例5：2步骤方法和4步骤方法的比较

根据图1A中的通用方法进行两步骤PTA反应来证明若干优点。简言之，将细胞分离，用裂解缓冲剂/引物溶液(“MS混合物”)处理，在室温下孵育，用中和/PTA混合物(“反应混合物”)处理，在30℃下孵育2.5小时，并且然后转化为测序就绪文库用于分析(4333-5.1)。与四步骤方法相比，裂解和引发步骤相结合，并且中和与PTA反应步骤相结合(图1B)。然后将这些反应与PTA化学的先前遗留版本比较。首先观察到2步骤反应在节省时间方面的改善。产生足够扩增的基因组材料所需的时间减少了大约4X(图10A)。有效文库制备所需的材料(～100ng)在两个反应的扩增时间内产生。基于来自反应的实时监测数据，通过将反应中洗涤剂的量降低，反应时间进一步减少至大约0.5-1.5hr。

测序文库制备然后通过连接和扩增过程转化扩增的材料，以创建双索引短读段测序文库。

使用制备试剂盒(Bioskryb Genomics)从为用于下一代测序准备而产生的扩增的DNA制备下一代测序文库。文库制备过程增加了测序衔接子和条形码，用于在测序平台上进行多重测序。

本文中描述的实施例，对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将想到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。

与相邻图中呈现的遗留PTA(V1 ResolveDNA)相比，数据质量显著改善(图11A-图11D)。这在等位基因平衡、覆盖率和灵敏度的改善中是明显的。尽管精确度未变化，但这也是重要的结果，因为通常随着SNV灵敏度的增加而观察到的是精确度的协调降低。

然后根据一系列规范测试此化学物质以确定统计置信度(表9)。

表9

对深度测序单细胞的详细分析表明，由不同操作者进行的各个反应具有高再现性。数据表明，在基因组覆盖率、灵敏度、精确度、准确性和特异性方面具有优异的性能指标，这是由高等位基因平衡和低基尼系数驱动的。

表10A

表10B

本文中描述的实施例，对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本发明的情况下现将构思到多种变化、改变和替代。应当理解，本文中所述的本发明实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。

Claims (45)

1.一种从单细胞扩增的方法，所述方法包括：

(a)使单细胞与裂解缓冲剂接触，其中所述裂解缓冲剂包含至少一种扩增引物；

(b)同时向所述裂解缓冲剂添加：中和缓冲剂、至少一种核酸聚合酶和核苷酸混合物，其中所述核苷酸混合物包含至少一种终止子核苷酸，所述终止子核苷酸终止所述聚合酶的核酸复制；以及

(c)扩增基因组中的至少一些以产生多个终止的扩增产物，其中所述复制通过链置换复制进行，其中如果所述裂解缓冲剂或所述中和缓冲剂包含TWEEN-20，则所述TWEEN-20的量不多于0.2％(v/v)。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲剂包括碱、缓冲剂和螯合剂中的一种或多种。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述缓冲剂包括HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸、BES、MOPS、TES、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO或TEA。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲剂的一种或多种组分的浓度范围为约10mM至约500mM。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述裂解缓冲剂的pH为约11至约14。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)进行多于10分钟。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)、步骤(c)或步骤(b)和步骤(c)两者进行少于10小时。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)、步骤(c)或步骤(b)和步骤(c)两者进行少于1小时。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括在所述步骤(c)之后直接添加ERAT和/或连接混合物。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述终止子是不可逆终止子。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述终止子核苷酸选自带有α基团修饰的核苷酸、C3间隔子核苷酸、锁核酸(LNA)、反向核酸、2’氟核苷酸、3’磷酸化核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸和反式核酸。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述带有α基团修饰的核苷酸是α-硫代双脱氧核苷酸。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述终止子核苷酸包含脱氧核糖的3’碳的r基团的修饰。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述终止子核苷酸选自双脱氧核苷酸、反向双脱氧核苷酸、3’生物素化核苷酸、3’氨基核苷酸、3’-磷酸化核苷酸、3’-O-甲基核苷酸、包括3’C3间隔子核苷酸、3’C18核苷酸、3’己二醇间隔子核苷酸的3’碳间隔子核苷酸、无环核苷酸及其组合。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶基本上不具有聚合酶活性直至加热到至少40℃。

16.如权利要求1所述的方法，其中镁的浓度小于8mM。

17.如权利要求1所述的方法，其中所述核苷酸混合物包含至少一种dNTP。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述至少一种dNTP以0.1-5mM的浓度存在。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述至少一种dNTP以小于2.5mM的浓度存在。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种终止子核苷酸以小于0.3mM的浓度存在。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括对多个终止的扩增产物或其扩增子测序。

22.如权利要求21所述的方法，其中测序导致以下一种或多种：

(a)等位基因平衡为至少0.8；

(b)1X覆盖率为至少0.95；

(c)精确度为至少0.99；以及

(d)SNV灵敏度为至少0.85。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述单细胞为NA12878。

24.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括分析至少100个细胞。

25.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括分析至少1000个细胞。

26.一种组合物，其包含至少一种扩增引物、至少一种核酸聚合酶、缓冲剂和核苷酸混合物，其中所述核苷酸混合物包含至少一种dNTP和至少一种终止子核苷酸，所述终止子核苷酸终止聚合酶的核酸复制，其中所述缓冲剂包含镁，其中镁的浓度小于8mM。

27.如权利要求26所述的组合物，其中所述组合物进一步包含靶核酸分子。

28.如权利要求26所述的组合物，其中镁的浓度为1-6mM。

29.如权利要求26所述的组合物，其中所述镁的浓度为2-4mM。

30.如权利要求26所述的组合物，其中缓冲剂包含氯化镁。

31.如权利要求26所述的组合物，其中所述至少一种dNTP以0.1-5mM的浓度存在。

32.如权利要求26所述的组合物，其中所述至少一种dNTP以小于2.5mM的浓度存在。

33.如权利要求26所述的组合物，其中所述至少一种dNTP以0.5-2mM的浓度存在。

34.如权利要求26所述的组合物，其中所述至少一种终止子核苷酸以小于0.3mM的浓度存在。

35.如权利要求26所述的组合物，其中所述至少一种终止子核苷酸以0.05-0.20mM的浓度存在。

36.如权利要求26所述的组合物，其中dNTP和终止子与镁的浓度比为0.5-1.5。

37.如权利要求26所述的组合物，其中所述终止子是不可逆终止子。

38.如权利要求37所述的组合物，其中所述终止子核苷酸选自带有α基团修饰的核苷酸、C3间隔子核苷酸、锁核酸(LNA)、反向核酸、2’氟核苷酸、3’磷酸化核苷酸、2’-O-甲基修饰的核苷酸和反式核酸。

39.如权利要求38所述的组合物，其中所述带有α基团修饰的核苷酸是α-硫代双脱氧核苷酸。

40.如权利要求26所述的组合物，其中所述终止子核苷酸包含脱氧核糖的3’碳的r基团的修饰。

41.如权利要求26所述的组合物，其中所述终止子核苷酸选自双脱氧核苷酸、反向双脱氧核苷酸、3’生物素化核苷酸、3’氨基核苷酸、3’-磷酸化核苷酸、3’-O-甲基核苷酸、包括3’C3间隔子核苷酸、3’C18核苷酸、3’己二醇间隔子核苷酸的3’碳间隔子核苷酸、无环核苷酸及其组合。

42.如权利要求26所述的组合物，其中所述组合物进一步包含裂解缓冲剂。

43.如权利要求42所述的组合物，其中所述裂解缓冲剂包括碱、缓冲剂和螯合剂中的一种或多种。

44.如权利要求43所述的组合物，其中所述缓冲剂包括HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸、BES、MOPS、TES、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO或TEA。

45.如权利要求42所述的组合物，其中所述裂解缓冲剂的一种或多种组分的浓度范围为约10mM至约500mM。