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CN118294677A - 一种检测成纤维细胞生长因子21的方法 - Google Patents

一种检测成纤维细胞生长因子21的方法 Download PDF

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CN118294677A
CN118294677A CN202410442586.0A CN202410442586A CN118294677A CN 118294677 A CN118294677 A CN 118294677A CN 202410442586 A CN202410442586 A CN 202410442586A CN 118294677 A CN118294677 A CN 118294677A
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CN
China
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fgf21
antibody
biotin
antigen
streptavidin
Prior art date
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Application number
CN202410442586.0A
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李剑
梁庆环
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Hangzhou Diag Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Diag Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明保护了一种检测成纤维细胞生长因子21的方法，用自主开发的兔单抗抗体对制成的夹心法Elisa试剂盒，包括步骤：a制备FGF21抗体对原料；b链霉亲和素微孔板的制备：用碳酸钠缓冲液溶解链霉亲和素，每孔加入50‑200ul，0‑4℃包被过夜；c生物素标记抗体的制备；d酶标抗体的制备：选择酶用于标记FGF21检测抗体，将标记好的抗体置换于PBS缓冲液中，保存备用；e ELISA一步法的建立。该方法简化现有技术中测定FGF21步骤，缩短操作时间，提高检测效率。此外，采用了链霉亲和素‑生物素系统，具有信号放大作用，因而可提高酶联免疫吸附反应的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。

Description

一种检测成纤维细胞生长因子21的方法
技术领域
本发明单克隆抗体制备领域，具体涉及一种检测成纤维细胞生长因子21的方法。
背景技术
成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21,FGF21)属于FGF家族，于2000年Nishimura等人在小鼠胚胎中发现。FGF21是一种分泌蛋白，由210个氨基酸组成，其中约30个氨基酸构成信号肽。该基因主要是在肝脏中进行特异性地表达，但在骨骼肌、胸腺和胰腺细胞等也有表达。研究已表明FGF21是一种新的糖脂代谢调节因子，有助于脂肪代谢，促进葡萄糖吸收，促进胰岛素分泌。FGF21具有治疗糖尿病药物所必须的一些特性，并且不会产生目前糖尿病治疗中常见的低血糖和水肿两个副作用，有望成为治疗糖尿病的理想药物。另外，FGF21对细胞没有明显的促有丝分裂作用，由此可大幅降低临床用药风险，对治疗具有极大的应用前景。目前已有临床研究发现FGF21类似物在治疗糖尿病、肥胖症以及非酒精性脂肪性肝炎方面具有很好潜力。基于上述优点,近年来FGF21成为了研究热点，与此同时对FGF21的检测也提出了更高的要求。目前，对FGF21的免疫检测方法是采用传统的ELISA夹心法，该方法检测时间较长。本方案拟采用我们自主研发的一步法对其进行检测，由此可简化测定步骤，缩短操作时间，提高检测效率。此外，由于传统检测方法的灵敏度有限，当样品中的抗原含量较少时，其检测结果有时仍为阴性，因而导致误断。然而，由于一步法采用了链霉亲和素-生物素系统，具有信号放大作用，因而可提高酶联免疫吸附反应的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种检测成纤维细胞生长因子21的方法，包括以下步骤：
a制备FGF21抗体对原料；
b链霉亲和素微孔板的制备：用碳酸钠缓冲液溶解链霉亲和素，每孔加入50-200ul，0-4℃包被过夜；
c生物素标记抗体的制备：用DMSO将生物素溶解，将生物素和FGF21捕获抗体按摩尔比1:10-1:50体积比混合，室温静置2h，除去多余的自由态生物素，置换于PBS缓冲液，保存备用；
d酶标抗体的制备：选择酶用于标记FGF21检测抗体，将标记好的抗体置换于PBS缓冲液中，保存备用；
e ELISA一步法的建立：将所述生物素标记抗体、待检样品和酶标抗体各20-150ul/孔加入经链霉亲和素包被的微孔板中，孵育，洗涤，拍干，加入底物，显色后终止反应。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述步骤a包括FGF21抗原制备：
①选取FGF21蛋白的氨基酸序列为aa29-209，氨基酸序列：HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVK TSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLP LPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS；
②构建FGF21质粒；
③将构建的FGF21质粒在真核细胞表达系统做瞬时表达，收取纯化后FGF21重组蛋白用于抗原制备。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述步骤a包括动物免疫：
选取免疫动物；
FGF21重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后用作免疫用抗原；
首次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
两周后第二次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
一周后第三次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
两周后第四次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
两周后第五次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
一周后取少量全血，离心制备抗血清用于血清滴度测试；
一周后静脉注射0.2-0.5mg不含佐剂FGF21重组蛋白加强免疫。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述步骤a还包括：抗血清检测、单个B细胞培养以及FGF21阳性孔筛选、阳性孔的抗体基因质粒构建与抗体的表达、棋盘筛选抗体配对、抗体配对的大规模生产。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述免疫动物为兔子，绵羊，豚鼠中的一种。
作为本发明实施例的一个优选方案，上述单个B细胞培养以及FGF21阳性孔筛选包括：
①分离全血B淋巴细胞；
②将分离的B淋巴细胞以3000个细胞/孔铺至有FGF21抗原包板的无菌96孔标板，过夜培养；
③用含10％-20％胎牛血清的PBS清洗两遍；
④清洗后剩余的B淋巴细胞用1640培养基培养；
⑤培养5天后取上清并用ELISA间接法筛选阳性孔。
本发明的有益效果是：本发明基于链霉亲和素-生物素系统，每个链霉亲和素可结合4个生物素，从而具有多级放大作用，提高FGF21检测灵敏度；将链霉亲和素包被于微孔板中，如此不仅易于保存，而且避免了抗体包被时出现的失活现象；生物素标记FGF21抗体、样本中的抗原和酶标FGF21抗体形成的复合物通过生物素与微孔板上的亲和素结合，由于亲和素与生物素的结合具有极高的亲和力，使反应具有高度专一性和稳定性；同时本发明方法采用一步法，可简化操作步骤，缩短检测时间，适于广泛应用。
附图说明
图1为本发明的抗体SDS PAGE分析纯化后纯度示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1FGF21抗体对原料药
1.FGF21抗原制备
1.1选取FGF21蛋白的氨基酸序列为aa29-209，具体氨基酸序列如下：HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVK TSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLP LPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS；
1.2构建FGF21质粒；
1.3将构建的FGF21质粒在真核细胞表达系统做瞬时表达，收取纯化后获得约20mg
FGF21重组蛋白用于抗原制备。
2.动物免疫
2.1选取四只兔子作为免疫动物；
2.2FGF21重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后用作免疫用抗原；
2.3首次免疫：每只动物多点注射合计0.2mg乳化后抗原；
2.4两周后第二次免疫：每只动物多点注射合计0.2mg乳化后抗原；
2.5一周后第三次免疫：每只动物多点注射合计0.2mg乳化后抗原；
2.6两周后第四次免疫：每只动物多点注射合计0.2mg乳化后抗原；
2.7两周后第五次免疫：每只动物多点注射合计0.2mg乳化后抗原；
2.8一周后取少量全血，离心制备抗血清用于血清滴度测试；
2.9一周后静脉注射0.2mg不含佐剂FGF21重组蛋白加强免疫。
3.抗血清检测
3.1将免疫后四只兔子的抗血清分别用制备的FGF21抗原蛋白做ELISA滴度测试，结果见表1；
3.2选取抗血清滴度最高的RB223号兔子，用于取全血。
表1四只兔子抗血清滴定结果
4.单个B细胞培养以及FGF21阳性孔筛选
4.1分离全血B淋巴细胞；
4.2将分离的B淋巴细胞以3000个细胞/孔铺至有FGF21抗原包板的无菌96孔标板，过夜培养；
4.3用含10％胎牛血清的PBS清洗两遍；
4.4清洗后剩余的B淋巴细胞用1640培养基培养；
4.5培养5天后取上清并用ELISA间接法筛选阳性孔，结果见表2.1-表2.6；
表2.1-表2.6RB223 B淋巴细胞滴定结果
表2.1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.263 0.182 0.392 0.254 0.298 0.178 0.179 0.309 0.155 0.336 0.368 0.316
B 0.198 0.257 0.242 0.206 0.221 0.383 0.366 0.390 0.391 0.139 0.251 0.192
C 0.360 0.123 0.125 0.208 0.157 0.370 0.147 0.249 0.399 0.195 0.397 0.262
D 0.112 0.386 0.147 0.595 0.347 0.123 0.295 0.332 0.395 0.330 0.271 0.181
E 0.233 0.116 0.155 0.359 0.348 0.181 0.199 0.124 0.242 0.214 0.233 0.174
F 0.141 0.279 0.194 0.252 0.154 0.137 0.221 0.231 0.326 0.214 0.388 0.308
G 0.227 0.201 0.386 0.247 0.337 0.125 0.266 0.249 0.306 0.302 0.168 0.252
H 0.249 0.236 0.337 0.119 0.388 0.132 0.355 0.233 0.231 0.124 0.297 0.279
表2.2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.263 0.323 0.277 0.112 0.138 0.189 0.386 0.258 0.145 0.214 0.373 0.217
B 0.204 0.314 0.124 0.384 0.215 0.280 0.228 0.288 0.364 0.210 0.226 0.232
C 0.235 0.204 0.211 0.135 0.342 0.246 0.295 0.213 0.303 0.267 0.392 0.205
D 0.189 0.222 0.587 0.280 0.251 0.131 0.145 0.208 0.302 0.284 0.371 0.176
E 0.356 0.384 0.154 0.269 0.176 0.290 0.234 0.177 0.171 0.258 0.302 0.169
F 0.184 0.237 0.352 0.261 0.314 0.172 0.316 0.286 0.190 0.279 0.207 0.396
G 0.314 0.361 0.351 0.318 0.258 0.150 0.174 0.163 0.251 0.327 0.373 0.297
H 0.291 0.332 0.346 0.134 0.262 0.302 0.336 0.164 0.284 0.233 0.398 0.116
表2.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.327 0.118 0.370 0.164 0.319 0.335 0.392 0.254 0.177 0.332 0.327 0.147
B 0.244 0.287 0.361 0.309 0.293 0.385 0.201 0.313 0.389 0.199 0.136 0.270
C 0.209 0.703 0.281 0.268 0.295 0.329 0.115 0.329 0.148 0.257 0.282 0.379
D 0.373 0.162 0.311 0.392 0.322 0.347 0.222 0.282 0.377 0.278 0.295 0.234
E 0.120 0.187 0.398 0.251 0.216 0.283 0.385 0.288 0.243 0.319 0.327 0.320
F 0.395 0.375 0.284 0.379 0.371 0.218 0.204 0.117 0.143 0.345 0.159 0.339
G 0.214 0.362 0.389 0.354 0.240 0.315 0.201 0.116 0.239 0.383 0.164 0.205
H 0.363 0.378 0.361 0.156 0.316 0.231 0.120 0.248 0.194 0.316 0.357 0.332
5.阳性孔的抗体基因质粒构建与抗体的表达(小量生产)
5.1为了构建抗体基因质粒，首先选取24孔阳性孔B细胞，通过分子克隆技术分别构建抗体基因质粒，成功构建10个抗体基因质粒，具体的，利用PCR扩增和酶切技术从这些细胞中提取抗体基因的DNA序列。接着，将这些DNA片段与质粒载体连接起来，形成重组质粒，这一过程涉及了限制酶切割、DNA连接和转化等关键步骤，每个质粒都经过了精确的设计和验证，质粒构建编号以及构建成功编号见表3；
5.2构建成功的质粒通过转染真核细胞表达获得相应抗体上清(小量生产)；
5.3纯化小量生产的抗体备用，参照图1，为单克隆抗体纯化结果，其中，Marker：蛋白质分子质量标准，后侧泳道：纯化后抗体，此外，通过SDS PAGE分析，在分子量约20kD处清晰可见条带，并未出现其他条带，以上的试验表明了纯化后的抗体纯度很高，并且没有受到其他杂质的影响。这些数据证明了该纯化系统的有效性和可靠性，为制备高纯度的抗体提供了重要的技术支持。
表3抗体基因质粒编号
阳性孔位编号 1D4 2D3 3D5 4F4 5C3 6C2 7E4 8E2 9F4 10D2 10G1 11E3
质粒构建编号 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12
构建成功编号 Failed #2 Failed Failed #5 Failed #7 Failed Failed #10 #11 Failed
阳性孔位编号 12E1 13E2 14C1 15E2 15G3 16A2 17A3 18D1 19D2 19F5 20A11 20G2
质粒构建编号 #13 #14 #15 #16 #17 #18 #19 #20 #21 #22 #23 #24
构建成功编号 #13 Failed Failed Failed #17 Failed #19 Failed #21 #22 Failed Failed
6.棋盘筛选最佳配对
6.1将10个小量生产获得的单克隆抗体的一半分别做生物素标记，另一半单克隆抗体备用；
6.2ELISA夹心法将10个(对)抗体用抗原做棋盘实验，结果见表4；
6.3选取最佳配对6对，见表5；
6.4ELISA夹心法将最佳6对配对抗体用已知FGF21阳性人血清检测，获得2对针对人血清样本阳性的兔单克隆抗体对，见表6。
表4棋盘筛选数据
#2-Biotin #5-Biotin #7-Biotin #10-Biotin #11-Biotin #13-Biotin #17-Biotin #19-Biotin #21-Biotin #22-Biotin
#2 0.151 0.862 0.423 0.481 0.571 0.781 0.881 0.812 0.671 0.589
#5 0.734 0.176 0.721 0.211 0.215 0.982 0.131 0.251 0.356 0.431
#7 0.732 1.334 0.462 0.567 1.658 0.924 0.883 1.239 0.891 0.591
#10 0.799 0.178 0.899 0.143 0.212 0.905 0.776 0.188 0.341 0.881
#11 0.869 0.348 0.433 0.312 0.302 0.345 0.315 0.313 0.661 0.556
#13 0.794 0.982 0.895 0.334 0.923 0.331 0.335 1.288 0.443 0.944
#17 0.931 0.173 0.491 0.901 0.303 0.661 0.141 0.211 1.321 0.976
#19 0.799 0.422 0.322 0.561 0.537 0.761 0.478 0.367 0.453 0.63
#21 0.512 0.766 1.315 0.605 0.521 0.604 0.601 0.825 0.241 0.254
#22 0.541 0.851 0.291 0.623 0.708 0.607 0.722 0.761 0.404 0.318
表5最佳6对配对抗体
最佳配对表
#7&#5-Biotin
#7&#11-Biotin
#7&#19-Biotin
#13&#19-Biotin
#17&#21-Biotin
#21&#7-Biotin
表6FGF21阳性人血清滴定数据
7.最佳配对的大规模生产
7.1选取2对人血清样本阳性抗体对中灵敏度更高的#7&#5抗体对和#17&#21抗体对对应的质粒做大量质粒扩增并提取；
7.2将扩增质粒转染真核细胞做大量生产并纯化获得的抗体即为FGF21ELISA试剂的核心原料。
实施例1FGF21检测试剂盒
1.酶联免疫吸附试剂的准备：
1.1生物素标记抗体的制备：用DMSO将生物素溶解，将生物素和FGF21捕获抗体按摩尔比1:20混合，室温静置2h，超滤离心除去多余的自由态生物素，并将其置换于PBS缓冲液，保存备用；
1.2辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体：采用过碘酸钠氧化法标记FGF21检测抗体。将标记好的抗体超滤离心置换于PBS缓冲液中，保存备用；
2样品准备：取静脉血约5ml，及时离心取上清，置于离心管中作为检测用血浆样本，-20℃保存备用；
3具体实验步骤：
3.1链霉亲和素包被微孔板：用碳酸钠缓冲液(pH 9.6)溶解链霉亲和素，每孔加入100ul，4℃包被过夜；
3.2洗涤：弃去包被液，加入300ul 1×PBST洗板，重复3次，每次3min，最后一次在吸水纸上拍干；
3.3封闭：每孔分别加入200ul 1％ BSA封闭液，室温下孵育1h；
3.4洗涤：弃去包被液，加入300ul 1×PBST洗板，重复3次，每次3min，最后一次在吸水纸上拍干；
3.5加样：将FGF21生物素标记抗体、标准品或待检样品和FGF21酶标抗体各50ul/孔加入微孔板中，37℃孵育1h；
3.6洗涤：弃去包被液，加入300ul 1×PBST洗板，重复3次，每次3min，最后一次在吸水纸上拍干；
3.7显色：加入TMB底物100ul/孔，显色15min，加入终止液1N H2S04 100ul/孔，终止反应；
3.8读值并计算结果：用酶标仪于波长450nm处读数，绘制标准曲线，计算待检样品中抗原浓度。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a制备FGF21抗体对原料；
b链霉亲和素微孔板的制备：用碳酸钠缓冲液溶解链霉亲和素，每孔加入50-200ul，0-4℃包被过夜；
c生物素标记抗体的制备：用DMSO将生物素溶解，将生物素和FGF21捕获抗体按摩尔比1:10-1:50体积比混合，室温静置，除去多余的自由态生物素，置换于PBS缓冲液，保存备用；
d酶标抗体的制备：选择酶用于标记FGF21检测抗体，将标记好的抗体置换于PBS缓冲液中，保存备用；
e ELISA一步法的建立：将所述生物素标记抗体、待检样品和酶标抗体各20-150ul/孔加入经链霉亲和素包被的微孔板中，孵育，洗涤，拍干，加入底物，显色后终止反应。
2.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a还包括FGF21抗原制备：
①选取FGF21蛋白的氨基酸序列为aa29-209，氨基酸序列：HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVK TSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLP LPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS；
②构建FGF21质粒；
③将构建的FGF21质粒在真核细胞表达系统做瞬时表达，收取纯化后FGF21重组蛋白用于抗原制备。
3.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a还包括动物免疫步骤：
①选取免疫动物；
②FGF21重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化后用作免疫用抗原；
③首次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
④两周后第二次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
⑤一周后第三次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
⑥两周后第四次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
⑦两周后第五次免疫：每只动物多点注射合计0.2-0.5mg乳化后抗原；
⑧一周后取少量全血，离心制备抗血清用于血清滴度测试；
⑨一周后静脉注射0.2-0.5mg不含佐剂FGF21重组蛋白加强免疫。
4.根据权利要求1所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述步骤a还包括：抗血清检测、单个B细胞培养以及FGF21阳性孔筛选、阳性孔的抗体基因质粒构建与抗体的表达、棋盘筛选抗体配对、抗体配对的大规模生产。
5.根据权利要求3所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述免疫动物为兔子，绵羊，豚鼠中的一种。
6.根据权利要求4所述的检测成纤维细胞生长因子21的方法，其特征在于，所述单个B细胞培养以及FGF21阳性孔筛选包括：
①分离全血B淋巴细胞；
②将分离的B淋巴细胞以3000个细胞/孔铺至有FGF21抗原包板的无菌96孔标板，过夜培养；
③用含10％-20％胎牛血清的PBS清洗两遍；
④清洗后剩余的B淋巴细胞用1640培养基培养；
⑤培养5天后取上清并用ELISA间接法筛选阳性孔。
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