CN112005119A - 检测和定量fgf21的方法 - Google Patents
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Abstract
目前公开的主题提供了结合FGF21的抗体及其使用方法。具体地，本公开提供了用于检测和定量样品中的有活性的和总的FGF21水平的免疫测定方法，以及用于执行这样的方法的试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
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序列表
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发明领域
本发明涉及与FGF21结合的抗体以及使用该抗体的免疫测定方法和试剂盒。
背景技术
成纤维细胞生长因子21(FGF21)是FGF超家族的内分泌物成员，在葡萄糖和脂质代谢的调节中发挥作用。FGF21需要FGF受体(FGFR)同种型和膜结合的共受体Klotho-β(KLB)进行信号传导(Ogawa等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104(18):7432-37(2007)；US 2010/0184665)。FGF21是一种有效的疾病改良蛋白，对葡萄糖内环境稳定和胰岛素敏感性具有有益作用，并且在动物疾病模型中已显示逆转肥胖症和2型糖尿病(Kharitonenkov等J.Clin.Invest.115(6):1627-35(2005))。重组FGF21的施用已显示在瘦蛋白信号缺乏(ob/ob或db/db)的小鼠或高脂饮食(HFD)喂养的小鼠中降低肝脏脂质，改善胰岛素敏感性并使血糖控制正常化(Dunshee等J.Biol.Chem.291(11):5986-96(2016)；US 2015/0218276)。在每天用重组FGF21治疗的肥胖和糖尿病恒河猴中，也已经观察到血糖降低和各种心血管危险因素的改善。
FGF21可以在N端和C端被蛋白水解切割，并且这种切割已显示影响FGF21的活性。在N末端，前四个氨基酸，其在人FGF21中具有序列His-Pro-Ile-Pro(HPIP(SEQ ID NO:76))，可以被二肽基肽酶切割(Dunshee等(2016))。在C端，内肽酶成纤维细胞活化蛋白(FAP)切割最末端的10个氨基酸，其具有在人FGF21中的氨基酸序列Ser-Gln-Gly-Arg-Ser-Pro-Ser-Tyr-Ala-Ser(SQGRSPSYAS(SEQ ID NO:77))(Dunshee等(2016))。缺少四个N-末端氨基酸的FGF21是完全活性的；而缺乏最后十个C末端氨基酸的FGF21不能结合共受体KLB且无活性(Yie等FEBS Letters 583:19-24(2009))。
已经提出循环FGF21是代谢疾病如糖尿病的生物标志物，因为在肥胖受试者、患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的受试者和患有2型糖尿病的受试者中观察到FGF21的血清水平升高(Zhang等Diabetes 57(5):1246-1253(2008)；Li等Diabetes Res.Clin.Pract.93(1):10-16(2011))。考虑到FGF21在代谢疾病的治疗和发展中的重要作用，在本领域中仍然需要用于确定个体中FGF21蛋白的量的测定法。
发明内容
本公开提供了结合成纤维细胞生长因子21(FGF21)的抗体，以及此类抗体在用于检测和定量样品中的FGF21蛋白(例如总的和/或有活性的FGF21蛋白)的免疫测定方法中的用途。
在某些实施方案中，本公开提供了用于确定样品中总FGF21蛋白的量的免疫测定。例如但不限于，确定样品中总FGF21蛋白的量的方法可包括使捕获抗体与所述样品接触以生成样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合,(b)使所述样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触，所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的结合，(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述检测抗体，并(d)基于结合的所述检测抗体的水平计算所述样品中存在的总FGF21蛋白的量。在某些实施方案中，所述捕获抗体和所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
在某些实施方案中，本公开提供了用于确定样品中有活性的FGF21蛋白的量的免疫测定。例如但不限于，确定样品中有活性的FGF21蛋白的量的方法可包括(a)使捕获抗体与所述样品接触以生成样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合,(b)使所述样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触，所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的结合，(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述检测抗体，并(d)基于结合的所述检测抗体的水平计算所述样品中存在的有活性的FGF21蛋白的量。
在某些实施方案中，本公开提供了用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的免疫测定。例如但不限于，所述方法可包括(i)使第一捕获抗体与所述样品接触以生成第一样品-捕获抗体组合材料，所述第一捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合,(ii)使所述第一样品-捕获抗体组合材料与第一检测抗体接触，所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的结合，(iii)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述第一检测抗体，并(iv)基于结合的所述第一检测抗体的水平计算所述样品中存在的总FGF21蛋白的量。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括(i)使第二捕获抗体与所述样品接触以生成第二样品-捕获抗体组合材料，所述第二捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合,(ii)使所述第二样品-捕获抗体组合材料与第二检测抗体接触，所述第二检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的结合，(iii)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述第二检测抗体，并(iv)基于结合的所述第二检测抗体的水平计算所述样品中存在的有活性的FGF21蛋白的量。在某些实施方案中，该方法可以包括将计算出的总FGF21蛋白的量与计算出的有活性的FGF21蛋白量进行比较，以确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例。在某些实施方案中，所述第一捕获抗体和所述第二捕获抗体是相同的抗体。在某些实施方案中，第一所述捕获抗体和所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
在某些实施方案中，免疫测定方法是酶联免疫吸附测定(ELISA)。在某些实施方案中，免疫测定方法以约2pg/ml至约20pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
在某些实施方案中，免疫测定方法是单分子检测测定，例如，使用QuanterixSimoa HD-1AnalyzerTM的单分子检测测定。在某些实施方案中，免疫测定方法以约0.2pg/ml至约0.5pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
本公开进一步提供了用于执行用于检测和定量FGF21蛋白的免疫测定方法的试剂盒。在某些实施方案中，本公开提供了用于确定样品中总FGF21蛋白的量的试剂盒。例如，但不限于，用于定量总FGF21蛋白的量的试剂盒包括(a)捕获抗体，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合，(b)检测抗体，与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合和(c)检测剂。在某些实施方案中，所述捕获抗体和所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
在某些实施方案中，本公开提供了用于确定样品中有活性的FGF21蛋白的量的试剂盒。例如，但不限于，用于定量有活性的FGF21蛋白的量的试剂盒包括(a)捕获抗体,其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合，(b)检测抗体，与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位结合和(c)检测剂。
在某些实施方案中，本公开提供了用于确定样品中有活性的FGF21蛋白的量的试剂盒。例如，但不限于，用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的试剂盒可包括(a)第一捕获抗体，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合，(b)第一检测抗体，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合，(c)第二捕获抗体，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合，(d)第二检测抗体，其与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位结合，和(e)一个或更多个检测剂。在某些实施方案中，所述第一捕获抗体和所述第二捕获抗体是相同的抗体。在某些实施方案中，所述第一所述捕获抗体和所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
在某些实施方案中，用于检测检测抗体、第一检测抗体和/或第二检测抗体的检测剂可以选自链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖缀合物，链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物及其组合。在某些实施方案中，所述链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖缀合物具有约100pM至约400pM的浓度。
在某些实施方案中，本公开的试剂盒可进一步包括试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷(galactopyranoside)、四甲基联苯胺、过氧化氢或其组合。例如但不作为限制，本公开的试剂盒可以包括链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖缀合物作为检测剂，并且可以进一步包括试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。在某些实施方案中，本公开的试剂盒可包括链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物作为检测剂，并且可进一步包含四甲基联苯胺和过氧化氢。
在某些实施方案中，本文公开的试剂盒以约2pg/ml至约20pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。在某些实施方案中，本文公开的试剂盒以约0.2pg/ml至约0.5pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
在某些实施方案中，将捕获抗体、第一捕获抗体或第二捕获抗体固定化在顺磁珠上。在某些实施方案中，捕获抗体、第一捕获抗体和/或第二捕获抗体以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。在某些实施方案中，检测抗体、第一检测抗体和第二检测抗体与生物素缀合。在某些实施方案中，所述检测抗体和/或第一检测抗体以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。在某些实施方案中，用于确定总FGF21蛋白的量的所述检测抗体和/或第一检测抗体具有约0.1μg/ml至约1μg/ml的浓度。在某些实施方案中，用于确定有活性的FGF21蛋白的量的检测抗体和/或第二检测抗体具有约1μg/ml至约3μg/ml的浓度。
在某些实施方案中，捕获抗体、第一捕获抗体和/或第二捕获抗体包括以下或竞争性地与包含以下的抗体结合：(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26和27组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:26)及其保守置换，(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:30和31组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:30)及其保守置换，(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列(例如SEQID NO:34)及其保守置换，(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:38)及其保守置换，(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:42)及其保守置换和(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:46)及其保守置换。
在某些实施方案中，捕获抗体、第一捕获抗体和/或第二捕获抗体包括以下或竞争性地与包含以下的抗体结合：(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:54、55、74和75组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:54)及其保守置换；和(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:50、51、70和71组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:50)及其保守置换。在某些实施方案中，捕获抗体、第一捕获抗体和/或第二捕获抗体包括以下或竞争性地与包含以下的抗体结合：(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:22、23、66和67组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:22)及其保守置换；和(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:18、19、62和63组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:18)及其保守置换。
在某些实施方案中，检测抗体和/或第一检测抗体包括以下或竞争性地与包含以下的抗体结合：(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:29)及其保守置换，(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ IDNO:32和33组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:33)及其保守置换，(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:37)及其保守置换，(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:41)及其保守置换，(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ IDNO:44和45组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:45)及其保守置换和(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:49)及其保守置换。
在某些实施方案中，检测抗体和/或第一检测抗体包括以下或竞争性地与包含以下的抗体结合：(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:56、57、72和73组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:57)及其保守置换；和(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:52、53、68和69组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:53)及其保守置换。在某些实施方案中，检测抗体和/或第一检测抗体包括以下或竞争性地与包含以下的抗体结合：(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:24、25、64和65组成的组的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:25)及其保守置换；和(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:20、21、60和61组成的组的氨基酸序列(例如SEQID NO:21)及其保守置换。
在某些实施方案中，在所公开的免疫测定方法中使用的抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在某些实施方案中，在公开的免疫测定方法中使用的抗体可以是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、双抗体或F(ab’)2片段。
在某些实施方案中，被分析的样品是获自受试者的血液样品。在某些实施方案中，样品是获自受试者的血浆样品。
本公开进一步提供了分离的抗FGF21抗体。在某些实施方案中，分离的抗FGF21抗体或其抗原结合部分包含：(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26-29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:30-33组成的组的氨基酸序列及其保守置换；(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ IDNO:34-37组成的组的氨基酸序列及其保守置换，(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38-41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42-45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46-49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
在某些实施方案中，分离的抗FGF21抗体或其抗原结合部分，包含：(a)重链可变结构域(VH)序列，其包含选自由SEQ ID NO:54-57和72-75组成的组的氨基酸序列；和(b)轻链可变结构域(VH)序列，其包含选自由SEQ ID NO:50-53和68-71组成的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，分离的抗FGF21抗体或其抗原结合部分，包含：(a)重链序列，其包含选自由SEQ ID NO:22-25和64-67组成的组的氨基酸序列；和(b)轻链序列，其包含选自由SEQ IDNO:18-21和60-63组成的组的氨基酸序列。
附图简述
图1.描述80种表达抗FGF21抗体的杂交瘤上清液的ELISA筛选结果。
图2：显示使用mAb4或mAb9捕获抗体和mAb11检测抗体通过夹心ELISA进行完整FGF21和(versus)经切割的FGF21检测的剂量反应。
图3：描述抗FGF21抗体mAb4、mAb9、mAb11和mAb15的
表面等离振子共振分析。
图4：描绘显示抗FGF21抗体与FGF21结合的示意图(FGF19用作阴性对照)。
图5：描绘用于检测总FGF21和有活性的FGF21的比色ELISA方法的非限制性实施方案的示意图。
图6：描述用于进行总的和有活性的FGF21 ELISA测定的方案的非限制性实施方案。
图7：描绘使用mAb4或mAb11捕获抗体和各种检测抗体的ELISA分析的结果。
图8：描绘使用示例性的总的和有活性的FGF21 ELISA测定法检测野生型和经切割的人FGF21的灵敏度的比较。
图9：描绘使用示例性总FGF21 ELISA测定法检测人FGF21。
图10：描绘指示示例性的抗FGF21抗体不与小鼠FGF21交叉反应的ELISA测定。
图11：描绘在示例性的总的和有活性的FGF21 ELISA分析中捕获抗体mAb4和mAb9灵敏度的比较。
图12：描述包被缓冲液和浓度对使用mAb4作为捕获抗体并使用mAb15作为检测抗体的示例性总FGF21 ELISA分析的灵敏度的影响。
图13：描述包被缓冲液和浓度对使用mAb4作为捕获抗体并使用绵羊C末端pAb作为检测抗体的示例性有活性的FGF21 ELISA分析灵敏度的影响。
图14：描绘生物素缀合的检测抗体和HRP浓度对使用mAb4作为捕获抗体并使用mAb15作为检测抗体的示例性总FGF21 ELISA检测灵敏度的影响。
图15：描绘使用Quanterix Simoa HD-1AnalyzerTM(“Quanterix Simoa”)检测总FGF21和有活性的FGF21的单分子检测方法的非限制性实施方案的示意图。
图16：描绘使用Quanterix Simoa的示例性总FGF21和有活性的FGF21测定的两步测定方案的非限制性实施方案。
图17：描绘通过使用Quanterix Simoa的示例性总FGF21和有活性的FGF21测定的完整的FGF21和切割的FGF21检测的剂量反应。
图18：描绘用于使用Quanterix Simoa进行示例性的总的和有活性的FGF21测定的方案的非限制性实施方案。
图19：描绘在使用Quanterix Simoa的示例性总的和有活性的FGF21测定中的标准曲线。
图20：描绘在使用Quanterix Simoa的示例性总的和有活性的FGF21测定中的标准曲线表现。
图21：描绘在使用Quanterix Simoa的示例性总的和有活性的FGF21测定中，在BA010和IL-12缓冲液的存在下检测总的和有活性的FGF21的灵敏度的比较。
图22：描绘使用Quanterix Simoa的高珠(HB)和低珠(LB)浓度对示例性总的和有活性的FGF21测定的灵敏度的影响。
图23：描绘在使用Quanterix Simoa的示例性总的和有活性的FGF21测定中，使用三个捕获顺磁珠批次(lots)检测总的和有活性的FGF21的灵敏度的比较。
图24：描绘在使用Quanterix Simoa的示例性总FGF21测定中，使用各种检测抗体检测总的和有活性的FGF21的灵敏度的比较。
图25：描绘在使用Quanterix Simoa，使用mAb4作为捕获抗体并使用mAb15作为检测抗体的示例性总FGF21测定中的钩状效应(Hook Effect)的分析。
图26：描绘使用示例性的总的和有活性的FGF21 ELISA测定法检测健康供体的血浆和血清样品中的总FGF21和有活性的FGF21。
图27：描绘使用示例性的总的和有活性的FGF21 ELISA测定检测血浆样品或经MS-SAFE处理的血浆样品中的总FGF21和有活性的FGF21，这些样品来自高血压的供体和未接受药物治疗的供体。
图28A：描绘使用Quanterix Simoa的使用示例性的总的和有活性的FGF21测定(第1天)，检测来自健康和2型糖尿病患者的血浆样品中的总FGF21和有活性的FGF21。
图28B：描绘使用Quanterix Simoa使用示例性的总的和有活性的FGF21测定(第2天)，检测来自健康和2型糖尿病患者的血浆样品中的总FGF21和有活性的FGF21。
图29：描绘用于使用Quanterix Simoa检测来自健康和2型糖尿病患者的血浆样品中总FGF21和有活性的FGF21的示例性总FGF21和有活性的FGF21测定的重现性。
图30：描绘用于使用Quanterix Simoa检测来自2型糖尿病患者的血浆样品中总FGF21和有活性的FGF21的示例性总的和有活性的FGF21测定的稀释的线性。
图31：描绘用于使用Quanterix Simoa检测来自2型糖尿病患者的血浆样品中总FGF21和有活性的FGF21的示例性总FGF21和有活性的FGF21测定中定量的下限(LLOQ)的确定。
图32：描绘用于使用Quanterix Simoa检测来自2型糖尿病患者的血浆样品中总FGF21和有活性的FGF21的示例性总的和有活性的FGF21测定的特异性。
图33：描绘使用用Quanterix Simoa的示例性的总的和有活性的FGF21测定，使用P800或K2-EDTA制备的血浆样品中的总FGF21和有活性的FGF21的检测。
图34：描绘在使用Quanterix Simoa的示例性总的和有活性的FGF21测定中，对来自GC29819研究的P800和K2-EDTA血浆样品中检测的总FGF21和有活性的FGF21的分析。
图35：描绘使用用Quanterix Simoa的示例性总FGF21测定定量的P800和K2-EDTA血浆样品(GC29819临床研究)中检测的总FGF21和有活性的FGF21量之间的相关性。
图36：描绘用Quanterix Simoa，使用示例性有活性的FGF21测定定量的P800和K2-EDTA血浆样品(GC29819研究)中检测的总FGF21和有活性的FGF21量之间的相关性。
图37：描绘用Quanterix Simoa，使用示例性总的和有活性的FGF21测定对来自GC29819研究中的P800血浆样品的稳定性的评价。
图38：描绘含有10μg/ml小鼠或绵羊IgG的测定稀释剂对使用Quanterix Simoa的总的和有活性的测定的影响。
图39：描绘含有10μg/ml小鼠和绵羊IgG的测定稀释剂对使用Quanterix Simoa的总的和有活性的测定的影响。
图40：描绘含有10μg/ml小鼠或绵羊IgG的测定稀释剂对使用Quanterix Simoa的总的和有活性的测定上的标准曲线的影响。
图41A：描绘示例性抗FGF21抗体的轻链可变区的序列。轻链可变区序列按出现顺序分别以SEQ ID NO:50、51、52、53、71、70、69和68公开。CDR-L1序列按出现顺序分别以SEQID NO:38、39、40、41、38、39、40和41公开；CDR-L2序列按出现顺序分别以SEQ ID NO:42、43、44、45、42、43、44和45公开；且CDR-L3序列按出现顺序分别以SEQ ID NO:46、47、48、49、46、47、48和49公开。
图41B：描述示例性抗FGF21抗体的重链可变区的序列。重链可变区序列按出现顺序分别以SEQ ID NO:54、55、56、57、75、74、73和72公开。CDR-H1序列按出现顺序分别以SEQID NO:26、27、28、29、26、27、28和29公开；CDR-H2序列按出现顺序分别以SEQ ID NO:30、31、32、33、30、31、32和33公开；且CDR-H3序列按出现顺序分别以SEQ ID NO:34、35、36、37、34、35、36和37公开。
发明详述
为了清楚起见，但不作为限制，将目前公开的主题的详细描述分为以下小节：
I.定义；
II.免疫测定；
III.抗体；
IV.试剂盒；和
V.示例性实施方案。
I.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；TheGlossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger等(eds.),Springer Verlag(1991)；和Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。
如本文所用，术语“约”或“大约”可以表示对于如本领域普通技术人员所确定的特定值而言在可接受的误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，例如，测量系统的局限性。例如，“约”可以指根据实践在给定值的1个或多于1个标准差内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”可以表示该特定值的可接受的误差范围，例如由术语“约”修饰的值的±10％。
如本文可互换使用的，术语“多肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的缀合。该定义中还包括例如含有一个或更多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其他修饰。如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖抗体。
除非另有说明，否则本文使用的术语“成纤维细胞生长因子21”或“FGF21”是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物，例如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然FGF21。该术语涵盖“全长”，未处理的FGF21以及在细胞处理而产生的任何形式的FGF21。除非另有说明，该术语还涵盖FGF21的天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。全长人FGF21氨基酸的非限制性实例如下所示：
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:1).
如本文所用，术语“总FGF21”包括未加工形式的FGF21以及由细胞加工产生的所有形式的FGF21，例如，N末端切割的FGF21和C末端切割的FGF21。缺少十个C端氨基酸的人FGF21氨基酸的非限制性例子是：
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGP(SEQ ID NO:58).缺少4个N末端氨基酸的人FGF21氨基酸的非限制性实例是：
DSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:59).例如但不作为限制，术语“总FGF21”包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列的FGF21蛋白。
如本文所用，术语“有活性的FGF21”是指保留其C端片段的FGF21蛋白。在某些实施方案中，该术语包括FGF21的加工形式，例如其中FGF21的N-末端片段(例如SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-4)被切割的那些。例如但不作为限制，术语“有活性的FGF21”包括具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列的FGF21蛋白。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含与完整抗体结合的抗原结合的完整抗体的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“结合”目标的抗原例如FGF21蛋白的抗体是以足够的亲和力结合抗原的抗体，使得该抗体可用作测定试剂，例如用作捕获抗体或作为检测抗体。通常，这种抗体不会与其他多肽发生明显的交叉反应。关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或“与特定多肽或特定多肽靶标上的表位特异性结合”或“针对特定多肽或特定多肽靶标上的表位是特异性的”是指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以例如通过确定与对照分子的结合相比的靶分子的结合来测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的相似结构的分子。
术语“抗FGF21抗体”是指能够以足够的亲和力结合FGF21的抗体，使得该抗体可用作靶向FGF21的试剂，例如，用作本文所述测定中的试剂。在某些实施方案中，抗FGF21抗体与不相关的非FGF21蛋白的结合程度小于(例如通过放射免疫测定(RIA))所测量的抗体与FGF21的结合的约10％。在某些实施方案中，与FGF21结合的抗体具有≤1M,≤100mM,≤10mM,≤1mM,≤100μM,≤10μM,≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，本文公开的与FGF21结合的抗体的Kd可以为10-3M以下或10-8M以下，例如，从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M。在某些实施方案中，本文公开的与FGF21结合的抗体可以是10-10M至10-13M。在某些实施方案中，抗FGF21抗体结合FGF21的表位，所述FGF21的表位在不同物种的FGF21中是保守的。
用于本文目的的“受体人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下文定义的。“源自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列改变。在某些实施方案中，氨基酸改变的数量为10个或更少、9个或更少、8个或更少、7个或更少、6个或更少、5个或更少、4个或更少、3个或更少或2个或更少。在某些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(partner)(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体和抗原)之间的1:1的相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述如下。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或更多个高变区(CDS)中具有一个或更多个变更的抗体，与不具有这种变更的亲本抗体相比，这种变更导致抗体针对抗原的亲和力提高。
与参照抗体“竞争结合的抗体”是指在竞争测定中阻断参照抗体与其抗原结合的50％或以上的抗体，相反，参照抗体在竞争测定中阻断抗体与其抗原的结合50％或以上。示例性竞争测定在“Antibodies,”Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,ColdSpring Harbor,NY)中描述。
如本文所用，“捕获抗体”是指特异性结合样品中的靶分子，例如FGF21形式的抗体。在某些条件下，捕获抗体与靶分子形成复合物，从而可以将抗体-靶分子复合物与样品的其余部分分离。在某些实施方案中，这种分离可以包括洗掉样品中不结合捕获抗体的物质或材料。在某些实施方案中，捕获抗体可以附着于固相支持体表面，例如但不限于板或珠子，例如顺磁珠子。
如本文所用，“检测抗体”是指特异性结合样品中的或样品捕获抗体组合材料中的靶分子的抗体。在某些条件下，检测抗体与靶分子或与靶分子-捕获抗体复合物形成复合物。检测抗体能够通过可被扩增的标记物直接检测，或者例如通过使用被标记并结合检测抗体的另一种抗体间接检测。对于直接标记，通常将检测抗体缀合至可通过某些方式检测的部分，所述方式例如包括但不限于生物素或钌。
术语“嵌合”抗体是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。与不同类别的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ、和μ。
如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素)；；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核溶酶；抗生素；毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及下面公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，所述抗体Fc区随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
本文所用的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号依照EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所描述的。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR一般由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，CDR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，是指具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”是拥有与由人或人细胞产生的抗体、或源自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的集合中最常出现的氨基酸残基的框架。一般地，人免疫球蛋白VL或VH序列的集合是来自可变结构域序列的亚组。通常，所述序列的亚组是如Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),Vols.1-3中的亚组。在某些实施方案中，对于VL，亚组是如上文Kabat等中所述的亚组κI。在某些实施方案中，对于VH，亚组是如上文Kabat等中所述的亚组III。
“人源化”抗体是指包含来自非人CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，且通常两个可变结构域，在其中全部的或基本上全部的CDR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部的或基本上全部的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选地可包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”，是指已经历人源化的抗体。
如本文所用的术语“高变区”或“CDR”是指抗体可变结构域中在序列上是高变的(本文也称为“互补决定区”或“CDRs”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区。除非另有说明，可变结构域中的CDR残基和其他残基(例如,FR残基)在本文中依照Kabat等编号，同上。抗体一般包含六个CDR：三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文示例性的CDR包括:
(a)存在于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2)和96-101(H3)的高变环(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2)和95-102(H3)的CDR(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thEd.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2)和93-101(H3)上的抗原接触(MacCallum等J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括CDR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3)和94-102(H3)。
“免疫缀合物”是指与一种或更多种异源分子缀合的抗体，包括但不限于细胞毒性剂。
“分离的”抗体是指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在某些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置。
“编码抗体的分离的核酸”(包括提及特定抗体，例如抗FGF21抗体)是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一种或更多种核酸分子，包括在单一载体或单独的载体中的这种(些)核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或更多个位置的这种(些)核酸分子。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即包含于所述群体的个体抗体是相同的/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体外，例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据目前公开的主题要使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法和用于制备本文所述单克隆抗体的其他示例性方法在本文描述。
“裸抗体”是指未与异源部分(例如，细胞毒性部分)或放射性标记缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物制剂中。
“天然抗体”是指具有各种结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键结合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重链结构域或重链可变结构域，接着是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，接着是恒定轻(CL)结构域。抗体的轻链可以根据其恒定域的氨基酸序列指定为两种类型之一，称为kappa(κ)和lambda(λ)。
如本文所用，“纯化的”多肽(例如抗体)是指已经在纯度上提高的多肽，使得其以比其在天然环境中存在和/或当初始合成和/或在实验室条件下扩增存在时更纯的形式存在。纯度是一个相对术语，不一定表示绝对纯度。
如本文中所使用的，术语“包装插页”是指照例包括在商业包装中的说明书，其包含与使用包装的组件有关的信息。
相对于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和引入空位，如果必要的话，以实现最大百分比序列同一性，并且不将任何保守置换认为是序列同一性的一部分后，在候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序的作者是Genentech,Inc.，并且源代码已经与用户文件一起被提交于美国版权局,Washington D.C.,20559，其以美国版权登记号TXU510087登记。公众可自Genentech,Inc.,South San Francisco,California获得ALIGN-2程序，或者所述程序可自源代码编译。ALIGN-2程序应当被编译为用于UNIX操作系统，包括数字UNIX V4.0D。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不需要改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A对、与或针对给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(其可以备选地表示为具有或包含对、与、或针对给定氨基酸序列B一定的％氨基酸序列同一性的给定的氨基酸序列A)，如下计算：
100乘以分数X/Y
其中X是在A和B的程序比对中由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且Y是B中氨基酸残基的总数。要理解的是，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A对B的％氨基酸序列同一性将不等于B对A的％氨基酸序列同一性。除非另外明确指出，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的结构域。天然抗体的重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个结构域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(CDR)。(See,e.g.,Kindt等Kuby Immunology,6thed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007).)单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。另外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域来分离结合特定抗原的抗体以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见,例如,Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature352:624-628(1991)。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞和源自其的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文包括具有与在初始经转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变后代。
如本文所用，术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合于已将其引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
如本文所用，术语“标记物”或“可检测标记物”是指可以连接至待检测或定量的物质例如抗体的任何化学基团或部分。标记是适用于物质的灵敏检测或定量的可检测标记。可检测标记的非限制性实例包括但不限于发光标记，例如荧光、磷光、化学发光、生物发光和电化学发光标记，放射性标记、酶、颗粒、磁性物质、电活性物质(electroactivespecies)等。备选地，可检测标记可以通过参与特异性结合反应来发出其存在的信号。此类标记的非限制性实例包括半抗原、抗体、生物素、链霉亲和素、his-标签、次氮基三乙酸、谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽等。
如本文所用，术语“检测手段”是指用于通过随后在测定中读出的信号报告来检测可检测抗体的存在的部分或技术。通常，检测手段采用试剂，例如检测剂，其扩增固定化的标记，例如在微量滴定板上捕获的标记，例如亲和素、链霉亲和素-HRP或链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖。
本文使用的术语“检测”包括靶分子(例如，FGF21或其加工形式)的定性和定量测量。在某些实施方案中，检测包括仅仅鉴定靶分子在样品中的存在以及确定样品中靶分子是否以可检测的水平存在。
如本文可互换使用的“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛，绵羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)，兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
如本文所用，“样品”是指大量材料的一小部分。在某些实施方案中，样品包括但不限于培养中的细胞，细胞上清液，细胞裂解物，血清，血浆，生物液(例如血液，血浆，血清，粪便，尿液，淋巴液，腹水，导管灌洗液，唾液和脑脊液)和组织样品。样品的来源可以是实体组织(例如，来自新鲜，冷冻和/或保存的器官，组织样品，活组织检查或抽吸物)，血液或任何血液组分，体液(例如尿液，淋巴液，脑脊髓液，羊水，腹膜液或间质液)或来自个体的细胞，包括循环细胞。
II.免疫测定
目前公开的主题提供了用于检测和定量FGF21蛋白的方法。在某些实施方案中，本公开提供了用于确定样品中总FGF21和/或有活性的FGF21蛋白的量的免疫测定。本公开进一步提供了用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的免疫测定方法。在某些实施方案中，本公开的免疫测定方法使用本文公开的抗FGF21抗体。表8-13和16-19提供了用于目前公开的方法的抗FGF21抗体的非限制性实例。
在某些实施方案中，本公开提供了用于检测和定量人FGF21蛋白的免疫测定方法。例如，免疫测定方法可用于检测和定量样品中的FGF21，例如总人FGF21和/或由活性的人FGF21蛋白。本公开的免疫测定方法可以整合本领域已知的策略，包括但不限于夹心测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)测定、数字形式的ELISA、电化学测定(ECL)测定和磁免疫测定。在某些实施方案中，免疫测定方法是单分子免疫测定，例如，使用单分子阵列。例如但不限于，免疫测定方法可以使用Quanterix仪器例如Simoa HD-1AnalyzerTM执行。
在某些实施方案中，本公开的方法包括在允许捕获抗FGF21抗体与来自受试者的样品中的FGF21蛋白结合的条件下，使得来自所述受试者的样品与捕获抗FGF21抗体(如本文所述的那些)接触。例如但非限制性地，可以将样品与结合FGF21上存在的表位的捕获抗体一起温育以生成样品捕获抗体组合材料。可以选择用于温育样品和捕获抗体的条件，以最大化测定的灵敏度和/或最小化解离，并确保存在于样品中的FGF21蛋白与捕获抗体结合。
在某些实施方案中，本文公开的免疫测定方法中使用的捕获抗体可以约0.1μg/ml至约5.0μg/ml的浓度使用。例如，但不限于，捕获抗体可以以下列浓度使用：约0.1μg/ml至约0.5μg/ml,约0.1μg/ml至约1.0μg/ml,约0.1μg/ml至约1.5μg/ml,约0.1μg/ml至约2.0μg/ml,约0.1μg/ml至约2.5μg/ml,约0.1μg/ml至约3.0μg/ml,约0.1μg/ml至约3.5μg/ml,约0.1μg/ml至约4.0μg/ml,约0.1μg/ml至约4.5μg/ml,约0.5μg/ml至约5.0μg/ml,约1.0μg/ml至约5.0μg/ml,约1.5μg/ml至约5.0μg/ml,约2.0μg/ml至约5.0μg/ml,约2.5μg/ml至约5.0μg/ml,约3.0μg/ml至约5.0μg/ml,约3.5μg/ml至约5.0μg/ml,约4.0μg/ml至约5.0μg/ml,约4.5μg/ml至约5.0μg/ml,约0.5μg/ml至约2.0μg/ml或约0.5μg/ml至约1.0μg/ml,例如,约0.5μg/ml。
在某些实施方案中，捕获抗体可以在包被缓冲液中稀释。包被缓冲液的非限制性实例包括PBS、碳酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液或其组合。在某些实施方案中，包被缓冲剂是碳酸氢钠。在某些实施方案中，包被缓冲液是PBS。在某些实施方案中，包被缓冲液可以以约10mM至约1M的浓度使用。例如，但不限于，包被缓冲液可以以下列浓度使用：约10mM至约100mM,约10mM至约200mM,约10mM至约300mM,约10mM至约400mM,约10mM至约500mM,约10mM至约600mM,约10mM至约700mM,约10mM至约800mM,约10mM至约900mM,约100mM至约1M,约200mM至约1M,约300mM至约1M,约400mM至约1M,约500mM至约1M,约600mM至约1M,约700mM至约1M,约800mM至约1M或约900mM至约1M。
如本文所用，捕获抗体可以固定化在固相上。例如但不限于，固相可以是在免疫测定中有用的任何惰性支持体或载体，包括例如以表面、颗粒、多孔基质、珠子等形式的支持体。常用支持体的非限制性实例包括小片，
凝胶，聚氯乙烯，塑料珠以及由聚乙烯，聚丙烯，聚苯乙烯等制成的测定板或试管，包括96孔微量滴定板，以及颗粒材料，例如滤纸，琼脂糖，交联的葡聚糖和其他多糖。在某些实施方案中，用于固定化的固相可以是珠子。例如但不限于，将本文公开的捕获抗体固定化在顺磁珠上。在某些实施方案中，将固定化的捕获抗体包被在微量滴定板上，该微量滴定板上可用于一次分析多个样品。
在某些实施方案中，偶联至捕获抗体的顺磁珠可以以约0.1×107珠子/ml至约10.0×107珠子/ml的浓度使用，例如，约0.1x 107珠子/ml至约0.5x 107珠子/ml,约0.1x107珠子/ml至约1.0x 107珠子/ml,约0.1x 107珠子/ml至约2.0x 107珠子/ml,约0.1x 107珠子/ml至约3.0x 107珠子/ml,约0.1x 107珠子/ml至约4.0x 107珠子/ml,约0.1x 107珠子/ml至约5.0x107珠子/ml,约0.1x 107珠子/ml至约6.0x 107珠子/ml,约0.1x 107珠子/ml至约7.0x 107珠子/ml,约0.1x 107珠子/ml至约8.0x 107珠子/ml,约0.1x107珠子/ml至约9.0x 107珠子/ml,约0.5x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约1.0x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约2.0x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约3.0x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约4.0x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约5.0x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约6.0x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约7.0x 107珠子/ml至约10.0x107珠子/ml,约8.0x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约9.0x 107珠子/ml至约10.0x 107珠子/ml,约0.5x 107珠子/ml至约1.0x 107珠子/ml,约0.5x 107珠子/ml至约2.0x 107珠子/ml或约0.5x 107珠子/ml至约3.0x 107珠子/ml。在某些实施方案中，顺磁珠可以以约0.5×107珠子/ml至约2.0×107珠/ml的浓度使用。在某些实施方案中，顺磁珠可以以约1.0×107珠/ml，例如约1.22×107珠/ml的浓度使用，或以约0.5×107珠/ml，例如约0.59×107珠/ml的浓度使用。
本文公开的免疫测定方法可以进一步包括使样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触。在某些实施方案中，检测抗体结合FGF21上存在的表位。在某些实施方案中，在缺乏FGF21的情况下，检测抗体与在样品捕获抗体组合材料上的表位结合，但不与捕获抗体上的表位结合。在某些实施方案中，样品-捕获抗体组合结合的检测抗体随后使用针对检测抗体的检测手段，例如一个或更多个检测剂，来测量或定量，以确定FGF21蛋白的量，例如与检测抗体结合的总FGF21或有活性的FGF21蛋白的量。
在某些实施方案中，检测抗体可以以约0.1μg/ml至约5.0μg/ml的浓度使用。例如，但不限于，检测抗体可以以下列浓度使用：约0.1μg/ml至约0.5μg/ml,约0.1μg/ml至约1.0μg/ml,约0.1μg/ml至约1.5μg/ml,约0.1μg/ml至约2.0μg/ml,约0.1μg/ml至约2.5μg/ml,约0.1μg/ml至约3.0μg/ml,约0.1μg/ml至约3.5μg/ml,约0.1μg/ml至约4.0μg/ml,约0.1μg/ml至约4.5μg/ml,约0.5μg/ml至约5.0μg/ml,约1.0μg/ml至约5.0μg/ml,约1.5μg/ml至约5.0μg/ml,约2.0μg/ml至约5.0μg/ml,约2.5μg/ml至约5.0μg/ml,约3.0μg/ml至约5.0μg/ml,约3.5μg/ml至约5.0μg/ml,约4.0μg/ml至约5.0μg/ml,约4.5μg/ml至约5.0μg/ml,约1.0μg/ml至约3.0μg/ml或约0.5μg/ml至约3.0μg/ml或约0.5μg/ml至约2.0μg/ml。在某些实施方案中，用于检测总FGF21蛋白的免疫测定法可以使用以约0.1μg/ml至约1.0μg/ml之间的浓度的检测抗体，例如约0.4μg/ml或约0.8μg/ml的浓度的检测抗体。在某些实施方案中，用于检测有活性的FGF21蛋白的免疫测定法可以使用约1.0μg/ml至约3.0μg/ml之间的浓度的检测抗体，例如约1.1μg/ml或约2.1μg/ml的浓度的检测抗体。
在某些实施方案中，可以标记用于所公开的方法的抗FGF21抗体。标记包括但不限于直接检测的标记或部分(诸如荧光的、发色的、电子致密的、化学发光的和放射性标记)，以及例如，通过酶促反应或分子相互作用间接检测的诸如酶或配体的部分。标记的非限制性实例包括放射性同位素32P,14C,125I,3H和131I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物、丹磺酰、伞形酮、萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮(dihydrophthalazinediones)、辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶的杂环氧化酶)，其与使用过氧化氢氧化染料前体的酶(诸如HRP、乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)、生物素/抗生物素蛋白、自旋标记、噬菌体标记、稳定的自由基等偶联。在某些实施方案中，检测抗体用生物素标记，例如，检测抗体与生物素缀合。
在某些实施方案中，用于生物素化的检测抗体的检测剂是抗生物素蛋白、链霉亲和素-HRP或链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖(SBG)。在某些实施方案中，检测剂的读出是荧光测定的或比色的。例如但不限于，可以使用四甲基联苯胺和过氧化氢作为读出。在某些实施方案中，如果检测剂是链霉亲和素-HRP，则读出可以通过使用四甲基联苯胺和过氧化氢而是比色的。备选地，在某些实施方案中，试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷可以用作读出。例如但不限于，如果检测剂是SBG，则读出可以通过使用试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷而是荧光测定的。
在某些实施方案中，检测剂例如SBG可以以约50至约500pM的浓度使用。例如但不限于，检测剂可以以下列浓度使用：约50至约100pM,约50至约150pM,约50至约200pM,约50至约250pM,约50至约300pM,约50至约350pM,约50至约400pM,约50至约450pM,约100至约500pM,约150至约500pM,约200至约500pM,约250至约500pM,约300至约500pM,约350至约500pM,约400至约500pM,约450至约500pM,约100至约400pM或约200至约400pM。在某些实施方案中，检测剂可以以约100pM至约400pM的浓度使用，例如，SBG可以以约110pM，约155pM或约310pM的浓度使用。在某些实施方案中，SBG可以以约310pM的浓度使用。在某些实施方案中，检测剂，例如，HRP，可以以约1/10至约1/1000的稀释度使用。例如，但不限于，检测剂可以以下列稀释度使用：约1/10至约1/100，约1/10至约1/500，约1/100至约1/1000或约1/500至约1/1000的稀释度。在某些实施方案中，检测剂可以约1/100至约1/1000的稀释度使用，例如，HRP可以约1/100或约1/500的稀释度使用。
在某些实施方案中，本公开的方法可以包括用封闭缓冲液封闭捕获抗体。在某些实施方案中，封闭缓冲液可包括PBS，牛血清白蛋白(BSA)和/或杀生物剂，例如ProClinTM(Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO)。在某些实施方案中，该方法可以包括多个洗涤步骤。在某些实施方案中，用于洗涤的溶液通常是缓冲液(例如“洗涤缓冲液”)，例如，但不限于包括去污剂(例如吐温20)的PBS缓冲液。例如，但不限于，可以在封闭后洗涤捕获抗体和/或可以将样品与捕获抗体分离以(例如通过洗涤)去除未捕获的材料。
在某些实施方案中，本公开的免疫测定方法可用于(例如通过检测FGF21的全长和加工形式)检测样品中总FGF21蛋白的量。例如但不限于，用于检测总FGF21蛋白的免疫测定方法可以使用一个或更多个与FGF21的氨基酸残基5-172(例如SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-172)内存在的表位结合的抗体。在某些实施方案中，捕获抗体是与FGF21的氨基酸残基5-172内的表位结合的抗体，而检测抗体是与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合的抗体。在某些实施方案中，捕获抗体和检测抗体是相同的抗体，而在其他实施方案中，捕获抗体和检测抗体是不同的抗体，但是两者都结合FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位。在某些实施方案中，所述捕获抗体和所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。例如，但不限于，所述捕获抗体和所述检测抗体结合FGF21的氨基酸残基5-172内的不重叠的表位。在某些实施方案中，所述捕获抗体和所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的部分重叠的表位结合。
在某些实施方案中，用于确定样品中总FGF21蛋白的量的免疫测定可以包括(a)使捕获抗体与所述样品接触以生成样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；(b)使所述样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触，所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的结合；(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述检测抗体；并(d)基于结合的所述检测抗体的水平计算所述样品中存在的总FGF21蛋白的量。
在某些实施方案中，本公开的免疫测定方法可用于，例如通过检测保留其C端片段的FGF21蛋白，检测样品中有活性的FGF21蛋白的量。在某些实施方案中，用于检测总FGF21蛋白的免疫测定方法可以使用一个或更多个与FGF21的氨基酸残基173-182，例如，SEQ IDNO:1的氨基酸残基173-182内存在的表位结合的抗体，以及一个或更多个与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合的抗体。例如，但不限于，检测有活性的FGF21蛋白量的免疫测定方法可以使用与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合的捕获抗体和与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位结合检测抗体。在某些实施方案中，与FGF21的氨基酸残基173-182结合的检测抗体可以是来自Epitope Diagnostics,Inc.,San Diego,CA的抗FGF21抗体，其以商品目录号31002出售。在某些实施方案中，与FGF21的氨基酸残基173-182结合的检测抗体可以是来自Epitope Diagnostics,Inc.,San Diego,CA的抗FGF21抗体，其以商品目录号30661出售。在某些实施方案中，用于确定样品中有活性的FGF21蛋白的量的免疫测定方法可以包括(a)使捕获抗体与所述样品接触以生成样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；(b)使所述样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触，所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的结合；(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述检测抗体；并(d)基于结合的所述检测抗体的水平计算所述样品中存在的有活性的FGF21蛋白的量。
本公开进一步提供了用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的免疫测定方法。例如但不限于，这样的方法可以涉及将用于检测总FGF21蛋白的免疫测定与用于检测有活性的FGF21蛋白的免疫测定相结合。在某些实施方案中，用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的免疫测定方法可包括(a)(i)使第一捕获抗体与所述样品接触以生成第一样品-捕获抗体组合材料，所述第一捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；(ii)使所述第一样品-捕获抗体组合材料与第一检测抗体接触，所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的结合；(iii)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述第一检测抗体；并(iv)基于结合的所述第一检测抗体的水平计算所述样品中存在的总FGF21蛋白的量；和(b)(i)使第二捕获抗体与所述样品接触以生成第二样品-捕获抗体组合材料，所述第二捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；(ii)使所述第二样品-捕获抗体组合材料与第二检测抗体接触，所述第二检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的结合；(iii)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述第二检测抗体；并(iv)基于结合的所述第二检测抗体的水平计算所述样品中存在的有活性的FGF21蛋白的量。该方法可以进一步包括将步骤(a)确定的总FGF21蛋白的量与步骤(b)确定的有活性的FGF21蛋白的量进行比较，以确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例。在某些实施方案中，所述第一捕获抗体和所述第二捕获抗体是相同的抗体。备选地，在某些实施方案中，第一捕获抗体和第二捕获抗体是不同的抗体，但是两者都结合FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位。在某些实施方案中，所述第一捕获抗体和所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。例如，但不限于，第一捕获抗体和第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内不重叠的表位结合。在某些实施方案中，第一捕获抗体和第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的部分重叠的表位结合。
在某些实施方案中，本文公开的免疫测定方法具有约2pg/ml至约20pg/ml的检测灵敏度，例如孔内灵敏度。例如，但不限于，本文公开的免疫测定法具有如下灵敏度：约2pg/ml至约3pg/ml,约2pg/ml至约4pg/ml,约2pg/ml至约5pg/ml,约2pg/ml至约6pg/ml,约2pg/ml至约7pg/ml,约2pg/ml至约8pg/ml,约2pg/ml至约10pg/ml,约2pg/ml至约11pg/ml,约2pg/ml至约12pg/ml,约2pg/ml至约13pg/ml,约2pg/ml至约14pg/ml,约2pg/ml至约15pg/ml,约2pg/ml至约16pg/ml,约2pg/ml至约17pg/ml,约2pg/ml至约18pg/ml,约2pg/ml至约19pg/ml,约3pg/ml至约15pg/ml,约3pg/ml至约10pg/ml或约3pg/ml至约5pg/ml。在某些实施方案中，本文公开的免疫测定法具有约2pg/ml或更高，1pg/ml或更高或0.5pg/ml或更高的灵敏度。在某些实施方案中，本文公开的免疫测定具有约0.2pg/ml至约2.0pg/ml,例如，约0.2pg/ml至约0.5pg/ml,约0.2pg/ml至约1.0pg/ml或约0.2pg/ml至约1.5pg/ml的检测灵敏度，例如孔内灵敏度。例如，但不以限定的方式，本文公开的免疫测定法，例如，使用SimoaHD-1AnalyzerTM的单分子免疫测定法，具有约0.2pg/ml至约0.5pg/ml的灵敏度，例如，孔内灵敏度。
通过本公开的免疫测定方法分析的样品可以是临床样品，培养中的细胞，细胞上清液，细胞裂解物，血清样品，血浆样品，其他生物流体(例如淋巴液)样品或组织样品。在某些实施方案中，样品的来源可以是来自受试者的实体组织(例如，来自新鲜，冷冻和/或保存的器官，组织样品，血清，血浆，活组织检查或抽吸物)或细胞。在某些实施方案中，样品是血液样品。在某些实施方案中，样品是血浆样品。在某些实施方案中，样品例如血液或血浆样品可获自受试者并且是用一个或更多个蛋白酶、酯酶、DDP-IV和/或磷酸酶抑制剂处理的。例如，但不以限定的方式，样品可以用蛋白酶和磷酸酶抑制剂的混合物(例如MS-SAFE(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO))处理。在某些实施方案中，样品用抗凝剂处理或收集在含有抗凝剂例如K2-EDTA的管中。在某些实施方案中，可以使用P800血液收集系统(BDBiosciences,San Jose,CA)收集样品。
III.抗体
本公开进一步提供了与FGF21，例如人FGF21结合的抗体。本公开的抗体可用于检测和定量样品中的FGF21蛋白水平。在某些实施方案中，本公开的抗体可以用于本文公开的用于检测和定量FGF21蛋白的免疫测定方法中。例如，但不以限定的方式，本公开的抗体可以用于检测样品中总FGF21蛋白和/或有活性的FGF21蛋白的水平。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以被人源化。在某些实施方案中，本公开的抗体包含受体人框架，例如人免疫球蛋白框架或人共有框架。在某些实施方案中，本公开的抗体可以是单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。例如，但不以限定的方式，本公开的抗体可以是嵌合的。在某些实施方案中，本公开的抗体可以是抗体片段，例如，Fv，Fab，Fab’，scFv，双抗体或F(ab’)2片段。在某些实施方案中，抗体是IgG。在某些实施方案中，抗体选自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。在某些实施方案中，抗体是全长抗体，例如完整IgG1抗体或如本文定义的其他抗体类别或同种型。在某些实施方案中，本文公开的抗FGF21抗体可以被标记，例如缀合至生物素。在某些实施方案中，本公开的抗体可以单独或组合地掺入任何特征，如下文详述的第1-7节中所述。
A.示例性抗FGF21抗体
本公开提供了与FGF21蛋白结合的分离的抗体。在某些实施方案中，本公开的抗体能够与FGF21的氨基酸残基5-172(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸残基5-172)内的表位结合。在某些实施方案中，本公开的抗体能够与FGF21的氨基酸残基173-182(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸残基173-182)内的表位结合。在某些实施方案中，本公开的抗体不与FGF21的氨基酸残基1-4(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-4)内的表位结合。表8-13和16-19以及图41A-B公开了抗FGF21抗体的非限制性实例。
本公开提供了抗FGF21抗体，在某些实施方案中，该抗FGF21抗体包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR，所述CDR选自(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:26-29中任一个的氨基酸序列及其保守置换；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:30-33中任一项的氨基酸序列及其保守置换；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:34-37中任一项的氨基酸序列及其保守置换；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38-41中任一项的氨基酸序列及其保守置换；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:42-45及其保守置换；(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46-49中任一项的氨基酸序列及其保守置换。
本公开提供了抗FGF21抗体，在某些实施方案中，其包含：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:26的氨基酸序列及其保守置换；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列及其保守置换；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列及其保守置换；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列及其保守置换；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列及其保守置换；(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列及其保守置换。
本公开提供了抗FGF21抗体，在某些实施方案中，其包含：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列及其保守置换；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列及其保守置换；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列及其保守置换；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列及其保守置换；(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列及其保守置换。
本公开提供了抗FGF21抗体，在某些实施方案中，其包含：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:28的氨基酸序列及其保守置换；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列及其保守置换；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列及其保守置换；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列及其保守置换；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列及其保守置换；(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列及其保守置换。
本公开提供了抗FGF21抗体，在某些实施方案中，其包含：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列及其保守置换；(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列及其保守置换；(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列及其保守置换；(d)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列及其保守置换；(e)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列及其保守置换；(f)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列及其保守置换。
在某些实施方案中，本公开的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:54-57和72-75中任一个的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的重链可变结构域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗FGF21抗体保留与FGF21结合的能力。在某些实施方案中，总共1至10个氨基酸已被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在某些实施方案中，本公开的抗FGF21抗体包含VH序列，该VH序列包含SEQ ID NO:54-57和72-75中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:50-53和68-71中任一个的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的轻链可变结构域(VL)序列。在某些实施方案中，具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗FGF21抗体保留与FGF21结合的能力。在某些实施方案中，总共1至10个氨基酸已被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含VH序列，该VL序列包含SEQ ID NO:50-53和68-71中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VL序列。在一个具体的实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，VL包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:55的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VL序列。在某些实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在某些实施方案中，VL包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:56的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VL序列。在某些实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:28的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在某些实施方案中，VL包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VL序列。在某些实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在某些实施方案中，VL包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:75的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VL序列。在某些实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:26的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列。在某些实施方案中，VL包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:74的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VL序列。在某些实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:27的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在某些实施方案中，VL包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:73的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:69的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VL序列。在某些实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:28的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在某些实施方案中，VL包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:72的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VH序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:68的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的VL序列。在某些实施方案中，VH包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-H1，其包含SEQID NO:29的氨基酸序列，(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列，和(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在某些实施方案中，VL包含选自以下各项的一个、两个或三个CDR：(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，和(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:22-25和64-67中任一个的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的全长重链(HC)序列。在某些实施方案中，具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的HC序列相对于参照序列含有置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗FGF21抗体保留与FGF21结合的能力。在某些实施方案中，总共1至10个氨基酸已被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含HC序列，该HC序列包含SEQ ID NO:22-25和64-67中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:18-21和60-63中任一个的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的全长轻链(LC)序列。在某些实施方案中，具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％同一性的LC序列相对于参照序列含有置换(例如，保守置换)、插入或缺失，但包含该序列的抗FGF21抗体保留与FGF21结合的能力。在某些实施方案中，总共1至10个氨基酸已被置换、插入和/或缺失。在某些实施方案中，置换、插入或缺失发生在CDR之外的区域(即，在FR中)。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含LC序列，该LC序列包含SEQ ID NO:18-21和60-63中任一个的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的HC序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的LC序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的HC序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的LC序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的HC序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的LC序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的HC序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的LC序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:67的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的HC序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:63的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的LC序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的HC序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:62的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的LC序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:65的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的HC序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:61的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的LC序列。
在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的HC序列。在某些实施方案中，本发明的抗FGF21抗体包含与SEQ ID NO:60的氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的LC序列。
在某些实施方案中，提供抗FGF21抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的VH，和如上文提供的任何实施方案中的VL。在某些实施方案中，提供抗FGF21抗体，其中所述抗体包含如上文提供的任何实施方案中的全长HC，和如上文提供的任何实施方案中的全长LC。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本公开的抗FGF21抗体可以具有≤1M,≤100mM,≤10mM,≤1mM,≤100μM,≤10μM,≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，本公开的抗体可具有约10-3或更小或10-8M或更小，例如，10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M的Kd。在某些实施方案中，本公开的抗FGF21抗体可以具有约10-10M至10-13M的Kd。例如，但不以限定的方式，本公开的捕获抗体或检测抗体以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
在某些实施方案中，可以通过放射性标记的抗原结合测定法(RIA)来测量Kd。在某些实施方案中，可以用Fab形式的目的抗体及其抗原来进行RIA。例如，但不以限定的方式，Fab对抗原的溶液结合亲和力通过以下来测量：在滴定系列的未标记抗原存在下，用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原(见，例如Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定条件，将
多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH9.6)中的5μg/ml的捕获性抗Fab抗体(CappelLabs)包被过夜，随后用PBS中的2％(w/v)牛血清白蛋白在室温(约23℃)下封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM[125I]-抗原与目标Fab的连续稀释液混合(例如，与在Presta等,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后将目标Fab温育过夜；然而，温育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移到捕获板上，用于在室温下温育(例如，一小时)。然后除去溶液，用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20
洗涤板8次。当板已经干燥，添加150μl/孔的闪烁剂(MICROSCINT-20TM；Packard)，然后在TOPCOUNTTM伽玛计数器(Packard)上计数平板十分钟。选择给出小于或等于最大结合的20％的每个Fab的浓度用于竞争性结合测定。
在某些实施方案中，可以使用
表面等离振子共振测定法测量Kd。例如，但不以限定的方式，使用
BIACORE X100或BIACORE T200处理单元(Biacore,Inc.,Piscataway,NJ)的测定在25℃用固定化的抗原CM5芯片以约10个反应单位(RU)进行。在某些实施方案中，根据供应商的说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5,Biacore,Inc.)。将抗原用pH 4.8的10mM乙酸钠稀释至5μg/mL(～0.2μM)，然后以5μL/分钟的流速注射，以获得偶联蛋白的约10个反应单位(RU)。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)在25℃下以大约25μL/min的流速注射到含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂(PBST)的PBS中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(
评价软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)可以计算为比率koff/kon。参见，例如，Chen等,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果上述表面等离子体共振测定的缔合速率超过106M-1s-1，那么可以通过使用荧光淬灭技术测定缔合速率，该技术在存在抗原的浓度增加的情况下在25℃下测量PBS(pH7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在光谱仪中测量的，分光光度计例如带有停流装置的分光光度计(AvivInstruments)或带有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
2.抗体片段
在某些实施方案中，本公开的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)2，Fv和scFv片段，以及以下描述的其他片段。有关某些抗体片段的综述，请参见Hudson等Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，见例如Pluckthün,in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,(Springer-Verlag,New York),pp.269-315(1994)；也见WO 93/16185；以及美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No.5,869,046。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是双抗体。双抗体是包含两个可以是二价或双特异性的抗原结合位点的抗体片段。参见，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson等,Nat.Med.9:129-134(2003)，它们是本公开的抗体范围内的另外的抗体片段。
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如美国专利No.6,248,516B1)。
抗体片段可以通过多种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞(例如E.coli或噬菌体)的生产，如本文所述。
3.嵌合的和人源化抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利No.4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在某些实施方案中，本公开的嵌合抗体包含非人可变区(例如，源自小鼠，大鼠，仓鼠，兔或非人灵长类，例如猴子的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体可以是“类别转换”抗体，其中类别或亚类已经与亲本抗体的类别或亚类改变了。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本公开的嵌合抗体可以是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或更多个可变结构域，其中CDR(例如CDR)(或其部分)源自非人抗体，并且FR(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选还包含人恒定区的至少一部分。在某些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生CDR残基的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中进行了综述并进一步描述于，Riechmann等,Nature332:323-329(1988)；Queen等,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；US专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面再塑”)；Dall'Acqua等,Methods36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述FR改组的“导向选择”方法))。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区域(见，例如，Sims等J.Immunol.151：2296(1993))；源自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(见，例如，Carter等Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；源自筛选FR文库的框架区(见例如,Baca等,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生。人抗体一般在van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)and Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。
能够通过对转基因动物施用免疫原以制备人抗体，所述转基因动物已被修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经被灭活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见，例如，美国专利No.6,075,181和6,150,584，其描述XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429，其描述了
技术；美国专利No.7,041,870，其描述了K-M
技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900，其描述了
技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。(参见,例如,Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991).)通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体也描述于Li等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括例如描述于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)也描述于Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)及Vollmers和Brandlein,Methodsand Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)。
人抗体也可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变域序列生成。然后，可以将此类可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。从抗体库中选择人抗体的技术描述如下。
5.源自文库的抗体
可以通过从组合文库筛选具有期望活性的抗体来分离本公开的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并从此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法在例如Hoogenboom等in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)中进行了综述，并且在例如以下中进行了进一步描述：McCafferty等,Nature 348:552-554；Clackson等,Nature 352:624-628(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks and Bradbury,in Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如描述于Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。备选地，可以克隆天然组库(例如，来自人)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。在某些实施方案中，如Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol,227:381-388(1992)所述，通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区域并完成体外重排，也可以合成地制备原初文库。描述人抗体噬菌体文库的专利公开包括，例如：美国专利No.5,750,373，和美国专利公开No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中，本公开的抗体可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同表位具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一是针对FGF21上存在的表位，另一个是针对任何其他抗原。可以将双特异性抗体制备为全长抗体或抗体片段。
用于制备多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两条免疫球蛋白重链-轻链对(见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983)；WO 93/08829；和Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991))和″杵臼结构(knob-in-hole)"改造(例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体还可以通过改造用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电转向效应(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(见，例如，美国专利No.4,676,980，和Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(见，例如，Kostelny等，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(见，例如，Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(见，例如，Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备例如，如Tutt等J.Immunol.14760(1991)中所述的三特异性抗体来制备。
具有三个或更多个功能性抗原结合位点的经设计的抗体，包括"章鱼抗体"，也包括在本文中(见，例如US 2006/0025576A1)。
7.抗体变体
当前公开的主题还提供了公开的抗体的氨基酸序列变体。例如，可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。能够通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括但不限于抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合达到最终构建体，条件是最终构建体，例如，经修饰的构建体，具有期望特征，例如抗原结合。
a)置换、插入和缺失变体
抗体变体可以具有一个或更多个氨基酸置换、插入和/或缺失。此类变异的目标位点包括但不限于CDR和FR。保守置换的非限制性实例显示在表1中“优选置换”的标题下。在表1中“示例性置换”的标题下提供了更多实质性变化的非限制性实例，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸置换引入目标抗体中，并筛选所需活性的产物，例如，保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性或改善的补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
表1
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
在某些实施方案中，非保守置换会需要用这些类别之一的成员交换另一个类别的成员。
在某些实施方案中，一种类型的置换变体涉及置换亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或更多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体具有某些生物学特性(例如，但不限于，增加的亲和力、降低的免疫原性)方面的修饰(例如，改善)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。置换变体的非限制性实例是亲和力成熟的抗体，其可以方便地生成，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文所述的那些。简而言之，突变一个或多个CDR残基并在噬菌体上展示变体抗体并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
在某些实施方案中，可以在CDR中进行改变(例如，置换)，例如以提高抗体亲和力。这种改变可以在CDR“热点”，即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基)(见，例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)，和/或接触抗原的残基中进行，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并从中重新选择的亲和力成熟已经描述在例如在Hoogenboom等,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O'Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在亲和力成熟的某些实施方案中，可以通过多种方法中的任何一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及CDR定向方法，其中若干个CDR残基(例如，每次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的CDR残基能够(例如使用丙氨酸扫描诱变或建模)特异性地鉴定。特别是CDR-H3和CDR-L3经常成为目标。
在某些实施方案中，置换、插入和/或缺失可以在一个或更多个CDR内发生，只要这种改变不会显著降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，本文提供的保守置换)。这样的改变可以例如在CDR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个CDR或者未变更，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸置换。
用于鉴定可以靶向诱变的抗体残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在此方法中，鉴定残基或靶残基的组(例如，带电荷的残基诸如arg、asp、his、lys和glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)将其替换以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始置换表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的置换。备选地或者另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为置换的候选者被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，对于抗体导向的酶前药治疗(ADEPT))或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，可以改变本公开的抗体以增加或减少抗体被糖基化的程度。例如，但不以限定的方式，抗体的糖基化位点的添加或缺失可通过改变氨基酸序列以产生或去除一个或更多个糖基化位点而方便地实现。
当本公开的抗体包含Fc区时，与其相连的碳水化合物(如果存在的话)可以被改变。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。参见,例如,Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括多种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及附着于双链寡糖结构“茎干”中的GlcNAc的岩藻糖。在某些实施方案中，可以对本公开的抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在某些实施方案中，提供了抗体变体，其具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以为约1％至约80％，约1％至约65％，约5％至约65％或约20％至约40％及之间的值。
在某些实施方案中，岩藻糖的量可以通过计算相对于附着于Asn 297的所有糖结构(例如，复合的、杂合的和高甘露糖结构)的总和，在Asn297糖链内的岩藻糖的平均量来确定，如通过MALDI-TOF质谱，例如，如WO 2008/077546中所述。Asn297是指位于Fc区的第297位左右(Fc区残基的Eu编号)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于第297位上游或下游的约±3个氨基酸，即第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能。见例如，美国专利公布No.US 2003/0157108(Presta,L.)；US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。与“去岩藻糖化”或“岩藻糖缺乏”抗体变体相关的出版物的实例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。
去岩藻糖基化抗体可以在蛋白质岩藻糖基化不足的任何细胞系中产生。细胞系的非限制性实施例包括蛋白质岩藻糖基化不足的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US专利公开No.US2003/0157108,Presta,L；和WO2004/056312,Adams等，尤其是实施例11)，以及敲除细胞系，诸如敲除α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8的CHO细胞(见，例如，Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO2003/085107)。
抗体变体进一步具有二等分型寡糖，例如，其中附着于抗体Fc区的二分支寡糖被GlcNAc二等分。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的非限制性实例描述于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；和US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。这样的抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体描述于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc区变体
在某些实施方案中，可以将一处或更多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中，由此产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或更多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中，本公开提供了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体。这种有限的效应子功能可以使抗体变体成为应用中理想的候选者，其所述应用中在体内抗体半衰期很重要而某些效应子功能(例如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)，而保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(见例如Hellstrom,I.等Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。备选地，可以采用非放射性测定方法(例如，参见用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(加利福尼亚州山景城的Cell Technology，Inc；和CYTOTOX
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地，或另外，可以在体内，例如在动物模型(诸如公开于Clynes等,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)的动物模型)中，评估目标分子的ADCC活性。也可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，并且因此缺乏CDC活性。见例如，WO2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如,Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。在某些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即，改善或减弱),例如，如美国专利No.6,194,551,WO99/51642,和Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述的。
具有降低的效应子功能的抗体包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或更多个的置换的那些(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两处或更多处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有与FcR的改善或减弱的结合的某些抗体变体。参见，例如，美国专利号6,737,056；WO2004/056312,和Shields等,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。
在某些实施方案中，本公开的抗体变体包含具有一个或更多个改善ADCC的氨基酸置换(例如Fc区的第298、333和/或334位(EU残基编号)的置换)的Fc区。
在某些实施方案中，本文公开的抗体例如双特异性抗体的Fc区中的改变可以产生具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的变体抗体(其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等,J.Immunol.24:249(1994))，在US2005/0014934(Hinton等人)中描述。那些抗体包含其中具有一个或更多个置换的Fc区，所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这种Fc变体包括在Fc区残基中的以下一个或更多个具有置换的那些：238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434，例如，Fc区残基434的置换(美国专利No.7,371,826)。
还可见Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260；美国专利No.5,624,821；和WO 94/29351(其涉及Fc区变体的其它例子)。
d)半胱氨酸改造的抗体变体
在某些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸改造的抗体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或更多个残基用半胱氨酸残基置换。在具体的实施方案中，经置换的残基出现在抗体的可及位点(accessible site)。通过用半胱氨酸置换那些残基，反应性硫醇基团因此定位在抗体的可及位点并且可以用于将抗体与其他部分(诸如药物部分或接头-药物部分)缀合，以生成免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，以下残基中的任何一个或更多个可以用半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。半胱氨酸改造的抗体可以如例如美国专利号7,521,541中所述生成。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中，本公开的抗体可以被进一步修饰以含有本领域已知的并且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而在制造中可具有优势。该聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可基于下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于要改进的抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定的条件下的治疗等。
在某些实施方案中，提供了可以通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质部分的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质部分是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。在某些实施方案中，辐射可以是任意波长的，且包括但不限于，不损害普通细胞但可以将非蛋白结构部分加热到杀死接近抗体-非蛋白结构部分的细胞的温度的波长。
B.抗体生产方法
可以使用本领域中任何可用的或已知的技术来产生本文公开的抗体。例如，但不以限定的方式，可以使用重组方法和组合物来生产抗体，例如，如描述于美国专利No.4,816,567的。产生抗体的详细程序在以下实施例中描述。
目前公开的主题还提供了编码本文公开的抗体的分离的核酸。例如，分离的核酸可以编码包含VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH的氨基酸序列，例如抗体的轻链和/或重链。在某些实施方案中，分离的核酸可包括编码具有SEQ ID NO:54所示序列的重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列，和/或编码具有SEQ ID NO:50所示的序列的轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，分离的核酸可包括编码具有SEQ ID NO:57所示序列的重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列，和/或编码具有SEQ ID NO:53所示的序列的轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列。
在某些实施方案中，核酸可以存在于一个或更多个载体，例如表达载体中。如本文所用，术语“载体”是指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离的哺乳动物载体)在导入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体，表达载体，能够指导与其可操作连接的基因的表达。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒(载体)的形式。但是，所公开的主题旨在包括具有此类其它形式的表达载体，诸如提供等同功能的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在某些实施方案中，可以将编码本公开的抗体的核酸和/或包括该核酸的一个或更多个载体引入宿主细胞。在某些实施方案中，可以通过本领域已知的任何方法将核酸引入细胞，所述方法包括但不限于用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体转染、电穿孔、显微注射、感染，细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。在某些实施方案中，宿主细胞可以包括，例如，已经用以下转化：(1)包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。
在某些实施方案中，制备公开的抗FGF21抗体的方法可以包括在适合于抗体表达的条件下培养其中已引入了编码抗体的核酸的宿主细胞，并任选地从宿主细胞和/或宿主细胞培养基中回收抗体。在某些实施方案中，通过层析技术从宿主细胞回收抗体。
对于本公开的抗体的重组产生，能够将编码抗体的核酸(例如如上文所描述的)分离，并插入一种或更多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序将此类核酸容易地分离并测序(例如，通过使用寡核苷酸探针来进行，所述寡核苷酸探针能够特异性结合至编码抗体的重和轻链的基因)。
用于克隆或表达抗体编码载体的合适的宿主细胞包括本文中所描述的原核或真核细胞。例如，抗体能够在细菌中产生，特别是在不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达抗体片段和多肽，见例如美国专利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523(还可见Charlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,编,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254,描述了抗体片段在E.coli.中的表达)表达后，可以将抗体在可溶性级分中从细菌细胞浆分离，并可以进一步纯化。
在原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是用于抗体编码载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人的糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004),和Li等,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。适合于表达糖基化抗体的宿主细胞可以衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞组合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。
适合于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞组合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
在某些实施方案中，植物细胞培养物可以用作宿主细胞。参见，例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
在某些实施方案中，脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，但不以限定的方式，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(293或293细胞，如描述于例如Graham等,J.GenVirol.36:59(1977)中的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(TM4细胞，如描述于例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如描述于例如Mather等人,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中的；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，例如Y0，NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，见，例如，Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。
在某些实施方案中，用于制备双特异性和/或多特异性抗体的技术包括，但不限于，重组共表达具有不同特异性的两条免疫球蛋白重链-轻链对(见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983)；PCT发明申请No.WO93/08829；和Traunecker等，EMBO J.10：3655(1991))和"杵臼结构(knob-in-hole)"改造(例如美国专利No.5,731,168)。双特异性抗体还可以通过改造静电转向效应而制备用于制备抗体Fc-异二聚体分子(WO2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(见，例如，美国专利No.4,676,980，和Brennan等人，Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(见，例如，Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术用于制备双特异性抗体片段(见，例如，Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(见，例如，Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备例如，如Tutt等J.Immunol.14760(1991)中所述的三特异性抗体。
本公开的双特异性和多特异性分子也可以使用化学技术(参见,例如Kranz(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:5807),“polydoma”技术(参见,例如,U.S.专利4,474,893)或重组DNA技术制备。目前公开的主题的双特异性和多特异性分子还可以使用本领域已知的和本文所述的方法，通过缀合组分结合特异性，例如第一表位和第二表位结合特异性，来制备。例如，但不以限定的方式，双特异性和多特异性分子的每种结合特异性可以分别产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，能够使用多种偶联剂或交联剂进行共价缀合。交联剂的非限制性实例包括蛋白A，碳二亚胺，N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78,118-132；Brennan(1985)Science229:81-83),Glennie(1987)J.Immunol.139:2367-2375)描述的那些。当结合特异性是抗体(例如两种人源化抗体)时，它们可以通过两条重链的C末端铰链区的巯基键合而缀合。在某些实施方案中，在缀合之前，铰链区可以被修饰为包含奇数个(例如一个)巯基残基。
在某些实施方案中，双特异性抗体的两种结合特异性可以在同一载体中编码，并在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性和多特异性分子是MAb x MAb、MAb x Fab、Fabx F(ab’)2或配体x Fab融合蛋白时，此方法特别有用。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体可以是单链分子，例如单链双特异性抗体，包含一个单链抗体和结合决定簇的单链双特异性分子或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可以是单链分子或可以包含至少两个单链分子。制备双特异性和多特异性分子的方法描述于，例如，美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858.中。具有三个或更多个功能性抗原结合位点(表位结合位点)的经设计的抗体，包括"章鱼抗体"，也包括在本文中(见，例如US 2006/0025576A1)。
在某些实施方案中，动物系统可以用于产生本公开的抗体。用于制备杂交瘤的一种动物系统是鼠系统。在小鼠中生产杂交瘤是一种非常完善的程序。用于分离免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的(例如，参见，Harlow and Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor New York)。
C.结合竞争测定
本文提供的本公开的抗FGF21抗体可以通过本领域已知的和本文提供的各种测定法来鉴定、筛选或表征其物理/化学性质和/或生物学活性。
1.结合测定和其他测定
可以通过已知方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)或蛋白质印迹测定来测试本公开的抗体的抗原结合活性。这些测定法中的每一种通常通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以使用识别并特异性结合抗体-FGF21复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FGF21-抗体复合物。或者，可以使用多种其他免疫测定中的任何一种来检测该复合物。例如，该抗体可以被放射性标记并用于放射免疫测定(RIA)中(参见，例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques,The Endocrine Society,March,1986,其通过引用并入本文)。放射性同位素可以通过使用盖革(Geiger)计数器或闪烁计数器的方法或放射自显影来检测。
在某些实施方案中，竞争测定可用于鉴定与本公开的抗FGF21抗体，例如mAb4或mAb15竞争结合FGF21的抗体。在某些实施方案中，这样的竞争抗体结合由mAb4或mAb15结合的相同表位(例如，线性或构象表位)。用于绘制抗体结合的表位的详细示例性方法提供在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”in Methods in Molecular Biologyvol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在竞争测定的非限制性实例中，固定化的FGF21可以在包含与FGF21(例如，mAb4或mAb15)结合的第一标记抗体和第二未标记抗体的溶液中温育，所述第二未标记抗体正在测试其与第一抗体竞争结合FGF21的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的FGF21在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中温育。在允许第一抗体与FGF21结合的条件下温育后，去除过量的未结合抗体，并测量与固定化的FGF21结合的标记的量。如果测试样品中与固定化的FGF21结合的标记的数量相对于对照样品显著减少，则表明第二抗体正在与第一抗体竞争结合FGF21。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY)。
D.免疫缀合物
目前公开的主题还提供了免疫缀合物，其包含与一种或更多种细胞毒性剂(例如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素，或其片段)缀合的抗体。例如，所公开的主题的抗体或抗原结合部分可以功能性地连接(例如，通过化学偶联，遗传融合，非共价缔合或其他方式)至一个或更多个其他结合分子，诸如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟物。
在某些实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或更多种药物缀合，所述药物不限于美登木素生物碱(见美国专利No.5,208,020,5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235)；auristatin诸如单甲基奥瑞他汀(monomethylauristatin)药物部分DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利No.5,635,483和5,780,588和7,498,298)；多拉司他汀；加利车霉素或其衍生物(见美国专利No.5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001和5,877,296；Hinman等，Cancer Res.53:3336-3342(1993)；和Lode等,Cancer Res.58:2925-2928(1998))；蒽环霉素诸如道诺霉素或阿霉素(见Kratz等,Current Med.Chem.13:477-523(2006)；Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters 16:358-362(2006)；Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005)；Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:829-834(2000)；Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002)；King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002)；和美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛；多西紫杉醇、紫杉醇、拉罗他赛、替司他赛和沃塔紫杉醇等紫杉烷类；单端孢霉烯；和CC1065。
在某些实施方案中，免疫缀合物包含如本文所述的缀合至酶促活性毒素的抗体或其片段,所述毒素包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A、α-八叠球菌素、油桐蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白质(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(saponaria officinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。
在某些实施方案中，免疫缀合物包含缀合至放射性原子以形成放射性缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于放射性缀合物的产生。非限制性的实例包括At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素。当放射性缀合物用于检测时，它可包含用于闪烁法研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或用于核磁共振(NMR)成像的自旋标记(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
抗体和细胞毒性剂的缀合物能够使用各种双功能蛋白偶联剂制备，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如二甲基己二酸盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基))己二胺)，双重氮衍生物(如双-(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2，4-硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，Science 238:1098(1987)中所描述的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的示例性螯合剂。见，WO94/11026。所述接头可以是“可切割的接头”，其促进细胞中细胞毒性药物的释放。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari等,Cancer Res.52:127-131(1992)；U.S.Patent No.5,208,020)。
本公开的免疫缀合物明确考虑但不限于用交联剂制备的这种缀合物，包括但不限于BMPS,EMCS,GMBS,HBVS,LC-SMCC,MBS,MPBH,SBAP,SIA,SIAB,SMCC,SMPB,SMPH、硫代-EMCS、硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SIAB、硫代-SMCC、硫代-SMPB和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，其可商业获得(例如，从Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A获得)。
IV.试剂盒
目前公开的主题还提供了试剂盒，其包含可用于进行本文公开的免疫测定的材料。在某些实施方案中，试剂盒包括含有本文公开的抗FGF21抗体的容器。合适的容器的非限制性实例包括瓶、试管、小瓶和微量滴定板。容器能够由多种材料形成，例如玻璃或塑料。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括包装插页，所述包装插页提供使用在免疫测定方法中使用抗FGF21抗体的说明。
在某些实施方案中，试剂盒可包括一个或更多个含有一个或更多个抗FGF21抗体的容器。表8-13和16-19以及图41A和B公开了抗FGF21抗体的非限制性实例。例如，但不以限定的方式，试剂盒可包括至少一个包含抗FGF21捕获抗体的容器和至少一个包含抗FGF21检测抗体的容器。
在某些实施方案中，用于检测样品中的总FGF21蛋白的试剂盒包括：第一容器，其含有与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合的捕获抗体；第二容器，其含有与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合的检测抗体，和第三容器，其含有检测剂。
在某些实施方案中，用于检测样品中的有活性的FGF21蛋白的试剂盒包括：第一容器，其含有与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合的捕获抗体；第二容器，其含有与FGF21的氨基酸残基173-182中存在的表位结合的检测抗体，和第三容器，其含有检测剂。
在某些实施方案中，用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的试剂盒可包括含有第一捕获抗体的第一容器，所述第一捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合，含有第一检测抗体的第二容器，所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合，含有第二捕获抗体的第三容器，所述第二捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合，含有第二检测抗体的第四容器，所述第二检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182中存在的表位结合，和含有检测剂的第五容器。在某些实施方案中，第一和第二捕获抗体是相同的抗体，并且可以在单个容器中提供。备选地，第一和第二捕获抗体是不同的抗体，并且可以在分开的容器中提供。
在某些实施方案中，捕获抗体和/或检测抗体可以在本公开的试剂盒中以约0.1μg/ml至约5.0μg/ml的浓度提供。在某些实施方案中，检测抗体可以(例如用生物素)标记。
在某些实施方案中，本公开的试剂盒中提供的检测剂可以是抗生物素蛋白，链霉亲和素-HRP或链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖(SBG)。在某些实施方案中，本公开的试剂盒可进一步包括四甲基联苯胺，过氧化氢和/或试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。在某些实施方案中，如果试剂盒包括链霉亲和素-HRP，则试剂盒可以进一步包括四甲基联苯胺和过氧化氢。在某些实施方案中，如果所述试剂盒包含SBG，则试剂盒可进一步包含试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。在某些实施方案中，SBG可以在试剂盒中以约100pM至约400pM的浓度提供。
在某些实施方案中，可以提供附着于固相支持体表面的捕获抗体，所述固相支持体表面例如但不限于板或珠子，例如顺磁珠。备选地或额外地，所述试剂盒可以进一步包括可以与捕获抗体偶联的固相支持体表面。在某些实施方案中，固相支持体可以是顺磁珠并且可以以约0.1×107珠子/ml至约10.0×107珠子/ml的浓度提供。
备选地或额外地，所述试剂盒可以包括从商业和用户的角度来看期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂和过滤器。在某些实施方案中，所述试剂盒可包括用于收集和/或处理血液样品的材料。
V.示例性实施方案。
A.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主题提供用于确定样品中总FGF21蛋白的量的免疫测定方法，其包括：
(a)使捕获抗体与所述样品接触以生成样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；
(b)使所述样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触，所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的结合；
(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述检测抗体，并
(d)基于结合的所述检测抗体的水平计算所述样品中存在的总FGF21蛋白的量。
A1.前述A所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体和所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
B.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主题提供用于确定样品中有活性的FGF21蛋白的量的免疫测定方法，所述方法包括：
(a)使捕获抗体与所述样品接触以生成样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；
(b)使所述样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触，所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的结合；
(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述检测抗体，并
(d)基于结合的所述检测抗体的水平计算所述样品中存在的有活性的FGF21蛋白的量。
C.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主题提供用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的免疫测定方法，所述方法包括：
(a)(i)使第一捕获抗体与所述样品接触以生成第一样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；(ii)使所述第一样品-捕获抗体组合材料与第一检测抗体接触，所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的结合；(iii)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述第一检测抗体；并(iv)基于结合的所述第一检测抗体的水平计算所述样品中存在的总FGF21蛋白的量；
(b)(i)使第二捕获抗体与所述样品接触以生成第二样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；(ii)使所述第二样品-捕获抗体组合材料与第二检测抗体接触，所述第二检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的结合；(iii)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述第二检测抗体；并(iv)基于结合的所述第二检测抗体的水平计算所述样品中存在的有活性的FGF21蛋白的量；和
(c)将通过步骤(a)确定的所述总FGF21蛋白的量与通过步骤(b)确定的有活性的FGF21蛋白的量进行比较，以确定所述样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例。
C1.前述C所述的免疫测定方法，其中所述第一捕获抗体和所述第二捕获抗体是相同的抗体。
C2.前述C所述的免疫测定方法，其中所述第一捕获抗体和所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
C3.前述A-C2中任一项所述的免疫测定方法，其中所述免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
C4.前述A-C3中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个固定化在顺磁珠上。
C5.前述A-C4中任一项所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体、第一检测抗体和第二检测抗体中的一个或更多个与生物素缀合。
C6.前述A-C5中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
C7.前述A和C-C6中任一项所述的的免疫测定方法，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
C8.前述A-C7中任一项所述的免疫测定方法，其中所述样品是血液样品。
C9.前述A-C7中任一项所述的免疫测定方法，其中所述样品是血浆样品。
C10.前述A-C9中任一项所述的免疫测定方法，其中所述方法以约2pg/ml至约20pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
C11.前述A-C9中任一项所述的免疫测定方法，其中所述免疫测定方法是使用单分子检测仪器进行的。
C12.前述C11所述的免疫测定方法，其中所述单分子检测仪器是Quanterix SimoaHD-1AnalyzerTM。
C13.前述C11和C12所述的免疫测定方法，其中所述方法以约0.2pg/ml至约0.5pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
C14.前述A-C13中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:26和27的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自SEQ ID NO:30和31的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
C15.前述A-C13中任一项所述的免疫检测，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:54、55、74和75组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:50、51、70和71组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
C16.前述A-C13中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:22、23、66和67组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:18、19、62和63组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
C17.前述A和C-C13中任一项所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:44和45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
C18.前述A和C-C13中任一项所述的免疫测定，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:56、57、72和73组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:52、53、68和69组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
C19.前述A和C-C13中任一项所述的免疫测定，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:24、25、64和65组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:20、21、60和61组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
C20.前述C14所述的免疫测定，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列及其保守置换。
C21.前述C20所述的免疫测定法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列及其保守置换；
C22.C21所述的免疫测定法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列及其保守置换。
C23.前述C17所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列及其保守置换。
C24.C23所述的免疫测定，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列及其保守置换；
C25.C24所述的免疫测定，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列及其保守置换。
C26.前述A-C13中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个竞争性地与包含以下的抗体结合：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自SEQ ID NO:26和27的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自SEQ ID NO:30和31的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
C27.前述A、C-C13中任一项所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个与包含以下的抗体竞争性结合：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自SEQ ID NO:32和33组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:44和45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
D.在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供用于检测样品中的总FGF21蛋白的试剂盒，该试剂盒包含：
(a)结合FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的捕获抗体；
(b)结合到FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的检测抗体；和
(c)检测剂。
D1.前述D所述的试剂盒，其中所述捕获抗体和所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
E.在某些非限制性实施方案中，本公开的主题提供用于检测样品中有活性的FGF21蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)结合FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的捕获抗体；
(b)结合到FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的检测抗体；和
(c)检测剂。
C.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主题提供用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)(i)第一捕获抗体，其与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合，以及(ii)第一检测抗体，其与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合；
(b)(i)第二捕获抗体，其与FGF21的氨基酸残基5-172中存在的表位结合，以及(ii)第二检测抗体，其与FGF21的氨基酸残基173-182中存在的表位结合；和
(c)一个或更多个检测剂。
F1.前述F所述的试剂盒，其中所述第一捕获抗体和所述第二捕获抗体是相同的抗体。
F2.前述F所述的试剂盒，其中所述第一捕获抗体和所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
F3.前述D-F2中任一项所述的试剂盒，其中捕获抗体，第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个固定化在顺磁珠上。
F4.前述D-F3中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体、第一检测抗体和第二检测抗体中的一个或更多个与生物素缀合。
F5.前述D-F4中任一项所述的试剂盒，其中所述检测剂选自链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖缀合物，链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物及其组合。
F6.前述F5的试剂盒，其进一步包含试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、四甲基联苯胺、过氧化氢或其组合。
F7.前述的D-F6中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
F8.前述的D和F-F7中任一项所述的试剂盒，其中检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
F9.前述D和F-F8中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体或第一检测抗体具有约0.1μg/ml至约1μg/ml的浓度。
F10.前述E-F7中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体或第二检测抗体中的一个或更多个具有约1μg/ml至约3μg/ml的浓度。
F11.前述的F5的试剂盒，其中所述链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖缀合物具有约100pM至约400pM的浓度。
F12.前述D-F11中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26和27组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自SEQ ID NO:30和31的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
F13.前述D-F11中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:54、55、74和75组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:50、51、70和71组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
F14.前述D-F11中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:22、23、66和67组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:18、19、62和63组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
F15.前述D和F-F11中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:44和45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
F16.前述D和F-F11中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:56、57、72和73组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:52、53、68和69组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
F17.前述D和F-F11中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:24、25、64和65组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:20、21、60和61组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
F18.前述F12所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列及其保守置换。
F19.前述F18所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列及其保守置换；
F20.前述F19所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列及其保守置换。
F21.前述F15所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列及其保守置换。
F22.前述F21所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列及其保守置换；
F23.前述F22所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列及其保守置换。
F24.前述D-F11中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个竞争性地与包含以下的抗体结合：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26和27组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自SEQ ID NO:30和31的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
F25.前述D和F-F11中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个与包含以下的抗体竞争性结合：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自SEQ ID NO:32和33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:44和45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
F26.前述D-F25中任一项所述的试剂盒，其中所述样品是血液样品。
F27.前述D-F25中任一项所述的试剂盒，其中所述样品是血浆样品。
F28.前述D-F27中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒以约0.2pg/ml至约0.5pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
G.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主体提供分离的抗FGF21抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26-29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:30-33组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34-37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38-41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42-45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46-49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
G1.前述G所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列及其保守置换。
G2.前述G所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列及其保守置换。
G3.前述G所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列及其保守置换。
G4.前述G所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列及其保守置换。
G5.前述G1所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列及其保守置换；
G6.前述G2所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列及其保守置换；
G7.前述G3所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列及其保守置换；
G8.前述G4所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列及其保守置换；
G9.前述G1所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列及其保守置换；
G10.前述G2所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列及其保守置换；
G11.前述G3所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列及其保守置换；
G12.前述G4所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列及其保守置换；
G13.前述G5所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列及其保守置换。
G14.前述G6所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列及其保守置换。
G15.前述G7所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列及其保守置换。
G16.前述G8所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列及其保守置换。
G17.前述G9所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列及其保守置换。
G18.前述G10所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列及其保守置换。
G19.前述G11所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列及其保守置换。
G20.前述G12所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分，包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列及其保守置换。
H.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主题提供编码G-G20中任一项的抗体或其抗原结合部分的分离的核酸。
I.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主题提供包含H的核酸的宿主细胞。
J.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主题提供了产生抗体的方法，该方法包括培养I的宿主细胞从而产生该抗体。
J1.前述J所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞回收所述抗体。
K.在某些非限制性实施方案中，目前公开的主题提供了组合物，所述组合物包含G-G20中任一项所述的一个或更多个抗体或其抗原结合部分。
实施例
以下实施例仅是对目前公开的主题的说明，不应以任何方式视为限制。
实施例1：抗FGF21抗体的生成
通过用重组人FGF21免疫SJL和Balb/c小鼠生成单克隆抗体。通过ELISA筛选了80种杂交瘤上清液(图1)。基于与完整人类FGF21(PUR98271)，完整猕猴FGF21(PUR 98270)和通过人FAP消化完整人类FGF21产生的切割的人类FGF21(PUR 102247)的结合，选择20个杂交瘤。
实施例2：抗FGF21抗体表征
从实施例1中鉴定的所选的20个杂交瘤中获得的IgG通过ELISA进一步表征。ELISA方法如下进行：将96孔MaxiSorp板(439454,Nalge Nunc International；Rochester,NY)用在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.6)中的1μg/mL的抗FGF21 mAb或抗FGF21绵羊pAb(Cat.No.RD184108100,Biovendor,Asheville,NC)于4℃过夜包被。第二天，用含有0.5％BSA和10ppm ProClin pH 7.4的PBS封闭，并用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween 20，pH 7.2)洗涤后，将板用0.00000186-2000pg/mL完整的人FGF21(全长，未切割的FGF21；Cat.No.2539-FG，R&D系统)或FAP切割的人FGF21在测定缓冲液(25mM HEPES，pH 7.2,150mMNaCl，0.2mM CaCl2，0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.05％Tween 20)中于室温温育1-2小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将平板与0.5μg/ml的二抗(R&D Systems，生物素化的山羊抗FGF21 pAbBAF2539)在室温下温育1-2小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将板与在测定缓冲液中以1:1,000稀释的高灵敏度链霉抗生物素蛋白-HRP(PIERCE Cat.No.21130)一起温育。用洗涤缓冲液洗涤后，通过加入底物3,3’,5,5’四甲基联苯胺(TMBE 1000，Moss；Pasadena，MD)评估抗FGF21与重组FGF21的结合。将来自重复孔的平均吸光度值作为抗体浓度的函数作图，并将数据拟合到三参数方程以使用Prism 6(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)计算每种抗体的半数最大有效浓度(EC50)值(表2)。
表2.每个FGF21抗体的EC50值。
基于完整的FGF21和切割的FGF21以及EC50绝对值的差异检测，将抗体mAb5，mAb6，mAb7和mAb12排除在进一步分析之外。抗体mAb1,mAb2,mAb3,mAb4,mAb8,mAb9,mAb10,mAb11,mAb13,mAb15和mAb16通过使用EZ-LinkTMNHS-PEG固相生物素化试剂盒(PIERCECat.No.21450)进行生物素化并使用完整的FGF21以成对组合方式进行了夹心ELISA(表3和表4)。生物素化的山羊抗FGF21 pAb BAF2539(R&D Systems)被用作阳性对照。
表3.夹心ELISA中抗FGF21 mAb的兼容性。
XX：OD>1的强信号，X：OD<1的强信号
表4.夹心ELISA中抗FGF21 mAb的兼容性。
当使用653pg/mL FGF21时，XX：具有OD>1.5的强信号，X：具有0.5<OD<1.5的强信号，-：OD＜0.5。完整的FGF21和FAP切割的FGF21的平均值用于生成表格。
根据表3中提供的结果，将抗体mAb2、3和13排除在进一步分析之外。表3的结果将抗体mAb1、4、8、9、10和11放入了三个表位箱中(表5)。
表5.表位分箱(binning)。
| 表位箱 | mAb |
| 1 | 1,10,11 |
| 2 | 4,9 |
| 3 | 8 |
然后使用完整的人类FGF21(Cat.No.2539-FG,R&D Systems)以组合方式在ELISA中测试抗体mAb1、4、8、9、10和11。将吸光度值作为抗体浓度的函数作图，并将数据拟合到三参数方程以使用Prism 6(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)计算每种抗体的半数最大有效浓度(EC50)值(表6)。如表6所示，当使用抗体mAb4或9作为捕获抗体并且使用抗体mAb10或11作为针对完整人FGF21的检测抗体时，观察到更好的效力。
表6.夹心ELISA中具有各种抗FGF21 mAb组合的EC50值。
然后使用完整的人FGF21(Cat.No.2539-FG,R&D系统)或FAP切割的人FGF21以组合方式在ELISA中测试抗体mAb4,8,9,10,11,15和16。将吸光度值作为抗体浓度的函数作图，并使用Prism 6(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)将数据拟合为每种抗体的三参数方程式。当使用抗体mAb4或9作为捕获抗体并且使用抗体mAb11或mAb15作为检测抗体时，观察到最一致的结果(图2和表7)。因此，将mAb8和16从进一步的分析中删除。图2显示了抗体与完整的和FAP切割的FGF21(cFGF21)均等结合，这对于检测总FGF21(即完整的和FAP切割的)的浓度很重要。
表7.夹心ELISA中使用各种抗FGF21 mAb组合的EC50值。
通过
表面等离振子共振进一步分析抗体mAb4、9、11和15，以确定Kd。如图3所示，mAb4具有3.689x 1010的Kd，mAb9具有8.895x 1010的Kd，mAb11具有2.704x 1010的Kd，且mAb15具有3.955x1012的Kd。
实施例3：表位分析
通过在瞬时转染的HEK293培养上清液中表达FGF19、FGF21或FGF19-FGF21嵌合蛋白作为FLAG标签蛋白，并通过ELISA测试抗体mAb4、9、11和15的结合，进行表位映射。对于ELISA，将96孔MaxiSorp板(439454,Nalge Nunc International；Rochester,NY)用15μl含分泌蛋白的培养上清液和135μl 1x包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.6)的混合物，在4℃包被过夜。与FGF21的C末端结合的商业抗体R5和R9被用作阳性对照。
人FGF19：
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:2)
人FGF21：
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:1)
人FGF21-19嵌合蛋白(FGF21部分为斜体，而FGF19部分带下划线)：
HPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAI KGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPM LPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:3)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGV HSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPM VPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:4)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGV HSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPM VPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:5)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGV HSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPM VPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:6)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLEIKAVALRTVAIKGV HSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPM VPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:7)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPM VPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:8)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPM VPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:9)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPMLPMVP EEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(SEQ ID NO:10)
RPLAFSDAGPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:11)
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:12)
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:13)
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:14)
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:15)
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTV AIKGVHSVRYLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:16)
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTV AIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS(SEQ ID NO:17)
如图4所示，抗体mAb4、9、11和15结合人FGF21的核心FGF折叠且不结合N端或C端柔性区。
实施例4：FGF21
ELISA测定
与通过使用EZ-LinkTMNHS-PEG Solid-Phase Biotinylation Kit(PIERCE#21450)生物素化的C端特异性抗FGF21 pAb(Cat.No.30661,Epitope Diagnostics,San Diego,CA；在本文中也称为“C-ter pAb”)结合，测试了mAb4和11抗体作为捕获抗体在检测完整FGF21中的效用。确定总FGF21和有活性的FGF21水平的免疫测定方法示意图如图5所示。
ELISA测定如下进行：将96孔MaxiSorp板(439454,Nalge Nunc International；Rochester,NY)用0.5μg/mL的抗FGF21 mAb在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH 9.6)中于4℃过夜包被。第二天，用含有0.5％BSA和10ppm Proclin pH 7.4的PBS封闭，并用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween20，pH 7.2)洗涤后，将板用0.0004-32000pg/mL完整的人FGF21(2539-FG,R&D系统)在测定缓冲液(25mM HEPES，pH 7.2,150mM NaCl，0.2mM CaCl2，0.1％牛血清白蛋白[BSA]，0.05％Tween 20)中于室温温育1-2小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将板与0.5μg/ml二抗(生物素化的抗FGF21 C末端pAb 30661或抗FGF21 mAb11或15)在Magic缓冲液(1XPBS pH 7.4,0.5％BSA,0.05％Tween 20,0.2％BgG,0.25％CHAPS,5mM EDTA,0.35M NaCl,10PPM Proclin)中，在室温下温育1-2小时。用洗涤缓冲液洗涤后，将板与在测定缓冲液中以1:1,000稀释的高灵敏度链霉抗生物素蛋白-HRP(PIERCE#21130)一起温育。用洗涤缓冲液洗涤后，通过加入底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMBE-1000,Moss；Pasadena,MD)评估抗FGF21与重组FGF21的结合。图6中提供了更详细的方案。将来自重复孔的平均吸光度值作为抗体浓度的函数作图，并使用Prism 6(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)将数据拟合为三个参数方程式(图7)。
如图8所示，总FGF21 ELISA测定具有5pg/ml的孔内灵敏度，且有活性的FGF21ELISA测定具有28pg/ml的孔内灵敏度。有活性的FGF21ELISA分析未检测到缺少最后10个C端氨基酸的FGF21切割形式。
进行了进一步的实验以确定血清对总FGF21 ELISA测定的影响。进行使用mAb4作为捕获抗体并且使用mAb11作为检测抗体的FGF21ELISA测定。如图9所示，存在血清对测定的最小干扰。还测试了对人FGF21的测定的特异性。如图9所示，总FGF21的测定检测到与对照小鼠相比在人FGF21敲入小鼠中表达的人FGF21。图10还显示使用公开的抗体的测定对人FGF21具有特异性，并且未检测到小鼠FGF21。
基于这些数据，选择了4种抗体mAb4，mAb9，mAb11和mAb15进行cDNA克隆以进行重组表达。这些抗体的氨基酸序列在表8-13以及图41A和41B中提供。重组mAb在鼠IgG2a背景中在100mL CHO培养物中表达。
表8.鼠抗FGF21单克隆抗体的全长轻链(LC)序列。
表9.鼠抗FGF21单克隆抗体的全长重链(HC)序列。
表10.鼠抗FGF21单克隆抗体的轻链可变区(VL)序列。
表11.鼠抗FGF21单克隆抗体的重链可变区(VH)序列。
表12.鼠抗FGF21单克隆抗体的重链CDR序列。
表13.鼠抗FGF21单克隆抗体的轻链CDR序列。
实施例5：FGF21
ELISA测定的优化
实施例4中所述的FGF21 ELISA测定法被进一步优化以提高测定的灵敏度。
比较不同的捕获抗体以确定哪种捕获抗体可导致更出色的检测。抗体mAb4和mAb9均被测试为捕获抗体。如图11所示，与mAb9相比，使用mAb4作为捕获抗体获得了更好的测定灵敏度。
对于总FGF21测定和有活性的FGF21测定，分析了不同类型的包被缓冲液和在固定检测抗体浓度下的不同浓度的包被抗体。在不同的包被抗体浓度下分析了碳酸氢盐包被缓冲液和PBS包被缓冲液。如图12所示，对于总FGF21测定，即使在不同浓度的包被抗体下，也观察到了碳酸氢钠和PBS包被缓冲液的相似的孔内灵敏度。例如，包被PBS中2μg/ml的mAb4具有2pg/ml的孔内灵敏度，包被2μg/ml的mAb4具有3pg/ml的孔内灵敏度。
对于有活性的FGF21测定，对于碳酸氢钠和PBS包被缓冲液，观察到相似的孔内灵敏度(图13)。
进行了其他实验，以确定检测抗体(mAb15)的浓度和辣根过氧化物(HRP)的浓度对总FGF21测定灵敏度的影响。针对检测抗体测试0.2、1和2μg/ml的浓度，针对HRP测试1/100和1/500的稀释度。如图14所示，较高浓度的检测抗体和HRP并未显著提高测定的灵敏度。
实施例6：使用Quanterix Simoa的FGF21检测测定
基于ELISA形式的优化，如实施例5中所讨论的，使用Quanterix Simoa HD-1AnalyzerTM的测定适于使用mAb 4作为捕获抗体，并使用生物素化mAb15(以检测总FGF21)或生物素化C-ter pAb(以检测有活性的FGF21)作为检测抗体。测定原理图如图15所示。
提供了免疫测定的总结。Quanterix Simoa免疫测定法首先采用两步测定方案(图16)，用酶缀合物(链霉亲和素β-半乳糖苷酶(SBG))捕获和标记总FGF21。在第一步中，将用缀合至mAb4的磁珠捕获的总FGF21和生物素化的检测抗体(针对总FGF21的mAb15-生物素或针对有活性的FGF21的C-ter pAb-生物素)一起加入以形成捕获的分析物夹心，然后在第二步中加入SBG用于检测。在每个步骤之间，洗涤珠子。在每个洗涤周期中，仪器会在自动吸出上清液之前使用一块磁铁使珠子沉淀。在最后的洗涤循环后，将捕获珠重悬于试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷(RGP)底物中。然后在制备过程中将珠子转移到Simoa Disc的入口，以准备成像和分析物定量。
在捕获并标记FGF21之后，将捕获珠加载到包含216,000 40-fL孔的阵列中，这些孔的大小可容纳每个孔不超过一个珠(宽4.25μm，深3.25μm)。珠悬浮液被拉过进入通道并穿过阵列。允许珠子通过重力沉降到孔中约90秒。将等分的油分配到阵列进入通道中，并拉过阵列，将珠子和RGP底物捕捉在微孔中，并从表面去除多余的珠子。如果已捕获并标记了FGF21分子，则SBG会将RGP底物水解为荧光产物试卤灵。该荧光产物会在密封的微孔中累积，能够检测单个分子。
使用两步EDAC偶联方案(Simoa Homebrew 2.0多重磁珠包被方案USER-213-11)制备多重捕获磁珠。珠子与0.5mg/mL mAb4和0.25mg/mL EDAC偶联。偶联反应发生在抗体伯氨基和珠子上的羧基之间。
在96孔NuncTM96孔聚丙烯MicroWellTM平板(V型底部，Thermo Scientific Nunc249944,Rochester,NY)中进行Quanterix Simoa分析。对于标准曲线，将重组完整的人FGF21(iFGF21)和经切割的人FGF21(cFGF21)在Simoa缓冲液(PBS pH 7.4,2％BSA(级分B,无蛋白酶),0.1％Tween,5mM EDTA)中从0.200-500pg/mL连续稀释(图17)或从Magic缓冲液(BA010)连续稀释(图19-25、28-32和33-37)。为了确定未知浓度的FGF21(例如血浆或血清中)，将测试样品在Simoa缓冲液或Magic缓冲液中以1:5-1:20稀释。将测定板和所需的推荐试剂一起加载到Simoa HD-1分析仪中。在每个孔中，对于每个反应，使用与mAb 4缀合的32μL捕获珠，使用32μL的1μg/mL的检测抗体(mAb15-生物素或C-ter pAb-生物素)和110μL的SBG。对于每个孔，一式两份进行测定。选择制造商的默认“自制测定法”作为自动化步骤的程序。图18提供了有关测定方案的其他信息。
如图19所示，总(T)FGF21基于Quanterix Simoa的测定(QSA)检测到完整的(野生型(WT))FGF21，孔内灵敏度(基于空白孔的2×平均AEB)为0.3pg/ml，和经切割的(CL)形式FGF21(不具有最后10个C末端氨基酸)，孔内灵敏度为0.6pg/ml。有活性的(A)FGF21 QSA以1.8pg/ml的孔内灵敏度检测完整的FGF21。与传统的ELISA相比，在总FGF21和有活性的FGF21 QSA中均观察到测定灵敏度的显著提高。图20显示了总FGF21和有活性的FGF21测定的标准曲线性能的代表。观察到良好的标准曲线性能。
实施例7：使用Quanterix Simoa的FGF21检测测定的优化
实施例6中所述的FGF21 QSA被进一步优化以提高测定的灵敏度。
分析了测定稀释剂的类型对测定的灵敏度的影响。测试了两种不同的稀释剂：BA010稀释剂(PBS,0.5％BSA,0.25％CHAPS,5mM EDTA,0.35M NaCl,0.05％Tween-20,0.05％Proclin 300,pH 7.4)和IL-12稀释剂(PBS,1.5％BSA,0.15％Tween-20,0.05％Proclin 300,pH 7.4).。BA010稀释剂针对总FGF21和有活性的FGF21分析中均能很好地发挥作用，并导致更低的背景并提高的灵敏度(图21)。
还分析了顺磁珠的浓度对测定的灵敏度的影响。测试了两种不同的浓度，1.22x107珠子/ml的“高”珠子浓度，0.59x 107珠子/ml的“低”珠子浓度。如图22所示，对于总FGF21测定，在高珠子浓度和低珠子浓度之间观察到相似的测定灵敏度。但是，对于有活性的FGF21测定，在低珠子浓度下观察到了更高的灵敏度(图22)。特别地，与使用低珠子浓度观察到的0.6pg/ml的孔内灵敏度相比，当使用高珠子浓度时，有活性的FGF21测定的孔内灵敏度为1.2pg/ml。还分析了三个不同的顺磁珠批(lots)。如图23所示，在当前和新批次的捕获顺磁珠中观察到了相似的结合曲线和测定灵敏度。优化的测定参数如表14所示。
表14.优化的测定参数。
| 试剂 | 浓度 |
| 测定稀释剂(BA010) | 1X |
| 珠子 | 0.59x 10<sup>7</sup>珠子/ml |
| 检测抗体(总的，有活性的) | 0.8μg/mL,2.2μg/mL |
| SBG | 310pM |
测试了不同的检测抗体以进行总FGF21测定。测试了抗体mAb11，mAb15和C-terpAb。在总FGF21测定中，使用各种检测抗体观察到了相似的灵敏度(图24)。但是，mAb15的曲线的背景最低。
从图14、19和22所示的结果，确定了用于总FGF21和有活性的FGF21测定的检测抗体和SBG的优化浓度(表15)。当检测抗体和SBG的浓度增加时，总FGF21和有活性的FGF21测定的测定灵敏度均得到提高。用0.8μg/mL检测抗体浓度和310pM的SBG浓度，总FGF21测定的灵敏度提高了；用2.2μg/mL检测抗体浓度和310pM的SBG浓度，有活性的FGF21测定的灵敏度提高了。
表15.检测抗体浓度和SBG的优化。
进一步分析总FGF21测定以确定是否观察到钩状效应。当样品中存在大量分析物且观察值错误地降低时，通常会观察到钩状效应。进行以下测定：对于总测定，使用浓度为0.59x 107珠子/ml的mAb4缀合的顺磁性珠进行捕获，并使用0.8μg/mL的生物素化mAb15进行检测；对于活性测定，使用浓度为0.59x 107珠子/ml的mAb4缀合的顺磁性珠子进行捕获，并使用2.2μg/mL的生物素化绵羊抗FGF21 C-term pAb进行检测。如图25所示，用总FGF21测定未观察到钩状效应。另外，总FGF21测定法以相似的灵敏度检测到完整的人FGF21和FAP切割的人FGF21(CL hFGF21)(图25)。
实施例8：使用FGF21 QSA分析血浆样品
使用总的和有活性的FGF21 QSA来分析从健康人类供体获得和新鲜制备的样品。如实施例6中所述进行测定。如图26所示，该测定法能够检测健康供体的血清样品中低水平的有活性的FGF21。在高血压或未接受任何药物治疗的供体中进行了其他实验，并将其与蛋白酶抑制剂混合物MS-SAFE的使用进行了比较(图27)。在2型糖尿病患者中进行了其他实验。如图28A-B所示，在14个样品中，使用总FGF21测定法在所有样品(100％)中检测到FGF21。对于有活性的FGF21测定，在12/14样品中检测到FGF21蛋白(86％)(图28A-B)。从该测定获得的结果是可再现的(图29)。在总FGF21和有活性的FGF21测定中，再现性在±30％的差异之内是可以接受的。
对于总的和活性的FGF21测定，分析了稀释度的线性。稀释度的线性在总FGF21的最低所需稀释度(MRD)(1:20稀释度)以及在有活性的FGF21测定中以1:40稀释度的±30％变化范围内是可以接受的(图30)。在初始MRD处观察到更高浓度的趋势。针对总的和活性的FGF21测定确定LLOQ。根据最高稀释倍数下平均计算浓度的±30％内的可接受回收率，总FGF21和有活性的FGF21测定的初步LLOQ分别确定为3.15pg/ml和10.94pg/ml ml(图31)。
进一步分析了测定的特异性。如图32所示，在总FGF21和有活性的FGF21测定中，在存在10μg/mL的mAb4的情况下，所有六个2型糖尿病血浆样品的AEB值均受到90％以上的抑制，从而证明了特异性。
将使用P800采血系统与单独使用K2-EDTA进行了比较，该P800采血系统包括蛋白酶，酯酶和DPP-IV抑制剂的组合，并包含抗凝血剂K2-EDTA(图33)。在总FGF21和有活性的FGF21测定中，观察到P800和K2EDTA筛选血浆样品之间的在可接受的±30％差异内的相当的结果(图34)。在总FGF21和有活性的FGF21测定中观察到P800和K2-EDTA筛选血浆样品之间具有良好的相关性(图35-36)。分析了血浆样品在2-8℃下保存后的稳定性。如图37所示，在总FGF21和有活性的FGF21测定中观察到来自在2-8℃稳定性样品的可接受的±30％回收率范围内的样品稳定性。
如图38和39所示，在K2-EDTA筛选血浆样品中观察到高于100％的活性比率，其通过总FGF21和有活性的FGF21测定进行分析，表明异嗜性抗体的干扰。特别地，当单独使用测定稀释剂时，从GC29819研究的K2-EDTA筛选血浆样品16和17而非9和10中观察到高于100％的活性比。具有高于100％的活性比率的样品16和17含有人抗小鼠抗体(HAMA)和人抗绵羊抗体(HASA)，表明患者血浆样品中HAMA和HASA的存在干扰总的和有活性的测定的准确性。如图38和图39所示，HAMA影响了总的和有活性的测定，而HASA仅影响有活性的检测。将10μg/ml小鼠IgG添加到总测定的稀释剂中，再将10μg/ml绵羊IgG添加到活性测定法的稀释剂中，分别有效去除了HAMA和HASA干扰，并解决了观察到的高于100％的活性比率(图38和39)。如图40所示，测定稀释液中存在10μg/ml的抗小鼠IgG或抗绵羊IgG分别不会影响总的和有活性的测定的标准曲线。
实施例9：嵌合抗FGF21抗体
将抗体mAb4，mAb9，mAb11和mAb15移植到具有K149C突变的人IgG1框架上，以生成具有小鼠VH和VL区以及具有K149C突变的人恒定区的小鼠/人嵌合抗FGF21抗体。下表16-19以及图41A和41B中提供了嵌合抗体的氨基酸序列。
表格16
表格17
表格18
表格19
除了所描绘和要求保护的各种实施方案之外，所公开的主题还针对具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施方案。这样，本文所呈现的特定特征可以在所公开的主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。为了说明和描述的目的，已经给出了所公开的主题的特定实施方案的前述描述。并不旨在穷举所公开的主题或将所公开的主题限制于所公开的那些实施方案。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不违背所公开主题的精神或范围的情况下，可以在所公开主题的组成和方法进行各种修改和变化。因此，意图是所公开的主题包括在所附权利要求及其等同方案的范围内的修改和变型。
本文引用了各种出版物，专利和专利申请，其内容通过引用以其整体并入本文。
Claims (89)
1.确定样品中总FGF21蛋白的量的免疫测定方法，其包括：
(a)使捕获抗体与所述样品接触以生成样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；
(b)使所述样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触，所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的结合；
(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述检测抗体，并
(d)基于结合的所述检测抗体的水平计算所述样品中存在的总FGF21蛋白的量。
2.权利要求1所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体和所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
3.确定样品中有活性的FGF21蛋白的量的免疫测定方法，其包括：
(a)使捕获抗体与所述样品接触以生成样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；
(b)使所述样品-捕获抗体组合材料与检测抗体接触，所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的结合；
(c)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述检测抗体，并
(d)基于结合的所述检测抗体的水平计算所述样品中存在的有活性的FGF21蛋白的量。
4.用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的免疫测定方法，其包括：
(a)(i)使第一捕获抗体与所述样品接触以生成第一样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；(ii)使所述第一样品-捕获抗体组合材料与第一检测抗体接触，所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位的结合；(iii)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述第一检测抗体；并(iv)基于结合的所述第一检测抗体的水平计算所述样品中存在的总FGF21蛋白的量；
(b)(i)使第二捕获抗体与所述样品接触以生成第二样品-捕获抗体组合材料，所述捕获抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；(ii)使所述第二样品-捕获抗体组合材料与第二检测抗体接触，所述第二检测抗体与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位的结合；(iii)检测结合至所述样品-捕获抗体组合材料的所述第二检测抗体；并(iv)基于结合的所述第二检测抗体的水平计算所述样品中存在的有活性的FGF21蛋白的量；和
(c)将通过步骤(a)确定的所述总FGF21蛋白的量与通过步骤(b)确定的有活性的FGF21蛋白的量进行比较，以确定所述样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例。
5.权利要求4所述的免疫测定方法，其中所述第一捕获抗体和所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
6.权利要求4所述的免疫测定方法，其中所述第一捕获抗体和所述第二捕获抗体是相同的抗体。
7.权利要求1-6中任一项所述的免疫测定方法，其中所述免疫测定是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
8.权利要求1-7中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个被固定化在顺磁珠上。
9.权利要求1-8中任一项所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体、第一检测抗体和第二检测抗体中的一个或更多个与生物素缀合。
10.权利要求1-9中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
11.权利要求1和4-9中任一项所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
12.权利要求1-11中任一项所述的免疫测定方法，其中所述样品是血液样品。
13.权利要求1-11中任一项所述的免疫测定方法，其中所述样品是血浆样品。
14.权利要求1-13中任一项所述的免疫测定方法，其中所述方法以约2pg/ml至约20pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
15.权利要求1-13中任一项所述的免疫测定方法，其中所述免疫测定方法是使用单分子检测仪器进行的。
16.权利要求15所述的免疫测定方法，其中所述单分子检测仪器是Quanterix SimoaHD-1 AnalyzerTM。
17.权利要求15或16所述的免疫测定方法，其中所述方法以约0.2pg/ml至约0.5pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
18.权利要求1-17中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26和27组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:30和31组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
19.权利要求1-17中任一项所述的免疫测定，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:54、55、74和75组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:50、51、70和71组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
20.权利要求1-17中任一项所述的免疫测定，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:22、23、66和67组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:18、19、62和63组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
21.权利要求1和4-17中任一项所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:32和33组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:44和45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
22.权利要求1和4-17中任一项所述的免疫测定，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:56、57、72和73组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:52、53、68和69组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
23.权利要求1和4-17中任一项所述的免疫测定，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:24、25、64和65组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:20、21、60和61组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
24.权利要求18所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列及其保守置换。
25.权利要求24所述的免疫测定，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列及其保守置换。
26.权利要求25所述的免疫测定，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列及其保守置换。
27.权利要求21所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列及其保守置换。
28.权利要求27所述的免疫测定，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列及其保守置换。
29.权利要求28所述的免疫测定，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列及其保守置换。
30.权利要求1-17中任一项所述的免疫测定方法，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个竞争性地与包含以下的抗体结合：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26和27组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:30和31组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
31.权利要求1和4-17中任一项所述的免疫测定方法，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个竞争性地与包含以下的抗体结合：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:32和33组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:44和45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
32.用于检测样品中总FGF21蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)捕获抗体或其抗原结合部分，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；
(b)检测抗体或其抗原结合部分，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；和
(c)检测剂。
33.权利要求32所述的试剂盒，其中所述捕获抗体和所述检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
34.用于检测样品中有活性的FGF21蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)捕获抗体或其抗原结合部分，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；
(b)检测抗体或其抗原结合部分，其与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位结合；和
(c)检测剂。
35.用于确定样品中有活性的FGF21蛋白与总FGF21蛋白的比例的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)(i)第一捕获抗体或其抗原结合部分，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合，以及(ii)第一检测抗体或其抗原结合部分，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合；
(b)(i)第二捕获抗体或其抗原结合部分，其与FGF21的氨基酸残基5-172内存在的表位结合，以及(ii)第二检测抗体或其抗原结合部分，其与FGF21的氨基酸残基173-182内存在的表位结合；和
(C)一个或更多个检测剂。
36.权利要求35所述的试剂盒，其中所述第一捕获抗体和所述第二捕获抗体是相同的抗体。
37.权利要求35所述的试剂盒，其中所述第一捕获抗体和所述第一检测抗体与FGF21的氨基酸残基5-172内的不同表位结合。
38.权利要求32-37中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个固定化在顺磁珠上。
39.权利要求32-38中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体、第一检测抗体和第二检测抗体中的一个或更多个与生物素缀合。
40.权利要求32-39中任一项所述的试剂盒，其中所述检测剂选自链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖缀合物，链霉亲和素-辣根过氧化物酶缀合物及其组合。
41.权利要求40所述的试剂盒，其进一步包含试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷、四甲基联苯胺、过氧化氢或其组合。
42.权利要求32-41中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
43.权利要求32和35-42中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个以约10-10M至10-13M的Kd与FGF21结合。
44.权利要求32和35-43中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体或第一检测抗体具有约1μg/ml至约1μg/ml的浓度。
45.权利要求33-42中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体或第二检测抗体中的一个或更多个具有约0.1μg/ml至约3μg/ml的浓度。
46.权利要求40所述的试剂盒，其中所述链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖缀合物具有约100pM至约400pM的浓度。
47.权利要求32-46中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26和27组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:30和31组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
48.权利要求32-46中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:54、55、74和75组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:50、51、70和71组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
49.权利要求32-46中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:22、23、66和67组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:18、19、62和63组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
50.权利要求32和35-46中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:32和33组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:44和45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
51.权利要求32和35-46中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:56、57、72和73组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含选自由SEQ ID NO:52、53、68和69组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
52.权利要求32和35-46中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含选自由SEQ ID NO:24、25、64和65组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含选自由SEQ ID NO:20、21、60和61组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
53.权利要求47所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列及其保守置换。
54.权利要求53所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列及其保守置换。
55.权利要求54所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列及其保守置换。
56.权利要求50所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列及其保守置换。
57.权利要求56所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列及其保守置换。
58.权利要求57所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列及其保守置换。
59.权利要求32-46中任一项所述的试剂盒，其中所述捕获抗体、第一捕获抗体和第二捕获抗体中的一个或更多个竞争性地与包含以下的抗体结合：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26和27组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:30和31组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38和39组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42和43组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46和47组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
60.权利要求32和35-46中任一项所述的试剂盒，其中所述检测抗体和第一检测抗体中的一个或更多个竞争性地与包含以下的抗体结合：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:28和29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:32和33组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:36和37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:40和41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:44和45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:48和49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
61.权利要求32-60中任一项所述的试剂盒，其中所述样品是血液样品。
62.权利要求32-60中任一项所述的试剂盒，其中所述样品是血浆样品。
63.权利要求32-62中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒以约0.2pg/ml至约0.5pg/ml的孔内灵敏度检测所述样品中总的或有活性的FGF21蛋白的量。
64.分离的抗FGF21抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)重链可变区CDR1，其包含选自由SEQ ID NO:26-29组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:30-33组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:34-37组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含选自由SEQ ID NO:38-41组成的组的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含选自由SEQ ID NO:42-45组成的组的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含选自由SEQ ID NO:46-49组成的组的氨基酸序列及其保守置换。
65.权利要求64所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列及其保守置换。
66.权利要求64所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列及其保守置换。
67.权利要求64所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列及其保守置换。
68.权利要求64所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区CDR1，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列及其保守置换；
(b)重链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列及其保守置换；
(c)重链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列及其保守置换；
(d)轻链可变区CDR1结构域，其包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列及其保守置换；
(e)轻链可变区CDR2结构域，其包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列及其保守置换；和
(f)轻链可变区CDR3结构域，其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列及其保守置换。
69.权利要求65所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列及其保守置换。
70.权利要求66所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列及其保守置换。
71.权利要求67所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列及其保守置换。
72.权利要求68所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列及其保守置换。
73.权利要求65所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列及其保守置换。
74.权利要求66所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列及其保守置换。
75.权利要求67所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列及其保守置换。
76.权利要求68所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链可变区，其包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链可变区，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列及其保守置换。
77.权利要求69所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列及其保守置换。
78.权利要求70所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列及其保守置换。
79.权利要求71所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列及其保守置换。
80.权利要求72所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列及其保守置换。
81.权利要求73所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列及其保守置换。
82.权利要求74所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列及其保守置换。
83.权利要求75所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列及其保守置换。
84.权利要求76所述的分离的抗体，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：
(a)重链，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列及其保守置换；和
(b)轻链，其包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列及其保守置换。
85.分离的核酸，其编码权利要求64-84中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
86.宿主细胞，其包含权利要求85所述的核酸。
87.产生抗体的方法，其包括培养权利要求86的宿主细胞，从而产生所述抗体。
88.权利要求87所述的方法，其进一步包括从所述宿主细胞回收所述抗体。
89.组合物，其包含权利要求64-84中任一项所述的一个或更多个抗体或其抗原结合部分。
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