CN101241137A - 一种猪囊虫病金标快速诊断试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测猪囊虫病(Cysticercosis)的快速诊断试剂以及这种快速诊断试剂的制备方法。本发明的这种诊断试剂是一种胶体金检测试纸条。本发明所用的猪囊虫抗原采用了人工克隆制备的猪带绦虫重组抗原，所用的抗猪囊虫免疫球蛋白是用人工克隆制备的猪带绦虫重组抗原免疫动物获得。

Description

一种猪囊虫病金标快速诊断试剂

技术领域

本发明涉及一种用于检测猪囊虫病(Cysticercosis)的快速诊断试剂以及这种快速诊断试剂的制备方法。本发明的这种诊断试剂是一种胶体金检测试纸条。

背景技术

猪囊虫病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫一猪囊尾蚴(Cysticercosis cellulosae)寄生于人或猪、野猪等中间宿主而引起的一种食源性人兽共患寄生虫病。该病在世界范围内普遍存在，在中国大部分地区是一个重要的公共卫生问题。在我国该病被列为肉类进出口、屠宰动物以及我国政府提出让人民吃上“放心肉”必检的人兽共患病。据卫生部2004年完成的全国人体重要寄生虫病现状调查显示，全国带绦虫的平均感染率为0.28％，较1990年完成的全国人体寄生虫分布调查发现的0.18％上升了52.47％，推算全国带绦虫感染的人数为55万，其中囊虫病调查了96008人，阳性率达0.58％。囊虫寄生于人体的肌肉和各组织器官对人的健康产生危害，通常引发癫痫发作、颅压增高、精神障碍、失明等症状，如不及时治疗或治疗不当往往会使人致残甚至危及生命。另外囊虫病还制约着养猪业及肉食品加工业的发展。

目前为止，国内普遍采用宰后剖检或免疫学方法检测血清中的循环抗体来实现猪囊虫病的检疫。其中血清学检测用抗原均来源于囊液或虫体抗原，存在的突出问题是虫体的采集受到客观条件的限制(如获得途径困难，来源短缺，数量有限)，纯化抗原的制备繁琐，数量及特异性和敏感性降低，在血清学试验中常易于出现假阳性和假阴性的问题。利用基因工程重组抗原制备诊断试剂是解决囊虫病免疫诊断的一种理想途径。囊虫大分子蛋白在诊断中由于与其它绦虫有交叉反应，特异性低，因而目前主要侧重于低分子量蛋白(通常小于30ku)囊虫诊断抗原的研究，如8ku蛋白，参见Kathy Hancock，Azra Khan，Fatima B.Williams，et al.Characterization of the 8-Kilodalton Antigens of Taenia soliumMetacestodes and Evaluation of Their Use in an Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay for Serodiagnosis[J].Journal of Clinical Microbiology.2003，41(6)：2577-2586，10ku蛋白，参见Chung JY，Bahk YY，Huh S，et al.A recombinant 10kDa protein ofTaenia solium metacestodes specific to active neurocysticercosis[J].The Journal ofInfectious disease，2000，181(5)：1870-1872，14ku蛋白，参见Marcia RamosMonteiro da Silva，Augusto Mendes Maia，et al.Recombinant expression ofTaenia solium TS14 antigen and its utilization for immunodiagnosis ofneurocysticercosis[J].Acta Tropica，2006，100(3)：192-198，24ku蛋白，参见KathyHancock，Sowmya Pattabhi，Fatima W，et al.Characterization and cloning of T24，aTaenia solium antigen diagnostic for cysticercosis[J].Molecular and BiochemicalParasitology，2006，147(1)：109-117等。

囊虫病的生前诊断很困难，现有的免疫学诊断方法如间接血凝试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶联免疫印渍(ELIB)等方法在操作程序上和适应性方面存在一定的不足，如ELISA检测对检测设备、环境条件、操作技能要求较高，同时还受检测周期长、小批量检测成本高等因素的限制，目前还难于在生猪屠宰企业中推广应用。为此，寻找一种简便、快速、准确、可实施现场操作的检测方法，是有效实施畜产品安全监管和确保这些法律法规实施的一个重要技术保障。

胶体金免疫层析技术是近十多年来迅速发展的一种将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合在一起的一种新型体外诊断技术。它具有简单快速、结果明确、无需复杂操作技巧和特殊设备等优点，并有“浓缩的ELISA”之称，已成为临床及检疫诊断领域发展的一个新方向。该技术是在免疫渗滤技术基础上建立而成，它只是将原来的纵向渗滤作用改为横向层析作用，但正是这一改进带动了定性诊断试剂的革命。

国内应用胶体金技术检测猪囊虫病的报道主要有：张洪花等(张洪花，王昌源，葛凌云等.金标特异抗原单克隆抗体斑点免疫金染色用于检测脑囊虫病循环抗原的研究[J]中国寄生虫病防治杂志.1994，7(1)：35-37.)应用金标记猪囊虫囊液抗原，利用单克隆抗体检测脑囊虫患者脑脊液中的循环抗原，阳性率可达88.09％。刘玉冰(刘玉冰，徐宏秀，王昌源等.金标免疫渗滤法在脑囊虫病诊断中的应用[J]地方病通报.2001，16(2)：11-13.刘玉冰，张洪花，徐洪秀，等.滴金免疫测定法用于检测囊虫病患者循环抗原的研究[J].中国人兽共患病杂志.2002，18(2)：84-86.)应用抗猪囊虫囊液抗原的2株单抗，建立了金标免疫渗滤法，检测脑脊液中的循环抗原，阳性率达77.8～93.75％；后来又建立了金标免疫层析法，检测活动性脑囊虫病人血清阳性率达80.77％，非活动性脑囊虫病人血清阳性率达55％。于庭等(于庭，刘素舫，黄晶，等.快速斑点免疫金渗滤法检测血清中囊虫抗体的研究[J].中国公共卫生.2000，16(12)：1139-1140.)用金标法与酶联免疫吸附试验对比检测57份囊虫患者血清标本，2法均为阳性的54份，2法均为阴性的1份，总符合率为95％。黄炳成等(黄炳成，李桂萍，贾凤菊，等.金标抗人单抗浸测实验对脑囊虫病诊断与疗效评价的研究[J].中国寄生虫病防治杂志.2000，13(4)：273-275.)用金标抗人IgG4单抗检测活动性脑囊虫病患者80例，阳性率为91.3％；检测非活动性患者19例，2例阳性。袁建华等(袁建华，甘绍伯，陈志勇.囊虫IgG胶体金诊断试剂盒(层析法)的研制和考核[J].中国人兽共患病杂志.2001，17(6)：59-61.)在国内外率先开发成功用于囊虫病诊断的IgG金标层析法(一步法)诊断试剂盒，经临床考核其敏感性为93.23％，特异性为97.37％，该试剂盒检测包虫血清的交叉反应率为45％，与血吸虫、肝吸虫、肺吸虫等寄生病人血清无交叉反应。唐雨德等(唐雨德，周东明，陆承平.快速检测猪囊虫抗体的金免疫层析法的建立及应用[J].中国人兽共患病杂志.2003，19(5)：77-79.)建立了快速检测猪囊虫抗体的金免疫层析法，以ELISA为对照，两者检测囊虫抗体的相符率达96.8％。以上方法均提示免疫胶体金快速诊断法简便、快速、适于基层推广应用，可用于囊虫病的诊断及流行病学调查。

中国发明专利申请200610050841.9公开了一种诊断猪囊虫病斑点金标免疫渗滤试剂盒及其制备及应用方法，该专利申请是以硝酸纤维素膜为固相载体，吸附猪的待检血样，以猪囊虫抗原与胶体金结合物为液相，并同时作为探针和指示剂，当抗原与相应的抗体配体结合，金颗粒在抗体配体位点大量聚集，便形成肉眼可见的红色斑点。该专利申请的试剂盒在应用时将被检猪血样干纸浸出液或血清稀释液1μL点在硝酸纤维素膜上，加洗涤液100μL，再滴加猪囊虫抗原胶体金100μL，2-3分钟内即形成或不形成红色斑点，其结果判断较为容易，检测成本低，具有敏感、特异、检出率高，省工、省时、采血样方便等优点，适用于猪囊虫病诊断与流通市场检疫等领域应用。

但上述报道所用的诊断抗原均为囊液抗原或虫体抗原，存在的突出问题是抗原来源困难，纯化繁琐，易于出现假阳性或假阴性的问题。而制备抗猪囊虫囊液抗原的单克隆抗体，生产成本较高，而且单抗细胞株保存要求较高，易于出现丢失现象。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足的猪囊虫胶体金检测试纸条及其制备方法。

本发明的试纸条包括首尾衔接依次固定于PVC衬板材料上的用多孔纤维材料构成的加样吸水层、位于加样吸水层尾端并与加样吸水层相连的吸附有猪囊虫金标抗原的金标结合垫、与金标结合垫尾端相连由硝酸纤维素膜构成的反应垫和与反应垫尾端相连的由吸水材料构成的吸收层，其中在反应垫上分别包被有由猪囊虫抗原构成的检测区和位于检测区下游的由猪囊虫抗体构成的质控区。本发明所用的猪囊虫抗原采用了人工克隆制备的猪带绦虫重组抗原，所用的抗猪囊虫免疫球蛋白是用人工克隆制备的猪带绦虫重组抗原免疫动物获得。

在本发明的猪囊虫金标试纸条所使用的猪囊虫抗原可以为人工制备的猪带绦虫六钩蚴的TSOL18重组抗原。而这种猪带绦虫六钩蚴的TSOL18重组抗原是采用基因工程技术将源于猪带绦虫六钩蚴的18ku编码基因进行RT-PCR，将PCR产物构建到真核表达载体上得到重组质粒，将重组质粒电转化到酵母感受态细胞得到重组菌株，再将重组菌诱导表达得到重组蛋白，用此蛋白制备金标抗原和包被检测区；应用基因工程技术将源于猪带绦虫六钩蚴的18ku基因进行PCR，再将PCR产物克隆到表达载体构建原核表达载体，经诱导表达后得到融合蛋白，用融合蛋白免疫动物，提取免疫动物的血清，从中分离得到抗融合蛋白抗体，用此多克隆抗体包被质控区。

在本发明的实施例中，所用的猪囊虫抗原是将源于猪带绦虫六钩蚴的18ku基因进行RT-PCR，所得产物构建真核表达载体pPIC9K-TSOL18，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，经诱导表达得到的重组蛋白；并应用基因工程技术将源于猪带绦虫六钩蚴的18ku基因进行PCR，再将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达载体pGEX-TSOL18/BL21，经诱导表达后得到融合蛋白，用融合蛋白免疫动物，提取免疫动物的血清，从中分离得到抗融合蛋白抗体，用此多克隆抗体包被质控区。

本发明的猪囊虫金标试纸条上还可以在加样吸水层设置有全血过滤装置。

本发明的猪囊虫金标试纸条制备方法是：

a.收集猪带绦虫虫卵，用化学法孵化和激活后，提取六钩蚴总RNA，经RT-PCR扩增TSOL18编码基因，并根据TSOL18基因的核酸序列设计并合成表达引物；

b.回收步骤a的PCR扩增产物；将回收的PCR扩增产物用限制性内切酶进行双酶切，将PCR产物构建到真核表达载体上得到重组质粒，将重组质粒电转化到酵母感受态细胞，得到重组菌株，再将重组菌诱导表达得到重组抗原蛋白；

c.回收a步骤所得PCR产物，再将PCR产物克隆到表达载体构建原核表达载体，诱导表达后得到融合蛋白，用融合蛋白免疫动物，提取免疫动物的血清，从中分离得到抗融合蛋白多克隆抗体；

d.制备胶体金，再用所制备的胶体金和由b所得重组抗原制备出金标抗原；

e.将d所得的金标重组抗原充分吸附于多孔吸水材料中，得到金标结合垫；

f.在硝酸纤维素膜的反应垫上分别设定由b所得重组抗原包被的检测区和由c步骤所得多克隆抗体包被的质控区，并按设计要求使反应垫上的检测区与质控区之间留有一段空白的区域；

g.将吸水材料、金标结合垫、硝酸纤维素膜反应垫和另一段吸水材料依次固定于不透水材料的衬底上，使各材料间保持首尾衔接，并使反应垫上的检测区位于加样侧，按设计要求将固定好的衬底切成所需的条状物，得到所述的猪囊虫金标试纸条。

本发明给出的实施例中，猪囊虫金标试纸条制备方法是：

a.以猪带绦虫六钩蚴的总RNA为模板，以上游引物R：5′TCT CTC CGAAAC AAT GAG TTA 3′和下游引物F：5′TAA TAG ATA CCC ATT TTC ATCACA 3′进行RT-PCR，所得产物纯化回收；

b.以a所得猪带绦虫六钩蚴TSOL18构建克隆载体pGEX-TSOL18；

c.以pGEX-TSOL18质粒为模板，以

上游引物P1：5’CGAGAATTCGACATTTTCGTTCCATACCTT3’

                   EcoRI

下游引物P2：5’TAGCGGCCGCTCACTACGATCTTCGGACCTTC3’

                   NotI

进行PCR扩增，所得产物纯化回收；

d.取C步骤所得纯化产物与pPIC9K载体质粒分别用EcoRI/NotI双酶切，再用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收后连接，连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞，得到pPIC9K-TSOL18质粒，再用Sal I单酶切线性化，电转化毕赤酵母感受态细胞，得到重组多拷贝菌株pPIC9K-TSOL18/GS115；

e.将pPIC9K-TSOL18/GS115在发酵罐中进行连续培养，得到TSOL18重组蛋白；

f.用b步骤所得pGEX-TSOL18为模板，扩增TSOL18编码基因，构建原核表达载体pGEX-TSOL18/BL21，经诱导表达后收集菌体，纯化后免疫兔，采集并分离免疫兔血清，纯化得到兔抗TSOL18-GST多克隆抗体的IgG；

g.制备胶体金，再用所制备的胶体金和由e所得重组抗原制备出金标抗原；

h.将g所得的金标重组抗原充分吸附于多孔吸水材料中，得到金标结合垫；

i.在硝酸纤维素膜的反应垫上分别设置由e所得重组抗原包被的检测区和由f步骤所得多克隆抗体包被的质控区，并按设计要求使反应垫上的检测区与质控区之间留有一段空白的区域；

j.将吸水材料、金标结合垫、硝酸纤维素膜反应垫和另一段吸水材料依次固定于不透水材料的衬底上，使各材料间保持首尾衔接，并使反应垫上的检测区位于加样侧，按设计要求将固定好的衬底切成所需的条状物，得到所述的猪囊虫金标试纸条。

本发明的猪囊虫金标试纸条制备方法还可在加样吸水层上还设置全血过滤装置。

本发明相比现有技术具有以下优点：

1本发明采用人工克隆制备重组囊虫抗原，解决了现有技术中抗原来源困难，纯化繁琐，易于出现假阳性或假阴性的问题，采用人工克隆制备囊虫抗原不但来源容易、成本低廉，还可发酵批量生产，质量易于控制。特别是本发明利用的猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组抗原制备检测盒，其抗原不仅具有成分单一、特异性较强、成本低廉以及可在实验室内大量制备等优点，并且可以方便地解决抗原来源的问题。

2在本发明的具体实施例中，构建了真核表达载体pPIC9K-TSOL18/GS115，实现了表达蛋白的糖基化修饰，获得了具有天然蛋白特性的重组蛋白TSOL18，且具有良好的免疫活性。在发酵罐水平可以高效表达，每升发酵液可获得TSOL18重组蛋白量为2.54g/L；经SephacrylS-300HR纯化后，获得大小约16ku的单一条带，薄层扫描分析纯度超过90％。这种具有天然蛋白特性、能大批量生产的TSOL18在用于制备检测猪囊虫检测试纸或其它的检测装置中均具有良好的应用前景和推广价值。

3本发明所制备的用于免疫动物的重组抗原较TSOL18分子量大，因此具有更好的免疫原性，在免疫家兔后易得到高效价的兔抗TSOL18-GST多克隆抗体。

4国内目前未见有应用TSOL18作为诊断抗原检测猪囊虫病的报道。有报道的重组蛋白均来自于猪带绦虫囊尾蚴阶段，而且采用大肠杆菌表达系统不能糖基化，影响了重组蛋白的抗原活性，且融合蛋白的载体部分易产生交叉反应，造成假阳性。选择真核表达系统则可克服现有技术的缺点。

5本发明的金标试纸条检测猪囊虫病时采用一步法，具有较高的特异性和敏感性，其检测快速，结果判定在10-15min中内完成，无需专门的实验设施、实验条件和专门的操作人员。

6本发明的试纸条制备方法具有制作简便，稳定性、重复性好的特点。特别是本发明的试纸条上设置有全血过滤装置，可以极大地现场方便使用。

附图说明

图1为本发明的工艺路线图

图2为本发明的结构示意图，其中：1为手持端吸水滤纸层，2为NC膜反应垫层，3为金标重组抗原垫层，4为测试端玻璃纤维吸水层，5为质控线，6为检测线，7为PVC衬板。

图3为本发明的结果判定示意图，其中：+表示猪标准阳性血清反应结果；±表示可疑猪血清样品反应结果；-表示猪标准阴性血清反应结果；失效是指质控区无任何显示，这种情况下试纸条失效，不能用于检测。

图4为真核表达载体pPIC9K-TSOL18/GS115的构建图。

图5为TSOL18基因PCR扩增图，图中：1为DL2000核酸Marker；2为RT-PCR获得的TSOL18基因。

图6为重组表达质粒pPIC9K-TSOL18酶切鉴定及PCR分析，其中：1为TSOL18的PCR产物；2为EcoRI和NotI双酶切pPIC9K-TSOL18的PCR产物；3为DL2000核酸Marker。

图7为重组菌株的PCR鉴定，其中：1为pPIC9K-TSOL18/GS115重组菌的PCR产物；2为DL2000核酸Marker。

图8为TSOL18表达蛋白及纯化后的SDS-PAGE电泳图，图中：M是低分子量蛋白标准；1是5L发酵罐中甲醇诱导72h的表达产物TSOL18；2是SephacrylS-300HR柱层析纯化后的TSOL18蛋白。

图9为TSOL18-GST的表达产物及纯化SDS-PAGE电泳图，图中：M为蛋白分子量标准；1为亲和纯化的TSOL18-GST融合蛋白；2为诱导后菌体裂解上清；3为诱导后菌体裂解沉淀。

图10为纯化兔抗TSOL18-GST IgG SDS-PAGE电泳图，其中：M是低分子量蛋白标准；1是纯化的兔抗TSOL18-GST蛋白的IgG。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步详述：

实施例一(重组诊断抗原制备实施例)

猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因的克隆及其真核表达载体pPIC9K-TSOL18/GS115的构建

1猪带绦虫六钩蚴TSOL18基因的克隆

1.1PCR引物的设计与合成

根据GeneBank上登录的猪带绦虫六钩蚴TSOL18核苷酸序列(AF017788)，用DNAStar软件设计一对引物R和F。上游引物R从编码区起始密码子开始，下游引物F为3′端非编码区序列。上、下游引物之间所扩增片段包括TSOL18基因的完整阅读框架。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

上游引物R：5′TCT CTC CGA AAC AAT GAG TTA 3′

下游引物F：5′TAA TAG ATA CCC ATT TTC ATC ACA 3′

1.2猪带绦虫六钩蚴TSOL18编码基因的扩增与回收

收集猪带绦虫虫卵，用化学法孵化和激活后，经Trizol法提取六钩蚴总RNA，经RT-PCR反转录扩增TSOL18基因。

RT-PCR扩增体系为：Total RNA悬液10μl，OligodT引物1μl，混匀后85℃预变性5min，迅速置于冰浴5min。然后加入5×反转录酶缓冲液4μl，RNasin(50u/μl)0.5μl，2.5mM dNTP Mixture 1μl，反转录酶(AMV)(10u/ul)1μl，灭菌DEPC水加至20μl，混匀后，42℃水浴反应1h，之后95℃5min灭活反转录酶。

双链cDNAPCR扩增体系为：反转录产物10μl，10×PCR buffer(Mg²⁺free)5μl，2.5mM dNTP Mixture 2μl，上、下游引物(50pmol/μl)各1μl，25mM MgCl₂3μl，灭菌双蒸水加至50μl。PCR反应条件为：95℃预变性5min后，加入1μl(5U/μl)TaqDNA聚合酶，进行30个循环(94℃1min，55℃30s，72℃5min)，最后72℃延伸5min。扩增完成后，取PCR产物5μl用1.2％琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴化乙锭，EB)电泳分析，扩增到一条大小约393bp的TSOL18基因片段(图5)；PCR产物经DNA凝胶快速回收试剂盒纯化回收。

2猪带绦虫六钩蚴TSOL18克隆载体pGEX-TSOL18的构建

取pGEM-T easy克隆载体(购自Promega公司)1μl(5μg/μl)与胶回收纯化目的片段3μL混合后，加入2×rapid ligase buffer 5μl，T₄DNA连接酶1μl(3u/μl)，混匀后置4℃过夜连接；转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆子，碱裂解法小量提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳、PCR扩增及限制性内切酶酶切鉴定后，证实其大小与预期相符，经上海晶泰生物技术公司测序证实该片段无碱基错配。用DNAstar软件对序列进行分析，并与已发表的序列进行同源性比较，证实同源性为99.45％。

3猪带绦虫六钩蚴TSOL18真核表达载体pPIC9K-TSOL18/GS115的构建

3.1表达引物的设计与合成

根据已测序TSOL18基因的核酸序列，用DNA Star软件在其阅读框外侧设计表达引物，除去位于5′末端的51bp的信号肽序列(这样做即不会对编码蛋白的结构及功能有太大的影响，还可在一定程度上增加可溶性表达)，并按照毕赤酵母密码子的偏爱性(参见赵翔，霍克克，李育阳.毕赤酵母的密码用法分析.生物工程学报，2000，16(3)：308-311)，在不改变其氨基酸序列的前提下，将低利用率密码子GAT、GTG同义突变为高利用率密码子GAC和GTT，表达引物5′端分别加入EcoRI和NotI酶切位点及6个保护性碱基。上下游引物之间所扩增片段为342bp。引物由宝生物(大连)工程公司合成。

TSOL18基因

上游引物P1：5’CGAGAATTCGACATTTTCGTTCCATACCTT3’

                  EcoRI

下游引物P2：5’TAGCGGCCGCTCACTACGATCTTCGGACCTTC3’

                  NotI

pPIC9K质粒载体引物：

5′AOX 1，5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′

3′AOX 1，5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′

pPIC9K质粒载体引物用以重组多拷贝菌株基因组DNA为模板进行PCR扩增，来证明TSOL18基因是否整合到了GS115染色体DNA中。

3.2表达载体pPIC9K-TSOL18/GS115的构建

以测序正确的pGEX-TSOL18质粒为模板，用带酶切位点的P1、P2为引物扩增TSOL18片段。PCR扩增体系50μL，内含模板1μL，10×PCR buffer 5μL，P1、P2引物(20μM)各0.5μL，Taq酶1ul，2.5mMdNTP 4μL，25mM MgCl₂4μL，灭菌双蒸水加至50μL。扩增条件：95℃预变性，5min；35个循环(94℃，50s；56℃，40s；72℃，1min)；再72℃延伸10min。扩增完成后，取PCR产物5μL用1.0％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测，获得342bp的特异性DNA片段；PCR产物经DNA凝胶快速回收试剂盒纯化回收。

将PCR纯化产物和pPIC9K载体质粒分别用EcoRI/NotI双酶切，用AgaroseGel DNA Extraction Kit回收后连接，连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞(CaCl₂法制备)。连接体系：酶切目的片段7μL、酶切载体1μL，10×Ligationbuffer 1μL、T₄DNA(3u/μL)连接酶1μL，混匀置16℃连接12h，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性克隆子，碱裂解法小量提取质粒。重组质粒pPIC9K-TSOL18经PCR扩增及限制性内切酶EcoR I/Xho I双酶切鉴定后，出现342bp的特异性条带，与预期的目的片段的大小相符(图6)。经酶切鉴定为阳性的重组菌株送大连宝生物工程有限公司测序，结果与预期完全吻合。将pPIC9K-TSOL18用Sal I单酶切线性化，电转化毕赤酵母感受态细胞，在MD培养基上生长的菌落为His⁺转化子，影印法逐级筛选G418抗性菌株即目的基因高拷贝重组菌株。

以重组多拷贝菌株基因组DNA为模板，对整合到毕赤酵母GS115染色体DNA中的TSOL18基因进行PCR扩增，PCR扩增体系：10×buffer 2.5μL、5′AOX1引物(50pmol/μL)0.5μL、3′AOX1引物(50pmol/μL)0.5μL、基因组DNA模板2.5μL、Taq酶0.5μL、dNTP 2μL、灭菌水补体积至25μL；扩增条件：95℃预变性，5min；35个循环(94℃1min、55℃1min、72℃1min)；再72℃延伸10min。扩增结束，取5μL反应液用琼脂糖凝胶电泳得到834bp大小的特异片段(空白菌株应为492bp)，表明转化子基因组中确实整合有TSOL18基因(图7)，表达载体pPIC9K-TSOL18/GS115的构建过程见图4。

4猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组蛋白的诱导表达与纯化

4.1TSOL18重组蛋白的诱导表达

重组酵母pPIC9K-TSOL18/GS115在5L发酵罐中进行连续培养，工作体积3L，培养过程如下：

挑种子培养物的单克隆接种于20mL的YPD培养基中，28℃摇床培养24h后转接种于200mLYPD培养基中继续培养18h左右，增菌达到2～5个OD₆₀₀单位时，再转接种于5L发酵罐内。培养过程中由电脑控制各物质含量，氧含量不低于50％，pH值5.0。整个发酵过程中控制甲醇浓度为：诱导的前2～4h甲醇流加量为3mL/L/h，诱导的前4～8h甲醇流加量为6mL/L/h，诱导8h后甲醇流加量为9mL/L/h，共诱导约72h。诱导结束后10000r/min离心30min取上清经SDS-PAGE分析，结果显示菌液的上清中含有大小约16ku的表达产物(图8)。将菌液上清浓缩冻干，注明批号，4℃保存备用。每批次发酵可获得重组蛋白2.54g/L。如此实现了重组蛋白的可溶性高效表达，为后续的蛋白纯化工艺奠定了基础。

4.2TSOL18重组蛋白的纯化

将预处理的SephacrylS-300(聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶S-300)装柱后，再用0.01MPBS(pH7.2)缓冲液充分平衡至电导率、紫外吸收基线、pH均稳定。取重组菌株诱导表达后的产物0.5mL(约含蛋白含量25mg)，用同样的缓冲液洗脱，流速为0.7mL/min，压力0.2Mpa，收集峰样品。利用紫外分光光度计测定蛋白含量，校正公式如下：

蛋白含量(mg/mL)＝(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数

经SDS-PAGE分析蛋白的纯度，结果表明纯化后的目的蛋白呈现单一条带(图8)，且蛋白回收量较大，每1000mL培养物上清可得到纯化蛋白约为0.854g。

实施例二(兔抗TSOL18-GST IgG的制备及纯化实施例)

1.TSOL18-GST融合蛋白的制备

目的蛋白TSOL18编码基因的克隆及克隆载体pGEX-TSOL18的构建同实施例一，其所用的表达载体引物设计为：

P3：5’ccggaattcagcggtgaccgtacattcgg3’

          EcoRI

P4：5’ccgctccgagctacgaacggcggaccttcttgt3’

          XhoI

将TSOL18目的基因克隆到表达载体pPGEX-4T-1，构建原核表达载体pPGEX-TSOL 18/BL21。经0.1mmol/L的IPTG于28℃诱导表达6h后收集菌液；超声破菌上清再经GST-FF亲和柱纯化后，得到高纯度、分子量约38ku的TSOL18-GST融合蛋白(图9)；该蛋白相比较TSOL18分子量较大，具有更好的免疫原性，免疫家兔后易得到高效价的兔抗TSOL18-GST多克隆抗体，该多抗将用于质控线的制备。

2兔抗TSOL18-GST融合蛋白多克隆抗体的制备

选择健康青年雌性青紫蓝兔10只，体重约3kg/只。将纯化的同一批次TSOL18-GST重组抗原依抗原剂量二倍递增法分别与弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂配伍，制成疫苗常规免疫家兔，免疫间隔为3周，于最后1次免疫后10d进行琼脂双扩散试验，效价达1∶32-1∶64即可心脏采血，分离血清。

3兔抗TSOL18-GST融合蛋白IgG的纯化

高免血清IgG的提纯采用饱和硫酸铵沉淀法和Sephacryl S-300HR凝胶层析法相结合进行纯化。具体操作如下：

取高免血清10mL，经50％及33％饱和硫酸铵逐次沉淀初步提纯后，再采用Sephacryl S-300HR凝胶层析法进一步纯化兔高免血清IgG。SDS-PAGE分析在分子质量略小于66ku处仅有一条带，应为γ球蛋白，即纯化IgG条带。经薄层扫描其纯度达90％以上，说明IgG纯度满足试纸条制备的要求(图10)。该抗体用于包被硝酸纤维素膜上的质控线。

实施例三(试纸条/卡组装制备例)

猪囊虫病金标快速诊断试剂组装及制备方法

1试剂的组装

参照图2，猪囊虫病金标快速诊断试剂的组装是在PVC衬板(7)的两端分别粘贴手持端吸水层(1)的滤纸和测试端吸水层(4)的玻璃纤维，并在其中段粘贴硝酸纤维素膜制成NC膜反应垫层(2)，在测试端玻璃纤维吸水层(4)与NC膜反应垫层(2)之间夹贴金标重组抗原垫层(3)的玻璃纤维，其4/5部分夹在测试端吸水层(4)，1/5部分压在反应垫层(2)的NC膜上，然后在手持端吸水层(1)与NC膜反应垫层(2)之间附上不干胶的彩色手柄纸，在测试端玻璃纤维吸水层(4)与NC膜反应垫层(2)之间附上不干胶的MAX线胶条固定，经斩切机切成3mm宽的条带，或制作成卡式盒，置干燥筒中存放于4℃。

所述的金标重组抗原垫层(3)的制备包括：i胶体金的制备，在浓度为0.01％-0.03％的氯金酸中加入其体积的0.6％、浓度为1％的柠檬酸三钠，煮沸5-10min，还原成20-40nm的胶体金原子液，调pH值8.0-8.2；ii TSOL18重组抗原的胶体金标记，在100mL胶体金溶液中加入1.0mg TSOL18重组抗原，再在上述胶体金溶液中加入终浓度为0.05％的PEG20000溶液，最后2000rpm离心10min去沉淀，取上清再经10000rpm离心1h得沉淀物，将沉淀物按8mL/100mL溶于0.02M、pH7.4Tris-HCl溶液得抗原胶体金溶液：其中含0.25％牛血清白蛋白、0.02％的叠氮钠；iii将金标TSOL18重组抗原用点膜机均匀浸入玻璃纤维，然后在37℃下干燥得到金标重组抗原垫层(3)。

所述NC膜反应垫层(2)的制备是用点膜机将浓度为2mg/mL TSOL18重组蛋白和兔抗TSOL18-GST IgG喷在硝酸纤维素膜上形成检测区(6)和质控区(5)，检测区与质控区之间相距为5mm；再用0.01M pH7.0PBS液含10％小牛血清封闭30min，漂洗、干燥得NC膜反应垫层(2)。

经以上所述制备的试纸条上还可在加样吸水层上还设置全血过滤装置，其具体的做法可参见。

本发明的试纸条的使用方法如下：

1血清样品的准备

自猪颈静脉采血，置37℃温育30min后，于4℃放置2h，使血清充分析出。将待检猪血清经3000rpm离心15min，尽量避免残留血细胞和溶血现象。用于生猪屠宰检验时可在屠宰时直接采血并分离血清。如果所用的试纸条上设有全血过滤装置，可以直接检测全血。

2操作方法

将试纸条(卡)取出平放于桌面；取50μL待检血清用样品稀释液(0.02M PB，pH7.4)作2倍稀释后，用滴管缓慢加入胶体金试纸条的加样孔上，10-15min观察结果。

3结果判定

如图3所示，检测区、质控区均出现红色条带者为阳性结果；检测区无条带、质控区出现红色条带者为阴性结果；质控区均未出现红色条带者为无效结果。

实施例四(猪血清样品的检测)

本实施例中试纸条的检测方法按照实施例三所述操作步骤进行，其中特异性试验、敏感性试验和灵敏度试验均以全囊虫ELISA检测方法作为对照进行各项指标的评价。其检测结果见表1、表2和表3。

攻虫试验内容：选择健康的3月龄长白仔猪，每头猪一次性经口感染20000枚猪带绦虫成熟虫卵，90天后逐渐发育为成熟的囊虫(囊尾蚴)。在攻虫感染后不同时间剖杀，计数每头猪的虫体数，同时采血、分离血清，用试纸条检测其阴、阳性。其中3头猪在攻虫感染后1.5年剖检；7头猪在攻虫感染后90天剖检；6头在攻虫感染后70天剖检。所有感染猪剖检后，均检出了不同数量有活力的虫体，部分猪的虫体已发生钙化。

攻虫试验猪血清以宰后剖检计数法和全囊虫ELISA检测方法作为对照进行符合率评价。其检测结果见表4。

表1试纸条的特异性及敏感性试验结果

血清标本	数量(份)	阳性率
				试纸条	ELISA
		猪囊虫阳性血清猪弓形虫阳性血清猪细颈囊尾蚴阳性血清猪阴性血清	2021220			15/200/24/123/20	19/200/22/121/20

表2试纸条与ELISA检测的灵敏度结果

血清稀释度		1∶1	1∶2	1∶4	1∶8	1∶16	1∶32	1∶64	阴性对照(1∶2)
										阳性	ELISA	未测	+	+	+	+	+	-
试纸条	+	+	+	+	+	-	-	-
									备注		阳性样本OD450：1∶2，1.012±0.327；1∶4，0.893±0.326；1∶8，0.709±0.349；1∶16，0.555±0.362；1∶32，0.409士0.291；1∶64，0.262±0.121；阴性对照：0.168

表3试纸条的稳定性试验结果

检测时间(d)	1	3	5	7	11	13	15	30	60	90	120	150
													4℃  阳性样品(15份)阴性样品(10份)	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-
室温  阳性样品(15份)阴性样品(10份)	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	5+10-	//	//
													37℃  阳性样品(15份)阴性样品(10份)	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	15+10-	//
备注	4℃保存至180天时，检测线和质控线均清晰，金释放完全，层析速度快；室温保存至60天时，金释放速度开始减慢，但层析速度良好；37℃保存至120天时，质控线模糊，金释放缓慢，层析速度良好。

表4试纸条检测攻虫试验猪血清的结果

序号	0541	0542	0543	0771	0772	0773	0774	0775	0776	0779
											攻虫时间(月)	18	24	30	3	3	3	3	3	3	3
检虫数(个)	2587	2032	1685	1405	0	11	732	30	763	873
											ELISA(OD492)	1.100	1.264	0.946	1.050	0.855	1.095	1.182	1.308	1.049	1.737
试纸条	+	+	+	±	-	+	+	+	+	+
											序号	0726	0727	0728	0732	0762	0763	标准阴性对照1		标准阴性对照2
攻虫时间(月)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	/		/
											检虫数(个)	805	339	47	4	25	290	0		0
ELISA(OD492)	1.103	0.653	1.073	0.507	0.906	0.842	0.224		0.220
											试纸条	±	+	+		+	+	-		-

表1特异性及敏感性试验结果，该试纸条与ELISA测定54头份猪血清的阳性符合率为78.9％(15/19)，阴性符合率为89.5％(17/19)，总符合率为85.0％(17/20)。但均与猪细颈囊尾蚴有交叉(此问题在国内尚无标准方法解决)，其交叉反应率为33.3％(4/12)。证实该试纸条与ELISA法检出特异性相近。

表2灵敏度试验表明，该试纸条检出猪囊虫标准阳性血清的最大稀释度为1∶16，检测强阳性血清时其灵敏度较ELISA灵敏度低1-2个滴度，表明该试纸条具有接近ELISA法的灵敏度。

表3试纸条稳定性试验表明，在37℃条件下，试纸条可稳定保存120d有效；试纸条的最佳存放条件为4℃保存，可明显延长有效期。另外对随机挑取的同批次试纸条进行3次重复试验，检测结果相一致，说明该方法稳定性好，变异程度不大。

表4结果表明，该试纸条与宰后检虫计数法的阳性符合率为80.0％(12/15)；与ELISA试剂盒的阳性符合率为75.0％(12/16)，其中不包括试纸条判定为可疑的2份样品。

由上述各指标的测定结果可见，该猪囊虫快速诊断试纸条具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，检测效果近似于全囊虫ELISA诊断试剂盒，使用更加方便、快速、安全，适用于猪囊虫病的快速诊断，特别是生猪屠宰的快速检疫工作。

Claims (8)

1、猪囊虫金标试纸条，包括首尾衔接依次固定于PVC衬板材料上的用多孔纤维材料构成的加样吸水层、位于加样吸水层尾端并与加样吸水层相连的吸附有猪囊虫金标抗原的金标结合垫、与金标结合垫尾端相连由硝酸纤维膜构成的反应垫和与反应垫尾端相连的由吸水材料构成的吸收层，其中在反应垫上分别包被有由猪囊虫抗原构成的检测区和位于检测区下游的由猪囊虫抗体构成的质控区，其特征在于本发明所用的猪囊虫抗原为人工克隆制备的猪带绦虫重组抗原，所用的抗猪囊虫免疫球蛋白是用人工克隆制备的猪带绦虫重组抗原免疫动物获得。

2、根据权利要求1所述的猪囊虫金标试纸条，其特征是所使用的猪囊虫抗原为人工制备的猪带绦虫六钩蚴的TSOL18重组抗原。

3、根据权利要求2所述的猪囊虫金标试纸条，其特征是：

a.所使用的猪囊虫抗原是：采用基因工程技术将源于猪带绦虫六钩蚴的18ku基因进行RT-PCR，将PCR产物构建到真核表达载体上得到重组质粒，再将重组质粒电转化到酵母感受态细胞，得到重组菌株，再将重组菌诱导表达得到重组蛋白，用此蛋白制备金标抗原和包被检测区；

b.所用的抗体是：用基因工程技术将源于猪带绦虫六钩蚴的18ku基因进行RT-PCR，将PCR产物克隆到表达载体构建原核表达载体，再将原核表达载体进行诱导表达，得到融合蛋白，用融合蛋白免疫动物，提取免疫动物的血清，从中分离得到抗融合蛋白抗体，用此抗体包被质控区。

4、根据权利要求3所述的猪囊虫金标试纸条，其特征是：

a.所用的猪囊虫抗原是将源于猪带绦虫六钩蚴的18ku基因进行RT-PCR，构建真核表达载体pPIC9K-TSOL18，所得产物电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，经诱导表达得到的重组蛋白；

b.所用的抗体是：用基因工程技术将源于猪带绦虫六钩蚴的18ku基因进行PCR，再将PCR产物克隆到表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达载体pGEX-TSOL18/BL21，经诱导表达得到融合蛋白，用纯化的融合蛋白免疫动物，提取免疫动物的血清，从中分离得到抗融合蛋白抗体，用此抗体包被质控区。

5、根据权利要求1至4所述的任一猪囊虫金标试纸条，其特征是在加样吸水层设置有全血过滤装置。

6、权利要求3所述的猪囊虫金标试纸条制备方法，其特征是：

a.收集猪带绦虫虫卵，用化学法孵化和激活后，提取六钩蚴总RNA，经RT-PCR扩增TSOL18编码基因，并根据TSOL18基因的核酸序列设计并合成表达引物；

b.回收步骤a的PCR扩增产物；将回收的PCR扩增产物用限制性内切酶进行双酶切后，将PCR产物构建到真核表达载体上得到重组质粒，将重组质粒电转化到酵母感受态细胞，得到重组菌株，再将重组菌诱导表达得到重组抗原；

c.回收a步骤所得PCR产物，将PCR产物克隆到表达载体构建原核表达载体，经诱导表达后得到融合蛋白，用融合蛋白免疫动物，提取免疫动物的血清，从中分离得到抗融合蛋白抗体；

d.制备胶体金，用所制备的胶体金和由b所得重组抗原制备出金标抗原；

e.将d所得的金标重组抗原充分吸附于多孔吸水材料中，得到金标结合垫；

f.在硝酸纤维素膜的反应垫上分别设定由b所得重组抗原包被的检测区和由c步骤所得抗体包被的质控区，并按设计要求使反应垫上的检测区与质控区之间留有一段空白的区域；

g.将吸水材料、金标结合垫、硝酸纤维素膜反应垫和另一段吸水材料依次固定于不透水材料的衬底上，使各材料间保持首尾衔接，并使反应垫上的检测区位于加样侧，按设计要求将固定好的衬底切成所需的条状物，得到所述的猪囊虫金标试纸条。

7、根据权利要求4所述的猪囊虫金标试纸条制备方法，其特征是：

a.以猪带绦虫六钩蚴的总RNA为模板，以上游引物R：5′TCT CTC CGAAAC AAT GAG TTA 3′和下游引物F：5′TAA TAG ATA CCC ATT TTC ATCACA 3′进行RT-PCR，所得产物纯化回收；

b.以a所得猪带绦虫六钩蚴TSOL18构建克隆载体pGEX-TSOL18；

c.以pGEX-TSOL18质粒为模板，以

上游引物P1：5’CGAGAATTCGACATTTTCGTTCCATACCTT3’

                   EcoRI

下游引物P2：5’TAGCGGCCGCTCACTACGATCTTCGGACCTTC3’

                   NotI

PCR扩增，所得产物纯化回收；

d.取C步骤所得纯化产物与pPIC9K载体质粒分别用EcoRI/NotI双酶切，再用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收后连接，连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞，得到pPIC9K-TSOL18质粒，再用Sal I单酶切线性化，电转化毕赤酵母感受态细胞，得到重组多拷贝菌株pPIC9K-TSOL18/GS115；

e.将pPIC9K-TSOL18/GS115在发酵罐中进行连续培养，得到TSOL18重组蛋白；

f.用b步骤所得pGEX-TSOL18为模板，扩增TSOL18编码基因，构建原核表达载体pGEX-TSOL18/BL21，经诱导表达后收集菌体，纯化后免疫兔，采集并分离免疫兔血清，纯化获得兔抗TSOL18-GST多克隆抗体的IgG；

g.制备胶体金，再用所制备的胶体金和由e所得重组抗原制备出金标抗原；

h.将g所得的金标重组抗原充分吸附于多孔吸水材料中，得到金标结合垫；

i.在硝酸纤维素膜的反应垫上分别设置由e所得重组抗原包被的检测区和由f步骤所得多克隆抗体包被的质控区，并按设计要求使反应垫上的检测区与质控区之间留有一段空白的区域；

j.将吸水材料、金标结合垫、硝酸纤维素膜反应垫和另一段吸水材料依次固定于不透水材料的衬底上，使各材料间保持首尾衔接，并使反应垫上的检测区位于加样侧，按设计要求将固定好的衬底切成所需的条状物，得到所述的猪囊虫金标试纸条。

8、权利要求6或7所述的猪囊虫金标试纸条制备方法，其特征是在加样吸水层上还设置全血过滤装置。

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