CN118291487B - OsbHLH167基因在调控水稻深根比中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻OsbHLH167基因及其在调控水稻深根比中的应用，涉及基因工程技术领域，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的简并序列。利用本发明OsbHLH167基因调控水稻深根比的能力，可以针对干旱地区开发抗旱型转基因水稻，针对土壤贫瘠地区开发抗贫瘠型转基因水稻，增强水稻种质对环境的适应性，增产增收。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及OsbHLH167基因在调控水稻深根比中的应用。
背景技术
水稻是农业生产中用水最多的作物，其节水抗旱性对我国的粮食、水和生态安全具有重要意义。
水稻品种的抗旱性是指植株在干旱时依靠某些性状来提供经济上有价值的收成的能力,也就是水稻在干旱条件下,利用较少的水分,获得较高产＝量的能力。水稻抗旱机制非常复杂,抗旱性大致可以分为四类:逃旱性、避旱性、耐旱性和复水抗旱性。
利用基因工程这一分子育种技术，将抗旱基因转入当前广泛应用的优良水稻品种中，从而改良其抗旱性，培育即抗旱又高产优质的农作物新品种是抗旱育种的有效途径之一。发掘抗旱基因是抗旱分子育种的基础。因此，发掘更多水稻抗旱基因是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种OsbHLH167基因在调控水稻深根比中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种水稻OsbHLH167基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ IDNO.3所示的简并序列。
本发明的另一目的是，提供上述OsbHLH167基因在调控水稻深根比中的应用，所述应用为以下任意一项：
A.增强所述OsbHLH167基因的表达量提高水稻的深根比；
B.减弱所述OsbHLH167基因的表达量降低水稻的深根比。
本发明的另一目的是，提供上述OsbHLH167基因在水稻抗逆性育种中的应用，所述应用为增强所述OsbHLH167基因的表达量培育抗旱性水稻品种。
本发明的另一目的是，提供增强上述OsbHLH167基因表达量的生物材料在提高水稻深根比或培育抗旱性水稻品种中的应用，所述生物材料为以下任意一种：
A.能够使上述OsbHLH167基因过表达的表达盒；
B.含有A所述表达盒的重组载体；
C.含有A所述表达盒或B所述重组载体的重组微生物。
本发明的另一目的是，提供降低上述述OsbHLH167基因表达量的生物材料在降低水稻深根比或培育抗贫瘠性水稻品种中的应用，所述生物材料为以下任意一种：
A.能够使上述OsbHLH167基因抑制的表达盒；
B.含有A所述表达盒的重组载体；
C.含有A所述表达盒或B所述重组载体的重组微生物。
本发明的另一目的是，提供一种培育转基因水稻的方法，所述方法为以下任意一种：
A.通过增强植株中OsbHLH167基因的表达和/或增加OsbHLH167蛋白的活性，获得深根比和/或抗旱性高于野生型的水稻；
B.通过抑制植株中的OsbHLH167基因的表达和/或降低OsbHLH167蛋白的活性，获得深根比低于野生型的水稻；
所述OsbHLH167基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的简并序列。
本发明术语“简并序列”是指，与SEQ ID NO.3序列的核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出与SEQ ID NO.3编码的氨基酸相同的序列。该术语还包括能在中度严谨条件(70-85％一致性)下，更佳的在高度严紧条件(85％上一致性)下与SEQ ID NO.3杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
本发明术语“表达盒”是指，能够在宿主细胞中表达目的基因的DNA，该DNA不但可包括启动蛋白编码基因转录的启动子，还可包括终止蛋白编码基因转录的终止子。较佳地，所述表达盒还可包括增强子序列。
本发明术语“载体”是指，选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等，在生产本发明的水稻OsbHLH167多肽时，可以将水稻OsbHLH167编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成水稻OsbHLH167蛋白表达载体。
有益效果：
本发明的OsbHLH167基因具有调控水稻深根比的能力，利用这一能力，可以针对干旱地区开发抗旱型转基因水稻，针对土壤贫瘠地区开发抗贫瘠型转基因水稻，增强水稻种质对环境的适应性，增产增收。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为篮子法鉴定水稻深根比示意图。
图2为转基因株系中OsbHLH167基因表达量检测；其中，AT4为过表达株系，at4为敲除株系，****表示与野生型植株相比t检验p值小于0.0001。
图3为OsbHLH167基因显著调控水稻深根比。WT表示野生型，AT4为过表达株系，at4为敲除株系，误差线表示3次重复标准误；*表示与野生型植株相比t检验p值小于0.05；**表示t检验p值小于0.01。
图4为OsbHLH167基因显著调控水稻抗旱性；其中，a为结实率，b为百粒重，c为单株产量；AT4为过表达株系，at4为敲除株系，*表示t检验p值小于0.05，**表示t检验p值小于0.01，***表示t检p值小于0.001。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
鉴定水稻根系深根比(篮子法)
方法：塑料篮中填满水稻土，放置在金属架上，置于灌满水的水泥池中，使水面与篮子上沿齐平。将水稻种子发芽(深根系IRAT109，浅根系珍汕97)，单株移植到篮子上沿中间位置。约30天左右，待水稻长至分蘖盛期，将篮子从水中取出，分别统计伸出篮子底部(深层根)和侧边(浅层根)根系数目，计算深根比(参见附图1)。深根比是水稻避旱性的重要鉴定指标。
深根比＝深根数/(深根数+浅根数)*100。
深根比是植物根系发育的一个指标。深根性是指植物的主根可以深入土壤深层，主要往纵深向发展；浅根性是指植物根系主要是沿水平方向发展。深根系植物根系生长深度较深，能够吸收更多更深的土壤水分和营养物质，从而增强其抗旱性，而浅根系植物适应能力更强，能够在较为枯燥和贫瘠的土壤中生长，且生长迅速。
实施例2
水稻OsbHLH167基因的克隆
1.幼苗培育：水稻(品种为“IRAT109”)为上海市农业生物基因中心种质资源库收集保存，将水稻置于35℃萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，取根系，液氮冻存，准备抽取DNA或RNA。
2.RNA的提取：分别取深层根和浅层根的根尖组织，在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有TRIzol试剂(天根生化科技有限公司)的1.5mL EP管，充分振荡后，室温放置5分钟，于4℃，12000r/min离心15min后，上清液移至新的1.5mL EP管中，氯仿去蛋白后，等体积异丙醇沉淀RNA，溶解后用Dnase消化降解残留DNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆：根据GeneBank中水稻数据库信息中提供的序列信息，设计引物，采用RT-PCR方法进行cDNA全长克隆。
通过RT-PCR[Pf1(SEQ ID NO.1)+Pr1(SEQ ID NO.2)]得到一个包含有完整开放阅读框在内的cDNA序列(SEQ ID NO.3)，长度为705bp；回收，连接到pGEMT-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行测序。分析测序结果可知，其编码蛋白共234个氨基酸残基(SEQ ID NO.4)，分子量为25.1k道尔顿，等电点(pI)为9.15，具有一个bHLH模体，具有DNA结合能力，是转录调节因子。
Pf1：5ˋ-ATGGATCAGGAGAAGGCGGA-3ˋ，SEQ ID NO.1；
Pr1：5ˋ-TCAAGACCGGATCACCAATG-3ˋ，SEQ ID NO.2。
CDS序列：
ATGGATCAGGAGAAGGCGGACGGCGGCGGCAGGAGGAGGAGGAGCAGGGCGACGAGTAGCAGCGGCAGCGGCGCGAGCAGCACGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGAGGAAGGAGATGGAGCGCAGGAGGCGGCAGGACATGAAGGGCCTCTGCGTCAAGCTCGCCTCTCTCATCCCCAAAGAACACTGCTCCATGTCCAAGATGCAGGCGGCGTCTAGGACCCAGCTGGGCAGCCTGGACGAAGCGGCGGCCTACATCAAGAAGCTCAAGGAAAGGGTGGACGAGCTGCACCACAAGAGGAGCATGATGAGTATCACATCATCGCGCTGCCGCTCAGGAGGAGGAGGAGGACCAGCTGCTGCTGCTGGCCAGTCGACGAGCGGCGGCGGCGGCGGGGAAGAAGAAGAAGAAGATATGACGAGGACGACGGCGGCGGCGGCGGTGGTGGAGGTGCGGCAGCACGTGCAGGAGGGGTCGCTGATCAGCTTGGACGTGGTGCTGATCTGCAGCGCAGCGAGGCCGGTCAAGTTCCACGACGTCATCACCGTCCTCGAGGAAGAAGGCGCCGACATCATCTCCGCCAACTTCTCCCTCGCCGCCCACAATTTCTACTACACCATCTACTCCAGGGCCTTTAGCTCAAGAATTGGCATAGAGGCTTCGAGGATTTCTGAGAGACTACGGGCATTGGTGATCCGGTCTTGA，SEQ ID NO.3。
氨基酸序列：
MDQEKADGGGRRRRSRATSSSGSGASSTAAAAAAERKEMERRRRQDMKGLCVKL
ASLIPKEHCSMSKMQAASRTQLGSLDEAAAYIKKLKERVDELHHKRSMMSITSSRCRSGG
GGGPAAAAGQSTSGGGGGEEEEEDMTRTTAAAAVVEVRQHVQEGSLISLDVVLICSAARPVKFHDVITVLEEEGADIISANFSLAAHNFYYTIYSRAFSSRIGIEASRISERLRALVIRS，SEQ ID NO.4。
实施例3
水稻OsbHLH167基因的转基因突变体创制
1.水稻OsbHLH167基因的基因敲除载体的构建：
根据水稻基因OsbHLH167的cDNA全长序列(SEQ ID NO.3)，利用CRISPER/Cas9系统，在基因编码区上游设计基因敲除靶点序列(5ˋ-ATGGATTGACGAAGCAGAAGAGG-3ˋ；SEQ IDNO.5)，并根据靶位点序列设计U6a启动子扩增反向引物u6a-R(5ˋ-TCTCCTGATCCATAATTAGTcggcagccaagccagca-3ˋ；SEQ ID NO.6)以及引导RNA序列扩增正向引物gRNAf(5ˋ-ACTAATTATGGATCAGGAGAgttttagagctagaaat-3ˋ；SEQ ID NO.7)，分别于通用引物配对，分别扩增出含靶序列的U6a片段和引导RNA片段。将两片段纯化，混合，采用桥式PCR扩增出汗靶位点的U6a：gRNA表达盒片段，采用同源重组酶，将此片段导入导入CRISPER/Cas9载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-H(Ma et al.,2015,DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007)。将载体转化导入大肠杆菌JM109，经含卡那霉素培养基筛选，提取质粒，测序。
再将其转入农杆菌EHA105中，并转化模式植物深根系水稻中花11(由于浅根系珍汕97水稻品种遗传转化率低，故用另一个浅根系水稻品种中花11进行进一步研究)。
2.水稻OsbHLH167基因过表达载体的构建：
根据水稻基因OsbHLH167的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例2中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将水稻基因OsbHLH167的cDNA克隆至中间载体(如pBI121)，进一步克隆到双元表达载体(如pCAMBIA1300)上，在保证阅读框架正确的前提下再将该双元表达载体转入农杆菌中，并转化模式植物水稻中花11。
3.水稻遗传转化
愈伤诱导：种子用无菌水漂洗15-20分钟，再用70％的乙醇消毒1分钟，然后用次氯酸钠(1.5％有效浓度)溶液振荡消毒20min。最后再用无菌水冲洗5遍。将洗好的种子用吸水纸吸干接种在诱导愈伤培养基中，25℃暗培养2周。
继代培养：把胚性愈伤组织切下，接入继代培养基中，25℃暗培养2周。
农杆菌浸染和愈伤组织共培养：培养农杆菌挑，取阳性单菌落，在1ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养过夜；取以上培养物，加入50ml农杆菌培养液(含抗生素)中，28℃培养至OD600＝0.6-1.0。将获得的农杆菌菌液离心，将收集到的菌体加入悬浮培养液中，震荡培养30min至OD600＝0.6-1.0。然后将愈伤组织放入含有农杆菌菌液的悬浮培养液中，振荡培养20min左右。将愈伤组织在灭菌滤纸上晾干，转入共培养培养基中，25℃暗培养5d。
筛选培养：共培养3d后，选取好的愈伤组织，转入筛选培养基中，25℃暗培养2周，筛选两次。
分化培养：挑取胚性愈伤组织接入分化培养基，24℃，16h/8h光暗培养诱导分化芽(4-6周)。
生根培养：待芽长至2cm左右时，将幼芽切下，插入生根培养基中，25℃左右，16h/8h光暗培养，诱导生根。
转化植株培养；待根系发达后，打开试管口，加入无菌水练苗2-3天后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始遮荫避风，待植株健壮后进行常规田间或温室管理培养。
本实施例中所涉及的各项培养基(诱导愈伤培养基、继代培养基、共培养培养基、筛选培养基、诱导分化培养基、生根培养基)均为常规培养基。
通过PCR对转基因水稻进行阳性鉴定和突变情况检测。对过表达转基因阳性植株和基因敲除突变纯合突变株进行定量检测。结果表明，过表达植株中OsbHLH167基因表达量极显著高于野生型水稻；而突变体水稻中OsbHLH167基因表达量极显著下降(参见附图2)。
实施例4
1.OsbHLH167基因调控水稻根系发育
我们构建植物转化载体并导入水稻中花11中，获得了OsbHLH167基因的突变材料和过表达材料；通过测序鉴定纯合、移码突变材料、表达量检测等，获得敲除突变体株系和过表达株系材料。
将获得的敲除突变体株系和过表达株系水培，在6叶期测定水稻根系容积，具体方法为：水稻种子在1/2MS培养基上发芽，海绵包裹根部，插入支撑架孔中，移栽至装满水稻液体培养基的种植盒中；每个材料种植5个单株，每盒可以种植18株；每3天更换一次水稻液体培养基，培养至4叶期。正常培养，则继续用水稻液体培养基培养7天；18％PEG胁迫，则在每1L水稻液体培养基内溶解180g PEG6000，胁迫培养7天。考察根系性状。
同时通过篮子法在分蘖盛期检测这些突变体与野生型亲本中花11的深根比。
通过分析深根比数据，发现敲除突变体水稻与野生型水稻的根系容积突变体的深根比极显著下降20％-30％，过表达材料深根比则显著增加10％左右(参见附图3)。因此，我们确定OsbHLH167基因在干旱胁迫下显著调控水稻根系容积，同样显著调控水稻深根比表型，合理推测其具有提高水稻避旱性功能。
2.OsbHLH167基因调控水稻抗旱性
在大田间采用土壤自然干旱法，对OsbHLH167基因的过表达水稻株系和基因敲除突变株系进行田间水分胁迫试验，分析水稻OsbHLH167基因的抗旱作用。我们把野生型中花11(WT，旱敏感型)和过表达OsbHLH167基因的2个独立转化株系AT4-32、AT4-34，3个不同类型的独立突变株系at-106、at-107、at-108，种植在海南抗旱大棚中，分别进行常规的水分管理(自插秧起，田中保持5-10cm水层覆盖，至分蘖盛期断水7天晒田，之后灌水保持5-10cm水层直至成熟)和自然干旱胁迫处理(苗期移栽至田间开始，不浇水)，每种处理设3个重复小区，每个小区中每份材料分别种植36株。自然干旱胁迫田块无犁底层，齐苗后断水生长；成熟后进行农艺性状考察。
结果表明，在正常水分下，野生型中花11(WT)和过表达OsbHLH167基因水稻以及基因敲除水稻材料，在结实率、千粒重、单株产量等性状无显著差异；但是干旱胁迫下，过表达OsbHLH167基因水稻结实率、千粒重、单株产量等农艺性状显著高于WT水稻，显著性达到显著或极显著水平；与之相反的是，基因敲除水稻在结实率、千粒重、单株产量显著低于WT水稻，显著性也达到了显著或极显著水平(参见附图4)。这些结果表明，水稻OsbHLH167基因调控水稻抗旱性，可以通过提高其在水稻中的表达水平改良水稻的抗旱性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.OsbHLH167基因在调控水稻深根比中的应用，其特征在于，所述应用为以下任意一项：
A.增强所述OsbHLH167基因的表达量提高水稻的深根比；
B.减弱所述OsbHLH167基因的表达量降低水稻的深根比；
所述OsbHLH167基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的简并序列。
2.OsbHLH167基因在水稻抗逆性育种中的应用，其特征在于，所述应用为增强所述OsbHLH167基因的表达量培育抗旱性水稻品种；
所述OsbHLH167基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的简并序列。
3.增强OsbHLH167基因表达量的生物材料在提高水稻深根比或培育抗旱性水稻品种中的应用，其特征在于，所述生物材料为以下任意一种：
A.能够使OsbHLH167基因过表达的表达盒；
B.含有A所述表达盒的重组载体；
C.含有A所述表达盒或B所述重组载体的重组微生物；
所述OsbHLH167基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的简并序列。
4.降低OsbHLH167基因表达量的生物材料在降低水稻深根比中的应用，其特征在于，所述生物材料为以下任意一种：
A.能够使OsbHLH167基因抑制的表达盒；
B.含有A所述表达盒的重组载体；
C.含有A所述表达盒或B所述重组载体的重组微生物；
所述OsbHLH167基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的简并序列。
5.一种培育转基因水稻的方法，其特征在于，所述方法为以下任意一种：
A.通过增强植株中OsbHLH167基因的表达和/或增加OsbHLH167蛋白的活性，获得深根比和/或抗旱性高于野生型的水稻；
B.通过抑制植株中的OsbHLH167基因的表达和/或降低OsbHLH167蛋白的活性，获得深根比低于野生型的水稻；
所述OsbHLH167基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示的简并序列。
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