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CN119193550A - 一种AvCHIT1蛋白及其在提高植物耐盐性中的应用 - Google Patents

一种AvCHIT1蛋白及其在提高植物耐盐性中的应用 Download PDF

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CN119193550A
CN119193550A CN202411354137.7A CN202411354137A CN119193550A CN 119193550 A CN119193550 A CN 119193550A CN 202411354137 A CN202411354137 A CN 202411354137A CN 119193550 A CN119193550 A CN 119193550A
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CN
China
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avchit1
protein
gene
avchit
salt tolerance
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Application number
CN202411354137.7A
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徐宗昌
鲁雪莉
李义强
张成省
孟晨
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Tobacco Research Institute of Hubei Province
Original Assignee
Tobacco Research Institute of Hubei Province
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Publication date
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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种AvCHIT1蛋白及其在提高植物耐盐性中的应用。本发明提供了一种AvCHIT1蛋白，所述AvCHIT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述AvCHIT1蛋白在逆境胁迫响应中发挥重要作用，可提高植物耐盐能力。实施例结果表明，在拟南芥中过表达AvCHIT1蛋白，能显著提高拟南芥种子萌发率，提高其耐盐能力，将AvCHIT1基因构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的遗传转化方法进行遗传转化，能有效获得具有耐盐特性的新种质。本发明对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

Description

一种AvCHIT1蛋白及其在提高植物耐盐性中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种AvCHIT1蛋白及其在提高植物耐盐性中的应用。
背景技术
罗布麻(Apocynum venetum)是夹竹桃科(Apocynaceae)罗布麻属(Apocynum)植物，因在新疆罗布泊地区发现而得名，环境适应能力强，能够在干旱地区、盐碱地甚至是海滨滩涂地区生长，是一种耐盐能力强的盐生植物。
近年来，农业生态环境不断恶化，高盐逆境愈发严重，土壤盐渍化已成为世界范围内农业生产领域亟待解决的重要问题，并成为影响植物生长发育及产量的关键胁迫因子，培育耐盐作物新品种是有效利用盐渍土，提高粮食产量的重要途径。耐盐植物在长期盐胁迫适应性生长和进化过程中，建立了一些系列减轻盐胁迫危害的机制，是挖掘优异耐盐基因的良好供体。随着分子生物学技术的不断完善，通过基因工程手段结合分子设计理念来提高植物抗逆性已成为目前研究的热点方向。由此，挖掘耐盐基因并加以利用显得至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种AvCHIT1蛋白及其在提高植物耐盐性中的应用，本发明所述AvCHIT1蛋白能够调控植物耐盐能力，可用于创建耐盐新种质。
本发明提供了一种AvCHIT1蛋白，所述AvCHIT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种AvCHIT1基因，所述AvCHIT1基因为上述方案所述的AvCHIT1蛋白的编码基因；所述AvCHIT1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述方案所述的AvCHIT1蛋白或上述方案所述的AvCHIT1基因在调控植物耐盐性中的应用。
优选的，所述调控包括：提高AvCHIT1蛋白表达量或提高AvCHIT1基因表达量提高植物耐盐性。
优选的，所述提高植物耐盐性包括提高植物萌发率。
优选的，所述植物包括罗布麻和/或拟南芥。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述方案所述的AvCHIT1基因。
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包含上述方案所述的重组表达载体。
本发明还提供了上述方案所述的AvCHIT1蛋白或上述方案所述的AvCHIT1基因或上述方案所述的重组表达载体或上述方案所述的重组菌在培育耐盐植物品种中的应用。
本发明还提供了一种提高植物耐盐性的方法，包括：将上述方案所述的重组表达载体或上述方案所述的重组菌转入植物中。
本发明提供了一种AvCHIT1蛋白，所述AvCHIT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述AvCHIT1蛋白在逆境胁迫响应中发挥重要作用，可提高植物耐盐能力。实施例结果表明，在拟南芥中过表达AvCHIT1蛋白，能显著提高拟南芥种子萌发率，提高其耐盐能力，将AvCHIT1基因构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的遗传转化方法进行遗传转化，能有效获得具有耐盐特性的新种质。本发明对于优良作物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中罗布麻耐盐特性鉴定图；其中A为罗布麻幼苗系列盐浓度处理后形态表型；B为罗布麻幼苗干鲜物质比；C为罗布麻幼苗叶子Na+含量；D为罗布麻种子盐胁迫条件下萌发表型；E为罗布麻种子盐胁迫条件下萌发率；
图2为实施例2中罗布麻响应盐胁迫差异表达基因筛选图，其中A为韦恩图分析结果；B为基因表达趋势分析结果；
图3为实施例3中AvCHIT1基因受盐胁迫诱导上调表达图；其中A为qRT-PCR校正转录组数据；B为AvCHIT1受盐胁迫诱导半定量实验；
图4实施例4中AvCHIT1系统进化树；
图5实施例4中AvCHIT1、HOT2和PR-3蛋白分析图；其中A为AvCHIT1、HOT2和PR-3蛋白序列比对图；B为AvCHIT1、HOT2和PR-3蛋白保守结构域分析图；
图6为实施例5中AvCHIT1蛋白组织表达图；其中A为AvCHIT1蛋白亚细胞定位图；B、C为GUS染色检测AvCHIT1蛋白时空表达模式，B中标尺为2mm，C中标尺为5mm；
图7为实施例6中AvCHIT1过表达株系对氯化钠的耐受性图；其中A为对照及添加不同浓度氯化钠胁迫下拟南芥表型；B为拟南芥根长统计；C为拟南芥Na+含量；
图8为实施例7中AvCHIT1互补实验验证图；其中A为hot2，pr3，35Spro:AvCHIT1，35Spro:AvCHIT1:hot2和35Spro:AvCHIT1:pr-3突变体背景检测；B为pH＝6.0，150mM NaCl处理条件下WT、hot2、pr3、35Spro:AvCHIT1、35Spro:AvCHIT1:hot2和35Spro:AvCHIT1:pr-3种子萌发实验；C为pH＝5.0，150mMNaCl处理条件下WT、hot2、pr3、35Spro:AvCHIT1、35Spro:AvCHIT1:hot2和35Spro:AvCHIT1:pr-3种子萌发实验；D为培养皿种子摆放顺序；E为两种pH条件下WT、hot2、pr3、35Spro:AvCHIT1、35Spro:AvCHIT1:hot2和35Spro:AvCHIT1:pr-3种子萌发率统计图。
具体实施方式
本发明提供了一种AvCHIT1蛋白，所述AvCHIT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：MRFWAVVLCSALCLVGVSAQVGSFVSKSLFDQLLKHRNDANCPAKGFYTYEAFIAAANSFGGFGTTGDTDTRKREIAAFLAQTSHETTGGWASAPDGPYSWGYCFKQEQGNPPSYCVQSQQWPCAPGKKYYGRGPIQISYNYNYGPAGRAIGANLLNNPDLVANDPVISFKTALWFWMTPQQPKPSSHDVMTGRWRPSGADSAAGRVPGFGVVTNIINGGIECGKGNNAQMQSRIGFYRRYCSILGVSPGNNLDCANQRPFA。
本发明还提供了一种AvCHIT1基因，所述AvCHIT1基因为上述方案所述的AvCHIT1蛋白的编码基因；所述AvCHIT1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，末尾为终止密码子，具体如下：
5′-ATGAGGTTTTGGGCAGTGGTTTTGTGCTCTGCATTGTGTCTTGTAGG TGTCTCGGCACAGGTTGGTTCCTTCGTTAGTAAATCTTTGTTTGATCAATTGTTGAAGCATCGAAATGATGCCAATTGCCCAGCTAAAGGCTTCTACACTTATGAAGCTTTCATAGCAGCTGCTAATTCCTTTGGGGGTTTCGGCACCACTGGCGATACCGACACACGTAAACGAGAAATCGCAGCCTTTTTGGCTCAAACTTCCCATGAAACAACAGGTGGATGGGCAAGTGCCCCTGATGGACCATATTCATGGGGATACTGCTTCAAGCAAGAACAAGGCAACCCTCCAAGTTACTGTGTCCAGAGCCAACAATGGCCCTGCGCTCCTGGGAAGAAGTACTACGGACGTGGTCCAATCCAAATTTCCTACAACTACAACTATGGTCCAGCAGGGAGAGCCATTGGTGCAAATCTGCTAAACAATCCTGATTTAGTTGCAAATGATCCTGTAATTTCTTTCAAGACTGCACTATGGTTTTGGATGACACCGCAACAACCAAAACCATCCTCCCACGATGTCATGACGGGCCGGTGGAGACCATCTGGAGCCGATTCTGCCGCCGGACGTGTCCCGGGCTTTGGTGTTGTAACAAACATCATCAATGGTGGGATTGAATGTGGTAAAGGCAATAATGCACAGATGCAAAGCAGGATTGGTTTCTACAGGCGATACTGTAGCATACTCGGAGTGAGCCCAGGCAACAATCTGGATTGTGCCAACCAAAGGCCATTTGCATAG-3′。
本发明还提供了上述方案所述的AvCHIT1蛋白或上述方案所述的AvCHIT1基因在调控植物耐盐性中的应用。作为一种实施方式，本发明所述调控包括：提高AvCHIT1蛋白表达量或提高AvCHIT1基因表达量提高植物耐盐性。作为一种实施方式，所述提高植物耐盐性包括提高植物萌发率。
作为一种实施方式，本发明所述植物包括罗布麻和/或拟南芥，在具体实施例中，所述植物可以为罗布麻或拟南芥。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述方案所述的AvCHIT1基因。
本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包含上述方案所述的重组表达载体。
本发明还提供了上述方案所述的AvCHIT1蛋白或上述方案所述的AvCHIT1基因或上述方案所述的重组表达载体或上述方案所述的重组菌在培育耐盐植物品种中的应用。
本发明还提供了一种提高植物耐盐性的方法，包括：将上述方案所述的重组表达载体或上述方案所述的重组菌转入植物中。作为一种实施方式，本发明所述植物包括罗布麻和/或拟南芥，在具体实施例中，所述植物可以为罗布麻或拟南芥。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种AvCHIT1蛋白及其在提高植物耐盐性中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
①罗布麻耐盐能力鉴定
取生长2周的罗布麻幼苗，随机分为6组，分别施加0mM、20mM、50mM、100mM、200mM和400mM五个梯度不同浓度的NaCl溶液处理四周，观察罗布麻的生长情况，并测定罗布麻叶片中的Na+含量，测定罗布麻的鲜重和干重，计算其干鲜比，结果参见图1中的A～C，图中不同小写字母代表p＜0.05。
Na+含量测定方法：取2g罗布麻叶子在120℃烘箱中保持30min，然后在80℃的烘箱中放置一夜，使其干燥至恒重。将干燥的罗布麻叶子磨成粉末，并通过0.5mm的筛网得到罗布麻粉末。取0.25g罗布麻粉末，用5mLHNO3消化，110℃保持至无色液体(约6h)，然后将液体混合物冷却至室温，用去离子水定容至10mL。使用perkins-elmer 360型原子吸收分光光度计测定上清液的Na+浓度。
根据图1可知，罗布麻随着盐浓度的升高其生长反而逐渐受到抑制，400mM处理下罗布麻幼苗生长几乎停止，并在后2～3周内逐渐衰老死亡(图1中的A)。但其生物量干鲜比随着盐浓度的增加有逐渐升高的趋势，并在200mM NaCl处理下达到最大(图1中的B)。随着盐浓度的增高，罗布麻叶子中Na+的含量逐渐升高(图1中的C)，这说明罗布麻叶片内积累了大量的Na+，这可能是导致植株外在形态在生长中受到抑制的原因。
②罗布麻种子萌发率测定
在培养基中分别添加0mM、10mM，20mM，50mM，100mM和250mM的NaCl，将罗布麻种子放置于培养基中进行种子萌发实验，观察种子萌发情况并统计萌发率，结果参见图1中的D、E。
结果发现，并未有能够促进罗布麻种子萌发的盐处理浓度(图1中的D)，即便在只含有10mMNaCl的培养基上，罗布麻种子的萌发率(44.03％)和未添加氯化钠的培养基相比(75.28％)，也显著下降(图1中的E)，说明盐胁迫能够抑制罗布麻种子的萌发。
虽然罗布麻在种子萌发和幼苗生长阶段并没有促进其生长的最佳盐浓度，但幼苗能够在高达200mM氯化钠(含盐量约为11.7‰)浓度下保持生长，说明罗布麻是一种非典型的盐生植物，能够表现较强的耐盐性。
实施例2
将盆栽成株期罗布麻随机分为2组，一组使用200mM NaCl对罗布麻进行盐胁迫处理，记为处理组，NaCl，另一组施用等量的纯水作为对照组CK。在第0天，第7天和第18天上午10时取样，分别取对照组和处理组的罗布麻叶进行转录组测序，其中对照组依次记为CK0Z、CK7Z、CK18Z，处理组依次记为NaCL7Z和NaCl18Z，每个处理3个生物学重复。
二代转录组测序一共获得254005个转录本，拼接后得到133486个最长转录本。无参转录组使用FPKM(Fragments Per Kilobase oftranscript per Million mappedreads)作为衡量基因表达水平的指标，差异表达基因(Different expression genes，DEGs)的确定采用两个参数(1)|log2Fold Change(expected count)|>＝1；(2)FDR<0.05。去除重复基因后在10个比较组中共鉴定到差异表达基因9134个，其中比较组为CK0Z_vs_CK7Z(3235)，CK0Z_vs_CK18Z(2932)，CK7Z_vs_CK18Z(1497)，CK0Z_vs_NaCl7Z(2430)，CK0Z_vs_NaCl18Z(1848)，CK7Z_vs_NaCl7Z(814)，CK7Z_vs_NaCl18Z(2727)，CK18Z_vs_NaCl7Z(2636)，CK18Z_vs_NaCl18Z(2775)，NaCl7Z_vs_NaCl18Z(814)。
通过韦恩图分析与盐胁迫相关的比较组，共得到25个共有差异基因(图2中的A)；基因表达趋势分析得到在盐胁迫下上调表达的基因22个(图2中的B)。两者共有差异表达基因15个(参见表1)，其中，TRINITY_DN39146_c0_g1编码一个几丁质酶基因，基因注释表明其和拟南芥几丁质酶基因At3g12500(PR-3)同源，命名为AvCHIT1。
表1韦恩图分析与基因表达趋势分析共有差异表达基因
GeneID 拟南芥同源基因 上下调 基因注释
TRINITY_DN42650_c1_g1 At1g20380 上调 POQR
TRINITY_DN38959_c0_g2 At1g65800 上调 ATARK2
TRINITY_DN44625_c1_g1 At2g40300 上调 FER4
TRINITY_DN41289_c3_g1 At2g47760 上调 ALG3
TRINITY_DN39146_c0_g1 At3g12500 上调 PR-3
TRINITY_DN40614_c3_g5 At3g22640 上调 PAP85
TRINITY_DN44188_c0_g4 At3g57270 上调 BG1
TRINITY_DN33945_c0_g2 At4g09670 上调 Oxidoreductase
TRINITY_DN42941_c3_g8 At5g19040 上调 IPT5
TRINITY_DN42308_c0_g2 At5g66400 上调 ATDI8
TRINITY_DN29716_c0_g1 At4g11650 上调 ATOSM34
TRINITY_DN32094_c0_g1 At1g53540 上调 HSP20
TRINITY_DN28411_c1_g1 At4g27670 上调 HSP21
TRINITY_DN28657_c0_g1 At4g10250 上调 HSP22.0
TRINITY_DN31702_c0_g1 At4g25200 上调 HSP23.6
实施例3
利用qRT-PCR对转录组的数据进行验证，所述qRT-PCR中AvCHIT1基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，内参基因为罗布麻EF-α基因，所述罗布麻EF-α基因的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
AvCHIT1-qRTPCR-F(SEQ ID NO.3)：
5′-TGGTGCAAATCTGCTAAACAATC-3′；
AvCHIT1-qRTPCR-R(SEQ ID NO.4)：
5′-TGCGGTGTCATCCAAAACCATA-3′；
AvEF-α-qRTPCR-F(SEQ ID NO.5)：
5′-TGAGAGGTCTACCAACCTTGA-3′；
AvEF-α-qRTPCR-R(SEQ ID NO.6)：
5′-TTGGGCTCAGAAATCAGGTCAA-3′。
所述qRT-PCR体系为20μL，包含2×ChamQ SYBR qPCRMasterMix 10μL，10μM的正向引物0.4μL，10μM的反向引物(R)0.4μL，50×ROX Reference Dye10.4μL，cDNA模板1μL，加ddH2O至20μL，设置3个技术重复；体系中的cDNA模板为1μg RNA反转得到的cDNA。
所述qRT-PCR扩增采用两步法，反应程序为95℃预变性30sec；然后95℃10sec、60℃30sec进行40个循环；再运行融解曲线阶段：95℃15sec，60℃1min，95℃15sec，反应结束后进行融解曲线分析。
将转录组数据和qRT-PCR数据进行分析，结果参见图3中的A，其中CK0对应实施例2中CK0Z，CK7对应实施例2中CK7Z、CK18对应实施例2中CK18Z，NaCl7对应实施例2中NaCl7Z，NaCl18对应实施例2中NaCl18Z。结果表明，qRT-PCR数据与转录组数据在各样品中的表达趋势基本一致，盐胁迫下罗布麻AvCHIT1基因表达量较对照上调明显。
对生长4周的罗布麻幼苗使用0mM、50mM、100mM和200mMNaCl胁迫处理后，利用半定量实验分别检测AvCHIT1基因的表达量，检测结果见图3中的B。根据图3中的B可知，与对照相比，在受到100mM和200mMNaCl胁迫时，AvCHIT1基因表达量明显上调。
实施例4
将拟南芥相关几丁质酶基因与文献报道受盐胁迫调控或过表达能够增强植物抗性的几丁质酶基因利用Mega6.0构建系统进化树，参见图4。
根据图4可知，AvCHIT1与拟南芥III型几丁质酶基因PR-3(At3g12500)处于同一个进化枝上，说明二者同源性较高，可能具有相似的功能，受盐胁迫诱导明显且过表达能够提高拟南芥抗盐性的辣椒几丁质酶基因CAChi2也和AvCHIT1处于同一个进化枝上，表明此类几丁质酶基因在功能上具有相似性。利用DNAMAN对AvCHIT1、HOT2和PR-3的蛋白序列和结构域进行预测，结果参见图5，其中PR-3蛋白即为拟南芥III型几丁质酶基因At3g12500编码的蛋白。根据图5中的A可知，AvCHIT1和HOT2、PR-3蛋白一级序列相似性分别为30.22％和50.75％。并且，AvCHIT1同HOT2和PR-3都具有相同的糖基水解酶结构域(图5中的B)，因此，可以推断AvCHIT1和HOT2/PR-3很有可能具有类似的功能。但转罗布麻AvCHIT1基因能否提高植物的耐盐性仍需要进一步实验验证。
实施例5
构建p35S:AvCHIT1-GFP融合蛋白表达载体和pro:AvCHIT1-GUS表达载体进行AvCHIT1蛋白亚细胞定位和AvCHIT1基因时空表达模式研究。
pro:AvCHIT1-GUS表达载体构建过程：以pBI101-GUS载体为基础载体(购自BioVectorNTCC典型培养物保藏中心，货号：pBI101 vetor)，使用Xba I单酶切线性化载体；以罗布麻幼苗叶子cDNA为模板，使用扩增引物pAvCHIT1-GUS-F(SEQ ID NO.7)和pAvCHIT1-GUS-R(SEQ ID NO.8)获得含有启动子的AvCHIT1基因片段后，在同源重组酶的作用下，将含有启动子的AvCHIT1基因片段与线性化载体进行连接，获得pro:AvCHIT1-GUS重组载体。
pAvCHIT1-GUS-F(SEQ ID NO.7)：
5′-TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAATGAGGTTTTGGGCAGTGGTT T-3′；
pAvCHIT1-GUS-R(SEQ ID NO.8)：
5′-ACTGACCACCCGGGGATCCTCTAGATGCAAATGGCCTTTGGTTGGC A-3′。
将pro:AvCHIT1-GUS重组载体转化农杆菌GV3101得到含有p35S:AvCHIT1-GFP载体的农杆菌GV3101。并使用含有p35S:AvCHIT1-GFP载体的农杆菌GV3101瞬转本氏烟，激光共聚焦显微镜下观察荧光信号，结果参见图6中的A。根据图6中的A可知，荧光信主要集中在细胞膜上，表明AvCHIT1蛋白主要定位在细胞膜上发挥作用。
p35S:AvCHIT1-GFP融合蛋白表达载体构建过程：以pCAMBIA1301-EGFP载体为基础载体，使用Kpn I和BamHI双酶切线性化载体；以罗布麻幼苗叶子cDNA为模板，使用扩增引物35S-AvCHIT1-GFP-F(SEQ ID NO.9)和35S-AvCHIT1-GFP-R(SEQ ID NO.10)获得AvCHIT1基因片段后，在同源重组酶的作用下，将AvCHIT1基因片段与线性化载体进行连接，获得p35S:AvCHIT1-GFP重组载体。
35S-AvCHIT1-GFP-F(SEQ ID NO.9)：
5′-CGAACGATAGCCATGGTACCAATGAGGTTTTGGGCAGTGGTTT-3′；
35S-AvCHIT1-GFP-R(SEQ ID NO.10)：
5′-CATGCCTGCGGCCGCGCCGGATCCTGCAAATGGCCTTTGGTTGGCA-3′。
采用滴花法将pro:AvCHIT1-GUS表达载体转化到拟南芥野生型中，对转基因后代各个生长时期进行GUS染色，染色结果参见图6中的B和C。结果表明，幼苗莲座叶的整个维管组织和叶肉细胞均有GUS表达，幼苗下胚轴也有GUS检出(图6中的B)，但是成株叶子中却没有GUS信号，这说明AvCHIT1基因在生长发育的早期有很高的表达量。除此之外，在成熟期植株的果荚基部和花萼中也检测到了GUS信号(图6中的C)。
实施例6
构建35Spro:AvCHIT1过表达载体：以pCAMBIA1301-EGFP载体为基础载体，使用KpnI和Xba I双酶切线性化载体；以罗布麻幼苗叶子cDNA为模板，使用扩增引物35S-AvCHIT1-GFP-F(SEQ ID NO.9)和AvCHIT1-R1(SEQ ID NO.11)获得AvCHIT1基因片段；在同源重组酶的作用下，将AvCHIT1基因片段与线性化载体进行连接，获得35Spro:AvCHIT1过表达载体。
AvCHIT1-R1(SEQ ID NO.11)：
5′-ACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAGATGCAAATGGCCTTTGGTTGGC A-3′。
将上述步骤得到的35Spro:AvCHIT1过表达载体转化农杆菌GV3101得到携带35Spro:AvCHIT1过表达载体的GV3101农杆菌菌株。将携带35Spro:AvCHIT1过表达载体的GV3101农杆菌菌株在LB培养基上划线，挑单克隆摇菌，菌液OD值达到0.5左右时，离心，弃上清，使用重悬溶液重悬菌体得到重悬液，所述重悬溶液含有终浓度5％(w/v)的蔗糖和0.02％(v/v)的Silwet。将盛开的拟南芥花序在重悬液中浸泡30s后，黑暗培养12h，收获种子后进行筛选，得到转基因株系OE1和OE2。
对筛选到的阳性植株OE1和OE2进行耐盐表型鉴定，统计拟南芥幼苗根长，并测定叶片Na+含量，测定方法同实施例1，结果参见图7，图中**代表p＜0.05。
根据图7可知，在含有100mM和150mMNaCl的培养基上转基因植株OE1和OE2的根长要明显长于对照。Na+含量结果表明，盐胁迫条件下AvCHIT1过表达株系叶子中Na+含量也明显低于野生型。这些结果说明，AvCHIT1基因能够增强植物的抗盐能力。
实施例8
验证AvCHIT1与PR-3和HOT2功能的互补性：
从欧洲拟南芥储备中心(https://arabidopsis.info/StockInfo？NASC_id＝625057)订购拟南芥pr-3和hot2突变体(货号为：SALKseq_081718.1和SALKseq_058663.1)，将实施例7得到的35Spro:AvCHIT1过表达载体采用滴花法转入拟南芥pr-3和hot2突变体中，获得35Spro:AvCHIT1:pr-3和35Spro:AvCHIT1:hot2互补系。以拟南芥AtTUBULIN作为内参基因，使用半定量PCR对获得的突变体株系进行背景鉴定，所述半定量PCR所用引物序列见表2。
表2半定量PCR引物序列信息
基因 引物 序列号 序列信息
AvCHIT1 AvCHIT1-F SEQ ID NO.3 5′-TGGTGCAAATCTGCTAAACAATC-3′
AvCHIT1 AvCHIT1-R SEQ ID NO.4 5′-TGCGGTGTCATCCAAAACCATA-3′
AtHOT2 AtHOT2-F SEQ ID NO.12 5′-ATGGTGACAATCAGGAGTGGTT-3′
AtHOT2 AtHOT2-R SEQ ID NO.13 5′-TTACGAAGAGGAAGAGGAAGG-3′
AtPR3 AtPR3-F SEQ ID NO.14 5′-ATGCCTCCACAAAAAGAAAACC-3′
AtPR3 AtPR3-R SEQ ID NO.15 5′-CTAAATAGCAGCTTCGAGGAGG-3′
AtTUBULIN AtTUBULIN-F SEQ ID NO.16 5′-ATCCGTGAAGAGTACCCAGAT-3′
AtTUBULIN AtTUBULIN-R SEQ ID NO.17 5′-AAGAACCATGCACTCATCAGC-3′
半定量PCR结果如图8中的A所示，外源AvCHIT1基因在拟南芥WT、hot2和pr-3中均未扩增出条带，但是在35Spro:AvCHIT1，35Spro:AvCHIT1:hot2以及35Spro:AvCHIT1:pr-3中均扩增出了条带，说明AvCHIT1在过表达株系中都有表达；而AtHOT2和AtPR3基因在各自的突变体中均未扩增出条带，在拟南芥其它株系中扩增出了亮度基本一致的条带，说明突变体背景干净，各个突变体材料构建成功。
对WT，35Spro:AvCHIT1，hot2，pr-3，35Spro:AvCHIT1:hot2以及35Spro:AvCHIT1:pr-3六个株系开展种子萌发阶段和苗期耐盐性鉴定，结果参见图8中的B～E。根据图8中的B～E可知，在pH＝6.0的正常条件下，150mMNaCl处理之后，拟南芥hot2和pr-3突变体的种子萌发率明显降低，WT较二者略有提高，但萌发率也在70％左右；而AvCHIT1过表达植株的萌发率则接近100％，两个互补系35Spro:AvCHIT1:hot2和35Spro:AvCHIT1:pr-3的萌发率均较各自对照有明显的提高，这说明AvCHIT1在提高植物耐盐性的过程中发挥着作用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种AvCHIT1蛋白，所述AvCHIT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种AvCHIT1基因，所述AvCHIT1基因为权利要求1所述的AvCHIT1蛋白的编码基因；所述AvCHIT1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的AvCHIT1蛋白或权利要求2所述的AvCHIT1基因在调控植物耐盐性中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述调控包括：提高AvCHIT1蛋白表达量或提高AvCHIT1基因表达量提高植物耐盐性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述提高植物耐盐性包括提高植物萌发率。
6.根据权利要求3～5任一项所述的应用，所述植物包括罗布麻和/或拟南芥。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的AvCHIT1基因。
8.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包含权利要求6所述的重组表达载体。
9.权利要求1所述的AvCHIT1蛋白或权利要求2所述的AvCHIT1基因或权利要求7所述的重组表达载体或权利要求8所述的重组菌在培育耐盐植物品种中的应用。
10.一种提高植物耐盐性的方法，其特征在于，包括：将权利要求7所述的重组表达载体或权利要求8所述的重组菌转入植物中。
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