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CN118064468A - 一种重组弹性蛋白、制备方法及其应用 - Google Patents

一种重组弹性蛋白、制备方法及其应用 Download PDF

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CN118064468A CN202410437908.2A CN202410437908A CN118064468A CN 118064468 A CN118064468 A CN 118064468A CN 202410437908 A CN202410437908 A CN 202410437908A CN 118064468 A CN118064468 A CN 118064468A
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Abstract

本发明提供一种重组弹性蛋白、制备方法及其应用，属于结合组织肽技术领域，所述重组弹性蛋白由以下模块依次串联：信号肽、截短的弹性蛋白、His标签、连接子、弹性蛋白外显子30；所述截短的弹性蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的任一种所示。本申请对截短的弹性蛋白的核苷酸序列进行优化后，其构建的重组表达载体具有更强的表达重组弹性蛋白的能力；本申请核苷酸序列优化后的重组弹性蛋白，其促进成纤维细胞增殖和促进成纤维细胞分泌原胶原蛋白的效果明显优于核苷酸序列优化前的重组弹性蛋白。

Description

一种重组弹性蛋白、制备方法及其应用
技术领域
本发明提供一种重组弹性蛋白、制备方法及其应用，属于结合组织肽技术领域。
背景技术
弹性蛋白是皮肤真皮层中一种重要的结构蛋白，在维持皮肤形态中扮演重要角色。弹性蛋白赋予皮肤弹性，并参与调节细胞的增殖和分化等基本的生理过程。变性弹性蛋白在真皮中的堆积，会引起弹性纤维增粗、卷曲和排列紊乱，导致皮肤弹性降低，屏障能力减弱，进而产生皱纹、斑块与结节。 因此，弹性蛋白在皮肤医学中的应用备受关注。
在现有技术中，弹性蛋白主要依靠从动物组织中提取，动物提取的弹性蛋白，易降解为片段，丧失弹性蛋白的结构特征和生物活性，并且存在病毒传播风险，严重限制了其在组织工程领域的应用。而随着生物技术的发展，利用基因重组技术获得的重组弹性蛋白已取得巨大成果，与天然弹性蛋白相比，利用该技术生产的重组弹性蛋白解决了传统提取法存在的病毒隐患缺陷，同时又显著提高了弹性蛋白的稳定性、亲水性和生物相容性，因此，基因重组弹性蛋白引起越来越多的关注。
当前重组蛋白的生产主要有四大系统：原核表达系统最常用的大肠杆菌蛋白表达、真核表达系统如酵母、哺乳动物细胞蛋白表达(常用的细胞为CHO、HEK293)及昆虫细胞蛋白表达系统。各种表达系统各有优缺点，使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低，大肠杆菌系统还是被证明是最受欢迎的重组药物蛋白表达宿主，但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低；酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，成本低，但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同；哺乳动物细胞表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态，但表达量低，操作繁琐。
CN115772216A公开了一种重组弹性蛋白的生产方法，涉及基因重组工程菌发酵纯化技术领域。其中重组弹性蛋白的生产方法包括使用特异性发酵培养基、培养方法、诱导方法、破胞方法、纯化方法获得重组弹性蛋白。
CN115925986A公开了一种重组融合弹性蛋白、制备方法及应用，所述重组融合弹性蛋白包括弹性蛋白序列与Sc12蛋白折叠结构域，弹性蛋白的氨基酸序列完全来自于人弹性蛋白；
所述重组融合弹性蛋白在大肠杆菌工程菌中高效表达。
CN113993885A公开了重组弹性蛋白及其生产，其提供了非天然存在的截短的弹性蛋白分子，所述非天然存在的截短的弹性蛋白可以减少细胞外基质的降解。
CN117551184A公开了一种重组弹性蛋白和制备方法及其用途，该重组弹性蛋白良好的生物相容性和生物活性，对于皮肤修改功能强。
上述发明申请在制备或在生产重组弹性蛋白时，均选择了原核表达系统，即大肠杆菌表达系统。虽然大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低，但这种表达系统获得的目的蛋白通常以包涵体形式表达，产物纯化困难；另外，原核表达系统缺乏翻译后修饰机制或翻译后加工修饰体系不完善，很难形成接近天然的弹性蛋白以及蛋白表达产物的生物活性较低。
现有技术中尚未有使用哺乳动物细胞表达系统表达重组弹性蛋白的报道。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种重组弹性蛋白、制备方法及其应用，实现以下发明目的：采用哺乳动物细胞表达系统表达重组弹性蛋白，提高重组弹性蛋白的表达水平，提高重组弹性蛋白对成纤维细胞的增殖作用以及对原胶原蛋白的分泌水平，提高重组弹性蛋白的抗炎和光保护作用。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种重组弹性蛋白，所述重组弹性蛋白由以下模块依次串联：信号肽、截短的弹性蛋白、His标签、连接子、弹性蛋白外显子30；所述截短的弹性蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5中的任一种所示。
所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述His标签的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述连接子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；所述弹性蛋白外显子30的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。
所述制备方法为将重组弹性蛋白的核苷酸序列连接到载体上，获得重组表达载体，然后转染CHO细胞，表达得到重组弹性蛋白。
所述的重组弹性蛋白在制备护肤品中的应用。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
（1）本申请重组弹性蛋白的表达选择的是哺乳动物细胞表达系统，哺乳动物细胞表达系统能够为重组人源蛋白提供最接近于天然状态的翻译后修饰，在蛋白表达过程中会形成接近天然蛋白的蛋白质折叠和聚合，具备活性蛋白所必须的空间结构和修饰，在活性方面远胜于原核表达系统及酵母、昆虫细胞等真核表达系统。
（2）本申请对截短的弹性蛋白的核苷酸序列进行优化后，其构建的重组表达载体具有更强的表达重组弹性蛋白的能力。
（3）本申请核苷酸序列优化后的重组弹性蛋白，其促进成纤维细胞增殖和促进成纤维细胞分泌原胶原蛋白的效果明显优于核苷酸序列优化前的重组弹性蛋白。
（4）本申请核苷酸序列优化后的重组弹性蛋白，具有更强的抗炎、光保护作用。
（5）本申请重组弹性蛋白的结构中包括弹性蛋白外显子30，弹性蛋白外显子30可以在外源因子的作用下提高弹性蛋白的产量。
附图说明
图1为重组弹性蛋白的结构示意图；
图2为重组表达载体转染CHO细胞后上清中重组弹性蛋白含量的柱状图；
图3为pcDNA3.1-ELN1-Exon30和pcDNA3.1-ELN1-优化前-Exon30稳转CHO细胞系中GFP表达率的流式检测图；
其中A为pcDNA3.1-ELN1-优化前-Exon30稳转CHO细胞系中GFP表达率的流式检测图；B为pcDNA3.1-ELN1-Exon30稳转CHO细胞系中GFP表达率的流式检测图；
图4为实施例5中His抗体鉴定结果图；
图5为实施例6中成纤维细胞的上清中原胶原蛋白含量的柱状图；
图6为实施例7中角质形成细胞上清中IL-6的含量的柱状图；
图7为实施例7中角质形成细胞上清中IL-8的含量的柱状图；
图8为实施例7中角质形成细胞的抗氧化基因GPX2的相对表达量的柱状图；
图9为实施例8中3种重组弹性蛋白mRNA的相对表达量的柱状图；
图10为实施例8中稳转CHO细胞上清中3种重组弹性蛋白含量的柱状图。
具体实施方式
实施例1 重组弹性蛋白结构的设计
所述重组弹性蛋白从N端到C端依次由以下模块依次串联：
信号肽、截短的弹性蛋白（简称为ELN）、His标签、连接子、弹性蛋白外显子30（简称为Exon30）；
所述信号肽用于引导和促进蛋白的分泌，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述His标签用于蛋白的鉴定与纯化，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述连接子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；所述弹性蛋白外显子30可以与外源的细胞因子TGF-β相互作用，延长弹性蛋白mRNA的半衰期及增强mRNA的稳定性，从而促进弹性蛋白的表达，所述弹性蛋白外显子30的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示，重组弹性蛋白的具体结构示意如图1所示。
实施例2 重组弹性蛋白载体的构建
在全长弹性蛋白氨基酸序列（NCBI 参考序列：NP_001265868.1）中选取5个不同位置的截短的弹性蛋白氨基酸序列（ELN1：386-786；ELN2:1-371；ELN3：499-786；ELN4:1-253；ELN5:661-786），并对其核苷酸序列进行了密码子优化。
优化后的核苷酸序列分别为：
①ELN1的核苷酸序列（SEQ ID NO.1）；
②ELN2的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）；
③ELN3的核苷酸序列（SEQ ID NO.3）；
④ELN4的核苷酸序列（SEQ ID NO.4）；
⑤ELN5的核苷酸序列（SEQ ID NO.5）；
将上述5个截短的弹性蛋白的核苷酸序列分别按照实施例1所述的重组弹性蛋白的结构进行重组，分别构建编码ELN1重组弹性蛋白的核苷酸序列、编码ELN2重组弹性蛋白的核苷酸序列、编码ELN3重组弹性蛋白的核苷酸序列、编码ELN4重组弹性蛋白的核苷酸序列、编码ELN5重组弹性蛋白的核苷酸序列。
将上述编码重组弹性蛋白的核苷酸序列，委托山东弘诺生物科技有限公司合成，将其分别连接到pcDNA3.1-EGFP-T2A-Puro载体上，获得的重组载体分别命名为pcDNA3.1-ELN1-Exon30，pcDNA3.1-ELN2-Exon30，pcDNA3.1-ELN3-Exon30，pcDNA3.1-ELN4-Exon30，pcDNA3.1-ELN5-Exon30。按照常规实验方法对这些载体进行转化、摇菌并提取质粒，各种质粒的浓度均调整为1.0μg/μL，得到5种含有Exon30的pcDNA3.1重组表达载体。
另外，将上述5个截短的弹性蛋白的核苷酸序列替换成密码子优化之前的核苷酸序列， 将ELN1优化前的核苷酸序列（SEQ ID NO.10）、ELN2优化前的核苷酸序列（SEQ IDNO.11）、ELN3优化前的核苷酸序列（SEQ ID NO.12）、ELN4优化前的核苷酸序列（SEQ IDNO.13）、ELN5优化前的核苷酸序列（SEQ ID NO.14），分别按照实施例1所述的重组弹性蛋白的结构进行重组，委托山东弘诺生物科技有限公司合成，将其分别连接到pcDNA3.1-EGFP-T2A-Puro载体上，获得的重组载体分别命名为pcDNA3.1-ELN1-优化前-Exon30，pcDNA3.1-ELN2-优化前-Exon30，pcDNA3.1-ELN3-优化前-Exon30，pcDNA3.1-ELN4-优化前-Exon30，pcDNA3.1-ELN5-优化前-Exon30。按照常规实验方法对这些载体进行转化、摇菌并提取质粒，各种质粒的浓度均调整为1.0μg/μL，得到5种优化前含有Exon30的pcDNA3.1重组表达载体。
实施例3 重组表达载体转染CHO细胞及重组弹性蛋白含量检测
1、CHO细胞的培养
（1）复苏细胞：将液氮中冷冻保存的1管CHO细胞（体积为1mL）于37℃水浴锅中迅速摇晃解冻，将解冻后的细胞转移至50mL离心管中，400g，离心5分钟，弃去上清液，加5mLDMEM完全培养基后吹匀，然后将所有细胞悬液加入培养瓶中，于37℃、5%CO2培养箱培养；DMEM完全培养基为含10Vol% FBS的DMEM高糖培养基（购自Gibco）。
（2）细胞传代：细胞密度达80%以上，即可进行传代培养，第一次传代后的细胞培养至细胞状态良好，活力98%以上，取对数生长期的细胞稀释至5×105个/mL，接种至六孔板中（每孔加入1mL细胞悬液），每孔补加1mL DMEM高糖培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞密度达到50%的汇合率即可进行转染。
2、重组表达载体转染CHO细胞
（1）转染前，将培养基更换为新鲜的DMEM高糖培养基。
（2）取一只洁净无菌的离心管，加入246μL DMEM高糖培养基，再加入4μL的实施例2制备的pcDNA3.1重组表达载体（4μg）混匀，得到DNA溶液； 取另一只洁净无菌的离心管，加入238μL的DMEM高糖培养基，再加入12μL的LipofiterTM，用枪轻轻吹打混匀，终体积250μL，得到LipofiterTM溶液。
（3）将 DNA溶液和LipofiterTM溶液充分混匀后，室温孵育20min，得到LipofiterT M-DNA的培养液，将上述六孔板中的待转染的CHO细胞，去掉上清，将LipofiterTM -DNA的培养液加入到六孔板中的一个孔中置于37℃、5%CO2的培养箱中培养6h。
（4）去除含有LipofiterTM-DNA的培养液，每孔加入2mL新鲜的DMEM完全培养基继续培养。
（5）转染48小时后，在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达率在50%左右，取部分细胞培养液在3000rpm下，离心5min后，收集上清，通过弹性蛋白ELISA试剂盒（ml025439；购自酶联生物）检测上清中重组弹性蛋白的含量。
结果如表1和图2所示，可见①本发明的各重组表达载体转染的CHO细胞均能够分泌重组弹性蛋白，但上清中重组弹性蛋白的含量有显著差异，这表明截短的弹性蛋白的序列影响重组表达载体表达重组弹性蛋白的能力；②本发明截短的弹性蛋白的核苷酸序列经密码子优化后，其构建的重组表达载体具有更强的表达重组弹性蛋白的能力，其中编码ELN3重组弹性蛋白的重组表达载体的效果最好。
表1 CHO细胞上清中重组弹性蛋白的含量
实施例4 稳转细胞系的筛选
（1）向实施例3步骤（5）转染48小时的CHO细胞培养液中加入终浓度为600μg/mL的G418（购自MCE，货号HY-17561），筛选稳转细胞系，每隔2天更换新鲜的含有600μg/mL G418的DMEM完全培养基，每孔加入量为2mL。
（2）筛选第6天，观察细胞生长状态，细胞出现大量死亡，此时选用适应性培养基（每孔加入量为2mL），继续进行筛选。
适应性培养基的制备方法为：细胞转染前，在细胞密度达到50%的时候，部分细胞用于收集培养液，将培养液在3000rpm下离心10min，上清进行过滤（0.22μm）后，和含有600μg/mL G418的DMEM完全培养基按1：1（体积比）混合，得到适应性培养基，在4℃下备用。
（3）筛选第14天，可见细胞成簇状分布，有抗性克隆出现。
（4）将细胞簇消化后进行传代培养，定期在荧光显微镜下观察细胞中GFP的表达情况，在其表达率达到90%以上时，收集细胞，用流式细胞仪测定GFP的表达率，侧面反映pcDNA3.1重组表达载体在稳转CHO细胞系中的表达情况。
本发明的5种含有Exon30的pcDNA3.1重组表达载体、5种优化前含有Exon30的pcDNA3.1重组表达载体，分别按照上述方法制备得到稳转CHO细胞系，各稳转CHO细胞系中GFP的表达率如表2所示。
表2各稳转CHO细胞系中GFP的表达率
实施例5 重组蛋白的鉴定及纯化浓缩
将筛选得到的不同重组表达载体稳转CHO细胞系，进行扩大培养，收集上清获得重组弹性蛋白，根据Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化法将收集的上清进行纯化，得到纯化后的重组弹性蛋白溶液，对纯化后的蛋白利用His抗体进行鉴定。
ELN1-Exon30与ELN1-优化前-Exon30重组弹性蛋白的大小约为35KD；ELN2-Exon30与ELN2-优化前-Exon30重组弹性蛋白的大小约为33KD；ELN3-Exon30与ELN3-优化前-Exon30重组弹性蛋白的大小约为26KD；ELN4-Exon30与ELN4-优化前-Exon30重组弹性蛋白的大小约为23KD；ELN5-Exon30与ELN5-优化前-Exon30重组弹性蛋白的大小为约11KD；利用His抗体鉴定，结果如图4所示，实际重组弹性蛋白大小与预测的重组弹性蛋白大小一致。
将纯化后的5种核苷酸序列优化后的重组弹性蛋白溶液及5种核苷酸序列优化前的重组弹性蛋白溶液分别用PBS稀释（购自索莱宝，货号：P1020）到1mg/mL备用；分别命名为：核苷酸序列优化后ELN1、核苷酸序列优化后ELN2、核苷酸序列优化后ELN3、核苷酸序列优化后ELN4、核苷酸序列优化后ELN5、核苷酸序列优化前ELN1、核苷酸序列优化前ELN2、核苷酸序列优化前ELN3、核苷酸序列优化前ELN4、核苷酸序列优化前ELN5。
实施例6 重组弹性蛋白对成纤维细胞活力及原胶原蛋白合成的影响
1、重组弹性蛋白对成纤维细胞活力的影响
（1）取对数生长期的人成纤维细胞，用成纤维细胞成长培养基（10Vol%FBS+FGM培养基）稀释得到细胞悬液，按照8×104个/孔的密度，将细胞悬液接种于培养板中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。
（2）待其细胞铺板率达到40％，更换成纤维细胞成长培养基（每孔加入100μL），对照组每孔加入200μL PBS溶液；样品组每孔加入200μL 纯化后的各重组弹性蛋白溶液(实施例5制备，终浓度为10μg/mL)；调零组无细胞接种，仅加入200μL成纤维细胞成长培养基。放置在培养箱(37℃、5％CO2)中培养，细胞孵育培养48h后，弃掉上清，加入含有0.5mg MTT的培养基200μL，37℃避光孵育2h，孵育结束后，弃掉上清，每孔加100μL的DMSO，在 490nm处读取OD值。
细胞相对活率=（样品组-调零组）/（对照组-调零组）×100%
如表3所示：根据MTT结果，重组弹性蛋白在终浓度为10μg/mL的情况下未表现出细胞毒性。相比较对照组，经重组弹性蛋白处理后的细胞活率显著升高，表现出促进成纤维细胞增殖的作用，且本发明核苷酸序列优化后的重组弹性蛋白的促进成纤维细胞增殖的作用优于核苷酸序列优化前的重组弹性蛋白。
表3重组弹性蛋白处理后成纤维细胞的活率
2、重组弹性蛋白对成纤维细胞原胶原蛋白合成的影响
成纤维细胞是细胞外基质肽的主要来源，包括原胶原蛋白和弹性蛋白。原胶原蛋白是由皮肤真皮层成纤维细胞合成的大肽，是胶原蛋白的前体。当肽被加工形成成熟的胶原蛋白时，前肽蛋白（I 型胶原C末端肽）被切割掉。然后，成熟的胶原蛋白和I 型胶原C末端肽片段都被释放到细胞外环境中。因此，可通过人I型胶原C末端肽（ICTP）ELISA试剂盒（ml062889；购构自酶联生物）检测I型C肽来反应原胶原蛋白合成含量。
（1）取对数生长期的人成纤维细胞稀释至5×105个/mL，接种至六孔板中（每孔加入1mL细胞悬液），每孔补加1mL成纤维细胞成长培养基，于37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜。
（2）第二天更换新鲜的成纤维细胞成长培养基，待细胞密度达到50%的汇合率时，加入终浓度为（10μg/mL）的重组弹性蛋白溶液处理细胞36小时，未处理的细胞作为阴性对照。
（3）收集细胞培养液，离心（3000rpm，5min）后，收集上清，通过ICTP ELISA试剂盒检测原胶原蛋白的表达。
如表4和图5所示：本发明的重组弹性蛋白均能够促进成纤维细胞原胶原蛋白的分泌，但核苷酸序列优化后的重组弹性蛋白相较于优化前的重组弹性蛋白，其促原胶原蛋白的分泌效果明显更好，其中核苷酸序列优化后的ELN3促原胶原蛋白分泌的效果最好。
表4成纤维细胞的上清中原胶原蛋白的含量
实施例7 重组弹性蛋白对炎性细胞因子及抗氧化基因的影响
角质形成细胞在皮肤的免疫反应中起着重要作用，可以通过刺激（刺激性化学物质或紫外线辐射）皮肤炎症激活TNFα和IL-1β的分泌，因此，在维持皮肤稳态方面具有重要作用。
1、重组弹性蛋白对炎性因子的影响
（1）按照常规技术培养角质形成细胞，取对数生长期的角质形成细胞接种于6孔板中，每孔接种5×105个细胞，于37℃、5%CO2的培养箱中过夜培养。
（2）待细胞融合度达到70%时，将细胞暴露于50mJ/cm2强度的中波紫外线（UVB）中2小时。
（3）UVB处理结束后，立即加入终浓度为10μg/mL纯化后的重组弹性蛋白溶液（实施例5制备），于37℃、5%CO2的培养箱中孵育24小时，将暴露于UVB未加入纯化后的重组弹性蛋白溶液的细胞作为对照组。
（4）孵育结束后，收集细胞培养液，3000rpm离心5min后，收集上清，通过ELISA试剂盒炎症细胞因子（IL-6、IL-8）含量。
结果如表5、表6、图6、图7所示：角质形成细胞在UVB照射下，释放大量的炎症细胞因子（IL-6、IL-8），与未处理的细胞相比，重组弹性蛋白能够显著降低角质形成细胞炎性细胞因子的释放，即本发明的重组弹性蛋白具有抗炎及光保护作用，另外，经核苷酸序列优化后的重组弹性蛋白具有更强的抗炎及光保护作用。
表5 角质形成细胞上清中炎症因子IL-6的含量
表6角质形成细胞上清中炎症因子IL-8的含量
2、重组弹性蛋白对角质形成细胞的抗氧化基因的影响
（1）取对数生长期的角质形成细胞接种于6孔板中，每孔接种5×105个细胞，于37℃、5%CO2的培养箱中过夜培养。
（2）待细胞密度达到70%的汇合率时，加入终浓度为10μg/mL的纯化后的重组弹性蛋白溶液（实施例5制备）处理细胞24小时，未处理的细胞作为阴性对照。
（3）细胞处理结束后，收集细胞并提取RNA，检测分析抗氧化基因GPX2的表达情况。
如图8所示：本发明的重组弹性蛋白均能够促进角质形成细胞的抗氧化基因表达上调，表明本发明的重组弹性蛋白具有良好的抗氧化能力。另外，本发明核苷酸序列优化后的重组弹性蛋白相较于核苷酸序列优化前的重组弹性蛋白，其抗氧化能力明显增强，相比较于对照组，经核苷酸序列优化后ELN3处理后的角质形成细胞，其抗氧化基因GPX2的表达水平提高4.1倍。
实施例8 外源的细胞因子TGF-β处理重组表达载体稳转CHO细胞
由于编码ELN3重组弹性蛋白具有更强的合成弹性蛋白的能力且促原胶原蛋白分泌效果明显更好以及更强的抗氧化能力，故本实施例选择pcDNA3.1-ELN3-Exon30稳转CHO细胞、pcDNA3.1-ELN3-优化前-Exon30稳转CHO细胞进行以下试验。
1、构建不含Exon30的重组弹性蛋白载体（pcDNA3.1-ELN3）：
与实施例1的区别之处：重组弹性蛋白的结构中不包括连接子（核苷酸序列为SEQID NO.8）及弹性蛋白外显子30（核苷酸序列为SEQ ID NO.9）。
将截短的弹性蛋白ELN3构建不含Exon30的重组弹性蛋白，按照实施例2-4的步骤筛选不含Exon30的重组弹性蛋白稳转CHO细胞，命名为pcDNA3.1-ELN3稳转CHO细胞。
2、TGF-β处理重组表达载体稳转CHO细胞
（1）将pcDNA3.1-ELN3-Exon30稳转CHO细胞、pcDNA3.1-ELN3-优化前-Exon30稳转CHO细胞及pcDNA3.1-ELN3稳转CHO细胞分别接种于6孔板中（接种密度5×105/孔），待细胞密度达50%，添加终浓度为20ng/mL外源细胞因子TGF-β处理，未加TGF-β处理的细胞作为阴性对照；
（2）TGF-β处理48小时后，分别收集细胞与上清，进行重组弹性蛋白mRNA表达量及重组弹性蛋白含量的检测。
图9和图10中 “+”代表添加外源细胞因子，“-”代表没加外源细胞因子；
如图9所示：pcDNA3.1-ELN3的mRNA表达量受外源细胞因子TGF-β的影响较小，本发明的含Exon30的重组弹性蛋白在外源细胞因子TGF-β的刺激下，其mRNA表达量显著提高，这表明TGF-β与弹性蛋白外显子30相互作用，能够延缓重组弹性蛋白的mRNA的降解，延长重组弹性蛋白的mRNA半衰期，增强mRNA的稳定性，从而促进重组弹性蛋白量的表达。
如图10所示：不含Exon30的稳转CHO细胞（pcDNA3.1-ELN3）在外源细胞因子TGF-β刺激下，其分泌重组弹性蛋白的能力没有明显变化，而含Exon30稳转CHO细胞（pcDNA3.1-ELN3-Exon30与pcDNA3.1-ELN3-优化前-Exon30）在TGF-β刺激下，分泌重组弹性蛋白的能力均显著提高，分别提高2.6倍、1.9倍。

Claims (4)

1.一种重组弹性蛋白，其特征在于：所述重组弹性蛋白由以下模块依次串联：信号肽、截短的弹性蛋白、His标签、连接子、弹性蛋白外显子30；所述截短的弹性蛋白的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中的任一种所示。
2.根据权利要求1所述的一种重组弹性蛋白，其特征在于：所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述His标签的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述连接子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；所述弹性蛋白外显子30的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。
3.权利要求2所述重组弹性蛋白的制备方法，其特征在于：所述制备方法为将重组弹性蛋白的核苷酸序列连接到载体上，获得重组表达载体，然后转染CHO细胞，表达得到重组弹性蛋白。
4.权利要求1所述的重组弹性蛋白在制备护肤品中的应用。
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