[go: up one dir, main page]

CN118064346B - 重组基因工程菌株及其构建方法、pqq的发酵生产方法 - Google Patents

重组基因工程菌株及其构建方法、pqq的发酵生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN118064346B
CN118064346B CN202410465220.5A CN202410465220A CN118064346B CN 118064346 B CN118064346 B CN 118064346B CN 202410465220 A CN202410465220 A CN 202410465220A CN 118064346 B CN118064346 B CN 118064346B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
pqq
seq
genes
genetic engineering
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202410465220.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN118064346A (zh
Inventor
袁强
郭帅印
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Juntai Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shandong Juntai Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Juntai Pharmaceutical Co ltd filed Critical Shandong Juntai Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202410465220.5A priority Critical patent/CN118064346B/zh
Publication of CN118064346A publication Critical patent/CN118064346A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN118064346B publication Critical patent/CN118064346B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/01004—Glutamate dehydrogenase (NADP+) (1.4.1.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01001—Amino-acid N-acetyltransferase (2.3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
    • C12Y207/02011—Glutamate 5-kinase (2.7.2.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03027—Anthranilate synthase (4.1.3.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01051—Prephenate dehydratase (4.2.1.51)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于PQQ生产技术领域，涉及发酵生产PQQ的技术，具体涉及重组基因工程菌株及其构建方法、PQQ的发酵生产方法。以大肠杆菌BL21(DE3)作为出发菌株，敲除proB基因、argA基因、tyrR基因、trpE基因、pheA基因，转入PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因使其过表达PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因。经过实验表明，该工程菌株的最高发酵产量可达2.6 g/L。

Description

重组基因工程菌株及其构建方法、PQQ的发酵生产方法
技术领域
本发明属于PQQ生产技术领域，涉及发酵生产PQQ的技术，具体涉及重组基因工程菌株及其构建方法、PQQ的发酵生产方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
PQQ，吡咯喹啉醌是一种重要的氧化还原辅基，具有多种生理化学功能，在食品、医药卫生及农业畜牧业等领域具有广泛的应用。随着医药、化妆品、保健品以及食品行业的发展，PQQ市场需求量逐年递增，目前，全球主要供应商为日本三菱瓦斯化学，另外部分通过植物提取制备PQQ，但植物提取存在含量低，提取难度高，生产周期长等问题，化学合成过程相当复杂、收率低等也不易推广。相比之下生物发酵制备PQQ具有条件温和、合成过程易于控制，对环境无污染等优点，是未来工业化生产PQQ的发展方向。
据发明人研究了解，生物发酵制备PQQ的主要问题在于产量较低，为了提高生物发酵生产PQQ的产量，目前采用生物工程对菌株的基因进行重组，改变菌株的代谢途径，从而改变PQQ的产量，例如杨雪鹏等在大肠杆菌Escherichia coli中表达来源于G.oxydans621H中的PQQ合成基因簇pqqABCDEF获得了1.98g/L的产量。孙继国等在大肠杆菌Escherichia coli中表达来源于K. pneumoniae的PQQ合成基因簇pqqABCDEF，PQQ产量为1700 nmol/L。Meulenberg等在E. coli中克隆表达来源于 K. pneumoniae的 6.7 kb pqq基因簇，PQQ产量仅为280 nmol/L。虽然上述方法可以在一定程度上提高PQQ的产量，但是其产量仍然有待进一步提高。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供重组基因工程菌株及其构建方法、PQQ的发酵生产方法，本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术增强Glu 和 Tyr的合成力，过表达PQQ合成基因簇及促进合成相关基因tldD，构建出一株高产PQQ的大肠杆菌工程菌株，经过实验表明，该工程菌株的最高发酵产量可达2.6 g/L。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，一株重组基因工程菌株，以大肠杆菌BL21(DE3)作为出发菌株，敲除proB基因、argA基因、tyrR基因、trpE基因、pheA基因，转入PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因使其过表达PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因。
在一些实施例中，proB基因的靶点PAM序列如SEQ ID NO.2所示，argA基因的靶点PAM序列如SEQ ID NO.1所示，tyrR基因的靶点PAM序列如SEQ ID NO.7所示，trpE基因的靶点PAM序列如SEQ ID NO.8所示，pheA基因的靶点PAM序列如SEQ ID NO.9所示，PK基因的碱基序列如SEQ ID NO.44所示，gdhA基因的碱基序列如SEQ ID NO.45所示，fpK基因的碱基序列如SEQ ID NO.46所示，PQQ合成基因簇pqqABCDE/F的碱基序列如SEQ ID NO.47所示，tldD基因的碱基序列如SEQ ID NO.48所示。
第二方面，一种上述重组基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
将大肠杆菌基因组中的proB基因、argA基因、tyrR基因、trpE基因、pheA基因敲除，获得突变菌株；
将PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因转入至突变菌株，即得所述大肠杆菌基因工程菌株。
在一些实施例中，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行敲除。
具体地，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行敲除的过程包括sgRNA载体的构建过程和donor DNA的构建过程。
更为具体地，sgRNA载体的构建过程中，proB基因的引物序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，argA基因的引物序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示， tyrR基因的引物序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示， trpE基因的引物序列分别如SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13所示， pheA基因的引物序列分别如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15所示。
更为具体地，donor DNA的构建过程中，敲除proB基因的引物序列分别如SEQ IDNO.20~23所示，敲除argA基因的引物序列分别如SEQ ID NO.16~19所示，敲除tyrR基因的引物序列分别如SEQ ID NO.24~27所示，敲除trpE基因的引物序列分别如SEQ ID NO.28~31所示，敲除pheA基因的引物序列分别如SEQ ID NO.32~35所示。
在一些实施例中，通过电转化法将PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因转入至突变菌株。
第三方面，一种PQQ的发酵生产方法，采用上述重组基因工程菌株进行发酵，即得。
在一些实施例中，在进行所述发酵前对所述重组基因工程菌株进行种子培养。具体地，所述种子培养的培养基为LB培养基。
在一些实施例中，所述发酵的条件为：温度为28~32 ℃，时间为48~72 h。
在一些实施例中，所述发酵的发酵培养基中含有：0.9~1.1 g/L Glu、2.9~3.1 g/LL-Tyr、5.9~6.1 g/L KH2PO4、16.3~16.5 g/L K2HPO4、4.9~5.1 g/L (NH4)2SO4、1.0~1.2 g/L柠檬酸、0.9~1.1 g/L MgSO4、9.9~10.1 g/L 酵母膏、6.9~7.1 g/L 葡萄糖、0.09~0.11 g/L维生素B1、1.9~2.1 mL/L 微量元素。
具体地，所述微量元素包括：9.9~10.1 g/L FeSO4·7H2O、1.52~1.53 g/L CaCl2、2.1~2.2 g/L ZnSO4·7H2O、0.9~1.1g MnSO4·4H2O、0.9~1.1 g/L CuSO4·5H2O、0.09~0.11g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.19~0.21 g/L Na2B4O7·10H2O、0.9~1.1 g/L NiCl2、0.9~1.1 g/LH3BO3、9.9~10.1 mL/L HCl。
在一些实施例中，所述发酵的补料培养基中含有：490~510 g/L 葡萄糖、6.9~7.1g/L MgSO4、9.9~10.1 g/L Glu、29~30 g/L Tyr、0.9~1.1 mL/L 微量元素。
本发明的有益效果为：
本发明利用代谢工程手段通过敲除基因proB、argA、过表达基因PK、gdhA，增加谷氨酸的累积；敲除tyrR基因解除酪氨酸合成反馈调节抑制，敲除trpE、pheA同时过表达基因fpK增强酪氨酸合成，最后过表达PQQ合成基因簇pqqABCDE/F以及与PQQ合成相关基因tldD，从而构建了重组基因工程菌株。该重组基因工程菌株能够高效累积Glu和Tyr，从而有效提高PQQ的发酵效率，达到高产PQQ的目的。经过实验研究表明，采用本发明提供的重组基因工程菌株连续发酵的最高产量可达2.6g/L，为工业化大规模生产PQQ提供了新方案。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例在大肠杆菌BL21(DE3)中构建的PQQ合成途径；
图2为本发明实施例中donor DNA制备原理示意图；
图3为本发明实施例中pACYC-T7p-PK-RBS-gdhA-T7p-fpK-T7t过表达载体的构建图谱；
图4为本发明实施例中pRSF-T7p-pqqABCDE/F-T7p-tldD-T7t过表达载体的构建图谱；
图5为本发明实施例中液相分析PQQ产量的柱状图。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
在大肠杆菌BL21(DE3)（通过购买获得）中，从头构建PQQ合成途径，其合成途径如图1所示，根据合成途径通过CRISPR/Cas9基因编辑技术增强Glu和Tyr的合成力。
制备相应sgRNA载体进行基因敲除：
1. 敲除基因argA与proB阻断谷氨酸代谢，促进谷氨酸累积。基因argA与proB的靶点PAM序列如下表所示：
根据PAM序列设计引物构建sgRNA载体，设计的相应引物如下表所示：
以pTarget-sgRNA载体为模板，分别以引物sg-argA-F/ sg-argA-R、sg-proB-F/sg-proB-R进行全质粒PCR，所用聚合酶为KOD -Plus- Neo，PCR程序为95℃预变性3min，95℃变性10s，58℃退火10s，68℃延伸1min，68℃终延伸5min，95℃变性10s，58℃退火10s，68℃延伸1min执行25个循环，然后用核酸酶DpnI消化去除模板，通过纯化试剂盒进行产物回收备用。以化学法转化大肠杆菌DH5a感受态，鉴定测序获得阳性克隆，转化方法：50ng全质粒PCR回收产物被加入进100ul感受态细胞中，轻轻混匀，然后冰上静置20min，42℃水浴热激90s，冰上静置5min，加入800ul LB培养基，37℃，220r摇床孵育45min，最后涂布抗性平板，37℃恒温箱过夜培养，挑单克隆送测序获得阳性克隆。
2. 敲除基因tyrR解除上游酪氨酸合成反馈调节抑制，促进酪氨酸合成，敲除基因trpE和pheA阻断合成酪氨酸支路代谢，促进酪氨酸累积。基因tyrR、trpE和pheA靶点PAM序列如下表所示：
根据PAM序列设计引物构建sgRNA载体，设计的相应引物如下表所示：
制备相应donor DNA进行基因敲除：
1. donor DNA为敲除基因argA引物设计：
up-argA-F: gggttactcaacgcgaactgcttata，如SEQ ID NO.16所示；
up-argA-R: atcgcggcacacctctttgcatgattattcgaaattagtgt，如SEQ ID NO.17所示；
dw-argA-F: gcaaagaggtgtgccgcgatgaaaatcgtcggatgcgacatgcgtaac，如SEQ IDNO.18所示；
dw-argA-R: gtacgaaggtcgaccggtgatgattgc，如SEQ ID NO.19所示。
参考参考基因组GenBank: CP001509进行引物设计，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,分别以引物up-iclR-F/ up-iclR-R和dw-iclR-F/ dw-iclR-R进行PCR，所用聚合酶为KOD -Plus- Neo, PCR程序为95℃预变性3min，95℃变性10s, 58℃退火10s，68℃延伸1min, 68℃终延伸5min，95℃变性10s, 58℃退火10s，68℃延伸1min执行25个循环。然后通过纯化试剂盒进行产物回收进行下一步重叠延伸PCR，各取100ng纯化产物混合加入聚合酶，PCR程序为95℃预变性3min，95℃变性10s, 58℃退火10s，68℃延伸1min, 68℃终延伸5min，95℃变性10s, 58℃退火10s，68℃延伸1min执行10个循环，然后通过纯化试剂盒进行产物回收作为Donor DNA备用。
2. donor DNA为敲除基因proB引物设计：
up-proB-F: tcagttgatcgttaatttgtgtttc，如SEQ ID NO.20所示；
up-proB-R: ctgctccgattctctgccattcaattttaggaaaaatgatatc，如SEQ ID NO.21所示；
dw-proB-F: gaatggcagagaatcggagcaggctgatgctggaacaaatg，如SEQ ID NO.22所示；
dw-proB-R: ggatcaccgcattaccggttttcaggc，如SEQ ID NO.23所示。
同上，分别以两对引物，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板进行PCR制备上下游同源臂，然后再以上下游同源臂进行重叠延伸PCR，最终获得donor DNA。
3. donor DNA为敲除基因tyrR引物设计：
up-tyrR-F: gtcgatatggcgtttatcgcc，如SEQ ID NO.24所示；
up-tyrR-R: catattcgcgcgggaaccttcacctgaaaaaagaacaattaatatg，如SEQ IDNO.25所示；
dw-tyrR-F: ggtgaaggttcccgcgcgaatatgcctgatggtgcaacaccatcag，如SEQ IDNO.26所示；
dw-tyrR-R: gcgcagacttttactctcgtggcaaaag，如SEQ ID NO.27所示。
同上，分别以两对引物，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板进行PCR制备上下游同源臂，然后再以上下游同源臂进行重叠延伸PCR，最终获得donor DNA。
4. donor DNA为敲除基因trpE引物设计：
up-trpE-F: gtggtgtcatggtcggtgatc，如SEQ ID NO.28所示；
up-trpE-R: gtcagccatgttattctctaattttgttcaaaaaaaagcccgc，如SEQ ID NO.29所示；
dw-trpE-F: gagaataacatggctgacattctgctgctcga，如SEQ ID NO.30所示；
dw-trpE-R: ccattaaaatgggcgttgatggttaaac，如SEQ ID NO.31所示。
同上，分别以两对引物，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板进行PCR制备上下游同源臂，然后再以上下游同源臂进行重叠延伸PCR，最终获得donor DNA。
5. donor DNA为敲除基因pheA引物设计
up- pheA -F: cacaagggtttgttgctgacgccacaatc，如SEQ ID NO.32所示；
up- pheA -R: ccggcaccttttcaagtgttgcctttttgttatcaataaaaaaggc，如SEQ IDNO.33所示；
dw- pheA -F: gcaacacttgaaaaggtgccggatgatgtgaatcatccggcactg，如SEQ IDNO.34所示；
dw- pheA -R: gcgtttattcaggctctgcgccactttg，如SEQ ID NO.35所示。
同上，分别以两对引物，以E.coli BL21(DE3)基因组为模板进行PCR制备上下游同源臂，然后再以上下游同源臂进行重叠延伸PCR，最终获得donor DNA。
其中，donor DNA的制备原理如图2所示。
构建过表达载体：
基因PK与gdhA过表达，促进合成谷氨酸，基因fpK过表达促进合成酪氨酸，过表达基因簇pqqABCDE/F和基因tldD促进谷氨酸与酪氨酸转化合成PQQ。双质粒系统被引入来过表达基因PK、gdhA、fpK、基因簇pqqABCDE/F和tldD。其中在载体pACYCduent-1上基因PK与gdhA以多顺反子的形式表达，基因fpK以单顺反子的形式表达。基因簇pqqABCDE/F和tldD分别在载体pRSFduent-1上以单顺反子的形式表达。除了载体pACYCduent-1与pRSFduent-1之外，同时拥有两个表达框的载体还有pETduent-1、pCDFduent-1等均可在本实验中适用。其载体图谱如图3~4所示。
基因PK、gdhA、fpK以及pACYC-T7p-PK-RBS-gdhA-T7p-fpK-T7t过表达载体由北京华大基因合成。
pRSF-T7p-pqqABCDE/F-T7p-tldD-T7t过表达载体构建：
扩增基因簇pqqABCDE/F和基因tldD，基因簇pqqABCDE/F和基因tldD均来自于G.oxydans 621H中，在此我们以G. oxydans 621H的基因组为模板，进行PCR扩增，参考基因组Accession number: CP000009的基因组信息进行引物设计，设计的相关引物如下表所示。
以G. oxydans 621H的基因组为模板，引物Pqq-F/ Pqq-R扩增3.7kb PQQ合成酶基因簇，引物TldD-F/ TldD-R扩增tldD基因，引物Bacb-1-F/ Bacb-1-R扩增载体骨架，所用聚合酶为KOD -Plus- Neo，PCR程序为95℃预变性3min，95℃变性10s, 58℃退火10s，68℃延伸3min，68℃终延伸5min，95℃变性10s, 58℃退火10s，68℃延伸1min执行25个循环，PCR产物被纯化试剂盒纯化回收备用，首先我们以Pqq-F/ Pqq-R扩增产物与Bacb-1-F/ Bacb-1-R扩增产物进行无缝克隆，转化DH5a感受态，测序获得阳性载体pRSF-T7p-pqqABCDEF-T7p-T7t，再以该载体为模板，以引物Bacb-2-F/ Bacb-2-R进行PCR，产物被纯化试剂盒纯化回收，以TldD-F/ TldD-R扩增产物与Bacb-2-F/ Bacb-2-R扩增产物进行第二轮无缝克隆转化DH5a感受态，测序获得最终阳性载体pRSF-T7p-pqqABCDEF-T7p-tldD-T7t。
合成PQQ重组工程菌株构建：
通过电转化的方法将质粒pACYC-T7p-PK-RBS-gdhA-T7p-fpK-T7t与质粒pRSF-T7p-pqqABCDE/F-T7p-tldD-T7t共转化进入菌株BL21(DE3) ΔargA, ΔproB, ΔtyrR, ΔtrpE, ΔpheA。电转化的方法的过程如下：
（1）电转化感受态制备：
（1-1）挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；
（1-2）取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
（1-3）将菌液迅速置于冰上，在冰上冷却10分钟；
（1-4）4℃下3000g冷冻离心5分钟，收集菌体；
（1-5）加入30ml 10%的无菌甘油溶液，重悬菌体；
（1-6）4℃下3000g冷冻离心5分钟，收集菌体；
（1-7）3ml 10%的无菌甘油溶液，重悬菌体，按实际情况分装-80℃保存备用。
（2）电转化：
分别取50ng质粒载体与100ul感受态细胞混合，加入进遇冷后的0.2cm电击杯中，电击参数设置为2.5KV，200Ω，电击常数显示5ms左右为宜，然后迅速加入SOC复苏培养基37℃，220r复苏1h，涂双抗平板，抗性为卡那霉素与氯霉素。
摇瓶发酵测试：
将工程菌株划线37℃恒温箱过夜培养活化在LB固体培养基上，挑取单克隆到100mL 摇瓶带有20mL LB培养基中，37℃，220r摇床过夜培养作为种子液，按1%接种量转接种子液进入500mL 摇瓶带有100mL TB培养基中，37℃，220r培养至OD600=0.6~0.8，添加IPTG诱导剂使终浓度为0.2Mm，37℃，220r培养24h。取10ml菌液超声破碎，进行液相分析，结果表明存在PQQ合成产物，产量达到472mg/L。
5L-发酵罐测试：
重组菌接种到500ml药瓶带有100ml LB培养基中，37℃, 220r摇床过夜培养作为种子液，种子液按2%接种量转接到5L发酵罐含2.5L发酵培养基中，发酵培养基：1g/L Glu、3g/L L-Tyr、6 g/L KH2PO4、16.4 g/L K2HPO4、5 g/L (NH4)2SO4、1.1 g/L 柠檬酸、1 g/LMgSO4、10 g/L 酵母膏、7 g/L 葡萄糖、0.1 g/L 维生素B1、2 mL/L 微量元素；微量元素包含10 g/L FeSO4·7H2O、1.53 g/L CaCl2、2.2 g/L ZnSO4·7H2O、1g MnSO4·4H2O、1 g/LCuSO4·5H2O、0.1 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.2 g/L Na2B4O7·10H2O、1 g/L NiCl2、1 g/LH3BO3、10 mL/L HCl, 先将微量元素溶解于盐酸中，然后加去离子水定容调pH为7.0；补料培养基：500g/L 葡萄糖、7 g/L MgSO4、10g/L Glu、30g/L Tyr、1 mL/L 微量元素。30℃连续补料培养发酵48~72h，取适量菌液超声破碎，液相分析PQQ产量达到 1.5g/L~2.6g/L，如图5所示，其中发酵72h， PQQ产量可达2.6g/L。
PK碱基序列：
ATGAGAAAAACTAAAATTGTTTGTACCATCGGTCCGGCAAGTGAAAGTATTGAAATGCTTACGAAATTAATGGAGTCAGGAATGAACGTGGCTCGATTAAACTTTTCTCACGGAGATTTTGAGGAGCACGGTGCAAGAATTAAAAATATCCGCGAAGCAAGTAAAAAACTTGGCAAGAACGTTGGAATTCTGCTTGATACAAAAGGTCCTGAAATCCGCACACATACAATGGAAAACGGCGGTATTGAGCTTGAAACAGGCAAAGAGCTCATTATTTCAATGGACGAGGTTGTAGGAACAAAAGATAAAATTTCAGTGACATATGAAGGTTTAGTCCATGACGTTGAACAAGGTTCAACGATTCTGTTAGATGACGGCCTTATCGGTCTTGAGGTACTTGATGTAGATGCCGCTAAACGCGAAATCAAAACAAAAGTATTAAACAACGGAACACTCAAAAATAAAAAAGGTGTTAACGTACCGGGCGTAAGTGTCAATCTTCCGGGGATTACTGAAAAGGATGCGCGAGACATCGTTTTCGGTATTGAGCAAGGAGTAGACTTCATCGCACCATCTTTCATTCGACGTTCTACGGATGTGCTCGAAATCCGTGAGCTTCTTGAAGAGCACAACGCTCAGGATATTCAAATCATCCCTAAAATCGAAAACCAAGAGGGCGTTGACAACATCGATGCGATTCTCGAAGTGTCTGACGGCTTAATGGTTGCACGCGGAGACTTAGGTGTGGAAATTCCAGCTGAAGAAGTGCCGCTTGTGCAAAAAGAACTGATCAAAAAATGCAACGCGCTGGGCAAACCTGTTATTACAGCGACACAAATGCTTGACAGCATGCAGCGCAACCCGCGTCCGACTCGTGCGGAAGCAAGTGACGTTGCAAACGCGATCTTCGACGGAACAGATGCGATCATGCTTTCTGGTGAAACTGCTGCCGGAAGTTACCCGGTTGAAGCAGTTCAAACAATGCATAACATCGCGTCCCGTTCTGAAGAAGCATTAAATTATAAAGAAATTCTCTCAAAACGCAGAGACCAAGTGGGCATGACAATTACAGACGCAATTGGACAATCTGTCGCACATACGGCGATTAACCTGAATGCTGCTGCGATCGTAACGCCGACAGAAAGCGGCCATACAGCACGTATGATTGCAAAATACCGTCCGCAGGCTCCGATTGTTGCGGTTACTGTAAATGACTCTATTTCCAGAAAGCTTGCCCTCGTATCTGGCGTATTCGCGGAAAGCGGCCAAAATGCGAGCTCAACAGATGAGATGCTTGAGGATGCTGTCCAAAAATCATTGAACAGCGGAATTGTAAAACACGGCGATCTTATCGTTATTACAGCTGGCACTGTCGGTGAGTCCGGCACTACGAACTTAATGAAGGTTCATACTGTCGGCGATATCATCGCTAAAGGCCAAGGCATTGGACGCAAATCAGCTTACGGTCCGGTTGTCGTTGCACAAAATGCAAAAGAAGCTGAGCAAAAAATGACTGACGGTGCGGTACTTGTTACCAAAAGCACTGACCGTGATATGATTGCATCCCTTGAAAAAGCGTCTGCTCTTATTACAGAAGAAGGCGGTTTGACTAGCCATGCTGCGGTAGTCGGATTAAGCCTTGGCATCCCGGTTATCGTGGGTCTGGAAAATGCGACATCTATTTTGACAGATGGCCAGGATATTACAGTTGACGCTTCCAGAGGCGCAGTCTATCAAGGCCGTGCGAGCGTTCTTTAA，如SEQ ID NO.44所示。
gdhA碱基序列：
ATGTCCACGGTCCTGGAATACGTTGACCCTCTGGAAGGCTTTCGCGGCTGGCTGGTGTACGATGGCGGCTCTTGCCGTATCGCTGCAGGTGGTTGTCGCGTACAGCAGGGCCTGACTCGTGATACCCTGGTGTCTCTGGCATCCCGTATGACGCTGAAAGAACGTCTGCTGGGCATCAACGTTGACGGCGCAAAATGCGGCATCGACTACGATCCGCGTAGCCCTGGCAAAGCCGCGGCCGTTCGTCGCTTCCTGGCGTTCCTGCGCGAAGAACTGGTCCACCGTTTCTCCATGGGTAGCGACATGGGCACCCGTTGGGATGAACTGGAACGTCTGGCCGCGGCAGAGGGTATCCCATCCATCAAATACGCGGTACGCCGTGCGCAGGAATTTACCGACGATGAATTTTTTGCGCGCCTGCGCACCCTGCAGGCTCCAGTTGGTGCTCTGACTCTGGCACAGCGTCGTGCGGGTCATGCCCTGGCTGAAGCAGCAGTTGGTGCAGCACGTGCGGCAGGCCTGGGTCCGCGTGCAACTTGTGCGCTGCAGGGCTTTGGTAATCTGGGTCGTGCCGCGGCGTGTACCCTGGCTGAAGTGGGTATGACGGTGGTGGCGGTTTCCGACGAATTCGGTTGTGTTGCTGACCACCATGGCCTGGATATCCCGGGCATGCTGGCGGCCCCGTTCGGCACTCCAGTCCAGGCGTCCGTCCGTCGTGGTGAACAGCTGCCTTCCACCGCCCTGTTCAAAATTCCGGCTGACATCAGCATTCTGGCTGCCACCGAAAACGCTATCAGCCTGCCGCAAGTAGGCGAACTGCCGACCCCTGTGGTCGTGGTTGGCGCCAACTGCGGTCTGACCCCGGATGTTGAAGCAGCGCTGGACCGTGCGGGCGTACTGGTTATTCCGGATTTTGTTGGTGGCATCGGCGGCTCTGCCTCCGTGGAGGCTCTGTTCGGTCCGGAACACCGTCCGACTGAAGTTCACGTGCTGGGTGGCGTGACCCAGATCATGCGTCAGCTGGTTGACCACCTGATTTCCGAAGCTCGTCGTCGTGGCACGTCTGCTCGTTCCGTTGCGCTGCATCTGGCGCAGACGACCATCCCGGTGCCGGACCGCCGCCCGTATGGCCGTAGCCGTTTCCTGGCGTAA，如SEQ ID NO.45所示。
fpK碱基序列：
ATGACCTCCCCTGTTATCGGTACCCCATGGAAAAAACTGAACGCGCCAGTTAGCGAAGAAGCCATTGAAGGCGTAGACAAGTACTGGCGCGCTGCTAACTACCTGAGCATCGGCCAGATTTACCTGCGCTCTAACCCGCTGATGAAGGAACCGTTCACCCGTGAAGATGTCAAACACCGTCTGGTTGGTCATTGGGGTACTACCCCGGGCCTGAACTTCCTGATCGGTCACATCAATCGTCTGATCGCTGATCACCAGCAGAACACCGTGATCATTATGGGCCCGGGTCACGGTGGTCCGGCGGGTACCGCACAGTCTTATCTGGACGGCACCTATACCGAATACTTCCCAAACATTACCAAAGACGAAGCCGGTCTGCAGAAATTTTTTCGTCAGTTCTCTTACCCGGGTGGCATCCCAAGCCATTACGCTCCGGAAACTCCTGGCTCTATCCACGAAGGTGGTGAGCTGGGCTACGCACTGTCTCATGCGTATGGTGCTGTTATGAACAACCCATCCCTGTTCGTGCCGGCCATTGTTGGCGACGGTGAAGCCGAAACTGGTCCGCTGGCTACCGGCTGGCAGAGCAACAAACTGATTAACCCACGTACTGACGGCATCGTTCTGCCGATCCTGCACCTGAATGGCTACAAAATTGCGAACCCGACCATTCTGAGCCGCATCAGCGACGAGGAACTGCATGAATTCTTCCACGGTATGGGCTACGAACCGTACGAATTTGTTGCAGGCTTCGATAACGAAGATCATCTGTCTATCCACCGTCGCTTCGCCGAACTGTTTGAGACCGTATTCGATGAGATCTGTGATATCAAAGCCGCTGCTCAGACCGACGATATGACGCGTCCGTTCTACCCGATGATCATCTTTCGTACTCCGAAAGGTTGGACCTGTCCGAAATTCATTGACGGTAAGAAAACCGAAGGTTCTTGGCGTTCTCATCAAGTTCCGCTGGCATCCGCTCGTGATACTGAGGCGCACTTCGAAGTTCTGAAAAACTGGCTGGAATCTTATAAACCGGAAGAACTGTTCGATGAGAACGGCGCTGTGAAACCAGAGGTCACGGCATTCATGCCGACGGGCGAACTGCGTATCGGTGAGAACCCGAACGCCAACGGTGGCCGTATTCGTGAAGAACTGAAACTGCCGAAACTGGAAGATTACGAAGTTAAGGAAGTCGCCGAGTACGGTCATGGCTGGGGCCAACTGGAAGCAACTCGCCGCCTGGGCGTGTACACTCGCGACATCATTAAAAACAACCCGGATTCTTTCCGTATCTTTGGTCCGGACGAAACCGCATCTAACCGTCTGCAGGCCGCGTATGATGTTACGAACAAACAGTGGGACGCTGGTTACCTGTCTGCGCAGGTCGATGAACACATGGCAGTGACCGGCCAGGTTACGGAACAACTGTCCGAACATCAGATGGAAGGTTTCCTGGAGGGCTACCTGCTGACCGGCCGCCACGGCATCTGGAGCAGCTATGAGTCCTTCGTTCACGTAATCGACTCTATGCTGAACCAGCATGCGAAGTGGCTGGAAGCTACTGTTCGTGAAATCCCGTGGCGTAAACCTATCTCCTCTATGAACCTGCTGGTGTCTTCTCATGTATGGCGTCAGGACCATAACGGTTTCAGCCATCAGGACCCGGGTGTAACTTCTGTTCTGCTGAACAAGTGCTTCAACAACGACCACGTTATTGGCATCTACTTCCCGGTCGACTCCAACATGCTGCTGGCGGTGGCGGAGAAATGTTACAAAAGCACCAACAAAATCAACGCGATCATCGCTGGTAAACAACCAGCTGCGACCTGGCTGACCCTGGATGAAGCGCGTGCGGAGCTGGAGAAAGGTGCCGCAGAATGGAAATGGGCGTCTAATGTGAAATCCAACGACGAAGCGCAAATCGTTCTGGCTGCTACTGGTGATGTTCCGACTCAAGAAATCATGGCGGCCGCAGATAAACTGGACGCAATGGGTATCAAATTCAAAGTGGTGAACGTTGTTGACCTGGTTAAACTGCAGTCTGCTAAAGAGAACAACGAGGCACTGTCCGACGAAGAGTTCGCCGAACTGTTCACCGAAGACAAACCGGTCCTGTTTGCGTACCATTCCTACGCTCGTGATGTGCGCGGTCTGATCTACGATCGTCCAAACCATGACAACTTCAACGTTCACGGTTACGAAGAACAAGGTAGCACCACTACTCCTTACGACATGGTGCGTGTTAACAATATCGACCGTTATGAACTGCAGGCTGAAGCACTGCGCATGATTGATGCCGACAAATACGCGGACAAGATCAACGAACTGGAAGCGTTTCGCCAAGAAGCCTTCCAGTTCGCAGTTGACAACGGTTACGACCACCCGGATTACACCGATTGGGTTTACTCTGGTGTAAACACTAATAAACAAGGCGCCATTTCTGCCACCGCAGCGACCGCGGGTGACAACGAATAA，如SEQ ID NO.46所示。
pqqABCDE/F碱基序列：
ATGGCCTGGAACACACCGAAAGTTACCGAAATCCCGCTGGGCGCAGAAATCAACTCGTATGTCTGCGGCGAGAAGAAATAAGCCGCTTTCCCGGGGACCCGTCCTTGAGGAATAATGGCACGGCCGCTCCCCCATGGAGCGGCCGTTTTCGTTCATGGGTGCTCTGTGGTGCCCCAGTCAGACGGTTTGTGAAAAAATGATTGATGTCATCGTGCTTGGCGCGGCGGCAGGGGGCGGTTTTCCGCAGTGGAACTCCGCAGCACCCGGCTGTGTGGCCGCCCGCACGCGACAGGGCGCGAAAGCCCGGACCCAGGCCTCCCTTGCCGTCAGTGCCGACGGAAAGCGCTGGTTCATTCTCAACGCCTCGCCCGATCTGCGGCAGCAGATCATCGATACGCCGGCCCTGCATCATCAGGGCAGCCTGCGTGGAACGCCCATTCAGGGCGTCGTCCTGACCTGCGGCGAGATCGACGCCATAACCGGGCTTCTGACCCTGCGTGAGCGTGAGCCTTTTACCCTGATGGGCAGCGACTCGACCCTTCAGCAGCTTGCGGACAATCCGATCTTCGGTGCGCTCGATCCGGAAATCGTCCCACGTGTTCCGCTCATTCTCGATGAAGCCACGTCCCTGATGAACAAGGACGGGATTCCGTCCGGTCTTTTGCTCACGGCCTTCGCCGTTCCGGGCAAGGCGCCGCTTTACGCGGAAGCCGCAGGGTCACGCCCGGACGAGACGCTGGGCCTTTCCATTACGGATGGATGCAAGACGATGCTCTTCATTCCCGGCTGTGCGCAGATCACGTCGGAAATCGTGGAACGGGTAGCGGCAGCCGATCTCGTGTTCTTTGACGGGACACTGTGGCGGGATGACGAAATGATCCGCGCCGGGTTGAGCCCGAAGAGCGGACAGCGGATGGGACATGTGTCCGTGAATGATGCCGGGGGACCGGTCGAATGTTTCACGACATGCGAAAAACCCCGTAAAGTGTTGATTCATATCAACAACTCCAATCCAATTCTGTTCGAAGACAGCCCCGAACGCAAAGACGTCGAACGCGCCGGATGGACGGTTGCGGAAGACGGCATGACTTTCAGACTGGACACACCATGACGCTCCTCACACCTGACCAGCTTGAAGCACAGCTTCGCCAGATCGGGGCCGAGCGGTATCACAACCGGCACCCGTTCCATCGCAAGCTGCATGACGGCAAGCTGGACAAGGCACAGGTTCAGGCTTGGGCGCTGAACCGCTATTATTATCAGGCCCGCATCCCGGCGAAGGATGCGACGCTTCTCGCACGTCTGCCGACGGCCGAACTGCGCCGCGAATGGCGTCGCCGGATCGAGGACCATGACGGCACGGAGCCCGGAACGGGCGGTGTTGCGCGCTGGCTGATGCTGACGGATGGTCTGGGGCTGGACCGGGATTATGTGGAAAGCCTCGATGGTCTGCTTCCAGCCACGCGCTTCTCGGTCGATGCCTATGTGAACTTCGTGCGGGACCAGTCGATTCTGGCGGCCATTGCGTCGTCGCTGACGGAACTGTTTTCGCCCACGATCATCAGCGAGCGCGTCTCGGGGATGCTGCGGCACTACGACTTTGTGTCGGAAAAGACGCTGGCCTATTTCACGCCGCGCCTGACGCAGGCCCCGCGGGATTCCGATTTCGCGCTGGCCTATGTCCGCGAAAAGGCCCGCACGCCGGAGCAGCAGAAAGAAGTCCTGGGAGCGCTGGAGTTCAAGTGCTCCGTGCTGTGGACGATGCTGGATGCGCTCGACTACGCCTATGTGGAAGGCCACATTCCGCCGGGGGCTTTCGTTCCATGACGGAGGCCCCGCATGTCGTGGCGGAGGGGACGGTTCTCTCCTTTGCCCGGGGGCATCGTCTCCAGCACGATCGTGTGCGGGACGTGTGGATCGTGCAGGCGCCTGAAAAAGCATTTGTAGTTGAGGGCGCCGCGCCGCATATTCTGCGGCTGCTGGATGGGAAGCGCAGCGTCGGCGAGATCATCCAGCAGCTTGCAATCGAGTTTTCCGCCCCGCGTGAGGTCATTGCGAAAGATGTCCTCGCGCTTCTTTCTGAACTGACAGAAAAGAACGTCCTGCACACATGACACTCCCTTCGCCGCCGATGAGCCTTCTGGCTGAACTGACGCATCGATGCCCGCTTTCCTGCCCCTACTGCTCCAATCCGCTTGAACTCGAACGCAAGGCGGCAGAACTCGACACGGCCACCTGGACTGCCGTACTGGAGCAGGCGGCCGAGCTTGGGGTGCTCCAGGTTCATTTCTCTGGCGGCGAGCCTATGGCGCGGCCTGATCTGGTCGAACTGGTCTCCGTCGCACGGAGACTCAACCTGTATTCCAACTTGATCACGTCCGGCGTGTTGCTGGACGAACCGAAACTGGAAGCTCTCGACAGGGCGGGGCTGGATCACATCCAGCTCTCTTTCCAAGACGTGACGGAGGCGGGAGCCGAGCGTATCGGCGGTCTCAAGGGAGCGCAGGCCCGCAAGGTTGCGGCGGCGCGGCTCATCCGCGCGTCCGGCATTCCGATGACGCTCAATTTTGTGGTGCACAGGGAAAATGTCGCCCGTATCCCCGAGATGTTCGCCCTGGCGCGGGAACTCGGAGCGGGGCGGGTGGAGATCGCGCATACCCAGTATTATGGCTGGGGGCTGAAAAACCGTGAGGCGCTTCTTCCCAGCCGGGATCAGCTGGAGGAATCCACACGCGCCGTGGAAGCGGAGCGCGCTAAGGGTGGTTTGTCCGTTGATTATGTGACGCCGGACTATCATGCAGACCGGCCCAAGCCCTGCATGGGGGGATGGGGCCAGCGTTTCGTGAATGTCACACCTTCGGGCCGGGTCCTGCCGTGTCATGCAGCCGAAATCATTCCGGATGTCGCATTCCCGAATGTGCAGGATGTGACCCTGTCCGAAATCTGGAACATCTCACCGCTGTTCAACATGTTCCGCGGGACGGACTGGATGCCGGAGCCCTGCCGCTCCTGCGAGCGCAAGGAGCGTGACTGGGGCGGGTGTCGCTGTCAGGCGATGGCGCTGACGGGGAATGCCGCGAATACCGATCCCGTATGCAGTCTCTCCCCCTATCACGATCGGGTGGAGCAGGCCGTCGAGAACAACATGCAGCCAGAAAGCACGTTGTTCTACAGGCGTTATACGTAA，如SEQ ID NO.47所示。
tldD碱基序列：
ATGTCTGTTGCTGCTGATGCTCTGGGCGCTCTTGCGACGACCGATGCCCTGTTTTTCGGGCGGCCTGATTCAAAGCTGACCCGTGACGATGCCCGGGCGCTCGTCAATCAGGGGCTTGATGGCGTGGATGACGGCGAACTGTTCCTGGAATACCGGGAGAACGAAAGCATCAGCCTGGATGACGGGACGATCCGTTCGGCGAGCTTCAATACGTCTTCGGGGTTCGGGCTGCGGGCTGTTCTGGGGACGGAGACGGCTTTTGCGCATGCGGACGATATCAGCCGGGATGCTCTGGAGCGGGCTGTCAGTACGGTGGGTGCCGTGCGGCAGGGACGCAGCGGCATCATGGCGCCGGGACCGCAGGCGACGAACCGGCGGCTTTATGGCGACTCCCGCCCGCTTGAAGGAACGGATTTTGCAGCACGTGCGGCGGTTCTGAGCGAGATCGATGCCTATGCGCGGGGTCTGGATTCCCGGGTGGTGCAGGTCAGTGCCGTACTGAGTTCCGAATGGCAGGCCGTGCAGATCATGCGGCGCGCGGACTCCGGCGGCGATGTGGCGGACCTGCGGCCGCTGGTGCGCATGAACGTGTCTGTCGTCGTGGAAAAGGACGGTCAGCGTGAGAGCGGAAGCTGTGGTCTGGGAGGGCGCTATGAACTGGACCGGCTGCTGGCGCCGGAAACGTGGCGCGATGCCGTCGACAAGGCCCTGAAACAGGCTCTGATCACGCTGGAAGCCGCACCGGCGCCCGCAGGGGAAATGGATGTGGTGCTTGGTCCGGGATGGCCGGGCATTTTGCTGCATGAGGCTGTCGGGCACGGGCTGGAAGGCGATTTCAACCGCAAGGGGACCTCGTCCTTCTCGGGGATGATCGGCAAGCGTGTGGCGTCTCCAGGCGTGACTGTGGTCGATGATGGAACGCTTCCGGAGCGTCGTGGCTCGCTGAGTGTTGATGATGAAGGAACGCCGACGTCCCGGACCGTTCTGATCGAGGACGGAATTCTGACCGGATACCTTCAGGACCGGCTGAATGCCCGTCTGATGGGCACGAAATCCACCGGGAACGGACGCCGGGAATCCTATGCACATGCTCCGATGCCGCGCATGACCAATACGCTCATGCTGGAAGGAAGCGCGACCACCGATGAGATGATCCGCTCGATGAAGCGCGGGCTTTATGCCGTGAACTTCGGCGGCGGCCAGGTGGATATCACGTCGGGCAAGTTCGTGTTTGCGGCTTCGGAAGCCTATCTGGTCGAGGACGGGAAAATCATCCGTCCGGTCAAGGGGGCTACGCTGATCGGCAATGGGGCGGACGCGATGAACCAGATTTCCATGATCGGATCCGATGTGGCGCTGGATCCTGGCATCGGAACCTGCGGCAAGGCCGGTCAGGGCGTGCCGGTAGGCGTCGGGCAGCCGACCCTGAAGATTTCGGGTCTGACGGTGGGTGGTACGGCCTAA，如SEQ ID NO.48所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株重组基因工程菌株，其特征是，以大肠杆菌BL21(DE3)作为出发菌株，敲除proB基因、argA基因、tyrR基因、trpE基因、pheA基因，转入PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因使其过表达PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因；
PK基因的碱基序列如SEQ ID NO.44所示，gdhA基因的碱基序列如SEQ ID NO.45所示，fpK基因的碱基序列如SEQ ID NO.46所示，PQQ合成基因簇pqqABCDE/F的碱基序列如SEQ IDNO.47所示，tldD基因的碱基序列如SEQ ID NO.48所示。
2.如权利要求1所述的重组基因工程菌株，其特征是，proB基因的靶点PAM序列如SEQID NO.2所示，argA基因的靶点PAM序列如SEQ ID NO.1所示，tyrR基因的靶点PAM序列如SEQID NO.7所示，trpE基因的靶点PAM序列如SEQ ID NO.8所示，pheA基因的靶点PAM序列如SEQID NO.9所示。
3.一种权利要求1所述的重组基因工程菌株的构建方法，其特征是，包括如下步骤：
将大肠杆菌基因组中的proB基因、argA基因、tyrR基因、trpE基因、pheA基因敲除，获得突变菌株；
将PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因转入至突变菌株，即得所述大肠杆菌基因工程菌株。
4.如权利要求3所述的重组基因工程菌株的构建方法，其特征是，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行敲除。
5.如权利要求4所述的重组基因工程菌株的构建方法，其特征是，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行敲除的过程包括sgRNA载体的构建过程和donor DNA的构建过程。
6.如权利要求3所述的重组基因工程菌株的构建方法，其特征是，通过电转化法将PK基因、gdhA基因、fpK基因、PQQ合成基因簇pqqABCDE/F和tldD基因转入至突变菌株。
7.一种PQQ的发酵生产方法，其特征是，采用权利要求1或2所述的重组基因工程菌株进行发酵，即得。
8.如权利要求7所述的PQQ的发酵生产方法，其特征是，在进行所述发酵前对所述重组基因工程菌株进行种子培养。
9.如权利要求7所述的PQQ的发酵生产方法，其特征是，所述发酵的条件为：温度为28~32 ℃，时间为48~72 h。
10.如权利要求7所述的PQQ的发酵生产方法，其特征是，所述发酵的发酵培养基中含有：0.9~1.1 g Glu、2.9~3.1 g L-Tyr、5.9~6.1 g/L KH2PO4、16.3~16.5 g/L K2HPO4、4.9~5.1 g/L (NH4)2SO4、1.0~1.2 g/L 柠檬酸、0.9~1.1 g/L MgSO4、9.9~10.1 g/L 酵母膏、6.9~7.1 g/L 葡萄糖、0.09~0.11 g/L 维生素B1、1.9~2.1 mL/L 微量元素；
所述发酵的补料培养基中含有：490~510 g/L 葡萄糖、6.9~7.1 g/L MgSO4 、9.9~10.1g/L Glu、29~30 g/L Tyr、0.9~1.1 mL/L 微量元素；
所述微量元素包括：9.9~10.1 g/L FeSO4·7H2O、1.52~1.53 g/L CaCl2、2.1~2.2 g/LZnSO4·7H2O、0.9~1.1g MnSO4·4H2O、0.9~1.1 g/L CuSO4·5H2O、0.09~0.11 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O、0.19~0.21 g/L Na2B4O7·10H2O、0.9~1.1 g/L NiCl2、0.9~1.1 g/L H3BO3、9.9~10.1 mL/L HCl。
CN202410465220.5A 2024-04-18 2024-04-18 重组基因工程菌株及其构建方法、pqq的发酵生产方法 Active CN118064346B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410465220.5A CN118064346B (zh) 2024-04-18 2024-04-18 重组基因工程菌株及其构建方法、pqq的发酵生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410465220.5A CN118064346B (zh) 2024-04-18 2024-04-18 重组基因工程菌株及其构建方法、pqq的发酵生产方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN118064346A CN118064346A (zh) 2024-05-24
CN118064346B true CN118064346B (zh) 2024-06-25

Family

ID=91109717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410465220.5A Active CN118064346B (zh) 2024-04-18 2024-04-18 重组基因工程菌株及其构建方法、pqq的发酵生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118064346B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102177246A (zh) * 2008-09-08 2011-09-07 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
CN106086052A (zh) * 2016-07-01 2016-11-09 福建师范大学 生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250821B (zh) * 2011-06-01 2013-10-16 江南大学 一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法
CN102816780A (zh) * 2012-09-07 2012-12-12 天津大学 山梨糖脱氢酶基因、山梨酮脱氢酶基因与吡咯喹啉醌合成基因簇abcden的组合基因

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102177246A (zh) * 2008-09-08 2011-09-07 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
CN106086052A (zh) * 2016-07-01 2016-11-09 福建师范大学 生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN118064346A (zh) 2024-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110699394B (zh) 一种生产1,5-戊二胺的生物转化法
CN112813013A (zh) 一种生产羟基酪醇的重组大肠杆菌及其应用
CN105296411A (zh) 一株利用单糖发酵产l-天冬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN104726478A (zh) 表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用
CN105316273B (zh) 一株无苹果酸副产的l-天冬氨酸酶重组大肠杆菌及其构建方法与应用
CN118064346B (zh) 重组基因工程菌株及其构建方法、pqq的发酵生产方法
CN110499259B (zh) 一种解酯耶氏酵母yw100-1及其应用
CN114854659B (zh) 一种麦角硫因生产工艺及其应用
CN113061562B (zh) 一种利用钝齿棒杆菌发酵生产1,4-丁二胺的方法
CN115725520A (zh) 一种谷胱甘肽合成酶的制备方法及催化生产谷胱甘肽的方法
CN115960736A (zh) 一种产香草胺和辣椒碱的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
CN115197954A (zh) 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途
CN101892228B (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用
CN116426550B (zh) 利用烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌高效合成β-烟酰胺单核苷酸的方法
CN110804634A (zh) 酶催化法制备2,4-二氨基丁酸的工艺
CN113249281B (zh) 一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用
CN114350688B (zh) guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用
CN115612691B (zh) 一种在非茶植物中合成l-茶氨酸的方法
CN118064342A (zh) 一种以葡萄糖为碳源合成2′-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其应用
CN102978177B (zh) 冬虫夏草合成代谢二十碳五烯酸的△-5-脱氢酶、基因及应用
CN119161416A (zh) 一种高效合成四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法
CN118440880A (zh) 一种生产烟酰胺单核苷酸的基因工程菌株及其构建方法与应用
WO2024193158A1 (zh) 一种亚砜合成酶突变体及其在麦角硫因生产中的应用
CN119709792A (zh) 一种产烟酰胺单核苷酸的重组菌及其制备方法和应用
CN117535328A (zh) 一种高产己二胺基因工程菌株及其构建方法与运用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: Recombinant genetic engineering strains and their construction methods, as well as the fermentation production method of PQQ

Granted publication date: 20240625

Pledgee: Postal Savings Bank of China Limited Jinan Branch

Pledgor: Shandong Juntai Pharmaceutical Co.,Ltd.

Registration number: Y2024980027396