CN102250821B - 一种改造大肠杆菌产维生素c前体2-酮基-l-古龙酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改造大肠杆菌产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法，属于遗传工程领域。本发明通过基因工程技术，将来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的山梨醇脱氢酶(SLDH)、辅酶吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)基因簇和来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)的山梨糖脱氢酶(SDH)/山梨酮脱氢酶(SNDH)基因表达于大肠杆菌(Escherichia coli)中，获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的E.coli工程菌。目前国内维生素C工业化生产所采用的二步发酵过程工艺复杂，影响因素较多，难以精确控制，同时3种微生物生长消耗了大量的原材料和能源，采用E.coli工程菌利用山梨醇进行发酵生产2-KLG，简化了生产工艺，节约了原材料和能源，2-KLG的产量可达87g/L，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产2-KLG的大肠杆菌工程菌及其构建方法，采用分子手段引入SLDH、SDH/SNDH和辅酶PQQ，从而实现代谢山梨糖生产2-KLG，属于遗传工程领域。
背景技术
维生素C是一种重要的有机酸，广泛应用于制药、食品、饮料、化妆品和饲料等工业中，2-KLG是合成维生素C的重要前体。目前国内维生素C工业化生产采用二步发酵法，以D-山梨醇为底物的二步发酵法是研究得最早、也是研究得最多最深入的生产方法。在这一过程中，氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)转化D-山梨醇为L-山梨糖，L-山梨糖转变为2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG)的过程是由一个混菌系统完成的，这一混菌发酵系统由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，俗称大菌)和普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare，俗称小菌)组成，其中K.vulgare为产酸菌，单独培养时生长微弱，产酸较少；B.megaterium为伴生菌，不产酸，但促进K.vulgare生长或产酸。尽管目前国内维生素C工业化生产所采用的二步发酵工艺具有生产周期短、成本低廉等优点，但同时也存在一些问题，如：(1)能耗物耗较高、成本高；(2)废气、废水和废渣三废排放量大；(3)工艺复杂、产品创新品种较少等，制约了维生素C产业的进一步发展。如何简化发酵工艺是一个迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产2-KLG的E.coli工程菌。
所述工程菌含有sldh、sdh/sndh、pqq基因。
所述sldh、sdh/sndh、pqq基因核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所示。
所述sldh、sdh/sndh、pqq基因克隆于pET28a(+)表达质粒上。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种高产2-KLG的E.coli基因工程菌的构建方法。
为解决上述技术问题，本发明的具体方案为：
1)分别设计引物克隆Gluconobacter oxydans ATCC 621H的sldh基因和pqq基因；根据本实验室对K.vulgare DSM4205的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因；
2)将sldh、sdh/sndh、pqq基因与载体连接得到重组表达载体；
3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌(Escherichia coli)后得到重组菌株。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种发酵生产2-KLG的方法，工程菌种子培养后，按10％比例接种5L发酵罐，发酵16h后，流加量碳源2.5g/L.h，发酵参数：转速500rpm，pH 5.1～5.4，通气量1.5vvm，控制罐温30℃，罐压0.05MPa，发酵罐溶氧反弹到20％-30％时添加IPTG至终浓度0.5mM。
种子和斜面培养基(g/L)：酵母膏5，蛋白胨10，氯化钠10；琼脂20(斜面培养基)，pH 7.0，121℃灭菌15min，卡那霉素终浓度50μg/mL。
发酵培养基(g/L)：山梨糖80，蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4ml，磷酸二氢钾2.31，磷酸氢二钾12.54，pH 7.0，121℃灭菌15min，卡那霉素终浓度50μg/mL，IPTG终浓度0.5mM。
山梨醇、2-KLG含量测定：液相色谱(LC)
发酵样品用流动相十倍稀释，0.45μm滤膜过滤。Agilent 1100 system，RioRad公司Aminex HPX-87H色谱柱；流动相：2.75μmol/L浓硫酸；柱温：35℃；流速：0.6mL/min；进样量：5μL；检测器：示差折光检测器。
本发明通过基因工程改造，将来源于氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)的sldh和pqq基因簇及来源于普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigeniumvulgare)的sdh/sndh基因表达于大肠杆菌(Escherichia coli)中，获得了一株利用山梨醇生产2-KLG的E.coli工程菌。采用E.coli工程菌利用山梨醇发酵生产2-KLG工艺简单，2-KLG的产量可达87g/L，具有很好的应用前景。本发明提供的构建方法简单，适于标准化。
具体实施方式
实施例1表达载体的构建
设计引物P1：5’GGAATTCCATATGATGAAACCGACTTCGCTGCTTTGGGC3’；P2：5’CCCAAGCTTTTATTGCGGCAGGGCGAAGACGTAGA3’，克隆K.vulgare DSM4205的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列扩增后克隆到质粒pET28a(+)上，构建表达载体pET28a-sdh/sndh，将构建好的表达载体转化转化E.coli JM109后，挑选转化子，提取质粒并经HindIII及NdeI酶切后，出现1740bp的条带，证明已经成功构建表达载体pET28a-sdh/sndh；设计引物P3：5’CCCAAGCTTATGCCGAATACTTATGGCAGCAGAACCC3’P4：5’ATAAGAATGCGGCCGCTCAGCCCTTGTGATCAGGCAGTGC3’，克隆Gluconobacter oxydans ATCC 621H sldh基因序列扩增后克隆到pET28a(+)-sdh/sndh上，转化E.coli JM109，挑选转化子，提取质粒并经HindIII及NotI酶切后，出现2612bp的条带，证明已经成功构建表达载体pET28a-sdh/sndh-sldh；设计引物P5：5’ATAAGAATGCGGCCGCATGGCCTGGAACACACCG3’；P6：5’CCGCTCGAGTTACGTATAACGCCTGTAGAAC3’，克隆Gluconobacter oxydans ATCC 621H pqq基因序列扩增后克隆到pET28a-sdh/sndh-sldh上，转化E.coli JM109，挑选转化子，提取质粒并经NotI及XhoI酶切后，出现3187bp的条带，证明已经成功构建表达载体pET28a(+)-sdh/sndh-sldh-pqq。
实施例2E.coli工程菌的构建
将最后构建好的表达载体pET28a(+)-sdh/sndh-sldh-pqq转化E.coli JM109。由于重组质粒上带有卡那霉素抗性基因，转化E.coli JM109感受态，涂布到含有卡那霉素的LB(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，固体培养基加20g/L琼脂，调节pH 7.0，121℃灭菌15min)，挑取转化后平板上正常生长的转化子，提取质粒PCR验证，分别出现1740bp，2612bp，3187bp的条带，对照未能PCR同样条带，证明成功转化到E.coli中，再将提取的质粒转化E.coli BL21，得到E.coli-pET28a-sdh/sndh-sldh-pqq工程菌。
实施例3发酵生产2-KLG
种子和斜面培养基(g/L)：酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 10；琼脂20(斜面培养基)，pH 7.0，121℃灭菌15min，卡那霉素终浓度50μg/mL。
发酵培养基(g/L)：山梨糖80，蛋白胨12，酵母提取物24，甘油4ml，磷酸二氢钾2.31，磷酸氢二钾12.54，pH 7.0，121℃灭菌15min，卡那霉素终浓度50μg/mL，IPTG终浓度0.5mM。
培养条件：从斜面中接种重组菌于20mL的种子培养基中，接种菌龄12h，接种量10％，装液量10％；诱导前菌体OD600值0.6，添加IPTG至终浓度0.5mM，于30℃、220rpm进行摇瓶发酵，发酵周期48h。摇瓶2-KLG产量为56g/L。
实施例4发酵生产2-KLG
5L发酵罐发酵16h后流加山梨醇2.5g/L.h，发酵参数：转速500rpm，pH7.0，通气量1.5vvm，控制罐温30℃，罐压0.05MPa，发酵罐溶氧反弹到20％-30％时添加IPTG至终浓度0.5mM。发酵结束后2-KLG产量达到87g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种改造大肠杆菌产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2612
<212> DNA
<213> 氧化葡萄糖酸杆菌(GluconobacteroxydansATCC 621H)
<400> 1
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gggctgccga aaccaccccg atcaaggtgg gtgacggcct ctacatgtgc tcggcacaga 900
acgacatcat gaagatcgac ccggcgacgg gtaaggagat ctggcgtcac aacatcaacg 960
agaaatacga agccatcccc tacaccgcag cgtgcaaggg cgtgacgtat ttcacgtcgt 1020
ctcaggtgcc cgaaggccag ccctgccata accgtatcct tgaaggcacg ctcgacatgc 1080
gcctgatcgc ggttgatgcc gcgaccggca atctgtgcga aggcttcggc aatggcggcc 1140
aggtcaacct gatgcagggt cttggcgaat ccgtccccgg cttcgtctcc atgacgacgc 1200
cgccgccggt cgtgaacggt gtggttgtgg tcaaccacga agttctcgac ggtcagcgcc 1260
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cctgggacgt gaaccgcccc aacgatcaca gccagccgac cggcaacaac cattacagcc 1380
gtggtacgcc gaactcctgg gctgcgatga ccggcgacaa tgcgctgggc ctcgtctacg 1440
tcccgaccgg caactcggct tccgattact acagtgccct gcgtagccct gaagaaaaca 1500
aggtctcgtc cgcagttgtc gcgcttgacg taaagacggg ttcgccgcgc tgggtcttcc 1560
agaccgttca caaggacgtc tgggactatg acatcggctc gcaggccacc ctcatggaca 1620
tgcccggcca ggatggtcag cctgttcccg cactcatcat gccgaccaag cgtggccaga 1680
ccttcgtgct cgaccgtcgt gacggcaagc cgatcctgcc ggtcgaagag cgtcccgctc 1740
cgtcgccggg cgtgatcccg ggcgatccgc gttcgccgac gcagccctgg tccacgggaa 1800
tgccggctct gcgcgtgccg gatctgaaag agacggatat gtggggcatg tcccccatcg 1860
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cgagcgtcga caagccctgg atcgagtatc cgggctataa cggcggcagc gactggggtt 1980
ccgtgtccta tgacccgcag agcggcatcc tgattgcgaa ctggaacatc accccgatgt 2040
acgaccagct cgtaacccgc aagaaggccg acgaacttgg cctgatgccg atcgatgacc 2100
cgaactacaa gccgggtggc ggtggcgccg aaggtaacgg cgccatggac ggcacgcctt 2160
acggtatcgt cgtgaccccg ttctgggatc agtacacggg tatgatgtgc aaccgcccgc 2220
cctacggcat gatcacggcc atcgacatga agcacggcca gaaggtgctg tggcagcacc 2280
cgctgggaac ggcccgcgcc aatggtccgt ggggcctgcc gaccggtctt ccctgggaaa 2340
tcggtacgcc gaataatggt ggctcggtcg tgacggccgg tggcgtggtg ttcatcgcgg 2400
cagctacgga taaccagatc cgtgccatcg acgagcacac cggcaaggtg gtctggagcg 2460
cggtcctgcc gggcggcggt caggctaacc cgatgaccta cgaagccaat ggtcatcagt 2520
acgtcgccat catggcgggt ggtcatcact tcatgatgac gccggtcagc gatcagctgg 2580
tggtttacgc actgcctgat cacaagggct ga 2612
<210> 2
<211> 1740
<212> DNA
<213> 普通生酮基古龙酸菌(KetogulonigeniumvulgareDSM4205)
<400> 2
atgaaaccga cttcgctgct ttgggccagt gctggcgcac ttgcattgct tgccgcaccc 60
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tggatcagct acggtcagaa ccaagaaaac taccgtcact cgcccctgac gcagatcacg 180
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acgttcgacg tcgaccgcgg ccaaggcgaa gacatggttt cgaactcgtc gggcccgatc 540
gtggcaaacg gcgtgatcgt tgccggttcg acctgccaat actcgccgtt cggctgcttt 600
gtctcgggcc acgactcggc caccggtgaa gagctgtggc gcaactactt catcccgcgc 660
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gcctggggcc agatcaccta tgaccccgtc accaaccttg tccactacgg ctcgaccgct 780
gtgggtccgg cgtcggaaac ccaacgcggc accccgggcg gcacgctgta cggcacgaac 840
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ccctcgaccg agatggaagg tctgcagtcg atcaacccga acgccgcaac tggcgagcgt 1020
cgcgtgctga ccggcgttcc gtgcaaaacc ggcaccatgt ggcagttcga cgccgaaacc 1080
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<210> 3
<211> 3187
<212> DNA
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<400> 3
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ctgccgctcc tgcgagcgca aggagcgtga ctggggcggg tgtcgctgtc aggcgatggc 3060
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tacgtaa 3187
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。
<400> 4
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。
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<212> DNA
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<220>
<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。
<400> 6
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<213> 人工合成序列
<220>
<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。
<400> 7
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。
<400> 8
ataagaatgc ggccgcatgg cctggaacac accg 34
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<220>
<223> 根据基因序列设计，用于基因扩增。
<400> 9
ccgctcgagt tacgtataac gcctgtagaa c 31
Claims (1)
1.一种构建高产2-KLG的大肠杆菌基因工程菌的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)分别设计引物克隆氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)ATCC621H中sldh基因和pqq基因；根据本实验室对普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)DSM4205的全基因组测序结果中注释的sdh/sndh基因序列设计引物克隆sdh/sndh基因；
2)将sldh、sdh/sndh、pqq基因与载体pET28a(+)连接得到重组表达载体；
3)将得到的重组表达载体转化大肠杆菌（Escherichia coli）后得到重组菌株；所述sdh/sndh基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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| 谢莉."普通生酮基古龙酸菌S2基因文库的构建和筛选".《河北师范大学学(自然科学版)》.2008,第32卷(第1期), * |
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