CN106086052A - 生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用。本发明所提供的细菌是将特异质粒导入出发菌得到的，所述特异质粒是在出发质粒中导入PqqA蛋白的编码基因、PqqB蛋白的编码基因、PqqC蛋白的编码基因、pqqD蛋白的编码基因和PqqE蛋白的编码基因得到的。所述PqqA蛋白为(Y1)或(Y2)或(Y3)：(Y1)PqqA1蛋白、PqqA2蛋白和PqqA3蛋白；(Y2)PqqA1蛋白、PqqA2蛋白和PqqA3蛋白中的任意两个蛋白；(Y3)PqqA1蛋白、PqqA2蛋白或PqqA3蛋白。实验证明，本发明所提供的细菌可有效提高PQQ的产量，具有原料低廉、工艺简单、生产效率高等优点，具有良好的工业化应用前景。

Description

生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及生产吡咯喹啉醌的细菌及其应用。

背景技术

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一种广泛存在于革兰氏阴性菌中，在人和动、植物体内也有微量存在的氧化还原酶辅酶。PQQ参与呼吸链的电子传递，具有促进机体生长和神经生长因子合成、调节机体自由基水平等生理功能，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。迄今为止，仅有部分革兰氏阴性细菌能够产生PQQ，但大肠杆菌(Escherichia coli.)不能合成PQQ。不同细菌的PQQ合成量差距显著，例如假单胞菌属、微环菌属和枝动杆菌属的细菌只能合成微量的PQQ以满足自身的生理代谢需求，而生丝微菌属、交替单胞菌属和嗜甲基菌属等甲基营养菌能产生过量PQQ并分泌至胞外。

脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)属于生丝微菌属，是一类可以甲醇等一碳化合物为唯一碳源和能源来源的化能异养兼性厌氧菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何生产吡咯喹啉醌。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种特异DNA分子。

本发明所提供的特异DNA分子，可包括如下元件：区段A、区段B、区段C、区段D和区段E；

所述区段A可为如下(1)或(2)或(3)：

(1)含有PqqA1蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因和PqqA3蛋白的编码基因的DNA分子；

(2)含有PqqA1蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因和PqqA3蛋白的编码基因中的任意两个编码基因的DNA分子(如含有PqqA1蛋白的编码基因和PqqA2蛋白的编码基因的DNA分子)；

(3)含有PqqA1蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因或PqqA3蛋白的编码基因的DNA分子；

所述区段B可为含有PqqB蛋白的编码基因的DNA分子；

所述区段C可为含有PqqC蛋白的编码基因的DNA分子；

所述区段D可为含有PqqD蛋白的编码基因的DNA分子；

所述区段E可为含有PqqE蛋白的编码基因的DNA分子。

所述PqqA1蛋白可为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述PqqA2蛋白可为b1)或b2)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述PqqA3蛋白可为c1)或c2)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；

c2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述PqqB蛋白可为d1)或d2)：

d1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

d2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述PqqC蛋白可为e1)或e2)：

e1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；

e2)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述PqqD蛋白可为f1)或f2)：

f1)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；

f2)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述PqqE蛋白可为g1)或g2)：

g1)氨基酸序列是序列表中序列7所示的蛋白质；

g2)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述PqqA1蛋白的编码基因可为A1)或A2)或A3)：

A1)核苷酸序列是序列表中序列9所示的DNA分子；

A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqA1蛋白的DNA分子；

A3)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA1蛋白的DNA分子。

所述PqqA2蛋白的编码基因可为B1)或B2)或B3)：

B1)核苷酸序列是序列表中序列10所示的DNA分子；

B2)与B1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqA2蛋白的DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA2蛋白的DNA分子。

所述PqqA3蛋白的编码基因可为C1)或C2)或C3)：

C1)核苷酸序列是序列表中序列11所示的DNA分子；

C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqA3蛋白的DNA分子；

C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA3蛋白的DNA分子。

所述PqqB蛋白的编码基因可为D1)或D2)或D3)：

D1)核苷酸序列是序列表中序列13所示的DNA分子；

D2)与D1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqB蛋白的DNA分子；

D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqB蛋白的DNA分子。

所述PqqC蛋白的编码基因可为E1)或E2)或E3)：

E1)核苷酸序列是序列表中序列14所示的DNA分子；

E2)与E1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqC蛋白的DNA分子；

E3)在严格条件下与E1)或E2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqC蛋白的DNA分子。

所述PqqD蛋白的编码基因可为F1)或F2)或F3)：

F1)核苷酸序列是序列表中序列15所示的DNA分子；

F2)与F1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqD蛋白的DNA分子；

F3)在严格条件下与F1)或F2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqD蛋白的DNA分子。

所述PqqE蛋白的编码基因可为G1)或G2)或G3)：

G1)核苷酸序列是序列表中序列16所示的DNA分子；

G2)与G1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqE蛋白的DNA分子；

G3)在严格条件下与G1)或G2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqE蛋白的DNA分子。

上述任一所述的特异DNA分子，依次可包括如下元件：所述区段A、所述区段B、所述区段C、所述区段D和所述区段E。

所述特异DNA分子可为(z1)或(z2)或(z3)或(z4)或(z5)或(z6)或(z7)或(z8)或(z9)或(z10)：

(z1)含有序列表的序列9所示DNA序列和序列表的序列12所示DNA序列的DNA分子；

(z2)含有序列表的序列9所示DNA序列和序列表的序列12自5’末端起第12至3222位所示DNA序列的DNA分子；

(z3)含有序列表的序列10所示DNA序列和序列表的序列12所示DNA序列的DNA分子；

(z4)含有序列表的序列10所示DNA序列和序列表的序列12自5’末端起第12至3222位所示DNA序列的DNA分子；

(z5)含有序列表的序列11所示DNA序列和序列表的序列12所示DNA序列的DNA分子；

(z6)含有序列表的序列11所示DNA序列和序列表的序列12自5’末端起第12至3222位所示DNA序列的DNA分子；

(z7)含有序列表的序列9所示DNA序列、序列表的序列18所示DNA序列和序列表的序列12所示DNA序列的DNA分子；

(z8)含有序列表的序列9所示DNA序列、序列表的序列18所示DNA序列和序列表的序列12自5’末端起第12至3222位所示DNA序列的DNA分子；

(z9)含有序列表的序列9所示DNA序列、序列表的序列18所示DNA序列、序列表的序列19所示DNA序列和序列表的序列12所示DNA序列的DNA分子；

(z10)含有序列表的序列9所示DNA序列、序列表的序列18所示DNA序列、序列表的序列19所示DNA序列和序列表的序列12自5’末端起第12至3222位所示DNA序列的DNA分子。

含有上述任一所述特异DNA分子的特异质粒也属于本发明的保护范围。

所述特异质粒的制备方法可如下：在出发质粒中导入所述区段A、所述区段B、所述区段C、所述区段D和所述区段E，得到重组质粒。

所述特异质粒的制备方法具体可如下：在出发质粒中导入所述区段A、所述PqqB蛋白的编码基因、所述PqqC蛋白的编码基因、所述PqqD蛋白的编码基因和所述的PqqE蛋白的编码基因，得到重组质粒。所述出发质粒可为常规的表达载体。所述出发质粒具体可为质粒pBAD/hisB。所述质粒pBAD/hisB为invitrogen公司产品，产品目录号为V430-01。

所述特异质粒的制备方法中，各个编码基因可以分别插入所述出发质粒的不同酶切位点，也可以以任一组合形式分别插入所述出发质粒的不同酶切位点。

所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdA1BE。所述重组质粒pBHdA1BE为向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到的。所述重组质粒pBHdA1BE表达所述PqqA1蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白。

所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdA2BE。所述重组质粒pBHdA2BE为向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列10所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到的。所述重组质粒pBHdA2BE表达所述PqqA2蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白。

所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdA3BE。所述重组质粒pBHdA3BE为向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列11所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到的。所述重组质粒pBHdA3BE表达所述PqqA3蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白。

所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdA1A2BE。所述重组质粒pBHdA1A2BE为向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切酶NheⅠ和PstⅠ的识别位点之间插入序列表的序列18所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到的。所述重组质粒pBHdA1A2BE表达所述PqqA1蛋白、所述PqqA2蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白。

所述特异质粒具体可为重组质粒pBHdA1A2A3BE。所述重组质粒pBHdA1A2A3BE为向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切酶NheⅠ和PstⅠ的识别位点之间插入序列表的序列18所示的DNA分子，用限制性内切酶PstⅠ和EcoRⅠ的识别位点之间插入序列表的序列19所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子得到的。所述重组质粒pBHdA1A2A3BE表达所述PqqA1蛋白、所述PqqA2蛋白、所述PqqA3蛋白、所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白。

含有上述任一所述特异质粒的重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组菌的制备方法可如下：将上述任一所述特异质粒导入出发菌，得到重组菌。

上述重组菌的制备方法中，所述出发菌可为大肠杆菌。

上述重组菌的制备方法中，所述出发菌可为大肠杆菌突变株。所述大肠杆菌突变株是通过将大肠杆菌基因组中iscR蛋白的编码基因沉默得到的。所述大肠杆菌突变株具体可为大肠杆菌K12ΔiscR，大肠杆菌K12ΔiscR为日本国立遗传学研究所的产品，产品编号为ECK2528。

所述iscR蛋白可为h1)或h2)：

h1)氨基酸序列是序列表中序列8所示的蛋白质；

h2)将序列表中序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

所述iscR蛋白的编码基因可为H1)或H2)或H3)：

H1)核苷酸序列是序列表中序列17所示的DNA分子；

H2)与H1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述iscR蛋白的DNA分子；

H3)在严格条件下与H1)或H2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述iscR蛋白的DNA分子。

上述重组菌的制备方法中，所述出发菌可为大肠杆菌K12。

上述任一所述特异DNA分子，或，上述任一所述特异质粒，或，上述任一所述重组菌在制备吡咯喹啉醌中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种制备吡咯喹啉醌的方法。

本发明所提供的制备吡咯喹啉醌的方法，可包括如下步骤：发酵培养上述任一所述重组菌，得到吡咯喹啉醌。

上述方法中，所述发酵培养使用的培养基可为发酵培养基甲或发酵培养基乙。

所述发酵培养基甲为含0.4～0.6g/L L-阿拉伯糖的M9培养基。

所述发酵培养基乙为含0.4～0.6g/L L-阿拉伯糖和25～35μM二价铁离子的M9培养基。

所述发酵培养基乙中，所述二价铁离子是以硫酸亚铁的形式加入的。

所述发酵培养中，初始接种量为2％～7％。

所述发酵培养的培养条件为35℃～39℃、培养60～70h。

下述A)或B)也属于本发明的保护范围：

A)融合蛋白，包括如下元件：PqqA蛋白、上述任一所述PqqB蛋白、上述任一所述PqqC蛋白、上述任一所述PqqD蛋白和上述任一所述PqqE蛋白；

所述PqqA蛋白为如下(P1)或(P2)或(P3)：

(P1)上述任一所述PqqA1蛋白、上述任一所述PqqA2蛋白和上述任一所述PqqA3蛋白；

(P2)上述任一所述PqqA1蛋白、上述任一所述PqqA2蛋白和上述任一所述PqqA3蛋白中的任意两个蛋白(如上述任一所述PqqA1蛋白和上述任一所述PqqA2蛋白)；

(P3)上述任一所述PqqA1蛋白、上述任一所述PqqA2蛋白或上述任一所述PqqA3蛋白；

B)蛋白组合物，由所述PqqA蛋白、上述任一所述PqqB蛋白、上述任一所述PqqC蛋白、上述任一所述PqqD蛋白、上述任一所述PqqE蛋白组成。

实验证明，在出发质粒中导入本发明提供的特异DNA分子，得到重组质粒，然后将该重组质粒导入大肠杆菌K12ΔiscR，得到重组菌。利用该重组菌可有效提高PQQ的产量，具有原料低廉、工艺简单、生产效率高等优点，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为PQQ测定标准曲线。

图2为实施例3步骤一的PQQ产量的检测结果。

图3为实施例3步骤二的PQQ产量的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大肠杆菌K12记载在如下文献中：Tomoya Baba，Takeshi Ara，Miki Hasegawa，Yuki Takai，Yoshiko Okumura，Miki Baba，KirillA Datsenko，Masaru Tomita，Barry LWanner and Hirotada Moril.Construction of Escherichia coli K-12in-frame，single-gene knockout mutants：the Keio collection.Molecular SystemsBiology.2006:1-11).公众可以从福建师范大学(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

大肠杆菌K12ΔiscR为日本国立遗传学研究所的产品，产品编号为ECK2528。大肠杆菌K12ΔiscR是通过将大肠杆菌K12基因组中编码iscR蛋白的基因敲除得到的。所述iscR蛋白氨基酸序列如序列表中序列8所示。所述编码iscR蛋白的基因为如序列表中序列17所示。

质粒pBAD/hisB为invitrogen公司产品，产品目录号为V430-01。PQQ标准品为Sigma公司产品，产品目录号为D7783。DNA Assembly试剂盒、T4连接酶、限制性内切酶NcoⅠ、限制性内切酶NheⅠ、限制性内切酶PstⅠ、限制性内切酶EcoRⅠ和限制性内切酶HindⅢ均为NEB公司产品，产品目录号分别为E2621、M0202、R3193、R3131、R3140、R3101和R3104。

M9培养基的溶质及其浓度为：磷酸氢二钠6g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、甘油2.5g/L、葡萄糖0.5g/L、硫酸镁0.12g/L、氯化钙33mg/L、微量元素液1mL/L，溶剂为蒸馏水，pH值为7.0；其中微量元素液的溶质及其浓度为：氯化铁8.3g/L、氯化锌0.84g/L、氯化锰0.016g/L、氯化铜0.13g/L、氯化钴0.1g/L、硼酸0.1g/L、生物素1g/L和维生素B₁ 1g/L，溶剂为蒸馏水，pH值自然。

M9培养基甲：含L-阿拉伯糖的M9培养基，L-阿拉伯糖在M9培养基甲中的浓度为0.5g/L。

M9培养基乙：含L-阿拉伯糖和FeSO₄的M9培养基，L-阿拉伯糖在M9培养基乙中的浓度为0.5g/L，FeSO₄在M9培养基乙中的浓度为30μM。

LB固体培养基：将胰蛋白胨10g、酵母浸提物5g、NaCl 5g和琼脂粉15g溶于1L蒸馏水得到的。

LB固体平板：将LB固体培养基趁热倒入培养皿中，得到LB固体平板。

脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8CGMCC No.10620于2015年3月13日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，公众可从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得该菌株。脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8CGMCCNo.10620在下文中简称脱氮生丝微菌。

实施例1、构建重组大肠杆菌

一、构建重组质粒

1、重组质粒pBHdA1BE的构建

(1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。

(2)人工合成引物F1：5'-CATGCCATGGAAAGCAGTTACCG-3'(下划线为限制性内切酶NcoⅠ的酶切识别序列)和R1：5'-CTAGCTAGCTCAGATGAGGTTGATCTCAG-3'(下划线为限制性内切酶NheⅠ的酶切识别序列)。

(3)完成步骤(1)和(2)后，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F1和R1为引物进行PCR扩增，得到约140bp的双链DNA分子。

(4)用限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

(5)用限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ双酶切质粒pBAD/hisB，回收约4.1kb的载体骨架。

(6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到中间质粒。

(7)人工合成引物F2：

5'-CTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTC ATGATCATAAAAGTGCTCGGGT-3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第12至33位)和R2：5'-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTT -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至3222位的反向互补序列)。

(8)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到约3.3kb的双链DNA分子。

(9)用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切步骤(6)得到的中间质粒，回收约4.2kb的载体骨架。

(10)将步骤(8)得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly试剂盒连接，得到重组质粒pBHdA1BE。

根据测序结果，对重组质粒pBHdA1BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdA1BE表达序列表中序列1所示的蛋白质(以下简称PqqA1蛋白)、序列表中序列4所示的蛋白质(以下简称PqqB蛋白)、序列表中序列5所示的蛋白质(以下简称PqqC蛋白)、序列表中序列6所示的蛋白质(以下简称PqqD蛋白)和序列表中序列7所示的蛋白质(以下简称PqqE蛋白)。

2、重组质粒pBHdA2BE的构建

(1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。

(2)人工合成引物F3：5'-CATGCCATGGAGGACATCATGAAGAC-3'(下划线为限制性内切酶NcoⅠ的酶切识别序列)和R3：5'-CTAGCTAGCTTAGATGAGGTCGATCTCGG-3'(下划线为限制性内切酶NheI的酶切识别序列)。

(3)完成步骤(1)和(2)后，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F3和R3为引物进行PCR扩增，得到约110bp的双链DNA分子。

(4)用限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

(5)用限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ双酶切质粒pBAD/hisB，回收约4.1kb的载体骨架。

(6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到中间质粒。

(7)人工合成引物F2：

5'-CTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTC -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第12至33位)和R2：5'-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTT -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至3222位的反向互补序列)。

(8)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到约3.3kb的双链DNA分子。

(9)用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切步骤(6)得到的中间质粒，回收约4.2kb的载体骨架。

(10)将步骤(8)得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly试剂盒连接，得到重组质粒pBHdA2BE。

根据测序结果，对重组质粒pBHdA2BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列10所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdA2BE表达序列表中序列2所示的蛋白质(以下简称PqqA2蛋白)、序列表中序列4所示的PqqB蛋白、序列表中序列5所示的PqqC蛋白、序列表中序列6所示的PqqD蛋白和序列表中序列7所示的PqqE蛋白。

3、重组质粒pBHdA3BE的构建

(1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。

(2)人工合成引物F4：5'-CATGCCATGGGTATGAAAGTCTGGACGAAACC-3'(下划线为限制性内切酶NcoⅠ的酶切识别序列)和R4：5'-CTAGCTAGCTTAGATCAGATCGATCTCAGCC-3'(下划线为限制性内切酶NheⅠ的酶切识别序列)。

(3)完成步骤(1)和(2)后，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F4和R4为引物进行PCR扩增，得到约110bp的双链DNA分子。

(4)用限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

(5)用限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ双酶切质粒pBAD/hisB，回收约4.1kb的载体骨架。

(6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到中间质粒。

(7)人工合成引物F2：

5'-CTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTC -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第12至33位)和R2：5'-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTT -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至3222位的反向互补序列)。

(8)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到约3.3kb的双链DNA分子。

(9)用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切步骤(6)得到的中间质粒，回收约4.2kb的载体骨架。

(10)将步骤(8)得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly试剂盒连接，得到重组质粒pBHdA3BE。

根据测序结果，对重组质粒pBHdA3BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列11所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdA3BE表达序列表中序列3所示的蛋白质(以下简称PqqA3蛋白)、序列表中序列4所示的PqqB蛋白、序列表中序列5所示的PqqC蛋白、序列表中序列6所示的PqqD蛋白和序列表中序列7所示的PqqE蛋白。

4、重组质粒pBHdA1A2BE的构建

(1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。

(2)人工合成引物F5：5'-CTAGCTAGCAAGGAGATATAATGGAGGACATCATGAAGAC-3'(下划线为限制性内切酶NheⅠ的酶切识别序列)和R5：5'-AACTGCAGTTAGATGAGGTCGATCTCGG-3'(下划线为限制性内切酶PstⅠ的酶切识别序列)。

(3)完成步骤(1)和(2)后，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F5和R5为引物进行PCR扩增，得到约130bp的双链DNA分子。

(4)用限制性内切酶NheⅠ和PstⅠ双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

(5)用限制性内切酶NheⅠ和PstⅠ双酶切步骤1中(6)得到的中间质粒，回收约4.1kb的载体骨架。

(6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到中间质粒甲。

(7)人工合成引物F2：

5'-CTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTC -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第12至33位)和R2：5'-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTT -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至3222位的反向互补序列)。

(8)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到约3.3kb的双链DNA分子。

(9)用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切步骤(6)得到的中间质粒甲，回收约4.2kb的载体骨架。

(10)将步骤(8)得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly试剂盒连接，得到重组质粒pBHdA1A2BE。

根据测序结果，对重组质粒pBHdA1A2BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切酶NheⅠ和PstⅠ的识别位点之间插入序列表的序列18所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdA1A2BE表达序列表中序列1所示的PqqA1蛋白、序列表中序列2所示的PqqA2蛋白、序列表中序列4所示的PqqB蛋白、序列表中序列5所示的PqqC蛋白、序列表中序列6所示的PqqD蛋白和序列表中序列7所示的PqqE蛋白。

5、重组质粒pBHdA1A2A3BE的构建

(1)提取脱氮生丝微菌的基因组DNA。

(2)人工合成引物F6：5'-AACTGCAGAAGGAGATATAATGAAAGTCTGGACGAAACC(下划线为限制性内切酶PstⅠ的酶切识别序列)-3'和R6：5'-GGAATTCTTAGATCAGATCGATCTCAGCC(下划线为限制性内切酶EcoRⅠ的酶切识别序列)-3'。

(3)完成步骤(1)和(2)后，以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F6和R6为引物进行PCR扩增，得到约120bp的双链DNA分子。

(4)用限制性内切酶PstⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤(3)得到的双链DNA分子，回收酶切产物。

(5)用限制性内切酶PstⅠ和EcoRⅠ双酶切步骤4中(6)得到的中间质粒甲，回收约4.2kb的载体骨架。

(6)将步骤(4)回收的酶切产物和步骤(5)回收的载体骨架用T4连接酶连接，得到中间质粒乙。

(7)人工合成引物F7：

5'-CCGAGATCGACCTCATCTAAGAATTC -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，方框为RBS序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第12至33位)和R2：5'-CTCTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTT -3'(下划线为质粒pBAD/hisB上的同源序列，双下划线为序列表中序列12自5'末端起第3203至3222位的反向互补序列)。

(8)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以F7和R2为引物进行PCR扩增，得到约3.3kb的双链DNA分子。

(9)用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切步骤(6)得到的中间质粒乙，回收约4.3kb的载体骨架。

(10)将步骤(8)得到的双链DNA分子和步骤(9)回收的载体骨架利用DNA Assembly试剂盒连接，得到重组质粒pBHdA1A2A3BE。

根据测序结果，对重组质粒pBHdA1A2A3BE进行结构描述如下：向质粒pBAD/hisB的限制性内切酶NcoⅠ和NheⅠ的识别位点之间插入序列表的序列9所示的DNA分子，限制性内切酶NheⅠ和PstⅠ的识别位点之间插入序列表的序列18所示的DNA分子，用限制性内切酶PstⅠ和EcoRⅠ的识别位点之间插入序列表的序列19所示的DNA分子，限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ的识别位点之间插入序列表的序列12所示的DNA分子。重组质粒pBHdA1A2A3BE表达序列表中序列1所示的PqqA1蛋白、序列表中序列2所示的PqqA2蛋白、序列表中序列3所示的PqqA3蛋白、序列表中序列4所示的PqqB蛋白、序列表中序列5所示的PqqC蛋白、序列表中序列6所示的PqqD蛋白和序列表中序列7所示的PqqE蛋白。

二、构建重组大肠杆菌

1、构建重组大肠杆菌KQ01

将重组质粒pBHdA1BE导入大肠杆菌K12，得到含重组质粒pBHdA1BE的大肠杆菌K12，命名为重组大肠杆菌KQ01，简称KQ01。

2、构建重组大肠杆菌KQ02

将重组质粒pBHdA1BE导入大肠杆菌K12ΔiscR，得到含重组质粒pBHdA1BE的大肠杆菌K12ΔiscR，命名为重组大肠杆菌KQ02，简称KQ02。

3、构建重组大肠杆菌KQ03

将重组质粒pBHdA2BE导入大肠杆菌K12ΔiscR，得到含重组质粒pBHdA2BE的大肠杆菌K12ΔiscR，命名为重组大肠杆菌KQ03，简称KQ03。

4、构建重组大肠杆菌KQ04

将重组质粒pBHdA3BE导入大肠杆菌K12ΔiscR，得到含重组质粒pBHdA3BE的大肠杆菌K12ΔiscR，命名为重组大肠杆菌KQ04，简称KQ04。

5、构建重组大肠杆菌KQ05

将重组质粒pBHdA1A2BE导入大肠杆菌K12ΔiscR，得到含重组质粒pBHdA1A2BE的大肠杆菌K12ΔiscR，命名为重组大肠杆菌KQ05，简称KQ05。

6、构建重组大肠杆菌KQ06

将重组质粒pBHdA1A2A3BE导入大肠杆菌K12ΔiscR，得到含重组质粒pBHdA1A2A3BE的大肠杆菌K12ΔiscR，命名为重组大肠杆菌KQ06，简称KQ06。

7、构建重组大肠杆菌KQ07(空载体对照)

将质粒pBAD/hisB导入大肠杆菌K12ΔiscR，得到含质粒pBAD/hisB的大肠杆菌K12ΔiscR，命名为重组大肠杆菌KQ07，简称KQ07。

实施例2、单位细胞PQQ产量的测定

采用高效液相色谱(HPLC)测定单位细胞PQQ产量，具体测定步骤如下：

一、PQQ标准曲线的绘制

取1mg PQQ标准品，置于25mL容量瓶，加入20mL超纯水，涡旋使其完全溶解后再用超纯水定容至25mL，得到PQQ标准品浓度为40mg/L的溶液1；然后用超纯水将溶液1稀释，依次得到PQQ标准品浓度为30mg/L的溶液2、PQQ标准品浓度为20mg/L的溶液3、PQQ标准品浓度为16mg/L的溶液4、PQQ标准品浓度为12mg/L的溶液5、PQQ标准品浓度为8mg/L的溶液6、PQQ标准品浓度为6mg/L的溶液7、PQQ标准品浓度为4mg/L的溶液8和PQQ标准品浓度为2mg/L的溶液9。将上述各溶液用0.22μm的水系滤头过滤，收集滤液，然后采用HPLC进行定量测定，以吸收峰(保留时间为1.78～1.79min)的峰面积为横坐标，溶液浓度为纵坐标，绘制PQQ标准曲线，见图1。

HPLC测定条件如下：色谱柱：Waters反相柱(3.5μm，150×2.1mm)；柱温：45℃；检测波长：330nm；流动相：(水+0.1％TFA)：乙腈(v:v)＝20:80；流速：0.25mL/min。

二、单位细胞PQQ产量的测定方法

1、待测菌液中的PQQ产量的测定

取5mL待测菌液，10000g离心5min，得到上清。取所述上清，用0.22μm的水系滤头过滤，收集滤液并采用HPLC进行定量测定。根据待测菌液吸收峰的峰面积和步骤一绘制的PQQ标准曲线，得到待测菌液中的PQQ产量。

待测菌液中的PQQ产量的计算公式如下：

待测菌液中的PQQ产量(C_PQQ，mg/L)＝1.3746×Pst+0.8096；

其中Pst代表待测菌液吸收峰的峰面积(Pst单位：μV·S)。

2、待测菌液中生物量的测定

取20mL待测菌液，置于已称重的离心管中，10000g离心5min，弃上清，然后将含有菌体的离心管置于烘箱中，80℃处理48h，然后称重(m₂)。

待测菌液中生物量的计算公式如下：

待测菌液中生物量(DCW，g/L)＝(m₂-m₁)/0.02；

其中m₂代表含有菌体的离心管重量(单位：g)；m₁代表空离心管的重量(单位：g)。

3、单位细胞PQQ产量的计算

单位细胞PQQ产量的计算公式如下：

单位细胞PQQ产量(P_PQQ，mg/g DCW)＝C_PQQ/DCW。

实施例3、利用实施例1构建的KQ01～KQ06生产PQQ

一、添加二价铁离子对单位细胞PQQ产量的影响

1、在含100μg/mL氨卞青霉素的LB固体平板上活化实施例1构建的KQ01(活化条件为：37℃，12h)，得到KQ01单克隆。

2、完成步骤1后，取KQ01单克隆，接种至10mL含100μg/mL氨卞青霉素的M9培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h，得到培养菌液1。

3、完成步骤2后，取培养菌液1，以1:20的体积比接种至M9培养基甲或M9培养基乙，30℃、200rpm振荡培养65h，得到培养菌液2。

4、按照实施例2的方法，测定培养菌液2中单位细胞PQQ产量和生物量，得到KQ01接种至M9培养基甲或M9培养基乙中的单位细胞PQQ产量和生物量。

按照上述方法，将KQ01替换为KQ02，其它步骤均不变，得到KQ02接种至M9培养基甲或M9培养基乙中的单位细胞PQQ产量和生物量。

实验结果见图2(KQ01为KQ01接种至M9培养基甲；KQ01+30μm Fe为KQ01接种至M9培养基乙；KQ02为KQ02接种至M9培养基甲；KQ02+30μm Fe为KQ02接种至M9培养基乙)。结果表明，KQ01在M9培养基乙中的单位细胞PQQ产量更高，可见，在培养基中添加二价铁离子有利于大肠杆菌K12的合成PQQ，单位细胞PQQ产量从2.42mg/g DCW提高到3.07mg/g DCW；KQ02在M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量为3.13mg/g DCW，在M9培养基乙中的单位细胞PQQ产量为3.19mg/g DCW，两者无显著差异，表明培养大肠杆菌K12ΔiscR的培养基中无论是否含有二价铁离子，均可促进PQQ的合成。上述各生物量均无显著差异。

二、PqqA1蛋白、PqqA2蛋白或PqqA3蛋白对单位细胞PQQ产量的影响

1、在含100μg/mL氨卞青霉素的LB固体平板上活化实施例1构建的KQ02(活化条件为：37℃，12h)，得到KQ02单克隆。

2、完成步骤1后，取KQ02单克隆，接种至含100μg/mL氨卞青霉素的M9培养基中，37℃、200rpm振荡培养24h，得到培养菌液1。

3、完成步骤2后，取培养菌液1，以5％(体积百分比)的接种量接种至M9培养基甲，30℃、200rpm振荡培养65h，得到培养菌液2。

4、按照实施例2的方法，测定培养菌液2中单位细胞PQQ产量和生物量，得到KQ02接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。

按照上述方法，将KQ02替换为KQ03，其它步骤均不变，得到KQ03接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。

按照上述方法，将KQ02替换为KQ04，其它步骤均不变，得到KQ04接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。

按照上述方法，将KQ02替换为大肠杆菌K12ΔiscR，其它步骤均不变，得到大肠杆菌K12ΔiscR接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量(作为对照)。

按照上述方法，将KQ02替换为KQ07，其它步骤均不变，得到KQ07接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。

实验结果见图3中A。结果表明，KQ02、KQ03和KQ04在M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量分别为3.22mg/g DCW、2.12mg/g DCW和3.56mg/g DCW；大肠杆菌K12ΔiscR和KQ07在M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量均为0mg/g DCW。大肠杆菌K12ΔiscR、KQ07、KQ02、KQ03和KQ04在M9培养基甲中的生物量无显著差异。上述结果表明，序列表中序列11所示的pqqA3基因最有利于单位细胞PQQ产量的提高。

三、蛋白种类对单位细胞PQQ产量的影响

1、在含100μg/mL氨卞青霉素的LB固体平板上活化实施例1构建的KQ02(活化条件为：37℃，12h)，得到KQ02单克隆。

2、完成步骤1后，取KQ02单克隆，接种至含100μg/mL氨卞青霉素的M9培养基中，37℃、200rpm振荡培养24h，得到培养菌液1。

3、完成步骤2后，取培养菌液1，以5％(体积百分比)的接种量接种至M9培养基甲，30℃、200rpm振荡培养65h，得到培养菌液2。

4、按照实施例2的方法，测定培养菌液2中单位细胞PQQ产量和生物量，得到KQ02接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。

按照上述方法，将KQ02替换为KQ05，其它步骤均不变，得到KQ05接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。

按照上述方法，将KQ02替换为KQ06，其它步骤均不变，得到KQ06接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。

按照上述方法，将KQ02替换为大肠杆菌K12ΔiscR，其它步骤均不变，得到大肠杆菌K12ΔiscR接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量(作为对照)。

按照上述方法，将KQ02替换为KQ07，其它步骤均不变，得到KQ07接种至M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量和生物量。

实验结果见图3中B。结果表明，KQ02、KQ05和KQ06在M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量分别为3.10mg/g DCW、3.48mg/g DCW和4.18mg/g DCW；大肠杆菌K12ΔiscR和KQ07在M9培养基甲中的单位细胞PQQ产量均为0mg/g DCW。大肠杆菌K12ΔiscR、KQ07、KQ02、KQ05和KQ06在M9培养基甲中的生物量无显著差异。上述结果表明，在大肠杆菌K12ΔiscR中表达PqqA1蛋白、PqqA2蛋白和PqqA3蛋白的种类越多，其单位细胞PQQ产量就越高。

Claims (10)

1.特异DNA分子，包括如下元件：区段A、区段B、区段C、区段D和区段E；

所述区段A为如下(1)或(2)或(3)：

(1)含有PqqA1蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因和PqqA3蛋白的编码基因的DNA分子；

(2)含有PqqA1蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因和PqqA3蛋白的编码基因中的任意两个编码基因的DNA分子；

(3)含有PqqA1蛋白的编码基因、PqqA2蛋白的编码基因或PqqA3蛋白的编码基因的DNA分子；

所述区段B为含有PqqB蛋白的编码基因的DNA分子；

所述区段C为含有PqqC蛋白的编码基因的DNA分子；

所述区段D为含有PqqD蛋白的编码基因的DNA分子；

所述区段E为含有PqqE蛋白的编码基因的DNA分子；

所述PqqA1蛋白为a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

所述PqqA2蛋白为b1)或b2)：

b1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

b2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

所述PqqA3蛋白为c1)或c2)：

c1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；

c2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

所述PqqB蛋白为d1)或d2)：

d1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

d2)将序列表中序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

所述PqqC蛋白为e1)或e2)：

e1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；

e2)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

所述PqqD蛋白为f1)或f2)：

f1)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白质；

f2)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

所述PqqE蛋白为g1)或g2)：

g1)氨基酸序列是序列表中序列7所示的蛋白质；

g2)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。

2.如权利要求1所述的特异DNA分子，其特征在于：

所述PqqA1蛋白的编码基因为A1)或A2)或A3)：

A1)核苷酸序列是序列表中序列9所示的DNA分子；

A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqA1蛋白的DNA分子；

A3)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA1蛋白的DNA分子；

所述PqqA2蛋白的编码基因为B1)或B2)或B3)：

B1)核苷酸序列是序列表中序列10所示的DNA分子；

B2)与B1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqA2蛋白的DNA分子；

B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA2蛋白的DNA分子；

所述PqqA3蛋白的编码基因为C1)或C2)或C3)：

C1)核苷酸序列是序列表中序列11所示的DNA分子；

C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqA3蛋白的DNA分子；

C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqA3蛋白的DNA分子；

所述PqqB蛋白的编码基因为D1)或D2)或D3)：

D1)核苷酸序列是序列表中序列13所示的DNA分子；

D2)与D1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqB蛋白的DNA分子；

D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqB蛋白的DNA分子；

所述PqqC蛋白的编码基因为E1)或E2)或E3)：

E1)核苷酸序列是序列表中序列14所示的DNA分子；

E2)与E1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqC蛋白的DNA分子；

E3)在严格条件下与E1)或E2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqC蛋白的DNA分子；

所述PqqD蛋白的编码基因为F1)或F2)或F3)：

F1)核苷酸序列是序列表中序列15所示的DNA分子；

F2)与F1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqD蛋白的DNA分子；

F3)在严格条件下与F1)或F2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqD蛋白的DNA分子；

所述PqqE蛋白的编码基因为G1)或G2)或G3)：

G1)核苷酸序列是序列表中序列16所示的DNA分子；

G2)与G1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述PqqE蛋白的DNA分子；

G3)在严格条件下与G1)或G2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述PqqE蛋白的DNA分子。

3.含有权利要求1或2所述特异DNA分子的特异质粒。

4.如权利要求3所述的特异质粒，其特征在于：所述特异质粒的制备方法如下：在出发质粒中导入权利要求1或2中所述区段A、所述区段B、所述区段C、所述区段D和所述区段E，得到的重组质粒。

5.含有权利要求3或4所述特异质粒的重组菌。

6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌的制备方法如下：将所述特异质粒导入出发菌，得到重组菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述出发菌为大肠杆菌。

8.权利要求1或2所述特异DNA分子，或，权利要求3或4所述特异质粒，或，权利要求5至7中任一所述重组菌在制备吡咯喹啉醌中的应用。

9.一种制备吡咯喹啉醌的方法，包括如下步骤：发酵培养权利要求5至7任一所述重组菌，得到吡咯喹啉醌。

10.A)或B)：

A)融合蛋白，包括如下元件：PqqA蛋白、权利要求1或2中所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋白和所述PqqE蛋白；

所述PqqA蛋白为如下(P1)或(P2)或(P3)：

(P1)权利要求1或2中所述PqqA1蛋白、所述PqqA2蛋白和所述PqqA3蛋白；

(P2)权利要求1或2中所述PqqA1蛋白、所述PqqA2蛋白和所述PqqA3蛋白中的任意两个蛋白；

(P3)权利要求1或2中所述PqqA1蛋白、所述PqqA2蛋白或所述PqqA3蛋白；

B)蛋白组合物，由所述PqqA蛋白、权利要求1或2中所述PqqB蛋白、所述PqqC蛋白、所述PqqD蛋白、所述PqqE蛋白组成。