CN117959819A - 减少细胞培养基中氨和乳酸以回收和再利用的系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新颖的集成系统，其能够连续处理和回收来自大规模细胞培养物耗竭培养的基以降低成本和浪费。该方法包括可能细胞和细胞碎片澄清、中间浓缩、pH调节、电渗析分离和分析。初步细胞分离后，通过进一步的过滤步骤去除细胞和细胞碎片来澄清培养基，同时回收渗透物中的氨基酸和营养物质。可选的超滤可以在电渗析之前进一步富集蛋白质等组分。施加电场通过选择性膜将乳酸、盐和氨从介质中渗透到到浓缩液流道中。经过脱氨、脱乳酸的培养基进入质量控制流程进行成分分析，然后可以作为培养基的原料，进入生物反应器中重复使用。该系统通过回收细胞培养、特别是细胞灌流培养中的耗耗竭培养基，可显着减少大型生物生产行业(例如细胞培养肉等)的环境影响和费用。

Description

减少细胞培养基中氨和乳酸以回收和再利用的系统和方法

技术领域

本发明涉及通过去除细胞、碎片、乳酸和氨来澄清和回收用过的细胞培养基的系统和方法，以允许再利用或进一步处理。更具体地，公开了一种利用使用过滤、pH调节和连续或半连续操作的电渗析的系统解决方案。该系统可以节省培养营养和成本，同时通过从使用过的培养基中回收有价值的氨基酸、生长因子和其他成分来减少浪费和废液排放。

背景技术

人工培育的肉类可以以环保的方式补充传统牲畜肉类作为部分蛋白质来源。人工培育肉类可以减少温室气体排放、土地和水的需求，并显着有利于动物福利。

为了生产培育肉，将具有所需特性的动物细胞接种到具有适当设计的培养基的生物反应器中并使其增殖。细胞培养基必须包含氨基酸、葡萄糖等必需营养素，以及对介导和支持细胞生长至关重要的生长因子和白蛋白等其他关键成分。在细胞培养过程中，活细胞会产生乳酸和氨等代谢废物，需要将其消除或控制在特定范围内，以防止细胞生长受到抑制并获得高细胞产量。

各种细胞灌流技术将细胞从细胞培养基中分离出来，并从细胞培养系统中提取分离部分营养耗尽的培养基。然后将新鲜培养基添加到生物反应器系统中以补充营养物质和其他关键成分，例如生长因子。

细胞培养基是培育肉类行业的关键成本驱动因素。即使耗尽的培养基也包含有价值的成分，例如氨基酸、生长因子、白蛋白、可回收和再循环的缓冲液成分。如果不回收，这些耗尽的培养基可能会给废物管理带来额外的挑战，因为它们携带大量的有机材料。培养基可以来自细胞灌流培养工艺，也可以来自补料分批工艺最终收获肉细胞作为产品后的残余培养基。

由于缺乏适当的激励措施和重复利用的培养基工艺监管挑战，生物医药行业传统上不会回收培养基。目前还没有大规模解决方案能够有效实现这些目标的报道。

为了回收细胞培养基，必须将乳酸和氨等关键代谢废物减少到一定水平，并需要清除残余细胞碎片。

分离细胞碎片的最有效方法是通过过滤。过滤可以通过深层过滤或切向过滤来实现。用于细胞灌注或细胞分离的切向流过滤(TFF)提供了一个很好的选择用于细胞培养液的澄清。

TFF可以通过两种方式进行：单程切向流过滤(SPTFF)和循环切向流过滤(RTFF)。

在单程切向流过滤中，进料溶液通过膜一次，纯化的产物作为渗透物收集在膜的另一侧。未通过膜的进料溶液富含细胞碎片，称为回流液，或渗余液，可以是是副产物。该方法简单、高效，但可能受到膜孔堵塞，和膜的处理量的限制。

在循环切向流过滤中，进料溶液通过泵连续循环通过过滤器。澄清的培养基作为渗透物收集在膜的另一侧，并且将进料溶液再循环，直到达到所需的产物产率。此方法需要额外的设备，例如泵和处理容器，并且设置和操作可能更复杂。

SPTFF通常更简单、更有效，但RTFF可以实现更高的切向流流量，实现回收更高浓度的纯化产物。

TFF步骤还允许回收培养基成分，例如大分子、白蛋白、生长因子、外泌体或其他细胞产物，以收获其价值并减少废水。

过滤可用于澄清细胞碎片和分离大分子，但它并不是去除废培养基中氨和乳酸的有效方法。氨等气体的去除在工业上是可以通过脱气膜实现的，尽管过程缓慢，需要大量的膜表面积。

小分子的纯化可以通过离子交换色谱来完成。然而，色谱步骤消耗大量的水，并且色谱树脂价格昂贵，不易回收，并且不能自然降解，使其成本低效且不环保。

透析已在小批量回收培养基中进行了测试。然而，透析速度慢、效率低，并且可能很昂贵，因为它的处理量低，需要大的膜表面。

电渗析技术通过电场提高透析中的传质速率，通过调节电渗析进料流的pH值以及调节电压、电流、进料流量等工艺参数，可以实现离子在离子交换膜中传输的选择性。电渗析是一种利用电流通过离子选择性膜从溶液中分离离子的过程，可用于海水淡化，以去除盐离子，留下淡水。

在电渗析(ED)中，待处理的溶液(例如海水或废水)被送入一系列流通池，每个流通池由两种不同类型的离子选择性膜形成，膜之间用垫片隔开，以防止直接接触。在电池上施加直流电，导致离子向带有相反电荷的膜迁移并穿过膜。正离子(例如钠)向带负电的膜迁移并穿过带负电的膜，而负离子(例如氯离子)向带正电的膜迁移。

该系统由多层交替的阳离子交换膜(带负电)和阴离子交换膜(带正电)组成，分别选择性地允许正离子和负离子通过。

当离子穿过膜时，它们会在另一侧富集，从而降低溶液中的盐浓度。电渗析是从溶液中生产淡化水的有效方法。

电渗析对于淡水资源匮乏的地区尤其重要。除了海水淡化之外，电渗析还用于废水处理，有助于去除工业废水中的离子污染物。它在食品工业中也有重要用途，包括奶酪生产中对乳清进行脱盐以及纯化和浓缩各种食品。

电渗析非常节能，特别是在处理低至中等盐度的水时，并且可以选择性去除离子。

为了保护电渗析膜，需要预过滤以去除培养基中的细胞碎片和多余的有机成分，并需要调节pH到合适的范围。

电渗析的副产品是靠近电极的电子流中的酸和碱，这些副产品有可能被回收以回收用于pH调节和其他应用。

本发明公开了一种结合TFF和电渗析技术的经济高效的新工艺，用于澄清耗竭培养基中去除乳酸和氨以进行回收。

本发明公开了一种经济高效的耗竭培养基的处理和组份回收方法，将高效的过滤技术与电渗析相结合以回收培养基。

过滤和电渗析一般是批次操作，而大规模生物制造包括人造肉、合成生物学产品的规模话生产需要通过连续生产工艺来实现工艺强化，降低投资，提高效率。

这些技术能够实现培养基再循环的连续或半连续操作，帮助实现细胞培养肉，合成生物学工业化大规模生产。

发明内容

以下概述是对说明书中的系统、方法、装置和装置的一些一般发明步骤的解释。该概述不是本发明的完整和充分的概述，并且无意将其应用要求保护的范围限制在所描述的内容之内和。

在其一些实施例中，本发明公开了一种用于大规模回收来自大规模细胞培养、细胞分化、细胞洗涤或其他类型的生物生产的用过的细胞培养基的新颖系统，以实现成本高效的再利用。该系统利用过滤、pH调节和电渗析来减少乳酸和氨，同时去除细胞和杂质。连续操作可最大限度地减少浪费并恢复培养基以进行进一步的生物处理。

在一些方面，微滤，包括直流过滤和切向流过滤，可以用于培养基的澄清过滤。切向流过滤可以实现生长因子等蛋白质超过90％的截留率或90％的回收和截流，具体取决于膜孔径。切向流过滤可以使用单程和再循环模式。用于澄清的切向流滤膜孔径优选范围为0.1-0.45μm。

在一些方面，TFF步骤用于澄清细胞碎片，而在一些其他方面，使用合适的截流分子量的膜，比如小于0.1微米等，TFF还可以来达到浓缩培养基组分或细胞产物，例如大分子、外泌体等目的。

在其他优选的方面，pH调节为随后的电渗析制备澄清的培养基。调节澄清培养基的pH值操作可以分批过程或连续模式进行。本发明公开了这两种方法的应用。

大多数氨基酸和许多细胞蛋白质的等电点在pH 5-6.5之间。将培养基pH值设置为4.5-6.5可确保溶解度，同时将乳酸和氨转化为带电离子以进行去除。

在又一个方面，电渗析利用电场通过选择性膜从pH调节的培养基中提取离子乳酸离子和铵离子，将它们富集在浓缩流中。合适的条件下电渗析可以实现高达90％的乳酸去除效率。

在各个方面，集成系统可以浓缩生长因子等有价值的成分，同时达到需要的乳酸和氨的水平，以防止培养抑制。与其它技术相比，本发明的系统的连续性和紧凑性提供了可持续性优势。通过采用回收的细胞培养基，减少对废水处理、生产成本，已经和对新鲜培养基的成分要求。同时，进一步处理可以从电渗析浓缩液中回收有机酸等细胞外产物。

附图说明

是说明性实施例的特征的新颖特征在所附权利要求中阐述。然而，当结合所附的说明书阅读时，通过参考本公开的一个或多个示例性实施例的以下详细描述，将最好地理解示例性实施例以及优选的使用模式、进一步的目标及其描述。附图，其中：

图1示出了培养基回收系统的流程图，包括澄清、pH调节和电渗析三个模块。

图2示出了培养基回收系统的流程图，其中初始澄清和组分富集模块包括DFF和TFF部分。

图3示出了培养基回收系统的流程图，其中初始澄清仅包括TFF。

图4示出了用于灌注系统的培养基回收系统的流程图，其中细胞灌流用过滤器可以同时实现细胞分离，过滤系统也可以包括以下直流过滤(DFF)以用于额外的澄清或生物负载减少。

图5示出了用于细胞分离或澄清的模块化TFF系统的流程图，其中多个模块化TFF串联可以实现更大的处理能力。

图6示出了使用多过滤器用于细胞分离或澄清的TFF系统的流程图，其中过滤器可以实现在线清洗和再生。

图7示出了用于细胞分离或澄清的包括多个过滤器单程TFF系统的流程图，其中过滤器可以在线清洗和再生。

图8示出了包括多个过滤器直流过滤系统用于预过滤和澄清以保护电渗析装置的流程图，其中过滤器可以在线清洗和再生。

图9示出了pH调节模块的流程图，其中9A是使用混合罐的批量处理，而9B示出了使用在线混合器的连续操作。

图10A说明了电渗析的工作原理，大部分氨基酸保留在稀液中，而乳酸和铵离子将迁移到浓缩液流中，而图10B是电渗析系统的简化图，这里其它配套的管路和电线省略。

图11示出使用多级电渗析串联用于分离氨和乳酸的工作原理。

图12示出了具有在线膜再生能力并且能够连续操作的多个并行电渗析的工作原理。

具体实施方式

以下描述详细描述了自动化培养基恢复系统的优选实施例。然而，所提供的具体示例仅构成示例性实施方式。全文中的术语和措辞不应仅根据字面含义或字典定义进行解释。相反，文字和描述旨在体现发明的概念和创新，以解释回收方法及其优点。因此，在本发明的范围内，系统组件的布置、工作流程顺序、仪器或比例的变化是可能的。附加实施例可以利用替代配置或改进的元件来实现培养基回收。所公开的具体实施例仅代表功能示例性应用，但不限制权利要求中涵盖的可能表现形式的范围。

对维持耗竭培养基处理回收功能的所述组件的合理修改、集成和替换也应考虑在保护范围内。这些声明性陈述旨在列举创新的概念技术思路，以产生具有类似功能的方案。

因此，概述的培养基回收系统和技术概念应当基于有益的工业实用性来解释，而不是严格限于为说明目的而选择的示例性说明书、附图和描述。与本发明原理一致或相似系统和系统扩展旨在本发明的的权利要求书覆盖范围之内。

图1示意了用于从细胞培养生物反应器回收废培养基1包括的组份以降低总体生产成本和环境影响的集成连续系统。通过分离和回收生长因子、蛋白质和微量营养素等有价值的培养基成分，该系统显着减少了正在进行的大规模生产的的原料成本。

如图1所示，自动化流程包括三个初级回收和表征子系统/模块，包括：澄清和大分子分离；pH调节、电渗析；已经图内未显示控制和质量控制部分。

首先，生物反应器或发酵罐产生的细胞培养物首先进入初级细胞分离装置，优选装置包括过滤和/或离心机以实现初级细胞分离。细胞初步分离之后的耗尽培养基1穿过澄清(过滤)模块2。模块2可以包括额外的过滤以分离培养基中的较大颗粒和细胞产物或大分子。可选地，如果模块2中使用TFF装置，则细胞悬液5可以直接在澄清模块2中一步澄清。这些过程用于澄清培养基以除去细胞碎片等影响电渗析功能等的组份，如图1所示。在电渗析模块4中进一步处理之前，澄清后的培养基在pH调节模块3中进行pH调节。电渗析模块4排出的了呀包括稀释液流8和浓缩液流7。

在其一些实施例中，并且取决于细胞培养过程和灌注技术，澄清模块2可以包括直流过滤(DFF)组件和/或切向流过滤(TFF)组件。在一个实施例中，使用离心机中的离心实现初级细胞分离的培养基，仍然存在少量细胞碎片。一种模式中，预过滤器可用于直接过滤模式以澄清细胞碎片。然后，TFF步骤可用于在精密发酵中富集培养基成分，例如白蛋白生长因子，或细胞产物，例如脂肪颗粒、外泌体、乳蛋白、鸡蛋蛋白等。图2的实施例示出了培养基回收系统的流程图，其中初始澄清包括DFF系统6和TFF系统9。渗透物可以含有较低分子量的组分，例如葡萄糖、氨基酸和培养基缓冲组分等。在一些实施例中，由于TFF可以澄清包括细胞碎片含量更高的培养基，在TFF渗透物之后可以不必要进一步使用直流过滤器，但可以包括为后续步骤提供额外的保护过滤器。在图中，渗余物11可被传送到下一步操作进行以进行进一步处理。

在一些说明性的其他实施例中，孔径为1μm或更大的大孔膜用于在TFF或ATF细胞分离中截流细胞，而不是离心步骤。大孔TFF或ATF还可用作工艺强化的细胞灌流装置。通过灌流装置分离细胞之后收获的培养基仍然具有一定水平的细胞碎片，可以在电渗析操作的pH调节之前使用进一步的过滤步骤来进一步澄清。图3说明了培养基回收系统，其中初始澄清仅包括切向流过滤系统。

在一些实施例中，如果在灌注或细胞分离中使用较小孔径的膜(0.45um或更小)，则图中所示的直流澄清步骤不是必需的。具体地，图4示出了用于细胞灌流系统的培养基再循环系统，其中灌注过滤器服务可进行主要细胞分离，并且同时可以可选地包括以下直流过滤(DFF)以进行额外的澄清。该实施例中包括灌注生物反应器12，并且细胞悬浮液可以由灌注泵14通过供给管路供给至TFF模块9。一个或多个阀13可应用于控制和调节细胞培养基循环流量和控制/调节培养基至下一模块的流量。

在其他实施例中，澄清和大分子分离步骤中的TFF系统可以包括多个模块化系统以实现更大的容量，这些模块化系统可以并联或串联。图5示出了用于细胞分离或澄清的模块化TFF系统的流程图，其中模块化TFF串联以实现更大的容量。前一级TFF模块的渗透液通过进料管线15连接并可输送料液至下一级回流液循环流路的进料回路，如图所示。每个模块化系统都可以有多个TFF过滤器以提高容量。应当注意的是，这些模块化系统也可以并联布置以实现更高的容量。可以应用一个或多个压力监测器16来监测流路中培养基的压力。本TFF系统入如配合适当的过滤器、流量和泵、可用于细胞灌注。

更进一步，一些实施例可包括可以在线清洗和再生过滤器滤膜的再生设备，如图6所示。具体来说，如图6描述了用于细胞分离或澄清的多个模块化过滤器TFF系统，其中过滤器可以在线清洗和再生。该图示中的系统图配置允许通过将过滤器与待处理的物料隔离并通过注入入适当的缓冲剂和清洁试剂来的冲洗和清洁来再生过滤器。具体地，提供一个或多个容器17用于暂存冲洗和清洁溶液、或提供外接引入冲洗溶液或清洁溶液的管道。清洁溶液和冲洗溶液或被输送到过滤器并与膜过滤器接触以再生过滤膜或冲洗过滤器中的残余清洁试剂。在清洁步骤中，正在处理的样品或材料可以绕过这些过滤器并由其他过滤器进行处理，因此该过程可以连续进行。清洁程序完成后，可以重新连接入过滤器并用于生产。图中示出了滞留物或滲余物储罐19，用于暂存富集的细胞或细胞碎片等。在一些实施例中，所描述的过滤系统可用于细胞灌流并且罐12是灌流生物反应器。

在一些实施例中，过滤模块中使用的TFF系统是能够完全或部分实现单程切向流过滤(SpTFF)的系统，如图7所示。具体而言，该图示出了用于细胞分离或澄清的多过滤器TFF单程TFF系统。多个SpTFF过滤器(30)。依次连接，耗竭培养基继续流过每个过滤器的截流液(滲余液或回流液)路径，使细胞碎片或大分子浓缩在截留的滲余d液中11，并渗透10可以用于下一步操作。优选地，可以通过隔离待清洁的过滤器，并允许被处理的物料绕过正在清洗的过滤器来对每个过滤器实施在线过滤器再生。隔离后的过滤器经过漂洗、清洁、冲洗，并在清洁步骤完成后可以被重新部署用于处理物料。清洁/漂洗溶液可通过过滤器再循环或通过漂洗管路20以排放。

在又一个实施例中，过滤模块采用多个直流过滤过滤器，其可以并联或串联。这在以下例子中得到了体现图8示意了用于细胞耗竭培养基(1)预过滤和澄清以保护电渗析装置的多个过滤器直流过滤系统。在这个方面，过滤系统包括能够以与图7中所描述的类似的方式进行在线过滤器再生的并联连接的过滤器9。过滤器可以与料液通过关闭阀门隔离并进行清洁，可以在清洁步骤完成后重新部署。一种优选的实施，压力传感器16能够实现跨膜压和系统的实时监测和自动控制。

中空纤维膜、螺旋膜过滤器、平板盒式过滤器或陶瓷膜，0.1μm至0.45μm过滤器可用于澄清细胞、细胞碎片、颗粒和聚集物，而可使用0.1μm或更小孔径的膜过滤器用于浓缩和回收有价值的培养基蛋白质和补充剂以便再次。

此外，在一些优选实施，TFF渗透物流入临时储存罐，允许连续调节pH至pH 5.5-6.0的最佳窗口，用于随后的电渗析分离。

这里仅选择性的提供了实施过滤模块进行细胞分离和细胞碎片澄清以及培养基成分富集的操作。本公开并未详尽地阐述所有潜在的选项。并且存在无需创造性工作即可实现的许多其他变体，在本发明的范围之内。

pH调节模块

在其一些方面，pH调节子系统可以采用具有混合功能的容器，例如如图9A所示的混合罐23，以批量模式操作，其中pH调节试剂可以包含在罐21中，并且澄清的培养基在混合罐23中和pH调节试剂接触并混合，调到合适的pH后为后续的电渗析步骤做准备。在其他方面，可能优选采用在线混合器，例如图9B中所示的静态在线混合器24。在优选的方面，pH调节系统最少包括pH计、混合装置和pH调节试剂源例如酸和碱溶液。

使用在线混合器，可选地优选包括具有反馈回路的计算机控制系统90、上游的氨基酸分析仪器、在pH调节试剂添加之前的电导率计、以及在混合器之后的pH测定装置如图9A和9B所示。，用于过程控制并向计算机提供反馈。这些装置未完全在图中显示。

电渗析模块

在示例性方面，电渗析使用电场和离子交换膜去除样品中的盐和其他离子。它涉及交替的阳离子和阴离子交换膜，当在膜之间施加电流时，离子流向带相反电荷的电极迁移，而离子交换膜有选择性允许离子通过。电渗析的剖视图模块示出了具有阳极27和阴极26的模块，输入材料进入稀释流通道，从稀释流去除的离子将被浓缩流(C流)带走，并且电解液流28流过靠近电极的腔室。该工艺广泛用于海水淡化，特别是在处理低至中盐度的水方面。这里，浓缩流可以是耗竭的培养基、缓冲液、或纯水。

对于离子交换膜，特别是用于阴离子交换应用的离子交换膜，通常使用具有最低pKa的官能团，例如磺酸(-SO3H)基团，特别是在阳离子交换膜中，它们的pKa值非常低，低于1。

阴离子交换膜使用的官能团通常包括季铵盐等。这些基团本质上是碱性的(与酸性相反)，并且可以吸引和透过阴离子。电渗析的工作原理如图10A。_为了简单起见，本发明仅示出了主要液流包括携带培养基组份的，稀释流8表示减盐培养基，和浓缩液流7富集集来自稀释液流的离子，如图10B。

培养基中使用的大多数氨基酸具有5至6.5之间的pKi，如下表1所示。

表1：常用氨基酸的等电点

对进入稀释液流8的耗竭培养基进行pH调节以用于透析。培养基中使用的大多数氨基酸的pKi介于5和6.5之间。首次透析时将PH调节至5至6.5之间。

示例性地，电渗析(ED)模块可以包括一个或多个pH调节和电渗析步骤。在示例性的第一步中，可以将澄清培养基的pH调节至5至6.5之间以进行第一次透析。pH值在5至6.5之间时，氨的铵离子pKa为9.25左右，主要以NH₄ ⁺离子形式存在，可以通过阳离子交换膜，该膜只允许带正电的离子(阳离子)通过，而阻挡带负电的离子(阴离子)。阳离子交换膜通常由磺化聚苯乙烯等材料制成，其中磺酸基团提供阳离子交换位点。

pH值5-6.5时，乳酸的pKa为9.25，以阴离子形式(LT-)存在。乳酸离子可以通过带正电的阴离子交换膜。阴离子交换膜可以阻挡带正电的离子(阳离子)。优选地，用于AEM的材料通常包含季铵基团，其促进阴离子交换。

根据澄清培养基的氨基酸谱，可将进料的pH值调节至pH 5-6.5之间的值并送入稀释液通道。大多数氨基酸和葡萄糖带中性电荷并通过稀释液通道，而NH₄ ⁺和LT^-通过半透膜进入浓缩液流，如图10所示。

在一些非限制性方面，自动传感器和pH条件加料装置可以维持培养基pH。适当的pH值可确保大多数蛋白质保持溶解状态，同时将氨转化为在电场中迁移的带电铵离子。然后，电渗析组件通过离子选择性膜将这些离子富集到浓缩液中，在5小时内将乳酸和氨浓度降低50％或更多。脱盐溶液在稀液流中排出电渗析器以供再利用。

在一些可选的实施例中，在线传感器和分析连续地量化氨基酸谱、葡萄糖、维生素、生长激素水平和其他感兴趣的标记物，以监测回收效率并表征电渗析后的培养基组成。反馈控制逻辑可以自动调节上游过程参数以优化用于培养重新进入的恢复的解决方案。可以使用多步电渗析(ED)工艺，通过重新调整稀释液或浓缩液的pH值并再次进行另一步骤ED来进一步降低氨和乳酸水平和回收氨基酸，如图11所示。更具体地，图11示出了串联了多个电渗析步骤的工作原理，其中第一步的浓缩流或稀释流还可以通过另一个ED步骤进行处理，以进一步从氨基酸中分离乳酸或氨。

比如，第二步电渗析(ED)可以包括调节pH值接近乳酸的pKa 3.85，其中乳酸大部分显中性，而大多数氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸除外)带正电荷，这些氨基酸可以通过通过阴离子交换膜(带正电荷)。其他带正电的氨基酸，残留的氨离子带正电，可以通过磺酸等带有酸性官能团的阴离子交换膜。在此步骤中，可以从第一步的浓缩流流中除去氨基酸，并且可以在稀释液流中富集大部分中性的乳酸以进一步处理。

侧链氨基酸见表2。

表1.具有可电离侧链的氨基酸的pI

另一个可选的电渗析步骤是调节第一步电渗析(进料pH 5-6.5)或第二部步电渗析(进料pH～3.85)的浓缩液pH接近氨的pKa pH 9.25，除了赖氨酸和精氨酸带正电外，而其他氨基酸都带负电，可以通过阳离子半透膜。赖氨酸和精氨酸大部分仍带负电充电并可以通过阴离子交换膜。需要注意的是，如果使用季铵基膜，次数对带正电离子的排斥相对较弱。然而，如果阴离子交换膜使用具有更高pKa的基团，则可以改善对带正电离子的排斥和阻断作用。这里的主要目的是回收先前浓缩流中的氨基酸。

本发明仅公开了多阶段ED过程的示例性实施方式，存在其他类似工艺步骤。例如进行第一次透析是通过调节乳酸的pH接近pI来首先去除乳酸，这样氨基酸将在浓缩流中富集。

在一些实施方案中，为了实现连续处理，可以并行布置多个电渗析堆并且可以实施在线膜清洗和再生。多个电渗析单元4如图12所示并联连接，这允许单个电渗析单元与料液隔离并通过适当的缓冲剂和清洁试剂进行漂洗和清洁。特别地，使用一个或多个容器17用于暂存冲洗和清洁溶液或提供外接冲洗溶液或清洁溶液的输入管道，通过供给管路20输送到电渗析器且与电渗析膜接触，以清洁过滤膜然后并将清试剂冲洗掉。在清洁步骤中，正在处理的样品或材料可以绕过这些在进行膜再生电渗析单元、并由其他电渗析单元进行处理，因此该过程可以连续进行。清洁程序完成后，电渗析器可以重新接入并用于生产。总体而言，本发明，自动化过程可持续地再生用过的培养基，以支持的生物反应器长期连续性生产，同时回收在现有灌流过程中耗竭培养基找那个的有价值的组份。该系统可以通过合并具有更高容量的大型处理单元或并行扩展更多单元来轻松扩展，以满足工业规模流程的需求。

在一些实施方案中，示例性说明使用2um切向流滤膜进行细胞截流的灌流生物反应器的培养基回收(如图3所示)。灌流产生的耗竭废培养基通过单程切向流过滤(TFF)系统(如图7所示的SpTFF系统，具有孔径等级为0.2-0.45μm的过滤器)，以去除残留的细胞碎片和其他颗粒物质，提供电渗析之前提供澄清过滤。在一些实施例中，4个SpTFF过滤器单元顺序连接，具有在线过滤器再生能力。这种单程操作可将细胞碎片和杂质浓缩高达10倍，同时收集超过90％的补料量以恢复培养基质量。在2,000L批量灌注生物反应器的一种实施方式中，TFF灌注可以结合表面积为2m²且跨膜通量可以实现在10-100LMH之间的管式TFF过滤器。该过滤器可能能够结合在线再生。灌注和废细胞培养基收集后，0.2μm切向流过滤澄清并在5小时内收集渗透液中的培养基体积90％。如果不实施连续工艺，则可以将渗透缓冲液收集在保存容器中，用于电渗析操作的pH调节。

渗透培养基流在pH调节罐23中与pH调节试剂混合以在电渗析之前将pH稳定在5.6-5.8之间。该试剂可以是由计量泵引入的酸性滴定剂溶液。在此范围内优化pH值可确保大多数氨基酸电中性，且细胞蛋白质保持溶解度，同时还将氨转化为带电的铵离子，以便随后去除。

随后，将经过pH调节、TFF澄清的培养基送入电渗析装置。施加电场，导致负氯离子和乳酸离子向阳极迁移到浓缩液流，中并存储在浓缩流容器中。带正电的铵阳离子相反流向阴极，也进入浓缩液流。现在部分去除乳酸和氨的培养基通过稀释流出口离开电渗析器以进行储存或再利用。针对2，000L的处理量，单级电渗析可以使用最佳50m²的表面积。电渗析可以降低乳酸和氨减少50％或更多。可实现70％或更多的氨基酸回收率。

该电渗析浓缩流可以进行进一步的电渗析以回收有价值的组分，例如有机酸，包括乳酸。同时，通过QC模块分析以确认质量的稀释液返回到生物反应器或用于培养基的配置过程。

预期所描述的培养基回收系统可以作为集成的独立装置或以分布式模型来实现。在一个实施例中，切向流过滤、电渗析、浓缩、质量控制和控制系统组件在单个紧凑硬件装置上实现，而不依赖于外部通信。这些实施例的合理修改和整合均属于本发明的范围内。因此，申请人意图覆盖与本发明构思一致的密切相关的配置。

上述培养基回收模块可以作为大型设备系统的组成部分进行附加处理。添加额外的处理单元操作，例如色谱法、热交换或温度控制、冷冻干燥、蒸发，也在本发明的范围内。

工业应用

所公开的细胞培养基回收系统在工业规模培养肉生产设施或其他大规模生物生产中具有显着的实用性。随着这个新兴行业从小批量工艺发展成为满足全球蛋白质需求的大规模生产链，有效恢复和再利用耗尽的生长培养基可提供巨大的价值。一体化的、连续的回收方法使大型生物反应器或细胞灌流培养过程能够长时间持续运行，从而最大限度地减少排放。通过回收培养基成分来减少运营费用，并可以使培养基回收装置的投资合理化。此外，紧凑的模块化设计使回收设备能够支持在多生物反应器。通过回收培养基中的有效组份，该系统既可以降低成本，又可以减少环境废物的产生。因此，这项创新与能有效支持大规模细胞培养肉等生物工艺的降本增效。

参考：

1.苏曼·钱德拉·纳斯、英二Nagamori，Masanobu Horie，Masahiro Kino-Oka，通过透析精制培养基以在悬浮培养物中扩增人诱导多能干细胞，Bioprocess Biosyst工程，2017年1月；40(1):123-131。

2.Carey和Giuliano(2011)氨基酸、肽和蛋白质。有机化学第8版，25,1126McGrawHill，ISBN-13：978-0077354770。

Claims (13)

1.一种用于回收细胞培养基的系统，包括：

用于澄清使用过的培养基和/或富集一些培养基成分的过滤系统；

澄清之后料液的pH调节模块；和

用于从澄清介质中去除乳酸和氨离子的电渗析模块；

优选地，所述TFF系统是以切向流模式或交替流切向流过滤模式操作的细胞灌流培养系统的一部分。

2.根据权利要求1所述的系统，其中所述过滤系统包括以下之一：

切向流过滤系统；

直流过滤系统；或者

包括切向流和直流过滤部分的组合系统。

3.根据权利要求1所述的系统，其中所述过滤系统包括切向流过滤系统，所述切向流过滤系统具有至少一些串联连接的过滤器并且能够以完全或部分单程模式操作。

4.根据权利要求1所述的系统，其中所述过滤系统包括并联或串联布置的多个模块化切向流过滤子系统；其中串联式时其中前面模块化子系统的渗余物与后面子系统的渗余物循环流路回路连接，且透过液用于电渗析。

5.根据权利要求1所述的系统，其中所述过滤系统由一个或多个模块化系统中的多个过滤器组成，这些模块话系统可以用循环切向流模式，单程切向流模式，直流模式过滤，或混合模式过滤，这些过滤器可以并联或串联，并且过滤系统包括允许所述清洗和冲洗过滤器滤膜的在线再生系统，所述过滤器再生系统包括：

a.一个或多个用于冲洗和清洁溶液的容器或外接提供冲洗液或清洁溶液的输入管道，输送到过滤器并与过滤器膜接触；

b.冲洗和清洁溶液进口管路能够通过进料侧或渗透侧将冲洗和清洁溶液输送到过滤器，以及适用的控制阀；

c.清洁溶液出口管能够连接过滤器进料侧或渗透侧管路，将冲洗和清洁溶液转运到一个或多个清洁溶液容器以进行再循环或排放，以及适用的控制阀；

d.能够隔离一个或多个过滤器进行清洁和再生的管道和阀门，允许正在处理的样品或材料绕过这些在清洗的过滤器并由其他过滤器处理。

6.根据权利要求1所述的系统，其中所述用于减少细胞培养基中的乳酸和氨的电渗析模块包括：

a.多个串联或并联的电渗析装置；

b.一个或多个用于储存清洗液和冲洗液的容器或外接清洗液和冲洗液的管道

c.配套可以将清洗液和冲洗液输送至电渗析单元，进入电解液流、稀释流和浓缩流流道且与离子交换膜接触的管道；

d.清洗液和冲洗液出口管，能够从电渗析单元将清洗液和冲洗液传送至一个或多个清洁溶液缓冲容器进行循环清洗模式或排放的管道，以及适用的控制阀；和

e.能够隔离一个或多个电渗析塔进行清洁和再生的管道和阀门，允许待处理的料液绕过正在进行膜再生电渗析单元，且由其它单元处理。

7.根据权利要求1所述的系统，其中所述pH调节模块包括：

a.至少一个装有pH调节试剂的容器或外接pH调节试剂的管道；

b.至少能够控制添加pH调节剂的泵或阀门；

c.混合装置将pH调节剂与培养基混合；和

d.pH测定装置测定混合后的pH值；

优选地，所述pH调节模块中使用的混合器为在线混合器，具有连续调节料液pH的能力。

8.根据权利要求1所述的系统，其中所述电渗析模块包括多个串联或并联的电渗析单元；这些单元可以使用相同或不同进料pH范围；串联的后级可以用前级的稀释流或浓缩流调节到指定的pH作为进料。

9.一种回收细胞培养基的方法，包括：

a.使用过滤操作澄清培养基或浓缩耗竭培养基中的成分；

b.调节澄清后培养基的pH值；和

c.使用一步或多步电渗析从pH调节后的培养基中去除乳酸和溶解的氨；

优选地，其中所述第一步电渗析料液pH在5至6.5之间。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一步电渗析步骤的入口pH在5至6.5之间，第二步使用前一步的富乳酸料液在pH 3.5-4.2进入第二步以进一步富集乳酸并回收细胞培养基成分。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一电渗析步骤的入口pH在5至6.5之间，并且所述第二或第三步中的富氨样品再使用进料pH 8.7-10通过电渗析以将氨与其他氨基酸分离，这里氨富集在稀释流中。

12.根据权利要求9所述的方法，进一步涉及来自以下的一个或多个附加单元操作：色谱；浓缩；烘干；结晶；终端过滤；或蒸发等。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述回收和再生系统是在用于细胞培养的食品成分、药物成分或化妆品成分(包括外泌体)生产的哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞的培养工艺所使用的培养基上。