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CN117957323A - 经修饰的痘苗病毒及其应用 - Google Patents

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CN117957323A
CN117957323A CN202280055218.XA CN202280055218A CN117957323A CN 117957323 A CN117957323 A CN 117957323A CN 202280055218 A CN202280055218 A CN 202280055218A CN 117957323 A CN117957323 A CN 117957323A
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vaccinia virus
modified vaccinia
gene
cell
modified
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CN202280055218.XA
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袁明
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Shenzhen Huayao Kangming Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Huayao Kangming Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

提供一种经修饰的痘苗病毒，其包含编码一种或多种趋化因子的基因，以及，编码一种或多种T细胞生长因子基因和/或一种或多种T细胞激活因子。还提供了包含所述经修饰的痘苗病毒和免疫细胞的药物组合。还提供了所述经修饰的痘苗病毒和所述药物组合的制备方法及用途。

Description

经修饰的痘苗病毒及其应用 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种经修饰的痘苗病毒及其应用。
背景技术
细胞免疫疗法已被证明对治疗B细胞白血病，B细胞淋巴瘤以及多发性骨髓瘤非常有效，但在治疗实体瘤中尚未表现出理想的治疗效果。主要原因包括：1)不可接受的更大风险毒性(来源于潜在的“靶向肿瘤外”效应，由于很多正常组织表达靶分子引起的)；2)T细胞向肿瘤内的转运不足；3)T细胞的效应功能在肿瘤微环境中受损。另外的问题与实体瘤的固有异质性有关，这种异质性容易导致T细胞靶向肿瘤不完全并导致获得性耐药。
研究表明溶瘤病毒能够诱导增强肿瘤微环境(TME)中的I型干扰素的产生，另外溶瘤病毒可以增强树突状细胞(DC)和T细胞效应功能，并减少调节性T细胞(Treg)和髓源性抑制细胞(MDSC)诱导的免疫抑制，从而可以将肿瘤的免疫表型从“冷”转到“热”的状态，免疫热肿瘤促进T细胞进入、扩增和发挥功能。
如何能通过改进使得更有效地利用溶瘤病毒的优势，促进治疗性T细胞有效的进入实体瘤内发挥功能，是亟待解决的问题。
发明内容
本申请提供了一种经修饰的痘苗病毒及其应用。与未经修饰的痘苗病毒(例如野生型痘苗病毒)相比，所述经修饰的痘苗病毒可以具有选自下组的一个或多个特征：1)有效吸引T细胞进入实体瘤内部；2)有效使痘苗病毒产生抗肿瘤的特异性T细胞免疫；3)显著促进进入实体瘤内部的治疗性T细胞增殖；以及4)显著促进T细胞抗肿瘤的效果。
一方面，本申请提供了一种经修饰的痘苗病毒，其包含编码一种或多种趋化因子的基因，以及，编码一种或多种T细胞生长因子基因和/或编码一种或多种T细胞激活因子的基因。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含胸苷激酶(TK)缺陷的痘苗病毒。
在某些实施方式中，所述TK缺陷的痘苗病毒中编码TK的基因包含一个或多个突变。
在某些实施方式中，所述TK缺陷的痘苗病毒中编码TK的基因全部缺失。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含A46R基因包含一个或多个突变的痘苗病毒。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含A46R基因全部缺失的痘苗病毒。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含TK缺陷和A46R基因缺失的痘苗病毒。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含TK基因和A46R基因全部缺失的痘苗病毒。
在某些实施方式中，所述趋化因子包含CXCL9、CXCL10和/或CXCL11。
在某些实施方式中，所述CXCL9包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CXCL9包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述CXCL10包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CXCL10包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述T细胞生长因子包含IL-2。
在某些实施方式中，所述IL-2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述IL-2包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述T细胞激活因子包含IL-21。
在某些实施方式中，所述IL-21包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述IL-21包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含分别编码CXCL9、CXCL10、IL-2和IL-21的基因。
在某些实施方式中，在所述经修饰的痘苗病毒中，所述编码趋化因子的基因位于所述经修饰的痘苗病毒的TK基因所在的位置。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒的TK基因被所述编码趋化因子的基因所替代。
在某些实施方式中，所述编码T细胞生长因子的基因和/或编码T细胞激活因子的基因位于所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因所在的位置。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因被所述编码T细胞生长因子的基因和/或编码T细胞激活因子的基因所替代。
在某些实施方式中，在所述经修饰的痘苗病毒中，在TK基因缺失的位置插入编码趋化因子的基因，且在A46R基因缺失的位置插入编码T细胞激活因子和/或编码T细胞生长因子的基因。
在某些实施方式中，在所述经修饰的痘苗病毒中，在TK基因缺失的位置插入编码CXCL9的基因和编码CXCL10的基因，且在A46R基因缺失的位置插入编码IL-21和编码IL-2的基因。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒为李斯特株(Lister)。
另一方面，本申请还提供了核酸分子，其编码所述经修饰的痘苗病毒。
另一方面，本申请还提供了细胞，其包含所述经修饰的痘苗病毒，和/或，所述核酸分子。
在某些实施方式中，所述细胞包括宿主细胞。
在某些实施方式中，所述细胞包括肿瘤细胞。
另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包含所述经修饰的痘苗病毒，以及任选地药学上可接受地载剂。
在某些实施方式中，所述药物组合物被配制成适于全身给药，和/或，配制成适于静脉给药。
另一方面，本申请还提供了一种药物组合，其包含：1)所述经修饰的痘苗病毒，以及2)免疫效应细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包含经修饰的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包含T细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包含人T细胞。
另一方面，本申请还提供了所述经修饰的痘苗病毒，所述核酸分子，所述细胞，所述药物组合物，和/或，所述药物组合在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
另一方面，本申请还提供了一种提高经修饰的痘苗病毒使免疫效应细胞进入肿瘤的效率的方法，其包含：使所述经修饰的痘苗病毒包含编码一种或多种趋化因子的基因和编码一种或多种T细胞生长因子基因和/或编码一种或多种T细胞激活因子的基因。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包括A46R基因和/或TK基因包含一个或多个突变。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因和/或TK基因全部缺失。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含分别编码CXCL9、CXCL10、IL-2和/或IL-21的基因。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含分别编码CXCL9、CXCL10、IL-2和IL-21的基因。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒在TK基因缺失的位置插入编码CXCL9的基 因和编码CXCL10的基因，且在A46R基因缺失的位置插入编码IL-21和编码IL-2的基因。
在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒为李斯特株。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1显示的是TK穿梭载体的结构示意图。
图2显示的是A46R穿梭载体的结构示意图。
图3显示的是TKcxcl病毒重组结构示意图。
图4显示的是TKcxcl病毒基因组示意图。
图5显示的是本申请所述经修饰的痘苗病毒(Onco-T)的重组示意图。
图6显示的是本申请所述经修饰的痘苗病毒(Onco-T)的病毒基因组示意图。
图7显示的是本申请所述经修饰的痘苗病毒(Onco-T)的TK基因和A46R基因删除情况鉴定结果。
图8显示的是ELISA检测本申请所述经修饰的痘苗病毒(Onco-T)的IL-21基因和IL-2基因插入情况结果。
图9显示的是本申请所述经修饰的痘苗病毒(Onco-T)表达外源蛋白对T细胞趋化的影响。
图10显示的是本申请所述经修饰的痘苗病毒(Onco-T)表达外源蛋白对T细胞增殖的影响。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“经修饰的痘苗病毒”通常是指属于痘病毒科的病毒。所述经修饰的痘苗病毒可以为属于脊椎动物痘病毒(Chordopoxviridae)亚科的病毒。所述经修饰的痘苗病毒也可以为属于正痘病毒(Orthopoxvirus)属的病毒。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包括经修饰的痘苗病毒(Vaccinia virus)、牛痘病毒(cowpox virus)、金丝雀痘病毒(Canarypox virus)、鼠痘病毒(Ectromelia virus)或粘液瘤病毒(Myxoma virus)。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包括经修饰的痘苗病毒(Vaccinia virus)，其可以为DNA病毒(例如，其基因组可以为线性双链DNA)。所述经修饰的痘苗病毒具有较大(例如25kb以上)的基因组；外源基因可以在所述经修饰的痘苗病毒较为稳定；宿主范围广；可以不整合入宿主细胞的基因组等特点。所述经修饰的痘苗病毒可以包括Lister毒株。
在本申请中，术语“突变”通常是指特定蛋白质或核酸(基因，RNA)分别相对于野生型蛋白质或核酸的氨基酸或核酸序列的差异。
在本申请中，术语“TK缺陷”通常指与野生型痘苗病毒的TK相比，其功能、活性或基因发生改变。例如，所述TK缺陷可以指TK的活性下降或缺失。例如，所述TK缺陷可以指编码TK的基因发生突变。
在本申请中，术语“A46R”通常指痘苗病毒的含TIR结构域的病毒蛋白。在本申请中，该术语还涵盖其同源物、衍生物、突变体及功能活性片段。在本申请中，所述A46R区的左臂和右臂通常按照位于插入的目的基因的上下游定义。例如，所述A46R区左臂可以位于插入的目的基因的上游。例如，所述A46R区的右臂可以位于插入的目的基因的下游。
在本申请中，术语“生长因子”通常指对细胞生长有调节作用的蛋白质或多肽。在某些实施方式中，所述生长因子包含白细胞介素类生长因子，例如，所述生长因子包含IL-2。
在本申请中，术语“IL-21”也称“白介素-21”，是一种细胞激活因子。该术语还涵盖IL-21的同源物、衍生物、突变体及其功能活性片段。例如，所述IL-21可以包含人IL-21。例如，人IL-21的cDNA和氨基酸序列可见于如GenBank登录号BC066260.1和AAH69124.1。例如，所述IL-21可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“IL-2”也称“白介素-2”，是一种细胞生长因子。该术语还涵盖IL-2的同源物、衍生物、突变体及其功能活性片段。例如，所述IL-2可以包含人IL-2。例如，所述IL-2可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在本申请中，术语“Lister毒株”可以与“李斯特毒株”互换使用，通常是指在1961年羊中获得并在小牛上传代得到的VACV-List毒株的基础上制备得到的经修饰的痘苗病毒毒株。 所述Lister毒株已被广泛运用于疫苗生产(常规疫苗生产)。所述Lister毒株的基因组信息在GenBank的登录号为DQ121394。
在本申请中，术语“核酸分子”通常是指核苷酸(例如核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，和/或前述任一者的修饰形式)的聚合物形式。所述核酸分子可以包括RNA、cDNA、基因组DNA的有义链和反义链，及其合成形式和混合聚合物。所述核酸分子可以包括任何拓扑构象，包括单链，双链，部分双链体化，三链体化，发夹化，环形和挂锁构象。所述核酸分子可以包括天然存在的和/或非天然存在的核苷酸。
在本申请中，术语“药物组合物”通常是指一种或多种活性药物成分与一种或多种药学上可接受的载体的组合。所述药物组合物可以以最终的药物剂型存在，也可以为制备剂型的中间体。所述载体可以包括稳定剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或赋形剂。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载剂、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂、抗氧化剂、低分子量(少于约10个残基)多肽、蛋白质、亲水性聚合物、氨基酸、单糖、二糖和其它碳水化合物、螯合剂、糖醇、成盐反荷离子、例如钠，和/或非离子表面活性剂。
在本申请中，术语“肿瘤”通常是指由细胞(例如肿瘤细胞)异常生长形成的膨胀或损害。所述肿瘤可以与癌症在本申请中互换使用。所述肿瘤可以包括实体瘤和非实体瘤。所述肿瘤可以为弥散性肿瘤，或者可以为循环肿瘤。
在本申请中，术语“治疗”通常是指可以减少或减轻增殖性疾病的进展、严重程度和/或持续时间或改善增殖性疾病的一种或多种症状的措施。
在本申请中，术语“免疫效应细胞”通常指参与免疫应答，行使效应功能的免疫细胞。在本申请中，所述免疫效应细胞可以包含但不限于T细胞、自然杀伤T细胞、淋巴细胞。该术语还包括工程化的免疫细胞，如通过将DNA或RNA形式的外源遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的免疫细胞，如通过基因编辑技术将免疫细胞的基因改变得到的免疫细胞。
发明详述
一方面，本申请提供一种经修饰的痘苗病毒，其包含编码一种或多种趋化因子的基因，以及，编码一种或多种T细胞生长因子和/或编码一种或多种T细胞激活因子的基因。
另一方面，本申请还提供了经修饰的痘苗病毒，其包含和/或表达一种或多种外源趋化因子，以及包含和/或表达一种或多种外源T细胞生长因子和/或一种或多种外源T细胞激活因 子的基因。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含胸苷激酶(TK)缺陷的痘苗病毒。在本申请中，所述TK缺陷的痘苗病毒可以包含编码TK的基因具有突变的痘苗病毒。在本申请中，所述TK缺陷的痘苗病毒通常指与野生型痘苗病毒相比，其TK基因包含至少一个突变的痘苗病毒。例如，所述TK缺陷的病毒可以包含编码TK的基因具有部分突变，也可以包含编码TK的基因具有全部的突变。例如，所述突变可以包含基因的添加、缺失和/或替换。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒的TK可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含编码TK的基因全部缺失的痘苗病毒。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含A46R基因缺陷的痘苗病毒。在本申请中，所述A46R基因缺陷的痘苗病毒通常指与野生型痘苗病毒相比，其A46R基因包含至少一个突变的痘苗病毒。例如，所述经修饰的痘苗病毒可以包含A46R基因具有部分突变，也可以包含A46R基因具有全部突变。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含A46R基因全部缺失的痘苗病毒。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒的A46R可以包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以同时包含TK缺陷和A46R缺陷。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒与野生型痘苗病毒相比，可以在TK基因和在A46R基因上都发生突变。例如，所述经修饰的痘苗病毒可以包含TK基因全部缺失和A46R基因全部缺失。
在本申请中，所述趋化因子可以包含外源趋化因子。例如，所述趋化因子可以包含T淋巴细胞趋化因子。例如，所述经修饰的痘苗病毒可包含和/或表达一种或多种外源趋化因子。例如，所述经修饰的痘苗病毒可包含和/或表达两种不同的外源趋化因子。例如，所述经修饰的痘苗病毒科包含和/或表达三种不同的外源趋化因子。例如，所述趋化因子可以包含CXCL9、CXCL10和/或CXCL11。在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含CXCL9基因。在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含CXCL10基因。在某些实施方式中，所述经修饰的痘苗病毒包含CXCL9和CXCL10基因。在某些实施方式中，所述趋化因子可以为人源的。
在本申请中，所述CXCL9可以包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。在本申请中，所述CXCL9可以包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。在本申请中，所述CXCL10可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。在本申请中，所述CXCL10可以包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述编码趋化因子的基因可以位于所述经修饰的痘苗病毒中TK基因所在 的位置。例如，所述编码趋化因子的基因可以位于所述编码TK基因的起始基因和终止基因的范围内。例如，所述经修饰的痘苗病毒的TK基因可以被所述编码趋化因子的基因所替代。例如，所述经修饰的痘苗病毒的TK基因可以被CXCL9基因和CXCL10基因所替代。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒还可包含和/或表达一种或多种细胞因子。例如，所述细胞因子可以包含T细胞生长因子。例如，所述细胞因子可以包含T细胞激活因子。例如，所述细胞因子可包含IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β和/或GM-CSF。例如，所述经修饰的痘苗病毒还可包含和/或表达两种不同的细胞因子。例如，所述经修饰的痘苗病毒可包含和/或表达三种不同的细胞因子。例如，所述细胞因子可包含人源细胞因子。
在本申请中，所述T细胞生长因子可以包含IL-2。在本申请中，所述IL-2可以包含人IL-2。例如，所述IL-2可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。例如，所述IL-2可以包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。在本申请中，所述T细胞激活基因可以包含IL-21。在本申请中，所述IL-21可以包含人IL-21。例如，所述IL-21可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。例如，所述IL-21可以包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含T细胞生长因子和/或T细胞激活因子。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含T细胞生长因子。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含T细胞激活因子。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含T细胞生长因子和/或T细胞激活因子。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含IL-2和/或IL-21。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含IL2。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含IL-21。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含IL-2和IL-21。
在本申请中，所述编码T细胞生长因子和/或所述T细胞激活因子的基因可以位于所述经修饰的痘苗病毒中A46R基因所在的位置。例如，所述编码T细胞生长因子和/或所述T细胞激活因子的基因可以位于编码所述A46R基因的起始基因和终止基因的范围内。例如，所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因可以被所述编码T细胞生长因子和/或所述T细胞激活因子的基因所替代。例如，所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因可以被IL-2基因和IL-21基因所替代。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含CXCL9基因、CXCL10基因、IL-2基因和IL-21基因。
在本申请中，所述CXCL9基因、CXCL10基因、IL-2基因和/或IL-21可以通过各启动子 连接插入痘苗病毒的基因组中。所述各启动子可以相同，也可以不同。例如，所述启动子可以包含pLEO、Psel、PE/L和/或H5。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒包含TK基因缺失，A46R基因缺失，且包含CXCL9基因、CXCL10基因、IL-2基因和IL-21基因。
在本申请中，可以在所述经修饰的痘苗病毒中TK基因缺失的位置插入所述编码趋化因子的基因，且在所述A46R基因缺失的位置插入所述编码T细胞激活因子和/或所述编码T细胞生长因子的基因。
在本申请中，可以在所述经修饰的痘苗病毒中TK基因缺失的位置插入CXCL9基因和CXCL10基因，且在所述A46R基因缺失的位置插入IL-2基因和IL-21基因。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以为李斯特株(Lister)。
另一方面，本申请还提供了一种核酸分子，其包含经修饰的痘苗病毒的基因序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子编码所述经修饰的痘苗病毒的基因组。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请所述的经修饰的痘苗病毒，和/或，本申请所述的核酸分子。
在本申请中，所述细胞可以包括宿主细胞。
在本申请中，所述细胞可以包括肿瘤细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合，其包含所述经修饰的痘苗病毒，以及免疫效应细胞。
在本申请中，所述免疫效应细胞可以包含经修饰的免疫效应细胞。
在本申请中，所述免疫效应细胞可以包含T细胞。
在本申请中，所述免疫效应细胞可以包含经修饰的T细胞。
在本申请中，所述免疫效应细胞可以包含人T细胞。
在本申请中，所述药物组合中的所述经修饰的痘苗病毒和所述免疫效应细胞可以放置于同一容器中。在本申请中，所述药物组合中的所述经修饰的痘苗病毒和所述免疫效应细胞可以放置于不同容器中。
在本申请中，所述经修饰的溶瘤病毒可以和所述免疫效应细胞同时施用。在本申请中，所述经修饰的溶瘤病毒可以和所述免疫效应细胞分别施用。例如，可以先施用所述经修饰的溶瘤病毒，再施用所述免疫效应细胞。例如，可以先施用所述免疫效应细胞，再施用所述经修饰的溶瘤病毒。例如，药物组合中各组分可以间隔约1分钟，约2分钟，约3分钟，约4分钟，约5分钟，约10分钟，约20分钟，约30分钟，约45分钟，约1小时，约2小时， 约3小时施用，也可以间隔约半天，约一天，约两天，约三天，约四天，约五天，约一周，约一周半，约两周，约三周，约四周施用。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含本申请所述的经修饰的痘苗病毒，以及任选地药学上可接受的载剂。在本申请中，所述药物组合物还可以包含其他活性成分。例如，所述药物组合物还可以包含免疫细胞。
在本申请中，所述药物组合物可以包括“治疗有效剂量”或“预防有效剂量”的本申请所述的经修饰的痘苗病毒。所述“治疗有效剂量”可以为在必要的剂量和持续时间下有效地实现所需治疗结果的量。所述治疗有效剂量可以由本领域技术人员确定。例如，可以根据疾病的状态、受试者的年龄、性别、体重、所述经修饰的痘苗病毒在受试者体内引起所述反应的能力等因素变化。所述“预防有效剂量”可以为在必要的剂量和持续时间下，有效地实现所需预防结果的量。例如，所述预防有效剂量可以低于所述治疗有效剂量。
在本申请中，所述药物组合物可以被配制为适用于施用的形式(例如，适用于肠胃外、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内和皮下、肿瘤内和/或粘膜施用)。
在本申请中，所述药学上可接受的载剂可以包括生理上相容的任何或所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述药学上可接受的载剂可以包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等以及其组合中的一种或多种。所述药学上可接受的载剂还可以包括等渗即、润湿剂、乳化剂、防腐剂和/或缓冲剂。
在本申请中，所述药物组合物可以被配制成适于全身给药，和/或，其可以被配制成适于静脉给药。
另一方面，本申请提供了一种本申请所述经修饰的痘苗病毒，本申请所述的核酸分子，本申请所述的细胞，本申请所述的药物组合物，和/或，本申请所述的药物组合在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请提供了本申请所述经修饰的痘苗病毒，本申请所述的核酸分子，本申请所述的细胞，本申请所述的药物组合物，和/或，本申请所述的药物组合，其用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗疾病和/或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用本申请所述经修饰的痘苗病毒，本申请所述的核酸分子，本申请所述的细胞，本申请所述的药物组合物，和/或，本申请所述的药物组合。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包含实体瘤和非实体瘤。
另一方面，本申请提供了一种提高经修饰的痘苗病毒使免疫效应细胞进入肿瘤的效率的方法，其包含：使所述经修饰的痘苗病毒包含编码一种或多种趋化因子的基因和编码一种或多种T细胞生长因子的基因和/或一种或多种T细胞激活因子的基因。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒与未经修饰的痘苗病毒(例如，野生型痘苗病毒)相比，显著提高了免疫效应细胞进入肿瘤的效率。例如，提高了至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％或更多。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒与野生型痘苗病毒相比，显著提高了复制速度和/或杀伤宿主细胞的能力。例如，提高了至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约300％或更多。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒能够有效提高体内免疫细胞进入肿瘤的效率。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒能够有效提高肿瘤细胞的杀伤能力。
例如，与仅包含编码趋化因子或T细胞生长因子或T细胞激活因子的基因的痘苗病毒相比，本申请所述的同时包含编码一种或多种趋化因子的基因，以及，编码一种或多种T细胞生长因子的基因和/或编码一种或多种T细胞激活因子的基因能够有效提高体内免疫细胞进入肿瘤的效率。
例如，与仅包含编码趋化因子或T细胞生长因子或T细胞激活因子的基因的痘苗病毒相比，本申请所述的同时包含编码一种或多种趋化因子的基因，以及，编码一种或多种T细胞生长因子的基因和/或编码一种或多种T细胞激活因子的基因能够有效提高肿瘤细胞的杀伤能力。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可包括A46R基因和/或TK基因包含一个或多个突变。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因和/或TK基因可全部缺失。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可包含分别编码CXCL9、CXCL10、IL-2和/或IL-21的基因。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可包含分别编码CXCL9、CXCL10、IL-2和IL-21的基因。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以在TK基因缺失的位置插入编码CXCL9的基因和编码CXCL10的基因，且在A46R基因缺失的位置插入编码IL-21和编码IL-2的基因
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含任何本领域内已知的痘苗病毒毒株。例如，所述痘苗病毒毒株可以包含TK基因缺失。例如，所述痘苗病毒毒株可以包含A46R基因缺失。在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以为李斯特株。
在本申请中，所述经修饰的痘苗病毒可以包含Onco-T。在某些实施方式中，所述Onco-T为本申请实施例1所制备的经修饰的痘苗病毒。在某些实施方式中，在体内动物实验中，所述Onco-T可以有效地诱导T细胞进行趋化。在某些实施方式中，在体内动物实验中，所述Onco-T可以有效促进T细胞增殖。在某些实施方式中，所述Onco-T和T细胞联用对肿瘤的杀伤能力检测。
在某些实施方式中，与TK和A46R缺失的仅插入趋化因子的痘苗病毒和细胞生长因子联用的效果相比，Onco-T的杀伤对T细胞诱导趋化及促增殖效应表现出更好的效果。
在某些实施方式中，使用具有其他突变的痘苗病毒载体(例如，其他痘苗病毒毒株；例如，具有除TK和A46R基因缺失的其他突变)同时表达趋化因子和细胞生长因子也能表达有益效果(例如，诱导T细胞趋化，促进T细胞增殖，抗肿瘤效果)。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请发明的各个技术方案，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1制备经修饰的痘苗病毒
使用李斯特株痘苗病毒为载体，野生型痘苗病毒购自ATCC(ATCC VR-1549)，在野生型痘苗病毒的基础上进行如下改造：删除痘苗病毒的A46R基因和TK基因，在A46R基因处插入编码IL-21和IL-2的基因，在TK基因处插入编码CXCL9和CXCL10的基因。具体操作如下：
TK穿梭载体的构建
TK穿梭载体包括TK左臂靶向TK基因的左侧(L089)，TK右臂靶向TK基因的右侧(L091)。H5启动子(SEQ ID NO:1)和红荧光蛋白RFP，T细胞趋化因子基因CXCL9(氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)和CXCL10(氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，分别使用启动子pLEO(SEQ ID NO:2)和Psel(SEQ ID NO:3)，把以上所有的序列拼接在一起交由南京金斯瑞生物技术 有限公司合成，并克隆到PUC57载体中。TK穿梭载体结构示意图如图1所示。
A46R穿梭载体的构建
A46R穿梭载体包括A46R左臂靶向A46R基因的左侧(L163)，A46R右臂靶向A46R基因的右侧(L165)。Psel启动子(SEQ ID NO:3)驱动绿荧光蛋白GFP的表达。PE/L启动子(SEQ ID NO:4)驱动IL-21(氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)基因的表达，PE/L启动子驱动IL-2(氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)基因的表达。把以上所有的序列拼接在一起交由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，并克隆到PUC57载体中。A46R穿梭载体结构示意图如图2所示。
Cas9介导的同源重组痘苗病毒重组
在转染前一天将3×10 5个CV-1细胞接种到六孔板的一个孔中。将gRNA载体用于靶向TK区域的TKgRNA，靶向A46R区域的A46RgRNA与Cas9共转染到六孔板中的CV-1细胞中。第二天，用0.01PFU/细胞的骨架病毒感染转染了gRNA载体和Cas9基因的孔。在病毒感染后2小时，将用于同源重组的穿梭载体转染到感染的孔中。24小时后收获细胞，并在-80℃冷冻以进行重组病毒纯化。
重组病毒的纯化
将从Cas9介导的同源重组收集的细胞裂解物解冻，并将0.5μl该裂解物用于感染含有生长至80-90％汇合的CV1细胞的六孔板的所有6个孔。感染48小时后，在荧光显微镜下仔细检查每个孔，寻找发红色或者绿色荧光的病毒。在鉴定阳性感染斑后，用记号笔在板的下表面上标记它们的位置。然后在培养细胞的通风柜中在从孔中吸出培养基后，用20μl尖端仔细挑选病毒斑。然后将尖端浸没在含有200μl的细胞培养液的冷冻管中。在经过一次冻融循环后，将5-20μl该病毒溶液加入到含有CV1细胞的新6孔板的每个孔中。重复该过程直至每个病毒斑都发红色或者绿色荧光，即所有病毒斑都是由重组病毒引起的。通常，需要3至5轮的病毒斑纯化以获得纯的重组病毒。确认病毒已经纯了以后，把感染的细胞刮下离心得到细胞沉淀。然后取部分细胞提取病毒DNA。通过从提取的病毒DNA中PCR扩增靶基因来确认病毒的纯度。
重组病毒获得删除TK基因，携带T细胞趋化因子基因CXCL9和10的病毒。
用野生型的李斯特株痘苗病毒为母病毒，利用Cas9和gRNA技术将重组载体和母病毒进行重组(TKcxcl病毒重组示意图如图3所示)。重组后在荧光显微镜下筛选重组病毒，直至获得纯化的病毒，并用PCR方法鉴定TK基因删除以及插入基因的存在，通过鉴定获得TKcxcl病毒(TKcxcl病毒示意图如图4所示)。
上述获得的重组病毒TKcxcl为母病毒，进行重组获得A46R基因删除并且插入T细胞激活因子IL-21和T细胞生长因子IL-2基因的病毒(病毒重组示意图如图5所示)。利用Cas9和gRNA技术将重组载体和母病毒进行重组，重组病毒示意图如图6所示。重组后在荧光显微镜下筛选重组病毒，直至获得纯化的病毒，并用PCR方法鉴定A46R基因删除以及插入基因的存在，鉴定结果如图7所示，其中，+为阳性对照，—为阴性对照，S为经修饰的痘苗病毒，L09为编码List09蛋白的基因区域，做为扩增的对照基因，TK和A46R为鉴定删除的基因。结果显示，且痘苗病毒的TK基因和A46R基因被删除。
用ELISA方法鉴定得到的经修饰的痘苗病毒表达T细胞趋化因子基因CXCL9和CXCL10，T细胞激活因子IL-21和T细胞生长因子IL-2的结果，ELISA结果如图8所示，结果显示，在痘苗病毒中插入了CXCL9、CXCL10、IL-21和IL-2基因。
病毒的扩增
经过证实重组病毒是目的重组病毒，将50μl病毒裂解物加入含有CV1细胞的T175培养瓶中，在含有约30毫升的细胞培养液中生长至80-90％汇合。48小时后刮取细胞和培养基并保存。
实施例2经修饰的痘苗病毒对T细胞趋化的影响检测
验证本申请制备的经修饰的痘苗病毒对T细胞趋化的影响。使用Onco-T表示本申请制备的经修饰的痘苗病毒，检测本申请制备的经修饰的痘苗病毒表达的外源蛋白对T细胞跨膜趋化的影响。其中对照组为野生型痘苗病毒李斯特株。用Trans well检测4小时后T细胞跨膜移行的数量。
结果如图9所示，结果显示，用含有本申请制备的经修饰的痘苗病毒表达的外源蛋白的细胞培养液进行测试可以有效地诱导T细胞进行趋化。
实施例3经修饰的痘苗病毒对T细胞增殖的影响检测
使用Onco-T表示本申请制备的经修饰的痘苗病毒，验证本申请制备的经修饰的痘苗病毒对T细胞增殖的影响。其中对照组为野生型痘苗病毒李斯特株。通过细胞计数检测加入痘苗病毒24小时后对细胞增殖的影响。
结果如图10所示，结果显示，用含有本申请制备的经修饰的痘苗病毒表达的外源蛋白的细胞培养液进行测试可以有效地促进T细胞进行增殖。
实施例4经修饰的痘苗病毒联合T细胞对肿瘤的杀伤能力
建立BALB/c裸鼠人横纹肌肉瘤细胞A673皮下瘤模型，评价痘苗病毒Onco-T联合T细对肿瘤的杀伤能力。
1.动物造模
BALB/c裸鼠检疫合格，皮下注射0.1mL人横纹肌肉瘤细胞A673(5×107个/mL)于小鼠背部后侧，接种后每天观察肿瘤生长情况；待肿瘤明显生长后，每2天测量一次肿瘤体积(造模当天记为M1)；待肿瘤体积生长至80～160mm3左右，根据肿瘤体积进行随机分组给药(给药当天记为D1)。
2.动物分组
筛选成模的动物随机分组，分别为溶媒对照组、阳性对照组、Onco-T组以及分别联合T细胞治疗组，T细胞于各组病毒注射5天后注射。评价Onco-T对T细胞迁移和增殖情况以及肿瘤生长和动物生存情况。具体分组及给药信息如下：
3.动物肿瘤治疗效果检测
与溶媒对照组和阳性对照组相比，Onco-T组的动物肿瘤相对更小；在联用T细胞组中，Onco-T和T细胞联用组的动物肿瘤相对小，且比单独使用Onco-T治疗效果更好。肿瘤治疗效果：Onco-T和T细胞联用组＞HY01和T细胞联用组＞溶媒对照和T细胞联用组。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方式的范围内。

Claims (47)

  1. 经修饰的痘苗病毒，其包含编码一种或多种趋化因子的基因，以及，编码一种或多种T细胞生长因子的基因和/或编码一种或多种T细胞激活因子的基因。
  2. 根据权利要求1所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述经修饰的痘苗病毒包含胸苷激酶(TK)缺陷的痘苗病毒。
  3. 根据权利要求2所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述TK缺陷的痘苗病毒中TK基因包含一个或多个突变。
  4. 根据权利要求2-3中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述TK缺陷的痘苗病毒中TK基因全部缺失。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述经修饰的痘苗病毒包含A46R基因包含一个或多个突变的痘苗病毒。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述经修饰的痘苗病毒包含A46R基因全部缺失的痘苗病毒。
  7. 根据权利要求1-6中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其包含TK缺陷和A46R基因缺失的痘苗病毒。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其包含TK基因和A46R基因全部缺失的痘苗病毒。
  9. 根据权利要求1-8中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述趋化因子包含CXCL9、CXCL10和/或CXCL11。
  10. 根据权利要求9所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述CXCL9包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
  11. 根据权利要求9-10中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述CXCL9包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
  12. 根据权利要求9-11中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述CXCL10包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
  13. 根据权利要求9-12中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述CXCL10包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
  14. 根据权利要求1-13中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述T细胞生长因子包含IL-2。
  15. 根据权利要求14所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
  16. 根据权利要求14-15中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述IL-2包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
  17. 根据权利要求1-16中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述T细胞激活因子包含IL-21。
  18. 根据权利要求17所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述IL-21包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
  19. 根据权利要求17-18中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述IL-21包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
  20. 根据权利要求1-19中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其包含分别编码CXCL9、CXCL10、IL-2和IL-21的基因。
  21. 根据权利要求1-20中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述编码趋化因子的基因位于所述经修饰的痘苗病毒的TK基因所在的位置。
  22. 根据权利要求21所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述经修饰的痘苗病毒的TK基因被所述编码趋化因子的基因所替代。
  23. 根据权利要求1-22中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述编码T细胞生长因子的基因和/或编码T细胞激活因子的基因位于所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因所在的位置。
  24. 根据权利要求23所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因被所述编码T细胞生长因子的基因和/或编码T细胞激活因子的基因所替代。
  25. 根据权利要求1-24中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其在所述TK基因缺失的位置插入所述编码趋化因子的基因，且在所述A46R基因缺失的位置插入所述编码T细胞激活因子和/或所述编码T细胞生长因子的基因。
  26. 根据权利要求20-25中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其在所述TK基因缺失的位置插入所述编码CXCL9的基因和所述编码CXCL10的基因，且在所述A46R基因缺失的位置插入所述编码IL-21和所述编码IL-2的基因。
  27. 根据权利要求1-26中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，其中所述经修饰的痘苗病毒为李斯特株(Lister)。
  28. 核酸分子，其编码权利要求1-27中任一项所述的经修饰的痘苗病毒。
  29. 细胞，其包含权利要求1-27中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，和/或，权利要求28中所述的核酸分子。
  30. 根据权利要求29所述的细胞，其中所述细胞包括宿主细胞。
  31. 根据权利要求29-30中任一项所述的细胞，其中所述细胞包括肿瘤细胞。
  32. 药物组合物，其包含权利要求1-27中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，以及任选地药学上可接受的载剂。
  33. 根据权利要求32所述的药物组合物，其配制成适于全身给药，和/或，其配制成适于静脉给药。
  34. 药物组合，其包含：
    1)权利要求1-27中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，以及
    2)免疫效应细胞。
  35. 根据权利要求34所述的药物组合，其中所述免疫效应细胞包含经修饰的免疫效应细胞。
  36. 根据权利要求34-35中任一项所述的药物组合，其中所述免疫效应细胞包含T细胞。
  37. 根据权利要求34-36中任一项所述的药物组合，其中所述免疫效应细胞包含人T细胞。
  38. 权利要求1-27中任一项所述的经修饰的痘苗病毒，权利要求28所述的核酸分子，权利要求29-31中任一项所述的细胞，权利要求32-33中任一项所述的药物组合物，和/或，权利要求34-37中任一项所述的药物组合在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
  39. 根据权利要求38所述的用途，其中所述疾病和/或病症包括肿瘤。
  40. 根据权利要求38-39中任一项所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
  41. 提高经修饰的痘苗病毒使免疫效应细胞进入肿瘤的效率的方法，其包含：使所述经修饰的痘苗病毒包含编码一种或多种趋化因子的基因和编码一种或多种T细胞生长因子的基因和/或一种或多种T细胞激活因子的基因。
  42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述经修饰的痘苗病毒包括A46R基因和/或TK基因包含一个或多个突变。
  43. 根据权利要求41-42中任一项所述的方法，其中所述经修饰的痘苗病毒的A46R基因和/或TK基因全部缺失。
  44. 根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述经修饰的痘苗病毒包含分别编码CXCL9、CXCL10、IL-2和/或IL-21的基因。
  45. 根据权利要求43-44中任一项所述的方法，其中所述经修饰的痘苗病毒包含分别编码CXCL9、CXCL10、IL-2和IL-21的基因。
  46. 根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述经修饰的痘苗病毒在TK基因缺失的位置插入编码CXCL9的基因和编码CXCL10的基因，且在A46R基因缺失的位置插入编码IL-21和编码IL-2的基因。
  47. 根据权利要求41-46中任一项所述的方法，其中所述经修饰的痘苗病毒为李斯特株。
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