CN109554353B

CN109554353B - 分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途

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Publication number: CN109554353B
Application number: CN201710882027.1A
Authority: CN
Inventors: 傅瑾; 赵荣华; 张蓉; 王婷婷; 陈霖; 胡放
Original assignee: Hangzhou Converd Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Converd Co Ltd
Priority date: 2017-09-26
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2037-09-26
Also published as: JP2020536533A; CN111315873A; CN118105415A; JP7248325B2; JP2023071953A; WO2019062234A1; EP3690034A1; WO2019062233A1; EP3690034A4; JP7564572B2; US20200289591A1; CN109554353A; CN111315873B

Abstract

本发明提供了分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。所述分离的重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL‑21基因，并且该IL‑21基因能够在肿瘤细胞中表达。所述重组溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，还能够充分发挥外源IL‑21的抗肿瘤免疫作用，从而能够使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和IL‑21的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。

Description

分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

背景技术

溶瘤病毒是一种能够在肿瘤细胞中选择性复制并杀伤肿瘤细胞，但不伤害正常细胞的一类病毒。病毒在受感染的肿瘤细胞内进行复制后，释放出新的病毒颗粒，进而感染其周围的肿瘤细胞，进一步起了溶瘤作用，除了这一直接的溶瘤作用外，溶瘤病毒还可有效刺激机体产生针对病毒自身及针对被感染肿瘤细胞的免疫应答。由此可见，溶瘤病毒的抗肿瘤作用是通过选择性杀伤肿瘤细胞和诱导机体产生系统性抗肿瘤免疫反应的双重作用来实现的。

早在19世纪末人们就发现多种病毒可缓解肿瘤发展的进程，提示了病毒在肿瘤治疗领域的潜力。随着基因技术的发展，可通过改变病毒基因组结构使其可选择性地在肿瘤细胞内进行复制，提升其溶瘤靶向性。近十年来，研究者们以基因重组、基因转入、基因敲除等技术开始对腺病毒、疱疹病毒、小核糖核酸病毒、痘病毒等病毒进行了基因改构，为此开发出一系列的溶瘤病毒产品。迄今为止大约有20 多个产品进入临床研究的不同阶段。其中，2005年中国CFDA批准了上海三维生物技术有限公司的基因改构溶瘤腺病毒H101上市，用于治疗头颈部肿瘤，这是世界范围内首个上市的溶瘤病毒药物。10 年之后的2015年，第二个溶瘤病毒药物，即Amgen公司的基因改构溶瘤单纯疱疹病毒T-Vec才被美国FDA以及欧盟EMA批准上市，用于治疗晚期恶性黑素瘤。目前尚未有基因改构的痘病毒作为药物上市。

目前在肿瘤和/或癌症的溶瘤病毒免疫治疗中，仍然需要开发出效果更好的药物。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种分离的重组溶瘤痘病毒，其中该重组溶瘤痘病毒是TK 基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。

(2)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述TK基因通过插入外源核苷酸序列而使该TK基因功能缺陷。

(3)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。

(4)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。

(5)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。

(6)根据(1)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因，但不包括荧光蛋白基因。

(7)根据(1)或(5)所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述外源 IL-21基因来自于小鼠或人。

(8)一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据(1)-(7)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒，及可药用辅料。

(9)根据(8)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含1 ×10⁵-1×10⁸pfu的所述重组溶瘤痘病毒。

(10)根据(8)所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。

(11)一种用于制备(1)-(7)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒的载体，其中所述载体包含在启动子控制下的外源IL-21基因。

(12)一种含有(11)所述的载体的宿主细胞。

(13)根据(1)-(7)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

(14)根据(13)所述的用途，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。

(15)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据(1)-(7)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒。

(16)根据(15)所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为1×10⁵-1×10⁸pfu，每天1次，连续施用1-5天。

(17)根据(15)所述的方法，其中所述溶瘤病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。

(18)根据(15)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。

(19)一种药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括根据 (1)-(7)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒和NK细胞；优选的是，该药物组合物的活性成分由所述溶瘤痘病毒和NK细胞组成。

(20)根据(19)所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤痘病毒和所述NK细胞各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合。

(21)根据(19)所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含 1×10⁵-1×10⁸pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述药物组合物包含1×10⁹至3×10⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞。

(22)根据(19)所述的药物组合物，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

(23)根据(19)所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。

(24)一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括分别独立地装有根据(1)-(7)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒和NK细胞的独立容器，以及载明给药时机和给药方式的说明书。

(25)根据(24)所述的药盒，其中所述装有所述重组溶瘤痘病毒的独立容器包含1×10⁵-1×10⁸pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述装有NK细胞的独立容器包含1×10⁹至3×10⁹个细胞/ 天剂量的所述NK细胞。

(26)根据(24)所述的药盒，其中所述NK细胞选自自体NK 细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

(27)根据(24)所述的药盒，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。

(28)一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括以下依次进行的步骤：

1)对肿瘤和/或癌症患者施用根据(1)-(7)中任一项所述的重组溶瘤痘病毒；

2)在施用所述重组溶瘤痘病毒之后的第24小时至48小时，对所述肿瘤和/或癌症患者施用NK细胞。

(29)根据(28)所述的方法，其中所述NK细胞选自自体NK 细胞和异体NK细胞；优选地，所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

(30)根据(28)所述的方法，其中所述肿瘤和/或癌症包括肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌。

(31)根据(28)所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为为1×10⁵-1×10⁸pfu，每天1次，连续施用1-5天；并且所述NK细胞的施用剂量为1×10⁹至3×10⁹个细胞/天剂量，每天1次，连续施用1-6天。

(32)根据(28)所述的方法，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明首次提出使溶瘤痘病毒的TK基因和VGF基因的功能缺陷，同时使其携带免疫调控因子IL-21的基因，从而使所得的重组溶瘤痘病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，并且表达免疫调控因子 IL-21。基于该构思而提供的溶瘤痘病毒、药物组合物和方法能够充分发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥外源 IL-21的抗肿瘤免疫作用。本发明发现在溶瘤痘病毒中整合IL-21基因，能够使溶瘤病毒的溶瘤杀伤作用和IL-21的抗肿瘤免疫刺激作用产生协同效果。

此外，使痘病毒的TK和VGF双基因功能缺陷有效增强了其肿瘤靶向性，从而提高了安全性。

此外，由于本发明的重组溶瘤痘病毒在肿瘤细胞中选择性复制的同时表达外源IL-21，能够协同刺激机体的抗肿瘤免疫反应，进而使得本发明的重组溶瘤痘病毒能够与NK细胞得以联用。基于该构思而提供的药物组合物和方法能够充分发挥本发明的重组溶瘤痘病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞、以及进一步引起随后的机体免疫反应的作用，同时还能够充分发挥NK细胞杀伤肿瘤细胞的功能，并且巧妙地利用了本发明的重组溶瘤痘病毒选择性地在肿瘤细胞中复制的特点，使得含有本发明的重组溶瘤痘病毒的肿瘤细胞成为了NK细胞的特异性靶标，而表达的外源IL-21也能提升NK细胞的杀伤力从而进一步增强了NK细胞的肿瘤杀伤作用。这样最终产生进一步加强的协同杀伤肿瘤的作用。

进一步地，本发明通过研究，使得本发明的重组溶瘤痘病毒和 NK细胞各自的施用剂量、施用顺序和施用间隔能够使两者的联合施用达到最大效率的协同作用，同时避免了两者之间的相互制约，从而达到有效地治疗肿瘤和/或癌症的效果。

附图说明

图1示出在本发明一个实施方案中所构建的用于在痘病毒 VSC20(即图中所示“Dvv-VSC20/VGF-”)的TK基因中插入IL-21 基因的重组质粒的图谱，以及重组机制的示意图，通过所示重组机制得到本发明的一个实施方案的重组双基因缺陷痘病毒(重组DDvv)。

图2示出获得本发明的重组溶瘤痘病毒的一个实施方案的流程图。

图3示出本发明实施例1中所构建的质粒的图谱。

图4示出分别用PCR和ELISA法鉴定P0代重组病毒DDvv-IL21 的结果；其中A为用PCR法检测P0代病毒DDvv-mIL21，B为用 PCR法检测P0代病毒DDvv-hIL21，图中泳道M：D000marker，泳道1：阴性对照(即，PCR反应液)，泳道2：VSC20，泳道3：CV1 细胞，泳道4：P0代病毒；C为用ELISA鉴定P0代病毒培养上清中 IL21的表达水平。图4C中横坐标为组别，纵坐标为IL21浓度 (pg/mL)，横坐标中所示“NC”是指CV1细胞，“质粒”是指 pCB-mIL21。

图5示出空斑筛选后重组病毒的鉴定结果；其中A和B分别为用PCR法鉴定溶瘤痘病毒DDvv-mIL21、DDvv-hIL21，图中泳道M： D000marker，泳道1：阴性对照(即，PCR反应液)，泳道2：P0 代病毒，泳道3：DDvv-mIL21(图5A)或DDvv-hIL21(图5B)； C和D分别为用PCR法进行TK区鉴定，图中泳道M：D000marker，泳道1：阴性对照(即，PCR反应液)，泳道2：VSC20，泳道3： P0代病毒，泳道4：DDvv-mIL21(图5C)或DDvv-hIL21(图5D)； E和G分别为用WesternBlot使用抗IL-21抗体检测溶瘤痘病毒 DDvv-mIL21和DDvv-hIL21内IL21蛋白的表达，其中所示“NC” 是指CV1细胞；F和H分别为用ELISA试剂盒检测溶瘤痘病毒 DDvv-mIL21和DDvv-hIL21感染细胞后的培养液及细胞裂解液内IL21的含量。

图6示出携带鼠IL-21片段的重组痘病毒DDvv-mIL21对5种鼠源癌细胞的杀伤效果，其中A为B16细胞实验结果，B为4T1细胞实验结果，C为LLC细胞实验结果，D为GL261细胞实验结果，E 为CT26细胞实验结果。图6A-E横坐标为时间(小时)，纵坐标为细胞杀伤率(％)。

图7示出携带鼠IL-21片段的重组痘病毒DDvv-mIL21对5种鼠源癌细胞的杀伤效果曲线(A-E)和IC₅₀值(F)，其中A为B16细胞实验结果，B为CT26细胞实验结果，C为4T1细胞实验结果，D 为LLC细胞实验结果，E为GL261细胞实验结果。图7A-E横坐标为MOI的log值，纵坐标为细胞杀伤率(％)。图7F横坐标为细胞组别，纵坐标为IC₅₀值(MOI)。

图8示出携带人IL-21片段的重组痘病毒DDvv-hIL21对4种人源癌细胞的杀伤效果，其中A为A549细胞实验结果，B为Hela细胞实验结果，C为SKOV3细胞实验结果，D为U251细胞实验结果。图8A-D横坐标为时间(小时)，纵坐标为细胞杀伤率(％)。

图9示出携带人IL-21片段的重组痘病毒DDvv-hIL21对8种人源癌细胞的杀伤效果曲线(A-H)和IC₅₀值(I)，其中A为A549 细胞实验结果，B为HepG2细胞实验结果，C为Hela细胞实验结果， D为HT29细胞实验结果，E为SKOV3细胞实验结果，F为PANC1 细胞实验结果，G为SK-HEP-1细胞实验结果，H为FaDu细胞实验结果。图9A-H横坐标为MOI的log值，纵坐标为细胞杀伤率(％)。图9I横坐标为细胞组别，纵坐标为IC₅₀值(MOI)。

图10示出携带鼠IL-21片段的重组痘病毒DDvv-mIL21对B16 荷瘤小鼠的抑制瘤作用。图10A表示肿瘤体积随时间变化的曲线，横坐标为给药时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm³)。图10B表示 T/C随时间变化的曲线，横坐标为给药时间(天)，纵坐标为T/C(％)。图10C表示不同剂量组的肿瘤重量的比较结果，横坐标为组别，纵坐标为肿瘤重量(g)。

图11示出流式分析DDvv-mIL21对B16荷瘤小鼠的免疫作用；A和B分别为脾脏提取PBMC的流式分析检测CD4细胞的变化(A) 和CD8细胞的变化(B)；C和D分别为肿瘤组织提取肿瘤细胞的流式分析检测CD4细胞的变化(C)和CD8细胞的变化(D)。图 11A-D横坐标为给药组别，纵坐标为CD4⁺T或CD8⁺T细胞的百分比 (％)。

图12示出携带鼠IL-21片段的重组痘病毒DDvv-mIL21对LLC 荷瘤小鼠的抑制瘤作用。图12A表示肿瘤体积随时间变化的曲线，横坐标为给药时间(天)，纵坐标为肿瘤体积(mm³)。图12B表示 T/C随时间变化的曲线，横坐标为给药时间(天)，纵坐标为T/C(％)。

图13示出携带人IL-21的DDvv-hIL21痘病毒和NK细胞联合对人肿瘤细胞的杀伤作用。横坐标为组别，纵坐标为相应的抑制率的百分比数值。

图10-12中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001(与阴性对照组(PBS)比较，使用One-way ANOVA统计分析法得到)。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

在本发明中，词语“肿瘤”、“癌症”、“肿瘤细胞”、“癌细胞”涵盖本领域通常认为的含义。

人体是一个复杂的系统，它是由呼吸、循环、消化等十大系统组成，这些系统协调配合，使人体内各种复杂的生命活动能够正常进行。当肿瘤发生后，机体可通过多种免疫效应机制发挥抗肿瘤作用，机体的抗肿瘤机制包括细胞免疫和体液免疫两个方面。它们联系密切，相互影响，涉及多种免疫效应分子和效应细胞。一般认为，细胞免疫在抗肿瘤过程中起到主导作用，体液免疫在某些情况下起协同作用。本发明提出利用溶瘤痘病毒选择性地在肿瘤细胞中复制并杀伤肿瘤细胞的特点，同时使其携带免疫调控因子IL-21，从而使重组的溶瘤痘病毒协同发挥选择性溶瘤和增强机体抗肿瘤免疫效应的作用。基于该构思，本发明的发明人通过实验研究和理论摸索，发现同时使溶瘤痘病毒的TK基因和VGF基因的功能缺陷，并在基因组中整合 IL-21基因，能够很好地实现上述协同作用。

痘病毒(Vaccinia virus，VV)是迄今发现最大、最复杂的病毒之一，它是预防天花的疫苗病毒。该病毒的特殊生物属性使其在肿瘤免疫治疗/基因治疗领域获得越来越大的关注：(1)安全性：痘病毒是在细胞胞浆内复制的DNA病毒，不会整合进宿主细胞基因组，减少由于外源基因诱发的变异(参见文献：“Hruby,D.E.Vaccinia Virus Vectors:NewStrategies for Producing Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol. Rev.3,153–170(1990).”)；(2)表达效率高：痘病毒可培养到很高滴度(＞10⁹pfu/ml)，通常感染1-3小时，可使90％以上的受感染细胞表达目的基因产物(参见文献：“Pfleiderer,M.,Falkner,F.G.& Dorner,F.A novel vaccinia virus expression system allowing constructionof recombinants without the need for selection markers,plasmids and bacterialhosts.J.Gen.Virol.76,2957–2962(1995).”)；(3)感染的细胞范围广：几乎可感染所有类型的哺乳动物细胞，包括分裂和非分裂细胞(参见文献：“Hruby,D.E.Vaccinia VirusVectors:New Strategies for Producing RecombinantVaccines.Clin.Microbiol.Rev.3,153–170(1990).”)；(4) 基因组容量大：至少可插入25kb的外源基因而不影响其遗传稳定性 (参见文献：“Hruby,D.E.Vaccinia VirusVectors:New Strategies for Producing RecombinantVaccines.Clin.Microbiol.Rev.3,153–170(1990).”)； (5)稳定性：对温度不敏感，成药性好，方便使用和运输(参见文献：“Hruby,D.E.Vaccinia Virus Vectors:New Strategiesfor Producing Recombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.3,153–170(1990).”)；(6)表达产物具有天然结构：它表达的产物可具有正确的糖基化和翻译后加工，接近天然构型(参见文献：“Hruby,D.E.Vaccinia Virus Vectors: New Strategies for ProducingRecombinant Vaccines.Clin.Microbiol.Rev.3, 153–170(1990).”)，这对于病毒携带免疫调控基因用以激发机体免疫反应是至关重要的。

痘病毒的胸苷激酶(thymidine kinase(TK))基因是痘病毒复制过程需依赖的基因之一。如果痘病毒缺失了TK基因，则需通过宿主细胞提供TK蛋白补给，而TK蛋白在正常细胞周期中只能短暂表达，但在大多数肿瘤细胞中TK蛋白呈持续性高表达。因此利用TK蛋白在肿瘤组织的表达特性使得TK缺失痘病毒的复制局限在肿瘤组织内，而不在正常细胞内复制，从而提高了肿瘤靶向性。自从1982年开始使用痘病毒基因改造体系以来，TK基因区一直是被用于外源基因的插入区(参见文献：“Byrd,C.&Hruby,D.Construction ofRecombinant Vaccinia Virus.in Vaccinia Virus and Poxvirology:Methods andProtocols 269, 31–40(2004).”)。

其次，痘病毒在细胞内的复制和在细胞间的播散与宿主细胞表皮生长因子受体(EGFR)信号通路的活化密切相关。痘病毒感染细胞后分泌病毒生长因子(virus growthfactor(VGF))，其与已感染的或邻近的未感染细胞表面的EGFR结合并激活EGFR/Ras信号通路，为痘病毒的复制及感染邻近细胞提供有利的环境。因此VGF缺失的痘病毒在正常细胞内无法启动EGFR/Ras通道，使其感染正常细胞受限。而肿瘤细胞中EGFR信号通路处于活化状态，故缺失VGF基因的痘病毒在肿瘤细胞内的复制、感染不受影响，亦即相对提高了对肿瘤作用的特异性(参见文献：“Autio,K.et al.Safety and biodistribution of adouble-deleted oncolytic vaccinia virus encoding CD40ligand in laboratoryBeagles.Mol.Ther.-Oncolytics 1,1–8(2014).”)。

IL-21(即白细胞介素-21(interleukin-21))是一种多向性I型细胞因子，主要由T细胞产生，调节先天免疫和获得性免疫应答，在抗肿瘤免疫反应中发挥了重要作用。已有文献报道IL-21对各类免疫细胞及信号转导的作用(参见文献：“Leonard,W.J.&Wan,C.IL-21 Signaling in Immunity.F1000Research 5,1–10(2016).”)，各类免疫细胞主要包括：1)CD4⁺T细胞：促进增殖、产生细胞因子；T_fh细胞：促进分化、提高发育中心功能；T_h17细胞：促进分化、增殖；Treg 细胞：抑制其产生与存活；2)NKT细胞：增殖、增强细胞毒性；3) CD8⁺T细胞：提升细胞毒性、增殖和/或存活、抗肿瘤作用；4)NK 细胞：促进细胞成熟、增殖、提高细胞毒性作用、增强抗肿瘤活性； 5)DC细胞：抑制抗原递呈功能、诱导凋亡；6)巨噬细胞：提升吞噬作用；7)B细胞：促进增殖和/或凋亡、促进浆细胞分化和免疫球蛋白的生成；8)另外IL-21可激活多种与肿瘤相关信号通道，包括 JAK/STAT、MARK/PI3K等信号通道，调控肿瘤的发展过程。在肿瘤免疫治疗中，激活NK细胞和CD8⁺T细胞的细胞毒性是关键，许多研究已充分表明IL-21在这一程序中起着重要作用。IL-21促进NK 细胞成熟使其产生IFN-γ和穿孔素，诱发NK细胞介导的抗肿瘤细胞毒性作用靶向于肿瘤细胞表面的NKG2D配体，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)提升NK细胞的杀伤力(参见文献：“Spolski, R.&Leonard,W.J.Interleukin-21:a double-edged sword with therapeuticpotential.Nat.Rev.Drug Discov.13,379–395(2014).”)。其次，IL-21通过诱导CD8⁺T细胞的增殖、诱导记忆T细胞的生成、促进IFNγ/颗粒酶的分泌等，以增强CD8⁺T细胞对肿瘤的杀伤和有利于对复发肿瘤细胞产生记忆性免疫应答。重要的是不同于IL-2，IL-21不会诱导 Treg细胞的扩增，也进一步增强了CD8⁺T细胞的免疫功能应答(参见文献：“Spolski,R.&Leonard,W.J.Interleukin-21:a double-edged sword with therapeuticpotential.Nat.Rev.Drug Discov.13,379–395(2014).”)。基于IL-21对免疫细胞的多样化作用，体现了IL-21可在肿瘤微环境内 “重新活化”多种效应细胞，已有多个临床研究使用IL-21单独或与其它药物联合用于肿瘤治疗。

因此，本发明提供了一种分离的重组溶瘤痘病毒，其中该重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达。

本发明在提及溶瘤病毒的基因时所使用的术语“功能缺陷”是指该溶瘤病毒无法发挥该基因应有的功能，即功能丧失，该目的可通过(例如)在基因中插入外源片段或敲除该基因而实现。

因此，可以在所述TK基因中插入外源核苷酸序列，从而使其功能缺陷。也可以在所述VGF基因中插入外源核苷酸序列，从而使其功能缺陷，但优选将所述VGF基因敲除。

优选地，将外源IL-21基因插入到TK基因中，这样能够使该 TK基因发生功能缺陷，并且在感染肿瘤细胞之后能够表达IL-21基因。

在本发明中，可使用的痘病毒包括惠氏株或WR株，WR株的一个例子为VSC20。

在一个优选的实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒是对VSC20痘病毒进行基因改造而得到的。VSC20痘病毒是VGF基因缺失的痘病毒，制备方法可参见科技文献：“McCart,JA,et al.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutantlacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61:8751–8757.”。所述基因改造包括将外源IL-21基因插入该VSC20 痘病毒的TK基因中，从而使该TK基因功能缺陷。具体地，用于在痘病毒VSC20的TK基因中插入IL-21基因的质粒的图谱，以及通过重组机制实现插入的示意图如图1所示。

所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还可以整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt(鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因，但不包括荧光蛋白基因，以避免荧光蛋白的表达在患者体内带来的安全隐患。

在一些实施方案中，本发明通过分别使用痘病毒早/晚启动子 p7.5控制gpt基因，以及人工合成痘病毒早启动子pSEL控制外源 IL-21基因，使用体外细胞内重组技术将gpt和IL-21基因插入到痘病毒VSC20株的TK基因区中，以此构建溶瘤病毒，两个启动子以背靠背的方式分别启动各自调控基因的表达。

本发明进一步发现，仅将外源IL-21基因插入TK基因中，从而使其发生功能缺陷，并且使该溶瘤痘病毒的VGF基因的功能缺陷，即可发挥溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞中复制、杀死肿瘤细胞、引起随后的机体免疫反应的作用，并且溶瘤痘病毒携带的外源IL-21基因可直接诱发抗肿瘤免疫作用。

优选地，所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。

本发明的重组溶瘤痘病毒可通过生物工程领域的相关已知方法获得，一个具体实施方案的流程如图2所示。

本发明考虑了溶瘤痘病毒和IL-21各自的特点，巧妙地使其整合在一起而联合发挥作用，其中溶瘤痘病毒在溶瘤的同时，通过其在肿瘤细胞内复制的功能可放大IL-21在肿瘤细胞内表达，随后外泌到细胞外，以此进一步诱发机体的肿瘤免疫作用，两者联合作用具有更好的治疗效果。

基于本发明开发的重组溶瘤痘病毒，本发明还提供了一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒，及可药用辅料。

优选地，所述药物组合物包含临床施用剂量的所述重组溶瘤痘病毒。更优选地，所述重组溶瘤痘病毒的临床施用剂量为1×10⁵-1 ×10⁸pfu。

所述溶瘤病毒可采用本领域通常所采用的给药方式给药，例如通过瘤内注射给药或静脉给药。

本发明的药物组合物还可以包含本领域已知的其它活性成分，例如白细胞介素-2(IL-2)、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 等，其施用剂量和施用方式可以按照各自常规的方式进行。如果包含其它活性成分，那么所述重组溶瘤痘病毒应独立地存在于所述药物组合物中而不与其它活性成分相互混合。例如，将重组溶瘤痘病毒独立地装在独立容器中。

本领域的技术人员可以理解，本发明的药物组合物还可包含合适的可药用的辅料。

本发明另一方面还提供了一种用于制备本发明所述的重组溶瘤痘病毒的载体。

所述载体可通过重组机制使痘病毒内的TK基因和VGF基因发生功能缺陷。例如，在一个具体实施方案中，如图1所示，重组载体包含TK同源片段TK-L、TK-R、及启动IL-21基因和外源筛选基因 gpt的表达框。当痘病毒为WR株时，TK基因的序列为NCBI(即，美国国立生物技术信息中心，网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov) 的GenBank中编号为NC_006998的痘病毒基因中第80724-81257bp 所示的序列，则TK-L的序列可为例如第80724-80961bp所示序列片段，TK-R的序列可为例如第81033-81257bp所示序列片段。该载体可通过细胞内重组机制使IL-21基因表达框和gpt基因表达框插入到痘病毒的TK基因区中(从而使(例如)GenBank中编号为NC_006998 的痘病毒基因中第80962-81032bp所示的序列片段缺失)，从而使重组痘病毒丧失TK基因功能。本发明另一方面还提供了一种含有本发明所述的载体的宿主细胞。

本发明另一方面还提供了本发明所述的重组溶瘤痘病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

所述肿瘤和/或癌症包括但不限于：肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、淋巴癌、胃癌、食道癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、白血病、骨癌、睾丸癌等。

本发明另一方面还提供了一种治疗肿瘤和/或癌症的方法，包括对肿瘤和/或癌症患者施用根据本发明所述的重组溶瘤痘病毒。

在本发明的一个优选实施方案中，所述重组溶瘤痘病毒的施用剂量为临床施用剂量，每天1次，连续施用1-5天。所述临床施用剂量优选为1×10⁵-1×10⁸pfu。

如果需要，还可以将本发明的重组溶瘤痘病毒与其它药物联合使用，例如白细胞介素-2(IL-2)、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 等，其施用剂量和施用方式可以按照各自常规的方式进行。

可以根据实际情况和需要对患者进行一次或多次本发明的治疗肿瘤和/或癌症的方法。

以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。

例子

以下除非特别说明，否则以下例子中所用实验方法均使用生物工程领域的常规实验流程、操作、材料和条件进行。

以下除非特别说明，否则各试剂的百分浓度(％)均指该试剂的体积百分浓度(％(v/v))。

以下例子中所用的生物材料如下：

1.CV1细胞和Hu-143B细胞来源于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

2.各肿瘤细胞来源于中国典型培养物保藏中心和ATCC。

3.小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

4.gpt筛选药物配制方法：使用0.1M NaOH分别配制10mg/ml 霉酚酸(400×)、10mg/ml 40×黄嘌呤(40×)、10mg/ml次黄嘌呤(670×)，避光-20℃储存；使用时配制1×工作液：在10ml DMEM 内加入25μl霉酚酸+250μl黄嘌呤+15μl次黄嘌呤。

5.PBS配方：8mM Na₂HPO₄、136mM NaCl、2mM KH₂PO₄、2.6mM KCl，pH7.2-7.4。

6.STE缓冲液配方：10mM Tris-Cl、0.1M NaCl、1mM EDTA， pH8.0。

7.NK细胞

采用本领域常规的方法，用采血针穿刺肘部静脉，取健康人的外周静脉血，提取PBMC。使用体外培养体系(培养试剂盒)，扩增 NK细胞，最终NK细胞纯度达到90％，NK细胞存活活性达到90％， NK细胞体外杀伤率达到85％。培养试剂盒购自杭州鼎云技术有限公司。

以下例子中所用的缩写说明如下：

FBS：胎牛血清

PSG：青霉素-链霉素-谷氨酰胺

PBMC：外周血单个核细胞

RFP：红色荧光蛋白

TIL：肿瘤浸润淋巴细胞

制备例1：DDvv-IL21溶瘤痘病毒的构建

以下过程可参见图2。

(1)质粒构建

构建两株溶瘤痘病毒使其分别携带人IL-21、鼠IL-21基因，分别标注为DDvv-hIL21、DDvv-mIL21。

1)根据NCBI基因库序列NM_001291041和NM_021803，用基因合成方法合成鼠IL21DNA片段(mIL-21)和人IL21DNA片段 (hIL-21)共2条，具体而言：

mIL-21包含正常序列的鼠源IL21片段(即Genbank编号 NM_001291041的核苷酸序列中72-560bp的片段)，其序列(SEQ ID NO.1)如下所示：

AGATCTATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCTGGTAGTCATCTTCTTG GGGACAGTGGCCCATAAATCAAGCCCCCAAGGGCCAGATCGCCT CCTGATTAGACTTCGTCACCTTATTGACATTGTTGAACAGCTGAA AATCTATGAAAATGACTTGGATCCTGAACTTCTATCAGCTCCACA AGATGTAAAGGGGCACTGTGAGCATGCAGCTTTTGCCTGTTTTCA GAAGGCCAAACTCAAGCCATCAAACCCTGGAAACAATAAGACAT TCATCATTGACCTCGTGGCCCAGCTCAGGAGGAGGCTGCCTGCCA GGAGGGGAGGAAAGAAACAGAAGCACATAGCTAAATGCCCTTCC TGTGATTCGTATGAGAAAAGGACACCCAAAGAATTCCTAGAAAG ACTAAAATGGCTCCTTCAAAAGGTATGCACCTTAAATGCATTTCT TTCACTTCCATGTTGTGTCCGGGTACCTCCTGTGCCCAGTGACTCA TAG

其中AGATCT为BglII识别序列；

为SpeI 识别序列；以及

hIL-21包含正常序列的人源IL21片段(即Genbank编号为 NM_021803的核苷酸序列中56-544bp的片段)，其序列(SEQ ID NO.2)如下所示：

AGATCTATGAGATCCAGTCCTGGCAACATGGAGAGGATTGTCAT CTGTCTGATGGTCATCTTCTTGGGGACACTGGTCCACAAATCAAG CTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTAT AGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCC TGAATTTCTGCCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGT GGTCAGCTTTTTCCTGCTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAA ATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAG CTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAA ACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACC ACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGA TGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATT CCTGA

其中AGATCT为BglII识别序列；

为SpeI 识别序列。

使用BglII内切酶与SpeI内切酶进行剪切，把IL21基因插入pCB 质粒(来源可参见文献“房有容等，Zeocin和GFP双筛选标记重组痘苗病毒载体的构建.《国际流行病学传染病学杂志》,2012. 39(3):148-152.”)内，使用大肠杆菌DH5α转化提取质粒pCB-mIL21、pCB-hIL21(图3)。

2)T7通用引物测序检测质粒pCB-mIL21、pCB-hIL21，序列正确。

3)使用TIANprep Rapid Mini Plasmid试剂盒(TIANGEN， DP105-03)进行中等量质粒DNA提取。

(2)重组溶瘤痘病毒的包装及鉴定

1)选取生长状态良好的CV1细胞铺于6孔板中，约4×10⁵个细胞/孔，使得次日细胞密度达到80％-90％。

2)弃掉6孔板中的培养基，两个孔分别加入1ml无血清无抗生素的DMEM培养基，其中分别含有9×10³pfu的Dvv-VSC20病毒(病毒来源可参见文献“McCart,JA,etal.Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutantlacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Res(2001)61:8751–8757.”)使其浓度为0.03pfu/细胞，十字混匀，37℃培养2小时，期间每20分钟混匀一次，同时设置一个不加病毒液的对照孔。

3)配制质粒/Lipo2000(

2000转染试剂，Life Technologies，11668-019)混合液：溶液A－吸取5μg的质粒加入到 300μl的Opti-MEM I(Gibco，1802679)中混匀，室温孵育5分钟；溶液B－吸取12μl的Lipo2000，加入至300μl的Opti-MEM I中混匀，室温孵育5分钟；将配置好的溶液A及溶液B混合，温和混匀，室温孵育15分钟，得到质粒/Lipo2000混合液。向感染病毒的其中一个孔加入300μl质粒/Lipo2000混合液，另设置一个只转染质粒的对照孔，37℃培养4小时，每孔补加2ml含10％FBS+1％PSG的DMEM 培养基。

4)24小时后，弃旧的培养基，换含5％FBS+1％PSG的DMEM 培养基，继续培养约48小时，显微镜下观察见细胞完全病变后，收集上清及细胞，反复冻融3次，释放病毒。

5)取出200μl的病毒液，使用TIANamp Virus DNA/RNA试剂盒(TIANGEN，DP315)抽提病毒基因组，用于PCR法检测外源插入的IL-21基因是否整合到骨架病毒内；同时取50μl的病毒液离心取上清用于ELISA检测(Mouse IL-21DuoSet ELISA，R&D， DY594-05；HumanIL-21Uncoated ELISA，Invitrogen，88-8218)，进一步确定重组痘病毒是否表达IL-21蛋白，剩余病毒液保存于 -80℃，标示为P0。PCR鉴定所用引物序列如表1，PCR检测获得阳性病毒的鉴定条带大小如表2所示。

表1.PCR引物序列

表2.PCR结果条带大小

引物对	鉴定的病毒	条带大小(bp)
			P1/P2	VSC20	622
P15/P11	DDvv-mIL21	1893
			P15/zP1	DDvv-hIL21	1792

PCR结果显示，IL-21基因序列整合到病毒TK区，即病毒重组成功(图4A-B)；ELISA结果显示含有IL21的重组病毒上清(图中示为“DDvv-mIL-21”)中有IL-21蛋白的表达，其余细胞(图中示为“NC”)、转染质粒(pCB-mIL21)及VSC20对照未见IL-21的表达(图4C)。

(3)重组溶瘤痘病毒的筛选

1)使用60mm培养皿培养CV1细胞，达到80％满时加入1ml 病毒稀释液，含150μl P0代病毒，感染2小时后，加3ml含1×gpt 筛选药物进行筛选，观察细胞病变，收集病毒标注P1病毒。使用病毒基因组抽提试剂盒抽提病毒基因进行PCR验证。

2)重复2次步骤1)获得P3病毒，使用PCR法进行验证。

3)采用10cm培养皿培养CV1细胞待其密度达到80％，弃培养基，加入3ml梯度稀释的P3病毒感染2小时，去除培养液，加入8ml 含有0.8×gpt筛选药物的1％(w/v)琼脂糖凝胶(V_{5％的琼脂糖凝胶}:V_{1×gpt工作液}＝1:4)，37℃培养48小时，挑取单个空斑至300μl的无菌PBS中，反复冻融三次释放病毒，每个空斑分别取150μl的病毒液在24孔板中采用CV1细胞进行小扩，约48小时待病毒完全病变后，收集病毒，吸取200μl病毒液抽提基因组，使用PCR法验证，其余病毒液标记为P4，保存于-80℃。

4)重复2-3次步骤3)，PCR法确认重组病毒中不含骨架病毒 VSC20，同时使用ELISA和Western-blot方法(一抗：兔抗鼠IL21， PEpro Tech.INC.，#500-P278；兔抗IL21抗体，abcam，ab5978；二抗：Goat anti-Rb，Abcam，ab97051)确认IL21蛋白的表达。

结果显示：从上述4)步骤获得的病毒经PCR法鉴定显示P1/P2 的PCR结果无条带，表明重组病毒为携带外源目的基因IL-21的纯种病毒，不含其骨架背景病毒VSC20(图5A-D)。Western blot结果同样显示DDvv-IL21病毒可有效表达IL-21蛋白，且大小正确(图5E、G)。ELISA结果显示重组病毒DDvv-IL21在细胞培养上清及细胞裂解(图中示为“细胞”)中均可检测到IL-21蛋白，也进一步体现了IL-21蛋白为外泌型蛋白的特性(图5F、H)。

制备例2：溶瘤痘病毒的生产和纯化

(1)生产和纯化

1)分别对DDvv-mIL21的P5-1样本和DDvv-hIL21的P4-3样本进行大量扩增，使用50个150mm培养皿，当Hu-143B细胞长至 80％左右时，每个培养皿加50μL小扩后的病毒约2×10⁴PFU感染细胞，37℃、5％CO₂培养。约2～3天后，显微镜下观察细胞变圆呈串珠状，部分细胞脱离培养皿，使用细胞刮刀收集培养液/细胞，保存于-80℃冰箱。

2)使用液氮、高压灭菌水将所收集的病毒液反复冻融三次， 2000rpm离心3分钟，收集上清。

3)将收集的上清在12,000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀物用5mL PBS悬浮，12,000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀物用4mL 30％(w/v)蔗糖重悬。

4)蔗糖梯度的制备：在超速离心管中从下至上依次加入 60％(w/v)、50％(w/v)、40％(w/v)的蔗糖溶液各2mL，最上层加30％(w/v) 蔗糖重悬的病毒液4mL。

5)铺好蔗糖梯度后，39,000g超速离心20分钟后，肉眼可看到病毒呈乳白色条带，分布在50％(w/v)蔗糖层，使用1mL剪平/大口的枪头吸取病毒条带，置于新的离心管中(记录吸取病毒条带的体积为 V1)。

6)使用2倍V1体积的STE缓冲液清洗病毒去除残余的蔗糖，离心35,000×g、1小时，弃上清，保留沉淀。

7)用V1体积的STE重悬沉淀，离心35,000×g，30分钟，保留沉淀，重复此操作2次，随后用PBS洗3次。

8)最后用预冷的PBS重悬沉淀，混匀后分装在无菌的EP管中，储存于-80℃，预留1管放置4℃进行病毒滴度检测。

(2)病毒滴度检测

1)使用2个6-well培养皿，每孔接种约4×10⁵HuTK-143B细胞，在37℃、5％CO₂培养箱过夜，使其次日细胞量接近80％-90％。

2)将待测病毒液200μl用无血清DMEM 1800μl作10倍梯度稀释，使其稀释度在10^-4-10^-8范围。

3)吸去6孔板内细胞培养液，加入0.5ml稀释的病毒液，标注各孔稀释度，同时设立两个空白对照孔，置37℃感染2小时，期间每20分钟摇动6孔板一次，以保证孔内均匀湿润和避免局部干燥。

4)每孔加2ml含5％FBS的DMEM，37℃培养48小时。

5)吸去培养液，每孔加0.5ml含0.1％结晶紫染色液，室温染色 10分钟，吸去染色液，PBS清洗3次，倒扣自然风干，拍照。

6)计数各孔内的病毒噬斑数，病毒滴度＝平均病毒噬斑数/(病毒稀释度×加入的病毒体积)。

举例：假如在10^-5稀释度孔内有30个病毒噬斑，病毒滴度为30/ (10^-5×0.5)＝6×10⁶pfu/ml。

放大/纯化后各个批号的DDvv-mIL21病毒和DDvv-hIL21病毒的滴度在2×10⁸～4×10⁸PFU/ml。

实施例1：携带鼠IL-21的DDvv-mIL21痘病毒对不同鼠肿瘤细胞的杀伤作用

在96孔板铺鼠肿瘤细胞，包括B16细胞(小鼠黑色素瘤细胞)、 GL261细胞(小鼠脑胶质瘤细胞)、LLC细胞(小鼠Lewis肺癌细胞)、CT-26细胞(小鼠结肠癌细胞)、4T-1细胞(小鼠乳腺癌细胞)，每孔5000个细胞，培养过夜使其贴壁后使用1MOI的通过上述方法制备的DDvv-mIL21病毒感染细胞，分别于24小时、48小时和60小时后(针对LLC细胞、GL261细胞的试验)，或者24小时、 48小时和72小时后(针对B16细胞、CT-26细胞、4T-1细胞的试验)，使用MTT法检测肿瘤细胞凋亡情况(n＝3，2-3次重复实验)。本试验的对照组为：阴性对照组(无病毒感染)、重组鼠源IL-21蛋白 (rmIL-21，购自R&D Systems)及阳性对照组(1μM紫杉醇 (Paclitaxel)，购自北京双鹭药业)，每个处理组及对照组均设置3 个复孔，细胞杀伤率为实验组与阴性对照组百分比值。结果显示 DDvv-mIL21病毒对各肿瘤细胞在60小时或72小时后均达到超过 60％的杀伤率，其中，DDvv-mIL21病毒对CT-26和4T1细胞在感染 24小时后就达到70％的杀伤率(参见图6)。

实施例2：携带鼠IL-21的DDvv-mIL21痘病毒对不同鼠肿瘤细胞杀伤的IC₅₀

B16细胞、CT26细胞、4T1细胞、LLC细胞、GL261细胞铺于 96孔板，每孔5000个细胞，使用0.002MOI、0.02MOI、0.2MOI、 1MOI、2MOI的通过上述方法制备的DDvv-mIL21病毒感染细胞72 小时后使用MTT试剂检测细胞杀伤，并计算DDvv-mIL21重组痘病毒对不同肿瘤细胞杀伤的半数致死量(IC₅₀值)(n＝3，1次实验)。结果显示，重组痘病毒对B16细胞、CT26细胞、4T1细胞、LLC细胞、GL261细胞杀伤的IC₅₀分别为0.232MOI、0.216MOI、0.07MOI、0.304MOI、0.227MOI(参见图7)。由此可见，本发明的重组痘病毒DDvv-mIL21对不同肿瘤细胞的IC₅₀值均较低(小于或约等于 0.3MOI)，具有较好的成药前景。

实施例3：携带人IL-21的DDvv-hIL21痘病毒对不同人肿瘤细胞的杀伤作用

A549(人非小细胞肺癌细胞)、SKOV3(人卵巢腺癌细胞)、 Hela(人宫颈癌细胞)、U251(人神经胶质细胞瘤细胞)铺于96孔板，每孔5000个细胞，培养过夜使其贴壁后使用1MOI的通过上述方法制备的DDvv-hIL21病毒感染细胞，分别于24小时、48小时和 72小时后，使用MTT法检测肿瘤细胞凋亡情况(n＝3，3次重复实验)。本试验的对照组为：阴性对照组(无病毒感染)、重组人源 IL-21蛋白(rhIL-21，购自R&D Systems)及阳性对照组(1μM紫杉醇)，每个处理组及对照组均设置3个复孔，细胞杀伤率为实验组与阴性对照组百分比值。结果显示重组病毒对Hela、A549、SKVO3、 U251细胞杀伤作用呈时间依赖性，随时间而加强(参见图8)。此外，结果还显示DDvv-hIL21病毒对各肿瘤细胞在48小时后均达到超过60％的杀伤率，在72小时后均达到超过70％的杀伤率。

实施例4：携带人IL-21的DDvv-hIL21痘病毒对不同人肿瘤细胞杀伤的IC₅₀

A549、HepG2(人肝癌细胞)、Hela、HT29(人结直肠癌细胞)、 SKOV3(人卵巢腺癌细胞)、PANC1(人胰腺癌细胞)、SKHEP-1 (人肝癌细胞)、FaDu(人咽鳞癌细胞)铺于96孔板，每孔5000 个细胞，以3倍稀释MOI梯度的通过上述方法制备的DDvv-hIL21 病毒感染细胞，使DDvv-hIL21病毒的MOI浓度分别为：0.003、0.01、 0.03、0.1、0.3、1、3、10，感染48小时后使用MTT试剂检测细胞杀伤，并计算病毒对不同肿瘤细胞杀伤的IC₅₀值(n＝3，1次实验)，本研究每个处理组及对照组均设置3个复孔。结果显示，重组痘病毒对各株肿瘤细胞杀伤的TCID₅₀在0.05-0.4MOI之间，均较低(参见图9)。由此可见，本发明的重组痘病毒DDvv-hIL21具有较好的成药前景。

实施例5：携带鼠IL-21的DDvv-mIL21痘病毒对B16肿瘤小鼠的抑瘤作用

构建免疫健全荷瘤小鼠：使用对数生长期B16细胞，每只小鼠给予20万个细胞接种于C57BL/6小鼠(北京维通力华实验动物中心) 后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积在100-200mm³左右开始给药，以瘤内给药方式分别给予100μl PBS内包含5×10⁶pfu (低剂量(low dose))、1×10⁷pfu(高剂量(high dose))的通过上述方法制备的DDvv-mIL21及PBS，每组3只小鼠，每3天测定1 次瘤体大小及体重。结果显示重组病毒DDvv-mIL21能够有效的抑制肿瘤的生长，并且呈剂量依赖性(图10A)。截至给药后第9天，各给药组T/C(抑瘤有效率，即给药组肿瘤大小与对照组肿瘤大小的百分比率，该值<40％时表示药物有效)都小于40％(图10B)。第12 天处死小鼠，取出肿瘤检测瘤重，也显示出相似的结果(图10C)。

实施例6：携带鼠IL-21的DDvv-mIL21痘病毒对B16肿瘤小鼠的抗肿瘤免疫激活作用

使用对数生长期B16细胞，每只小鼠给予20万个细胞接种于 C57/Bl6小鼠后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积在 100-200mm³左右开始给药，以瘤内给药方式分别给予100μl PBS内包含5×10⁶pfu(低剂量(low dose))、1×10⁷pfu(高剂量(highdose)) 的通过上述方法制备的DDvv-mIL21及PBS，每组3只小鼠，2周后处死小鼠收取脾脏、肿瘤组织，提取脾脏PBMC和肿瘤组织内肿瘤细胞，采用流式检测CD8⁺T细胞(CD3⁺CD8⁺)(抗体：抗鼠CD3、抗鼠CD8a，eBioscience)和CD4⁺T细胞(CD3⁺CD4⁺)(抗体：抗鼠 CD4，eBioscience)。结果显示给重组病毒DDvv-mIL21的小鼠脾脏 PBMC内的CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞比例相对于PBS组有显著增加 (图11A-B)；同时肿瘤组织内免疫细胞侵润分析发现给予DDvv-mIL2高剂量组的CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞(TIL)比例相对于PBS组增加(图11C-D)。

实施例7：携带鼠IL-21的DDvv-mIL21痘病毒对LLC肿瘤小鼠的抑瘤作用

使用对数生长期LLC细胞，每只小鼠给予100万个细胞接种于 C57BL/6小鼠后腿背部皮下，观察肿瘤生长情况，当肿瘤体积在 100-200mm³左右开始给药，以瘤内给药方式给予100μl PBS内包含1 ×10⁶pfu(低剂量(low dose))、1×10⁷pfu(高剂量(high dose)) 的通过上述方法制备的DDvv-mIL21和100μlPBS作为对照组，每组 5只小鼠，每3天测定1次瘤体大小及体重。结果显示重组病毒 DDvv-mIL21能够有效地抑制LLC肿瘤的生长，并且呈剂量依赖性 (图12A)，给药后第9天，高剂量给药组T/C小于40％(图12B)。

实施例8：携带人IL-21的DDvv-hIL21痘病毒和NK细胞联合对人肿瘤细胞的杀伤作用

取SK-HEP-1细胞种入培养板，铺满30％，在MEM+10％FBS 环境中，在37℃、5％CO₂下孵育24小时，在DMEM无血清环境下加入MOI＝0.15的通过上述方法制备的DDvv-hIL21病毒，感染6小时，换液为MEM+10％FBS，在37℃、5％CO₂下培养24小时。之后换新鲜MEM+10％FBS，加入NK细胞(效靶比NK:SK-HEP-1＝5:1)，继续孵育48小时，洗去死细胞和碎片，对残留的活SK-HEP-1细胞进行台盼蓝染色计数，该实验组为DDvv-hIL21+NK组。实验中另外保留一组SK-HEP-1细胞，不加病毒，不加NK，作为空白(Blank) 组；一组在相应时间点加DDvv-hIL21病毒，但不加NK，作为 DDvv-hIL21病毒组；一组在相应时间点加NK，但不加DDvv-hIL21 病毒，作为NK组；一组在相应时间点加NK，并同时加入终浓度为 50ng/ml的人IL21重组蛋白，但不加DDvv-hIL21病毒，作为NK+IL21 组；一组不加病毒，不加NK，但在相应的时间加入终浓度为50ng/ml 的人IL21重组蛋白作为空白+IL21组。每组实验重复三次以上，取平均值做统计学分析。

结果如图13所示(其中横坐标为不同组别，纵坐标为相应的抑制率的百分比数值)，联合使用DDvv-hIL21病毒和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对SK-HEP-1杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约87％。而本实验中单用DDvv-hIL21病毒的抑制率为约47％，单用NK细胞的抑制率为约11％，NK+IL21组的抑制率为约22％，空白+IL21组的抑制率为约1％。而空白组抑制率约为0(未示出在图13中)。

结果显示联合使用DDvv-hIL21病毒和NK细胞(溶瘤病毒在先施用，NK细胞在后施用)对SK-HEP-1细胞杀伤有显著的协同作用，并且协同抑制率为约87％。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州康万达医药科技有限公司

<120> 分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途

<130> FI-172851-59:52/C

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

agatctatgg agaggaccct tgtctgtctg gtagtcatct tcttggggac agtggcccat 60

aaatcaagcc cccaagggcc agatcgcctc ctgattagac ttcgtcacct tattgacatt 120

gttgaacagc tgaaaatcta tgaaaatgac ttggatcctg aacttctatc agctccacaa 180

gatgtaaagg ggcactgtga gcatgcagct tttgcctgtt ttcagaaggc caaactcaag 240

ccatcaaacc ctggaaacaa taagacattc atcattgacc tcgtggccca gctcaggagg 300

aggctgcctg ccaggagggg aggaaagaaa cagaagcaca tagctaaatg cccttcctgt 360

gattcgtatg agaaaaggac acccaaagaa ttcctagaaa gactaaaatg gctccttcaa 420

aaggtatgca ccttaaatgc atttctttca cttccatgtt gtgtccgggt acctcctgtg 480

cccagtgact catagactag t 501

<210> 2

<211> 501

<212> DNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

agatctatga gatccagtcc tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc 60

ttcttgggga cactggtcca caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga 120

atgcgtcaac ttatagatat tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct 180

gaatttctgc cagctccaga agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc 240

tttcagaagg cccaactaaa gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta 300

tcaattaaaa agctgaagag gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac 360

agactaacat gcccttcatg tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa 420

agattcaaat cacttctcca aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga 480

agtgaagatt cctgaactag t 501

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

atcgcatttt ctaacgtgat ggat 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

tatctaacga cacaacatcc att 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

atggaatccg cgtcgactga g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

ggccagatcg cctcctgatt ag 22

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

ggtccctgaa tttctgccag c 21

Claims

1.一种分离的重组溶瘤痘病毒，其中该重组溶瘤痘病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的，并且该重组溶瘤痘病毒的基因组中整合有外源IL-21基因，并且该IL-21基因能够在肿瘤细胞中表达；其中：

所述重组溶瘤痘病毒为WR株；

所述外源IL-21基因编码I型IL-21；并且

所述外源IL-21基因插入在所述TK基因中，从而使GenBank中编号为NC_006998的痘病毒基因中第80962-81032bp所示的序列片段缺失。

2.根据权利要求1所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述VGF基因通过基因敲除或插入外源核苷酸序列而使该VGF基因功能缺陷。

3.根据权利要求1所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述重组溶瘤痘病毒的基因组中还整合有外源筛选基因，所述外源筛选基因包括gpt基因，但不包括荧光蛋白基因。

4.根据权利要求1所述的重组溶瘤痘病毒，其中所述外源IL-21基因来自于小鼠或人。

5.一种药物组合物，其中该药物组合物包括作为活性成分的根据权利要求1-4中任一项所述的重组溶瘤痘病毒，及可药用辅料。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含1×10⁵-1×10⁸pfu的所述重组溶瘤痘病毒。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的重组溶瘤痘病毒在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途；其中所述肿瘤和/或癌症为肺癌、黑色素瘤、头颈部癌症、肝癌、脑癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、或胰腺癌。

9.一种药物组合物，其中该药物组合物的活性成分包括根据权利要求1-4中任一项所述的重组溶瘤痘病毒和NK细胞。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤痘病毒和所述NK细胞各自独立地存在于所述药物组合物中而互不混合。

11.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含1×10⁵-1×10⁸pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述药物组合物包含1×10⁹至3×10⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞。

12.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。

13.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。

14.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述药物组合物的活性成分由所述溶瘤痘病毒和NK细胞组成。

15.根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

16.一种用于治疗肿瘤和/或癌症的具有协同作用的联合药物的药盒，包括分别独立地装有根据权利要求1-4中任一项所述的重组溶瘤痘病毒和NK细胞的独立容器，以及载明给药时机和给药方式的说明书。

17.根据权利要求16所述的药盒，其中所述装有所述重组溶瘤痘病毒的独立容器包含1×10⁵-1×10⁸pfu/天剂量的所述重组溶瘤痘病毒，并且所述装有NK细胞的独立容器包含1×10⁹至3×10⁹个细胞/天剂量的所述NK细胞。

18.根据权利要求16所述的药盒，其中所述NK细胞选自自体NK细胞和异体NK细胞。

19.根据权利要求18所述的药盒，其中所述NK细胞为经体外扩增得到的自体NK细胞或经体外扩增得到的异体NK细胞。

20.根据权利要求16所述的药盒，其中所述重组溶瘤痘病毒通过瘤内注射给药或静脉给药；所述NK细胞通过静脉给药。