CN117736278B - 一种用于检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒及检测方法。本发明首先提供一种呼吸道合胞病毒F重组蛋白，其以呼吸道合胞病毒F野生蛋白序列为基础，将所述野生蛋白序列的F1片段和F2片段之间的Furin酶切位点和p27多肽以(Gly)₈柔性连接肽序列替换，并优化密码子得到。然后提供基于该重组蛋白的应用。

Description

一种用于检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒及检测方法。

背景技术

呼吸道合胞病毒(RSV)属副粘液病毒科，肺炎病毒属，是一种引起下呼吸道感染的重要病原体，呼吸道合胞病毒感染是引起婴幼儿住院及死亡的主要原因，感染宿主后呈现出潜伏期短，容易反复感染，病情进展迅速等特点，易于引起爆发性流行。感染呼吸道合胞病毒不仅给患儿自身健康及其家庭经济带来巨大压力，同时也会给社会健康体系带来较大的经济负担。然而尽管呼吸道合胞病毒具有高感染率、高危害和高发性，目前尚未有安全有效的预防疫苗以进行应对。

人体被呼吸道合胞病毒感染后，一般有3～7天的潜伏期，之后约4～21天人体会产生可观的IgM抗体，随后再产生大量IgG抗体。虽然IgG抗体是临床常见的检测病毒感染的指标，但IgG抗体检测易受既往感染的影响，不适宜用为作早期感染判断的指标。IgM抗体产生时间早于IgG抗体，因此特异性检测出针对呼吸道合胞病毒抗原产生的IgM抗体可作为早期呼吸道合胞病毒抗原感染的标志。因此为了能够在早期识别到呼吸道合胞病毒感染，建立方便、快速、有效的检测方法至关重要。

呼吸道合胞病毒编码两个主要表面糖蛋白：粘附蛋白(attachment protein,G)和融合蛋白(fusion protein,F)。黏附G蛋白是2型表面糖蛋白，分为胞内区、胞外区及跨膜区，主要负责介导呼吸道合胞病毒附着于宿主细胞；病毒质膜的融合F蛋白则介导病毒进入宿主细胞。同时G蛋白还参与感染后机体中和抗体产生过程，可有效避免严重感染，由于G蛋白产生的中和抗体无法对不同的亚型、基因型病毒提供交叉保护作用，所以可能导致免疫逃逸而反复发生RSV感染。根据G蛋白表面抗原的差异性，呼吸道合胞病毒可被分为A亚型(RSV-A)和B亚型(RSV-B)，进一步根据G蛋白基因C末端的第2高变异区的核苷酸序列不同，RSV-A亚型可被细分为15个基因型，RSV-B亚型可被分为30个基因型。

申请号为CN2022106181965，发明名称为“一种呼吸道合胞病毒抗原检测试剂盒及其应用”的专利公开了一种检测RSV抗原的试纸及试剂盒，该检测试纸上包被有胶体金标记的RSV单克隆抗体，该检测试纸及试剂盒主要用于检测RSV-A分型。但胶体金法检测灵敏度不够高，对于病毒含量低的样本容易漏检。

相较于G蛋白具有众多的分型，F蛋白则具有更高的保守性，同时F蛋白相应抗体对RSV-A亚型和RSV-B亚型之间具有更好的交叉保护作用，因此编码F蛋白的序列是目前RSV抗体研究的热点。申请号为CN2014101395925，发明名称为“一种检测人呼吸道合胞病毒抗体的G和F蛋白的制备方法”的专利公开了对呼吸道合胞病毒表面抗原G蛋白和F蛋白基因的密码子进行优化，使得在原核细胞中高量表达。然后将表达出的G和F蛋白上清进行Elisa包被，然后用于检测患者血清。然而，由于原核细胞中没有细胞核、内质网、高尔基体等这些在细胞运输和翻译后修饰中起关键要素的原件，因此原核表达体系的翻译精度是不够的，表达出的蛋白的生物活性可能会有所欠缺。

文献资料《呼吸道合胞病毒滴度间接免疫荧光检测方法的建立及验证》(Chin JBiologicals August 2022，Vol.35No.8)公开了一种将Hep-2细胞用含有胎牛血清的培养基培养，并采用RSV病毒和细胞同时接种96孔板的方式贴壁培养。然而，贴壁培养的方式会使细胞培养的密度受到贴壁面积的限制，病毒和细胞同时接种培养的方式若操作不当容易引入其他外源微生物的污染。

综上所述，有必要提出新的方法策略，以缓解现有技术的不足。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供包括一种呼吸道合胞病毒F重组蛋白、转染呼吸道合胞病毒重组蛋白的阳性细胞的制备方法、含有该阳性细胞的检测试剂盒以及检测方法，具体技术方案如下。

一种呼吸道合胞病毒F重组蛋白，所述呼吸道合胞病毒F重组蛋白以呼吸道合胞病毒F野生蛋白序列为基础，将所述野生蛋白序列的F1片段和F2片段之间的Furin酶切位点和p27多肽以(Gly)₈柔性连接肽序列进行替换；所述F1片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述F2片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

可以理解的是，(Gly)₈柔性连接肽序列为连续8个Gly排列的多肽序列。

进一步，对所述呼吸道合胞病毒F重组蛋白的密码子进行优化改造，使所述呼吸道合胞病毒F重组蛋白的DNA序列中GC碱基比例大于50％。

进一步，所述呼吸道合胞病毒F重组蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

或者，所述呼吸道合胞病毒F重组蛋白的全长核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种制备和培养转染呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞的方法，包括如下步骤：

S01：将上述呼吸道合胞病毒F重组蛋白基因序列克隆到哺乳动物表达质粒制备得到质粒载体，所述质粒携带WPRE元件(增强mRNA运输)；

S02：将S01制备得到的质粒载体转染进哺乳动物细胞系，在含有G418的培养基上培养，通过G418加压筛选构建稳定细胞系，得到转染呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞，该阳性真核细胞稳定表达呼吸道合胞病毒F重组蛋白；

S03：将S02制备得到的转染呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞置于化学成分限定无血清培养基，于恒温振荡器中悬浮培养，培养转速范围为120-150rpm。

进一步，所述G418加压筛选的浓度范围为400-800μg/ml。

一种基于间接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包括上述方法制备得到的转染呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞。

进一步，所述试剂盒还包括一种荧光素标记的二抗(里面加入了伊文思蓝)。在本发明其中一个实施例中，所述二抗为鼠抗人IgM-FITC结合物，但本发明所列举的二抗不局限于此，还可以包括羊抗人IgM-FITC结合物，兔抗人IgM-FITC结合物等。

进一步，所述试剂盒还可以包括生理盐水、乙醇、抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体和/或PBS洗液。

一种利用上述试剂盒检测呼吸道合胞病毒感染的方法，包括以下步骤：

S01：将所述试剂盒中转染呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞用生理盐水重悬，调整细胞密度范围为1～5×10⁵个/mL制备为阳性真核细胞液，然后取适量所述阳性真核细胞液固定于载玻片上进行干燥；

S02：将干燥好的载玻片放入乙醇中，对细胞进行通透处理，使抗原表位暴露；

S03：加入待测血清样本共孵育30-60分钟；

S04：进一步加入所述试剂盒中荧光素标记的二抗共孵育20-30分钟，形成重组蛋白-样本-荧光二抗复合物；

S04：检测所述重组蛋白-样本-荧光二抗复合物的荧光状态，绿色荧光代表样本阳性(即样本中含有呼吸道合胞病毒)，红色荧光代表样本阴性(即样本中不含呼吸道合胞病毒)。

进一步，所述阳性真核细胞液、待测血清样本与荧光素标记的二抗的体积比为10:3:3。

有益技术效果

1.本发明首先提供了一种呼吸道合胞病毒F重组蛋白，该重组蛋白以野生蛋白序列为基础进行改造，使其能够在真核细胞中的表达量提高，同时作为抗原时具有更高的特异性和敏感性。实验证明相较于呼吸道合胞病毒F野生蛋白，该重组蛋白转染效率更高、蛋白表达量更高，生物活性更稳定。

2.进一步，本发明提供了一种经所述呼吸道合胞病毒F重组蛋白转染的阳性真核细胞，即提供了一种新细胞。该细胞能够稳定的表达吸道合胞病毒F重组蛋白。该细胞使用悬浮培养方法，优于传统的贴壁细胞培养后进行病毒接种，细胞密度不会受到贴壁面积的限制，且由于全程无需呼吸道合胞病毒接种，仅需培养该细胞系，就能得到稳定表达的吸道合胞病毒F重组蛋白，因此降低了外源病毒感染风险，具有更好的安全性。此外，该新型细胞系支持高密度、无血清悬浮培养工艺，细胞培养全程采用化学成分界定(CD)培养基，不含动物血清，成本低，不会引入支原体、衣原体或动物蛋白的污染；这种适用的培养基成分明确、容易配制并且使用方便。因此该新型细胞系方便产业化，可批量生产用于制备试剂盒产品。

3.本发明基于间接免疫荧光法，采用重组蛋白作为抗原与待测血清样本中相应抗体反应，结合荧光标记的二抗与抗原抗体复合物结合，荧光显微镜下观察重组蛋白-样本-荧光二抗复合物的特异性荧光，以检测血清是否有病原体感染。该方法具有灵敏度高和特异性强等特点，相较于目前使用更多的胶体金法，本发明方法的准确性更高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明方法改造野生型呼吸道合胞病毒F野生蛋白序列示意图；

图2为本发明的重组蛋白序列和野生蛋白序列的转染效率对比；

图3为转染7天后，本发明的重组蛋白序列和野生蛋白序列的荧光结果对比；

图4为本发明检测呼吸道合胞病毒感染的方法流程图；

图5为本发明间接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒阳性结果；

图6为本发明间接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒阴性结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。

本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。

需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。

如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。

在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。

实施例1

本实施例提供一种呼吸道合胞病毒F重组蛋白，及用该蛋白转染阳性真核细胞的方法示例

1.首先获取呼吸道合胞病毒F野生蛋白序列，将所述野生蛋白序列的F1片段和F2片段之间的Furin酶切位点和p27多肽以(Gly)₈柔性连接肽序列进行替换，并将所述F1片段和F2片段进行连接。

2.根据宿主Expi-293细胞(细胞类型：人肾来源上皮细胞；真核细胞)对密码子的偏好，进一步对步骤1的序列进行密码子优化，优化后的重组蛋白DNA序列中GC含量从野生型的约35％提高到55％，得到呼吸道合胞病毒F重组蛋白序列。该呼吸道合胞病毒F重组蛋白作为抗原具有较高的特异性和敏感性。

3.进一步与携带WPRE元件的质粒(pcDNA3.4)连接，构建表达载体。该过程示意图见图1。

4.将质粒转染进Expi-293细胞，G418加压筛选构建稳定细胞系，加压筛选的浓度范围为400-800μg/ml。得到一种呼吸道合胞病毒F重组蛋白稳定表达的细胞系，简称为Expi-293-RSV-F。

RSV病毒复制时F基因的转录翻译发生在细胞质中，但是哺乳动物细胞重组蛋白表达的时候质粒转录产生RNA发生在细胞核里，因此需要出核到细胞质中来完成病毒的复制。然而，原始病毒RNA序列没有针对出核运输优化，所以出核转运是表达效率的瓶颈。病毒F野生基因富含A-U,可能影响mRNA转运到细胞核。经本发明方法优化后的重组蛋白的核苷酸序列，相较于野生蛋白序列，其GC含量从野生型的约35％提高到55％，因此可能会增加表达。

此外用pcDNA3.4携带的WPRE序列有助于出核运输。WPRE是一段顺式作用的RNA元件，为转录后调控序列，放在多聚腺苷酸化信号之前可显著增加mRNA的表达水平和翻译效率，进而增强基因的表达。

最后，去掉蛋白剪切。野生蛋白在合成后会被剪成两条肽链，两条肽链之间靠二硫键连接。改造后的重组蛋白中，和剪切相关的这一段序列被替代，因此改造后的重组蛋白只形成一条肽链。因此有增加表达量和促进三聚体的作用。

本发明涉及的序列表信息如下：

结果验证：

1.将本实施例合成的重组蛋白序列(又称改造序列)与野生蛋白序列进行转染效率对比，实验方法为采用直接免疫荧光方法，即将转染后的细胞进行细胞基片的制备，一步法加抗呼吸道合胞病毒抗体-FITC结合物，37℃，孵育30min后，PBS洗液洗片后通过荧光显微镜进行荧光强度判读。由于在抗体-FITC结合物内加入了0.006％的伊文思蓝染料，因此会有红色和绿色荧光呈现。如有阳性，则镜下观察到绿色荧光，如为阴性，则镜下观察到红色细胞，见图2和图3。图2可见，改造的重组蛋白序列的荧光更多，说明其转染效率更高。

2.转染7天后，再次进行检测(图3)。图3可见改造序列的荧光相较于野生序列依然更多，说明本实施例得到的重组蛋白表达量更高，生物活性更稳定。

实施例2-

本实施例提供一种Expi-293-RSV-F细胞的培养及放大方法

1.在稳定细胞系的培养中，采用化学成分限定(CD)的无血清培养基，在恒温振荡器中悬浮培养，培养转速在120-150rpm，37℃5％-8％的CO₂。

本实施例中采用的化学成分限定(CD)的无血清培养基为OPM-CHO CD07 Medium(奥浦迈生物科技)，货号P081307-001。

2.当细胞准备好进行传代(即处于达到汇合状态之前的对数生长期)时，从培养箱中取出培养瓶并使用无菌移液器从培养瓶中取出少量样本。

3.使用自动细胞计数仪和台盼蓝拒染法，测定样本中的细胞总数和活细胞百分比。将细胞用无血清培养基稀释到接种密度范围为0.5-2.0×10⁶个/mL。

4.悬浮培养细胞无需更换培养基。加入足量培养基以将培养物稀释密度范围为至0.5-2.0×10⁶个/mL。加入新鲜的培养基足以补充细胞营养物质。

培养结果：在30mL体积的培养体系中，培养3天，得到细胞量为4.0-10.0×10⁶个/mL。显微镜下观察，细胞呈单个分散生长，形态饱满，大小均一。本实施例可以实现由6孔板-T125ml摇瓶-1L摇瓶-发酵罐的逐级放大，满足不同的生产应用场景。

实施例3

本实施例提供一种检测呼吸道合胞病毒感染的方法

1.将转染呼吸道合胞病毒重组蛋白(一抗)的阳性细胞用生理盐水重悬，细胞计数，调整密度为5×10⁵个/mL制备为阳性真核细胞液，每孔滴加50uL阳性真核细胞液加到空白载玻片上，干燥，使细胞贴合于载玻片(固相载体)上，同样的方法固定Expi-293空白细胞。将干燥好的覆盖有呼吸道合胞病毒重组蛋白(一抗)的阳性细胞载玻片放入乙醇中，固定细胞通透处理，使该重组蛋白上的抗原表位暴露，自然干燥后将待检载玻片分别加入15uL阳性对照、15uL阴性对照和15uL待测血清样本。其中，阳性对照为抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体，阴性对照为待测血清样本稀释液。

2.将待检载玻片放入湿盒中37℃、孵育60min，之后将该载玻片浸泡在PBS洗液(0.01M,pH7.4)中，放置水平摇床轻摇3分钟，重复三次，自然晾干。

3.每孔加入15uL荧光素标记的二抗，本实施例采用鼠抗人IgM-FITC结合物(结合物内加入了0.006％的伊文思蓝染料)，37℃、孵育30min。之后将载玻片浸泡在洗液中，放置水平摇床轻摇3分钟，重复三次，自然晾干。荧光倒置显微镜下观察荧光。如有阳性，则镜下观察到绿色荧光，如为阴性，则镜下观察到红色细胞。

本实施例基于间接免疫荧光法，将转染重组合胞病毒F的阳性细胞作为特异性抗原，铺于载玻片上，加入临床待检样本再结合FITC标记的二抗，显色后进行肉眼观察。见图4-6。

实施例4

实际样本检测

用实施例1制备的重组蛋白和实施例3的检测方法，对60份临床呼吸道合胞病毒IgM抗体阳性血清样本和100份临床呼吸道合胞病毒IgM抗体阴性血清样品进行特异性和灵敏性测试。同时对其他呼吸系统疾病常见病原体阳性样本进行交叉反应验证。其次对比同平台呼吸道合胞病毒IgM抗体胶体金产品阳性检出率。

表1本发明重组蛋白(抗原)的特异性及灵敏度检测结果

表1结果显示本发明重组蛋白作为抗原的灵敏性(对阳性样本检出的准确性)可达到95％，特异性(对阴性样本不检出的准确性)达到97％。

表2本发明对比同平台呼吸道合胞病毒IgM抗体胶体金产品阳性样本检出率结果

项目	阳性样本数	阴性样本数	总计
				本发明产品	57	3	60
胶体金法产品	54	6	60

表2结果显示本发明重组蛋白作为抗原，其阳性样本检出率可达95％，同平台呼吸道合胞病毒IgM抗体胶体金产品阳性样本检出率为90％。本发明重组蛋白作为抗原的检测准确率更高。

表3本发明的检测试剂盒与其他呼吸系统疾病常见病原体阳性样本交叉反应验证结果

表3结果显示，本发明重组蛋白作为抗原检测其他呼吸系统疾病常见病原体阳性样本，阳性率均为0。说明本发明重组蛋白作为抗原针对呼吸道合胞病毒检测特异性较好。

上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (4)

1. 一种基于间接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一种特异性抗原，所述特异性抗原为一种稳定表达呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞；所述稳定表达呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞按照每5×10⁵个/mL进行配制，并被设置为工作用量为50μL；所述试剂盒还包含一种荧光素标记的二抗；检测时，所述稳定表达呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞被设置为与所述荧光素标记的二抗及待测血清样本形成阳性真核细胞-样本-荧光二抗复合物；所述呼吸道合胞病毒F重组蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括生理盐水、乙醇、抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体和/或PBS洗液。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定表达呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞由以下步骤制备：

S01：将呼吸道合胞病毒F重组蛋白序列克隆到哺乳动物表达质粒制备得到质粒载体，所述质粒携带WPRE元件，所述呼吸道合胞病毒F重组蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

S02：将S01制备得到的质粒载体转染进哺乳动物细胞系，在含有G418的培养基上培养，通过G418加压筛选构建稳定细胞系，得到转染呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞；该阳性真核细胞稳定表达呼吸道合胞病毒F重组蛋白；

S03：将S02制备得到的稳定表达呼吸道合胞病毒F重组蛋白的阳性真核细胞置于化学成分限定无血清培养基，于恒温振荡器中悬浮培养，培养转速范围为120-150rpm。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述G418加压筛选的浓度范围为400-800μg/ml。