CN109913423A - 一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组细胞系及其应用。所述细胞系含有猪德尔塔冠状病毒N蛋白基因和抗性筛选基因。本发明获得的稳定表达PDCoV‑N蛋白的带有嘌呤霉素抗性的重组细胞系，可用于检测PDCoV特异性抗体，对于未经疫苗免疫的猪群，监测到特异性抗体阳性反应即可确定该猪群已经发生野毒感染。

Description

一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系及 应用

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组细胞系及其应用。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新发现的冠状病毒，可引起猪，特别是新生仔猪腹泻，其引发的临床表现与已知的猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻非常相似，容易混淆，感染后可导致较高的发病率和死亡率，是近年来在多个国家和地区造成新生仔猪死亡的重要原因之一。PDCoV最早于2012年由香港学者首次发现(WooPC,et al.Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in thegenus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the genesource of gammacoronavirus and deltacoronavirus.Journal of virology,2012,86(7):3995-4008.)，2014年在美国首次发生大规模流行(Li G,et al.Full-Length GenomeSequence of Porcine Deltacoronavirus Strain USA/IA/2014/8734.Genomeannouncements,2014,2(2)：e00278-14.)，随后在韩国，中国等地相继被检测到(Lee S,etal.Complete Genome Characterization of Korean Porcine Deltacoronavirus StrainKOR/KNU14-04/2014.Genome announcements,2014,2(6)：e01191-14.；Chen F,etal.2015.Full-length genome characterization of Chinese porcinedeltacoronavirus strain CH/SXD1/2015.Gen ome Announcements,3(5):e01284-15；)，呈现出全球流行的潜在趋势。目前对于该病毒的感染没有有效的抗病毒治疗药物和疫苗，对其疫情监控也缺乏有效的手段。核衣壳蛋白(N)是PDCoV最主要的结构蛋白之一，病毒感染后可迅速产生针对该蛋白的特异性抗体，因此建立表达N蛋白的重组细胞系可用于对猪群进行PDCoV感染抗体监测。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种PDCoVN蛋白稳定表达细胞系及其应用。

本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理地构建了插入PDCoVN基因的慢病毒系统表达质粒pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N，之后将该质粒转化入Stbl2感受态细胞大量扩增，与2个辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞进行慢病毒的包装，用收集的慢病毒感染Vero细胞，成功感染的话，慢病毒载体会将携带的PDCoV-N基因和载体上的嘌呤霉素抗性基因一起整合入Vero细胞基因组，经一定浓度的嘌呤霉素加压筛选，并通过克隆纯化获得的稳定表达PDCoV-N蛋白的带有嘌呤霉素抗性的重组细胞系，可用于检测PDCoV特异性抗体，对于未经疫苗免疫的猪群，监测到特异性抗体阳性反应即可确定该猪群已经发生野毒感染。

实现本发明目的的技术方案是：

一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系，其特征在于，该细胞系含有猪德尔塔冠状病毒N蛋白基因和抗性筛选基因。

具体地，该细胞系含有猪德尔塔冠状病毒N蛋白基因和嘌呤霉素抗性基因，是非洲绿猴肾细胞Vero/PDCoV-N，它的保藏号是CCTCC NO：C2018255。

本发明还公开了所述稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系在制备检测猪德尔塔冠状病毒试剂中的应用。

本发明所述的一种稳定表达PDCoVN蛋白重组Vero细胞系，可以通过以下步骤得到：

(1)PCR扩增目的序列，根据本实验室测定的PDCoVCHN/Tianjin/2016株N基因序列(GenBank登录号：KY065120)，去掉末端终止密码子TAG，使用引物设计软件Primer Premier5对剩余碱基序列设计引物进行PCR扩增。为方便克隆和后续的鉴定，基因片段两端分别加上BamH I和Xho I限制性内切酶识别位点，同时在基因3＇末端添加Flag标签序列。设计的PCR引物为：

PDCOV-N-F(SEQ ID NO.1)：5'-GAA CTC GAG ATC ATG GCT GCA CCA GTA GTC-3'

PDCOV-N-R(SEQ ID NO.2)：5'-GTT GGA TCC CTA CTT GTC GTC ATC GTC TTTGTAGTC CGC TGC TGA TTCTT-3'

(2)重组慢病毒表达质粒的构建：将步骤(1)中得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确进行切胶回收并将回收的目的片段定向克隆入pLVX-EF1α-IRES-Puro载体相应位点之间，获得重组慢病毒表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N(见图1)，将重组表达载体进一步转化到Stbl2感受态细胞，获得的重组菌命名为Stbl2/pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N。

(3)慢病毒的包装：将构建好的重组菌Stbl2/pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N以1：100的比例接种于添加氨苄青霉素的液体LB培养基中，250r/min剧烈震荡培养12～16h后用去内毒素提取质粒试剂盒提取pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N质粒，将提取的pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N慢病毒表达质粒与2个辅助质粒pMD2.G和psPAX2用3000转染试剂共转染293T细胞进行病毒包装(质粒总质量15μg，质粒的比例依次为7：2：1)，48h～72h后收集上清液，间隔48h～72h再收集，共收集3次，收集的慢病毒上清1000r/min离心10min，弃去底部细胞沉淀，保存于-70℃。

(4)嘌呤霉素筛选浓度的确定：在24孔板内接种Vero细胞，共11孔，培养过夜，细胞长至底面积80％～90％，依次给每孔换上加入了嘌呤霉素的完全培养基(10％FBS-DMEM)，设置0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/ml的浓度梯度，每隔2天观察细胞存活状态(细胞飘起即为死亡)，每隔2天更换0.75mL含相应浓度嘌呤霉素的培养基。筛选4～7天内使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为筛选浓度。第4天，含有4μg/ml嘌呤霉素的孔内的Vero细胞死完(见图3)，确定含有4μg/ml的嘌呤霉素完全培养基为之后的筛选培养基。

(5)慢病毒感染Vero细胞和嘌呤霉素筛选：接种适量的Vero细胞于12孔细胞板上的2个孔，1个孔感染慢病毒，另1个孔作为对照，待细胞生长到覆盖80％～90％底面积时，弃去其中1孔培养基，用无菌PBS(pH7.2)清洗2～3次。吸取步骤(3)收集的慢病毒0.5mL和0.5mL DMEM混合均匀接种于细胞上，感染6～8h后弃去慢病毒DMEM混合液加入完全培养基，48h后，将2个孔内的培养基换成嘌呤霉素筛选培养基，每2天更换一次筛选培养基，等到对照孔内细胞全部死完将接毒孔内细胞全部转出至另1个空的12孔内，用筛选培养基进行2次筛选，细胞长满后弃去4/5的细胞继续筛选传代，如此筛选4～5代后扩大培养，获得细胞系，命名为Vero/PDCoV-N，于2018年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号CCTCC NO.C2018255。

本发明的有益效果体现在：N蛋白是冠状病毒感染宿主细胞后在病毒复制过程中产生的早期蛋白，也是冠状病毒主要的结构蛋白，在冠状病毒感染后感染动物体内最早可检出的抗体即是针对N蛋白的抗体，因此检测N蛋白抗体可用于病毒感染的早期诊断。本发明获得的基于N蛋白的细胞系Vero/PDCoV-N能特异性的检测出PDCoV抗体，而与抗猪流行性腹泻病毒阳性血清(PEDV)、抗传染性胃肠炎病毒阳性血清(TGEV)、抗轮状病毒阳性血清(RoV)以及猪阴性血清不反应，因此该细胞系具有良好的特异性。由于目前国内外尚未研制出预防PDCoV感染的疫苗，因此猪群只要检出N蛋白抗体阳性，就可以确定为PDCoV感染。本发明相对于通过核酸检测方法进行PDCoV病原学检测，本发明更加适用于PDCoV感染流行病学调查中对于大量样品的高通量筛查。

附图说明

图1是本发明构建的重组表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N结构示意图

图2是重组表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N经BamH I和Xho I双酶切鉴定电泳图(M：DNA Marker；泳道1：重组表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N酶切后可产生8.8kb大小的载体条带和1074bp大小的目的条带；泳道2：pLVX-EF1α-IRES-Puro空载体酶切后仅观察到8.8kb大小的载体条带)

图3是嘌呤霉素杀死的细胞形态示意图(图A：筛选培养基培养4天后的Vero细胞形态；图B：正常生长的Vero细胞形态)。

图4是细胞系Vero/PDCoV-N的PCR鉴定图(M：DNA Marker；泳道1：Vero细胞总RNART-PCR产物；泳道2：重组细胞系Vero/PDCoV-N的总RNA RT-PCR产物)。

图5是重组细胞系Vero/PDCoV-N用针对Flag标签的单克隆抗体作为一抗进行Western-blot鉴定的结果图(M：蛋白Marker；泳道1：重组细胞系Vero/PDCoV-N蛋白样；泳道2：Vero细胞蛋白样)。

图6是重组细胞系Vero/PDCoV-N用针对PDCoV-N蛋白的单克隆抗体进行Western-blot鉴定的结果图(M：蛋白Marker；泳道1：细胞系Vero/PDCoV-N蛋白样；泳道2：Vero细胞蛋白样)。

图7是细胞系Vero/PDCoV-N的免疫组化染色试验结果(A：一抗为猪阴性血清；B：一抗为猪感染PDCoV阳性血清)。

图8是细胞系Vero/PDCoV-N的间接免疫荧光试验结果(A：一抗为猪阴性血清；B：一抗为猪感染PDCoV阳性血清)。

本发明的的细胞系Vero/PDCoV-N于2018年12月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国·武汉·武汉大学，保藏编号CCTCC NO：C2018255，分类命名为：非洲绿猴肾细胞Vero/PDCoV-N。

具体实施方式

下面将通过附图和具体实施方例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。

实施例1重组表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N的构建

PCR扩增目的序列，根据本实验室测定的PDCoVCHN/Tianjin/2016株N基因序列(Gen Bank登录号：KY065120)，去掉末端终止密码子TAG，使用引物设计软件PrimerPremier 5设计引物进行PCR扩增。为方便克隆，基因片段两端分别加上BamH I和Xho I限制性内切酶识别位点；为方便后续的鉴定，在基因3＇末端添加Flag标签序列。设计的PCR引物为：

PDCOV-N-F(SEQ ID NO.1)：5'-GAA CTC GAG ATC ATG GCT GCA CCA GTA GTC-3'

PDCOV-N-R(SEQ ID NO.2)：5'-GTT GGA TCC CTA CTT GTC GTC ATC GTC TTTGTAGTC CGC TGC TGA TTCTT-3'

添加的Flag标签序列为：5'-CTT GTC GTC ATC GTC TTT GTA GTC-3'(SEQ IDNO.3)

重组慢病毒表达质粒的构建：将步骤(1)中得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确进行切胶回收并将回收的目的片段定向克隆入pLVX-EF1α-IRES-Puro载体相应位点之间，获得重组慢病毒表达载体pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N(见图1)，重组载体经BamH I和Xho I双酶切之后经琼脂糖凝胶电泳鉴定可观察到8.8kb大小的载体条带和1074bp大小的目的条带，而pLVX-EF1α-IRES-Puro空载体双酶切后仅观察到8.8kb大小的载体条带(见图2)。将重组表达质粒进一步转化到Stbl2感受态细胞，获得的重组菌命名为Stbl2/pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N。

实施例2重组细胞系Vero/PDCoV-N的建立

本发明所述检测PDCoV抗体的重组细胞系Vero/PDCoV-N，可以通过下述步骤得到：

慢病毒的包装：将构建好的重组菌Stbl2/pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N以1：100的比例接种于添加氨苄青霉素的液体LB培养基中，250r/min剧烈震荡培养12～16h后用去内毒素提取质粒试剂盒提取pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N质粒，将提取的pLVX-EF1α-IRES-Puro-PDCoV-N慢病毒表达质粒与2个辅助质粒pMD2.G和psPAX2用3000转染试剂转染293T细胞进行病毒包装(质粒总质量15μg，质粒的比例为7：2：1)，48h～72h后收集上清液，间隔48h～72h再收集上清，共收集3次，收集的慢病毒上清1000r/min离心10min，弃去底部细胞沉淀，保存于-70℃。

嘌呤霉素筛选浓度的确定：在24孔板内接种Vero细胞，共11孔，培养过夜，细胞长至底面积80％～90％，依次给每孔换上加入了嘌呤霉素的完全培养基(10％FBS-DMEM)，设置0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/ml的浓度梯度，每隔2天观察细胞存活状态(细胞飘起即为死亡)，每隔2天更换0.75mL含相应浓度嘌呤霉素的培养基。筛选4～7天内使细胞全部死完的最低嘌呤霉素浓度，即为筛选浓度。第4天，含有4μg/ml嘌呤霉素的孔内的Vero细胞死完(见图3)，确定含有4μg/ml的嘌呤霉素完全培养基为之后的筛选培养基。

慢病毒感染Vero细胞和嘌呤霉素筛选：接种适量的Vero细胞于12孔细胞板上的2个孔，1个孔感染慢病毒，另1个孔作为对照，待细胞生长到覆盖80％～90％底面积时，弃去其中1孔培养基，用无菌PBS(pH7.2)清洗2～3次。吸取步骤(3)收集的慢病毒0.5mL和0.5mLDMEM混合均匀接种于细胞上，感染6～8h后弃去慢病毒DMEM混合液加入完全培养基，48h后，将2个孔内的培养基换成嘌呤霉素筛选培养基，每2天更换一次筛选培养基，等到对照孔内细胞全部死完将接毒孔内细胞全部转出至另1个空的12孔内，用筛选培养基进行2次筛选，细胞长满后弃去4/5的细胞继续筛选传代，如此筛选4～5代后扩大培养，获得细胞系Vero/PDCoV-N。

重组细胞系Vero/PDCoV-N的PCR鉴定：使用RNA提取试剂盒提取细胞系Vero/PDCoV-N的RNA，均分为3份做相应处理作为PCR的模板。1份直接反转录为cDNA；1份用DN aseI处理后再进行反转录为cDNA；1份RNA不做任何处理直接作为PCR的模板。用步骤(1)中设计好的特异性引物进行PCR扩增，结果显示重组细胞系Vero/PDCoV-N在转录水平成功表达PDCoV-N基因(见图4)。

Western-blot分析重组细胞系Vero/PDCoV-N中目的基因的表达：提取重组细胞系Vero/PDCoV-N蛋白样，同时制备Vero细胞蛋白样作为对照，分别以抗Flag标签蛋白的单克隆抗体和PDCoVN蛋白特异性单克隆抗体作为一抗、以HRP标记的羊抗鼠抗体作为二抗进行Western-blot分析，化学发光显色可见以重组细胞系Vero/PDCoV-N制备的蛋白样在40kDa左右出现特异性条带，而以Vero细胞制备的蛋白样无任何条带(见图5和图6)，该结果显示细胞系Vero/PDCoV-N可以成功表达PDCoVN蛋白。

实施例3细胞系Vero/PDCoV-N的应用

对采集自天津某已确诊PDCoV感染发病猪场的感染猪阳性血清和采集自某阴性猪场的阴性血清进行检测，用构建的重组细胞系进行免疫组化分析，分别以阳性感染猪血清和阴性猪血清作为一抗，以HRP标记的羊抗猪抗体和FITC标记羊抗猪抗体作为二抗，分别进行免疫组织化学染色和间接免疫荧光染色，结果显示：在免疫组织化学染色试验中与阳性血清反应的细胞系胞浆可染成明显的棕黄色，而阴性血清反应的细胞未出现颜色反应(图7)；在间接免疫荧光染色试验中与阳性血清反应的细胞系胞浆可可观察到明显的亮绿色荧光，而阴性血清反应的细胞未出现荧光(图8)，该结果说明本发明细胞系可以与阳性感染血清发生特异性反应。以上结果证明，本发明的稳定表达PDCoVN蛋白的重组Vero细胞系具有良好的特异性，可以用于临床猪群感染PDCoV的监测。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

<120> 一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系及应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaactcgaga tcatggctgc accagtagtc 30

<210> 2

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttggatccc tacttgtcgt catcgtcttt gtagtccgct gctgattctt 50

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cttgtcgtca tcgtctttgt agtc 24

Claims (3)

1.一种稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系，其特征在于，该细胞系含有猪德尔塔冠状病毒N蛋白基因和抗性筛选基因。

2.根据权利要求1所述的稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系，其特征在于，该细胞系含有猪德尔塔冠状病毒N蛋白基因和嘌呤霉素抗性基因，是非洲绿猴肾细胞Vero/PDCoV-N，保藏号是：CCTCC NO.C2018255。

3.权利要求1所述的稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的重组Vero细胞系在制备检测猪德尔塔冠状病毒试剂中的应用。