CN117642172A

CN117642172A - 嵌合多肽及使用方法

Info

Publication number: CN117642172A
Application number: CN202280045832.8A
Authority: CN
Inventors: S·S·尼拉普; 刘景伟; S·帕驰瓦; Y·唐
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2024-03-01

Abstract

本公开的方面提供了用于检测、分离、耗竭和/或纯化细胞的组合物和方法，其包含在此类方法中有用的多肽，包括嵌合多肽。公开了各种嵌合多肽，以及此类多肽作为选择标志物、转导标志物和/或安全开关的用途。还公开了包含编码一种或多种嵌合多肽的多核苷酸的细胞，包括治疗性细胞，诸如T细胞、NK细胞、NKT细胞和iPSC。

Description

嵌合多肽及使用方法

本申请要求2021年5月14日提交的美国临时专利申请序列号63/188,936以及2021年11月2日提交的美国临时专利申请序列号63/274,765的优先权，这两个申请通过引用以其整体并入本文。

背景

I.技术领域

本公开的方面涉及分子生物学领域。具体而言，本发明的实施方案涉及嵌合多肽、工程化的细胞及其使用方法。

II.背景

靶向肿瘤抗原的治疗性细胞，诸如CAR-NK细胞、CAR T细胞和TCR-转导的T细胞，是治疗各种恶性肿瘤的有前途的方法。尽管迄今为止这些疗法取得了成功，但仍存在一些局限性，包括疾病复发、高制造成本和毒性。需要用于靶向治疗性细胞的组合物和方法，诸如用于制造过程中的分离、鉴定和纯化，以及用于在发生不良事件诸如细胞因子释放综合征和移植物抗宿主病时选择性靶向此类细胞以将其消除。

概述

在一些方面，本文公开了用于检测、分离、耗竭和/或纯化细胞的方法和组合物。因此，在一些实施方案中公开了包含一个或多个胞外区(例如，来自BCMA、Trop2、CD30、EGFR或Her2)和跨膜结构域的嵌合多肽。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含一个或多个附加区域，例如信号肽、铰链区或胞内区。还公开了表达此类多肽的工程化的细胞以及检测、分离、耗竭和/或纯化此类细胞的方法。

本公开的实施方案包括核酸、多核苷酸、多肽、蛋白质、肽、构建体、载体、细胞、治疗性细胞、免疫细胞、工程化的细胞、产生工程化的细胞的方法、检测工程化的细胞的方法、分离工程化的细胞的方法、耗竭工程化的细胞的方法和纯化工程化的细胞的方法。本公开的核酸可编码本公开的一种或多种多肽，包括一种或多种嵌合多肽。在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码嵌合多肽。在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码两种或更多种嵌合多肽。本公开的嵌合多肽可包含至少1个、2个、3个或更多个以下区域或结构域：信号肽、胞外结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内区。本公开的工程化的细胞可包含1个、2个、3个、4个或更多个本公开的多核苷酸和/或多肽。本公开的方法可包括至少1个、2个、3个、4个或更多个以下步骤：将多核苷酸引入细胞，将载体引入细胞，将多肽引入细胞，在细胞中表达多肽，扩增细胞群，将细胞与抗原结合蛋白接触，将细胞与抗体药物缀合物接触，以及用显像剂检测细胞。

在一些实施方案中，本文公开了嵌合多肽，其包含(a)来自B细胞成熟抗原(BCMA)的胞外结构域；(b)来自程序性细胞死亡1配体1(PDL1)的铰链区；(c)跨膜结构域；和(d)胞内区。在一些实施方案中，胞外结构域包含与SEQ ID NO:19至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，胞外结构域由SEQ ID NO:19组成。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，铰链区由SEQ ID NO:23组成。在一些实施方案中，跨膜结构域是T细胞受体的α或β链，或者是来自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ IDNO:26。在一些实施方案中，跨膜结构域由SEQ ID NO:26组成。在一些实施方案中，跨膜结构域是来自PDL1的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO:25至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQID NO:25。在一些实施方案中，跨膜结构域由SEQ ID NO:25组成。在一些实施方案中，胞内区包含序列RLR(SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，胞内区由序列RLR(SEQ ID NO:29)组成。在一些实施方案中，胞内区包含SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，胞内区由SEQ IDNO:31组成。在一些实施方案中，胞内区包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，胞内区由SEQ ID NO:32组成。在一些实施方案中，胞内区包含与SEQ ID NO:40至少95％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内区包含SEQ ID NO:40。在一些实施方案中，胞内区由SEQID NO:40组成。在一些实施方案中，胞内区包含至多25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个或3个氨基酸。在一些实施方案中，嵌合多肽的长度小于或等于100个氨基酸。在一些实施方案中，其中嵌合多肽不包含信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含来自BCMA的胞内区。

在一些实施方案中，嵌合多肽包含与SEQ ID NO:1至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，嵌合多肽由SEQ ID NO:1组成。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与SEQ ID NO:38至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含SEQ IDNO:38。在一些实施方案中，嵌合多肽由SEQ ID NO:38组成。还公开了包含编码嵌合多肽的核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO:2至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO:39至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:2。还公开了包含核酸分子的载体。

在一些实施方案中，本文还公开了嵌合多肽，其包含(a)组织型纤溶酶原激活物(tPA)信号肽；(b)来自BCMA的胞外结构域；(c)铰链区域；(d)跨膜结构域；和(e)胞内区。在一些实施方案中，tPA信号肽包含与SEQ ID NO:34至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的序列。在一些实施方案中，tPA信号肽包含SEQ ID NO:34。在一些实施方案中，tPA信号肽由SEQ ID NO:34组成。在一些实施方案中，胞外结构域包含与SEQ ID NO:19至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，胞外结构域由SEQ ID NO:19组成。在一些实施方案中，铰链区包含CD8α铰链、PDL1铰链、IgG4铰链、IgG1铰链或CD34铰链。在一些实施方案中，铰链区是来自PDL1的铰链区。铰链区包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，铰链区由SEQ ID NO:23组成。在一些实施方案中，铰链区是来自CD8α的铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，铰链区由SEQ ID NO:24组成。在一些实施方案中，跨膜结构域是T细胞受体的α或β链，或者是来自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQID NO:26。在一些实施方案中，跨膜结构域由SEQ ID NO:26组成。在一些实施方案中，胞内区是CD8α的胞内区的一部分。在一些实施方案中，胞内区域包含至多10个、9个、8个、7个或6个氨基酸。在一些实施方案中，胞内区包含SEQ ID NO:30。在一些实施方案中，胞内区由SEQID NO:30组成。在一些实施方案中，嵌合多肽的长度小于或等于150个氨基酸。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含来自BCMA的胞内区。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与SEQ ID NO:3至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，嵌合多肽由SEQ ID NO:3组成。还公开了包含编码嵌合多肽的核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO:4至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:4。还公开了包含核酸分子的载体。

在一些实施方案中，本文还公开了嵌合多肽，其包含(a)来自CD30的胞外结构域；(b)来自CD30的跨膜结构域；和(c)来自BCMA的胞内区。在一些实施方案中，胞外结构域包含与SEQ ID NO:20至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，胞外结构域由SEQ ID NO:20组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO:27至少95％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，跨膜结构域由SEQ ID NO:27组成。在一些实施方案中，胞内区包含与SEQ ID NO:33至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内区包含SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，胞内区由SEQ ID NO:33组成。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含来自CD30的胞内区。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与SEQ IDNO:9至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含SEQ ID NO:9。还公开了包含编码嵌合多肽的核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO:10至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:10。还公开了包含核酸分子的载体。

在一些实施方案中，本文还公开了嵌合多肽，其包含(a)不是Her2信号肽的信号肽；(b)来自Her2的胞外结构域；和(c)来自Her2的跨膜结构域。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含胞内区。在一些实施方案中，信号肽是来自CD8α的信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:35至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，信号肽由SEQ ID NO:35组成。在一些实施方案中，胞外结构域包含与SEQ ID NO:21至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞外结构域包含SEQ ID NO:21。在一些实施方案中，胞外结构域由SEQ ID NO:21组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO:28至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQID NO:28。在一些实施方案中，跨膜结构域由SEQ ID NO:28组成。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与SEQ ID NO:11至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，嵌合多肽由SEQ ID NO:11组成。还公开了包含编码嵌合多肽的核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO:12至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:12。还公开了包含核酸分子的载体。

在一些实施方案中，本文还公开了包含编码Trop2多肽的核酸的工程化的免疫细胞。在一些实施方案中，Trop2多肽包含SEQ ID NO:15。在一些实施方案中，核酸包含与SEQID NO:16至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列。在一些实施方案中，核酸包含SEQ ID NO:16。

在一些实施方案中，本文还公开了嵌合多肽，其包含：(a)信号肽；(b)胞外区，其包含(i)EGFR结构域III和(ii)长度小于100个氨基酸的EGFR结构域IV的一部分；(c)铰链区域；和(d)跨膜结构域。在一些实施方案中，EGFR结构域IV的一部分具有小于75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个或35个氨基酸的长度。在一些实施方案中，EGFR结构域IV的一部分具有33个氨基酸的长度。在一些实施方案中，信号肽是来自GM-CSFRα的信号肽。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:36至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:36。在一些实施方案中，信号肽由SEQ IDNO:36组成。在一些实施方案中，胞外区包含与SEQ ID NO:22至少95％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞外区包含SEQ ID NO:22。在一些实施方案中，胞外区由SEQ ID NO:22组成。在一些实施方案中，铰链区是来自CD8的铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含与SEQ ID NO:37至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:37。在一些实施方案中，铰链区由SEQ ID NO:37组成。在一些实施方案中，跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，跨膜结构域由SEQID NO:26组成。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合多肽不包含来自EGFR的胞内区。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与SEQ ID NO:15至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，嵌合多肽包含SEQ IDNO:15。在一些实施方案中，嵌合多肽由SEQ ID NO:15组成。还公开了包含编码嵌合多肽的核苷酸序列的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子包含与SEQ ID NO:16至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的核酸序列。在一些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO:16。还公开了包含核酸分子的载体。

在一些实施方案中，公开了产生工程化的细胞的方法，其包括将本公开的嵌合多肽、核酸分子或载体引入细胞。

在一些实施方案中，公开了包含编码本公开的嵌合多肽的核酸分子的工程化的细胞。在一些实施方案中，工程化的细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞或调节性T细胞。在一些实施方案中，工程化的细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，工程化的细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，工程化的细胞是iPSC衍生的细胞。在一些实施方案中，工程化的细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，嵌合多肽与CAR有效连接。在一些实施方案中，工程化的细胞还包含T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，嵌合多肽与TCR有效连接。还公开了包含本公开的工程化的细胞的细胞群体。

还公开了用于检测、分离、耗竭或纯化本公开的工程化的细胞的方法，该方法包括将工程化的细胞与抗原结合蛋白接触，其中抗原结合蛋白能够与工程化的细胞的多肽结合。在工程化的细胞表达包含来自BCMA的胞外结构域的嵌合多肽的实施方案中，抗原结合蛋白是BCMA结合蛋白。在工程化的细胞表达包含来自CD30的胞外结构域的嵌合多肽的实施方案中，抗原结合蛋白是CD30结合蛋白。在工程化的细胞表达包含来自Her2的胞外结构域的嵌合多肽的实施方案中，抗原结合蛋白是Her2结合蛋白。在工程化的细胞表达Trop2多肽的实施方案中，抗原结合蛋白是Trop2结合蛋白。在工程化的细胞表达包含含有来自EGFR的胞外结构域的一部分的胞外区的嵌合多肽的实施方案中，所述抗原结合蛋白是EGFR结合蛋白。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是抗原特异性抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合蛋白与显像剂连接，并且该方法还包括用显像剂检测细胞。在一些实施方案中，抗原结合蛋白与细胞毒性剂连接(例如，为抗体-药物缀合物)。在一些实施方案中，在体外进行工程化的细胞与抗原结合蛋白的接触。在一些实施方案中，在体外进行工程化的细胞与抗原结合蛋白的接触。在一些实施方案中，在体内进行工程化的细胞与抗原结合蛋白的接触。

在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括测量或定量方法的固有误差变化。

当与术语“包含”结合使用时，词语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可以表示“一个”，但是其也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致

短语“和/或”表示“和”或“或”。举例来说，A、B和/或C包括：单独的A、单独的B、单独的C、A与B的组合、A与C的组合、B与C的组合、或者A、B与C的组合。换句话说，“和/或”操作作为包含性的或。

词语“包含(comprising)”(以及任何形式的包含(comprising)，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及任何形式的具有(having)，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括(including)，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的包含(containing)，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放性的，并且不排除附加的、未列举的要素或方法步骤。

组合物及其使用方法可以“包含”、“基本上由”或“由”整个说明书中公开的任何成分或步骤组成。“基本上由”所公开的任何成分或步骤组成的组合物和方法将权利要求的范围限制到具体的材料或步骤，所述材料或步骤不会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征。

在整个说明书中，对“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“附加实施方案”或“进一步实施方案”或其组合的引用意味着结合该实施方案描述的特定特性、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在整个本说明书各处出现的前述短语不一定都指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定的特性、结构或特征可以以任何合适的方式组合。

在治疗、诊断或生理目的或作用的上下文中的任何方法也可以在“用途”权利要求语言，诸如本文论述的任何化合物、组合物或剂用于实现或实施所述治疗、诊断或生理目的或作用“的用途”中描述。

本文所用的术语“工程化的”是指由人工产生的实体，包括细胞、核酸、多肽、载体等。在至少一些情况下，工程化的实体是合成的，并且包括并非以其在本公开中使用的方式自然存在或配置的元素。在具体实施方案中，通过重组核酸技术工程改造载体，通过工程化的载体的转染或转导工程改造细胞。

如本文中所用，“预防(prevent)”以及类似的词语，诸如“预防的(prevented)”、“预防(preventing)”等表示用于预防、抑制或降低疾病或疾患(例如癌症)发生或复发的可能性的方法。其还指延迟疾病或疾患的发作或复发，或延迟疾病或疾患的症状的发生或复发。如本文中所用，“预防(prevention)”和类似词语还包括在疾病或疾患发作或复发之前降低疾病或疾患的强度、效果、症状和/或负担。

如本文中所用，术语“受试者”通常指具有正在进行处理或分析的生物样品，在特定情况下，患有或被怀疑患有癌症的个体。受试者可以是作为方法或材料对象的任何生物体或动物受试者，包括哺乳动物，例如人、实验动物(例如，灵长类动物、大鼠、小鼠、兔子)、家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)、家养宠物(例如，狗、猫和啮齿动物)、马和转基因非人动物。受试者可以是患者，例如患有或被怀疑患有疾病(其可称为医学疾患)，诸如良性或恶性肿瘤或癌症。受试者可以正在接受或已经接受治疗。受试者可以无症状。受试者可以是希望预防癌症的健康个体。至少在一些情况下，术语“个体(individual)”可以互换使用。如本文中所用，“受试者”或“个体”可被安置在或可以不被安置在医疗机构中，并且可以作为医疗机构的门诊病人来治疗。个体可以通过互联网接收一种或多种医疗组合物。个体可包括任何年龄的人或非人动物，因此包括成人和青少年(即,儿童)和婴儿，并包括子宫内的个体。该术语并不意味着需要医疗，因此，个体可以自愿或非自愿地成为临床或支持基础科学研究的实验的一部分。

如本文中所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益或期望的作用，并且可包括被治疗的疾病或疾患(例如癌症)的一种或多种可测量标志物的甚至最小的减少。治疗可以任选地包括减轻或改善疾病或疾患的症状，或者延缓疾病或疾患的进展。“治疗”不一定表示疾病或疾患或其相关症状的完全根除或治愈。

特别地设想了，关于本发明的一个实施方案论述的任何限定可以应用于本发明的任何其它实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法，并且本发明的任何方法可用于生产或利用本发明的任何组合物。关于本公开的一个方面论述的任何实施方案也适用于本公开的其它方面，反之亦然。例如，本文描述的方法中的任何步骤可应用于任何其它方法。此外，本文描述的任何方法可以排除任何步骤或步骤组合。实例中阐述的实施方案的方面也是可以在不同实例中的其它地方或本申请中的其它地方(诸如在概述、详细描述、权利要求和附图简述中)论述的实施方案的上下文中实现的实施方案。

本发明的其它目的、特征和有利方面将根据以下详细描述中变得显而易见。然而，应该理解的是，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的具体实施方案，但仅仅是以说明的方式给出的，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

附图简述

以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括进来以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开的实施方案。

图1显示了用含有以下三种不同膜结合受体之一的质粒转染的293T细胞的GFP表达和BCMA染色：与PD-L1铰链和跨膜结构域融合的BCMA胞外结构域、与CD8α铰链和跨膜结构域融合的BCMA胞外结构域，或全长野生型BCMA。

图2显示了用共表达CD19 CAR和以下两种不同BCMA融合构建体之一的慢病毒载体转导的原代T细胞(用BCL6和BCL2L1转导的)的CD19 CAR和BCMA染色：具有PD-L1铰链和跨膜结构域但无功能性胞内结构域的BCMA胞外结构域(左图)或与PD-L1铰链和跨膜结构域融合并具有来自Trop-2的胞质结构域的BCMA胞外域(tBCMA；中图)。未染色的对照显示于右图中。

图3显示了使用抗APC磁珠富集的细胞的CD19 CAR和BCMA染色。

图4显示了用指示浓度的贝兰妥单抗莫福汀(belantamabmafodotin)处理的用BCMA融合蛋白转导的原代T细胞(用BCL6和BCL2L1转导的)的活细胞的百分比变化。

图5显示了各自用所示浓度的贝兰妥单抗莫福汀(0μg、12.5μg或25μg)处理的用慢病毒载体转导的Jurkat细胞的BCMA染色(横轴)，所述慢病毒载体表达：单独的BCMA胞外域、与来自CD317的胞质结构域融合的BCMA胞外域、或与来自CD3γ的胞质结构域融合的BCMA胞外域。

图6显示了用BCL6和BCL2L1转染的原代T细胞的CD30和CD69染色。

图7显示了用所示浓度的维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)处理指定时间的用BCL6和BCL2L1转染的原代T细胞的活细胞的百分比变化。

图8显示了编码CD19 CAR以及1)Her2结构域4和2)与BCMA胞质尾融合的CD30胞外结构域的构建体的示意图。

图9显示了用图8所示的构建体转导的293T细胞的CD30染色(左图)和Her2染色(中图)。右图显示了用所示浓度的本妥昔单抗(brentuximab)处理后第4天活细胞数量的变化。

图10显示了编码CD19 CAR以及1)Her2结构域4和2)截短的EGFR的构建体的示意图。

图11A显示了用图10所示的构建体转导的Jurkat T细胞的Her2和CD19 CAR染色。图11B显示了用所示浓度的曲妥珠单抗处理细胞后活细胞的百分比变化。

图12显示了编码CD19 CAR以及1)Her2结构域4和2)Trop2的构建体的示意图。

图13显示了用图12所示的构建体转染的293T细胞的CD19 CAR和Trop2染色。

图14显示了编码CD19 CAR以及1)Her2结构域4和2)截短的EGFR的构建体的示意图。

图15显示了用图1所示的构建体转染的293T细胞的CD19 CAR和EGFR染色(西妥昔单抗)。

图16A显示了具有体外功效的tBCMA安全开关。用tBCMA安全开关、BCL6和BCL2L1转染的T细胞是左边的条形图簇，用tBCMA安全开关、CD19 CAR、BCL6和BCL2L1转染的T细胞是中间的条形图簇，而对照非转染的Raji细胞是右边的条形图簇。

图16B显示了具有体内功效的tBCMA安全开关。

详细描述

本公开的方面涉及用于检测、分离、耗竭和/或纯化细胞的多肽。因此，本公开的某些方面涉及嵌合多肽，其包含例如来自BCMA的胞外结构域、来自Trop-2的胞外结构域、来自CD30的胞外结构域、来自EGFR的胞外结构域(例如，来自EGFR的结构域III和结构域IV的一部分)和/或来自Her2的胞外结构域(例如，来自HER2的结构域IV)。本公开的嵌合多肽还可包含一个或多个附加结构域或区域，诸如信号肽、铰链、跨膜区和/或一个或多个胞内区。还公开了包含本公开的一种或多种多肽(例如，嵌合多肽)的细胞(例如，治疗性细胞)，以及用于检测、分离、耗竭和/或纯化此类细胞的方法。

在特定的实施方案中，嵌合多肽用于例如与细胞疗法相关的一种或多种特定目的。在具体实施方案中，嵌合多肽用于直接或间接控制特定治疗性细胞的用途，并允许监测细胞疗法、检测细胞疗法中的细胞、分离用于细胞疗法的细胞和/或在期望的事件和/或时间终止细胞疗法。在特定的实施方案中，嵌合多肽被用作转导标志物、安全开关或两者。在一些情况下，本文涵盖的嵌合多肽被用作细胞中的转导标志物或选择标志物，但另一个安全开关控制细胞的抑制。在其它情况下，嵌合多肽被用作细胞中的安全开关，任选地作为同一细胞中另一个安全开关的补充。

安全开关嵌合多肽可用于转导/转染的细胞中，目的是在需要时引发细胞死亡。利用嵌合多肽的细胞可以包含一种或多种不同的作为安全开关的嵌合多肽。在一些实施方案中，安全开关嵌合多肽被用作“自杀基因”,其在前药或其它剂施用后，实现基因产物向杀死其宿主细胞的化合物的转变。在其它实施方案中，安全开关嵌合多肽被用作编码基因产物的自杀基因，当需要时，所述基因产物被靶向自杀基因产物的剂(诸如抗体)靶向。

在一些情况下，个体接受细胞疗法，其中细胞表达嵌合多肽。当接受细胞疗法和/或已经接受细胞疗法的个体表现一种或多种不良事件(诸如细胞因子释放综合征、神经毒性、过敏反应/变态反应，和/或非肿瘤靶向毒性(on-target/off tumor toxicity)(作为实例))的一种或多种症状，或被认为处于具有一种或多种症状的风险(包括即将发生的风险)中时，可对个体使用一种或多种结合嵌合多肽的胞外结构域的剂。结合嵌合多肽的剂的使用可以是计划治疗方案的一部分，或者可以仅在确认需要其使用时使用。在一些情况下，由于不再需要治疗，通过使用靶向嵌合多肽的胞外域的一种或多种剂来终止细胞疗法。

嵌合多肽作为安全开关的应用可在个体发生至少一种不良事件时启动，且该不良事件可通过任何手段(包括根据从细胞疗法开始起可以连续或可以不连续的常规监测)识别。可在检查和/或测试时检测到一种或多种不良事件。在个体患有细胞因子释放综合征(其也称为细胞因子风暴)的情况下，该个体可能例如具有升高的一种或多种炎性细胞因子(仅作为实例：干扰素-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10、IL-6和TNF-α)；发烧；疲劳；低血压；缺氧、心动过速；恶心；毛细血管渗漏；心脏/肾脏/肝脏功能障碍；或其组合。在个体具有神经毒性的情况下，该个体可能具有意识模糊、谵妄、失语症和/或癫痫发作。在一些情况下，测试个体的与细胞因子释放综合征的发作和/或严重性相关的标志物，诸如C-反应蛋白、IL-6、TNF-α和/或铁蛋白。

在特定的实施方案中，细胞疗法可包括编码一种或多种异源蛋白质的一种或多种载体，并且此类一种或多种异源蛋白质可以是使细胞具有治疗性的组合物。在一些实施方案中，编码一种或多种异源蛋白质的载体编码一种或多种安全开关。例如，安全开关可以与或可以不与CAR在同一载体上。在安全开关与CAR存在于同一载体上的情况下，安全开关和CAR可以例如由IRES或2A元件分开。

I.多肽

本公开的方面涉及多肽，包括嵌合多肽，及其使用方法。如本文中所用，“蛋白质”或“多肽”是指包含至少五个氨基酸残基的分子。如本文中所用，术语“野生型”是指天然存在于生物体中的分子的内源形式。在一些实施方案中，使用蛋白质或多肽的野生型形式，然而，在本公开的许多实施方案中，使用经修饰的蛋白质或多肽。上述术语可以互换使用。“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”或“变体”是指其化学结构，特别是其氨基酸序列，相对于野生型蛋白质或多肽发生了改变的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，经修饰/变异的蛋白质或多肽具有至少一种经修饰的活性或功能(认识到蛋白质或多肽可具有多种活性或功能)。特别地设想了经修饰/变异的蛋白质或多肽可在一种活性或功能方面被改变，而在其它方面仍保持野生型活性或功能。

当在本文中具体提及蛋白质时，其通常指天然(野生型)或重组(经修饰的)蛋白质，或者任选地，其中任何信号序列已被去除的蛋白质。蛋白质可以直接从其天然存在的生物体中分离，通过重组DNA/外源表达方法产生，或通过固相肽合成(SPPS)或其它体外方法产生。在特定的实施方案中，存在分离的核酸区段和重组载体，其整合了编码多肽(例如，抗体或其片段)的核酸序列。术语“重组体”可以与多肽或特定多肽的名称结合使用，并且这通常指从已在体外操作的核酸分子或作为这种分子的复制产物的核酸分子产生的多肽。

在某些实施方案中，蛋白质或多肽(野生型或经修饰的)的大小可以包含但不限于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个氨基酸残基或更多，以及其间任何可衍化的范围，或本文所述或参考的相应氨基酸序列的衍生物。设想了多肽可以通过截短，使它们比它们相应的野生型形式短来进行突变，并且它们可能通过融合或缀合具有特定功能(例如，用于靶向或定位，用于增强免疫原性，用于纯化目的等)的异源蛋白质或多肽序列来进行改变。如本文中所用，术语“结构域”是指蛋白质或多肽的任何独特的功能或结构单位，通常指具有本领域技术人员可识别的结构或功能的氨基酸序列。

本公开的多肽、蛋白质或编码此类多肽或蛋白质的多核苷酸可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个(或其间任何可衍化的范围)或更多变体氨基酸或核酸取代，或与SEQ ID NO:1-48的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000个或更多连续氨基酸或核苷酸或其间任何可衍化的范围至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)相似、一致或同源。

在一些实施方案中，所述蛋白质、多肽或核酸可以分别包含SEQ ID NO:1-48的氨基酸或核苷酸的1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999或1000个(或其间任何可衍化的范围)。

在一些实施方案中，所述蛋白质、多肽或核酸可分别包含SEQ ID NO:1-48的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999或1000个(或其间任何可衍化的范围)连续氨基酸或核苷酸。

在一些实施方案中，所述多肽、蛋白质或核酸可以分别包含SEQ ID NO:1-48的至少、至多或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999或1000个(或其间任何可衍化的范围)连续氨基酸或核苷酸，所述连续氨基酸或核苷酸分别至少与、至多与或正好与SEQ ID NO:1-48中任一个60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)相似、一致或同源。

在一些方面，存在始于SEQ ID NO:1-48中任一个的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999或1000并至少包含、至多包含或正好包含SEQ ID NO:1-48中任一个的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999或1000个(或其间任何可衍化的范围)连续氨基酸或核苷酸的核酸分子或多肽。

本公开的多肽和肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或其间任何可衍化的范围)或更多变体氨基酸取代或与SEQ ID NO:1-48中任一个的至少或至多3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸或核苷酸或其中任何可衍化的范围至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何衍化的范围)相似、一致或同源。

在一些实施方案中，所述肽、多肽或核酸可包含SEQ ID NO:1-48中任一个的氨基酸或核苷酸的1至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25(或其间任何衍化的范围)。

在一些实施方案中，所述肽、多肽或核酸可包含SEQ ID NO:1-48的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个(或其间任何可衍化的范围)连续氨基酸。

在一些实施方案中，所述肽、多肽或核酸可以包含，可以至少包含，或者可以至多包含SEQ ID NO:1-48中任一个的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个(或其间任何可衍化的范围)连续氨基酸或核苷酸，所述连续氨基酸或核苷酸至少与、至多与或正好与SEQ ID NO:1-48中任一个60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何衍化的范围)相似、一致或同源。

在一些方面，存在始于SEQ ID NO:1-48中任一个的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10并包含、至少包含或至多包含SEQ ID NO:1-48中任一个的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个(或其间任何可衍化的范围)连续氨基酸或核苷酸的肽、多肽或核酸。

相对于SEQ ID NO:1-48，所述肽、多肽或核酸可包含、可至少包含或可至多包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或其间任何可衍化的范围)氨基酸或核苷酸取代。所述肽、多肽或核酸可包含、可至少包含或可至多包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或其间任何可衍化的范围)氨基酸或核苷酸取代，并且所述一个或多个取代可位于相对于SEQ ID NO:1-48的位置1、2、3、4、5、6、7,8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和/或25上。对于氨基酸取代，取代(例如，在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和/或25处)可以是用丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸进行的取代对于核酸取代，取代(例如，在位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和/或25处)可以是用鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或其它核苷酸进行的取代。

以前已经公开了各种基因的核苷酸以及蛋白质、多肽和肽序列，并且可在公认的计算机化数据库中找到所述序列。两个常用的数据库是国家生物技术信息中心的和数据库(在ncbi.nlm.nih.gov/的万维网上)和通用蛋白质资源(UniProt；在uniprot.org的万维网上)。这些基因的编码区可以使用本文公开的技术或本领域普通技术人员已知的技术进行扩增和/或表达

设想了在本公开的组合物中，在一些实施方案中，每ml存在介于约0.001mg与约10mg之间的总多肽、肽和/或蛋白质。组合物中蛋白质的浓度可为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更高(或其间任何可衍化的范围)。

A.嵌合多肽

如本文所公开的，“嵌合多肽”描述了具有源自两种或多种不同多肽的区域、结构域或其它部分的任何多肽。例如，嵌合多肽的一个实例是具有源自第一蛋白质的第一结构域和源自第二蛋白质的第二结构域的多肽。当区域或结构域与多肽的至少一部分具有相同的序列时，该区域或结构域被描述为“来自”或“源自”所述蛋白质或多肽。因此，例如，来自PDL1的铰链区(也“源自”PDL1)描述了与PDL1蛋白的铰链区的至少一部分具有相同序列的铰链区。“源自”蛋白质或多肽的区域或结构域也可被描述为蛋白质或多肽区域或结构域；例如，源自CD30的跨膜结构域也可被描述为“CD30跨膜结构域”。嵌合多肽可包含来自至少2、3、4、5、6种或更多种不同多肽的区域。嵌合多肽的实例包括嵌合抗原受体(CAR)和其它嵌合细胞表面多肽。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽是包含来自BCMA的胞外结构域和一个或多个源自非BCMA蛋白的附加区域或结构域的多肽。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽是包含来自CD30的胞外结构域和一个或多个源自非CD30的蛋白质的附加区域或结构域的多肽。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽是包含来自Her2的胞外结构域和一个或多个源自非Her2的蛋白质的附加区域或结构域的多肽。在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽是包含来自EGFR的胞外结构域和一个或多个源自非EGFR蛋白的附加区域或结构域的多肽。本公开的嵌合多肽可包含例如信号肽(例如，组织型纤溶酶原激活物(tPA)信号肽、CD8α信号肽或GM-CSFRα信号肽)、胞外结构域(例如，来自BCMA的胞外结构域、来自CD30的胞外结构域、来自Her2的胞外结构域或来自EGFR的胞外结构域)、铰链结构域(例如，来自PDL1的铰链结构域或来自CD8的铰链结构域)、跨膜结构域(例如，来自PDL1的跨膜结构域、来自CD8的跨膜结构域、来自CD30的跨膜结构域或来自Her2的跨膜结构域)、胞内区(例如，来自CD8的胞内区、来自CD317的胞内区、来自CD3γ的胞内区或来自BCMA的胞内区)或其任意组合。这些区域或结构域中的任一个或多个可以从本公开的某些实施方案中排除。

在一些实施方案中，本文公开了包含来自BCMA的胞外结构域、铰链区、跨膜结构域和胞内区的嵌合多肽。所述嵌合多肽可包含胞外结构域，所述胞外结构域具有与、至少与或至多与来自BCMA蛋白的胞外结构域60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，来自BCMA的胞外结构域与、至少与或至多与SEQ ID NO:19具有60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)的一致。

本公开的嵌合多肽可包含来自例如CD8α、PDL1、IgG4、IgG1或CD34的铰链区。在一些实施方案中，铰链区具有与、至少与或至多与CD8α铰链、PDL1铰链、IgG4铰链、IgG1铰链或CD34铰链60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致的氨基酸序列在一些实施方案中，铰链区域与、至少与或至多与PDL1铰链60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，铰链区域与、至少与或至多与SEQ ID NO:23 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，铰链区域与、至少与或至多与CD8α铰链60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，铰链区是来自CD8α的铰链区。在一些实施方案中，铰链区域与、至少与或至多与SEQ ID NO:24 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，铰链区域与、至少与或至多与SEQ ID NO:37 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，铰链区包含SEQ ID NO:37。

本公开的嵌合多肽可包含来自一种或多种跨膜蛋白的跨膜区。本发明的嵌合多肽可包含来自例如4-1BB/CD137、T细胞受体的α链、T细胞受体的β链、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD11a(ITGAL)、CD11b(ITGAM)、CD11c(ITGAX)、CD11d(ITGAD)、CD16、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD22、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD37、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD64、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8),CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3),CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关α链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关β链),CD80、CD84(SLAMF5)、CD86、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D),CD103(ITGAE)、CD123、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD154、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A),CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-ζ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRTAM)、CD357(TNFRSF18)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS),LFA-1(CD11a/CD18)、NKG2C、DAP-10,ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fcγ受体、MHC1类分子、MHC2类分子或TNF受体蛋白。在一些实施方案中，跨膜结构域是T细胞受体的α或β链，或者是来自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与、至少与或至多与CD8α跨膜结构域60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与、至少与或至多与SEQ ID NO:26 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ IDNO:26。在一些实施方案中，跨膜结构域与、至少与或至多与CD30跨膜结构域60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，跨膜结构域是来自CD30的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与、至少与或至多与SEQ ID NO:27 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ IDNO:27。在一些实施方案中，跨膜结构域与、至少与或至多与Her2跨膜结构域具有60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)的一致。在一些实施方案中，跨膜结构域是来自Her2的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与、至少与或至多与SEQ ID NO:28 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:28。

本公开的嵌合多肽可包含来自一种或多种跨膜蛋白的胞内区(也称为“胞质区”)。如本文中所用，“胞内区”描述了当多肽在细胞表面表达时，存在于细胞表面的细胞内(或“细胞质”)侧的多肽的区域。在一些实施方案中，胞内区不包含信号传导结构域(即，不能传递或转导任何细胞内信号)。在一些实施方案中，胞内区不来自BCMA。在一些实施方案中，胞内区来自BCMA。在一些实施方案中，胞内区来自CD317。在一些实施方案中，胞内区来自CD3γ。在一些实施方案中，胞内区包含或至多包含20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基，或其间任何衍化的范围。在一些实施方案中，胞内区包含序列RLR(SEQ ID NO:29)。在一些实施方案中，胞内区由序列RLR(SEQ ID NO:29)组成。在一些实施方案中，胞内区包含序列LYCWVR(SEQ ID NO:30)。在一些实施方案中，胞内区由序列LYCWVR(SEQ ID NO:30)组成。在一些实施方案中，与、至少与或至多与SEQ ID NO:31 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，胞内区包含SEQ ID NO:31。在一些实施方案中，与、至少与或至多与SEQ ID NO:32 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，胞内区包含SEQ ID NO:32。在一些实施方案中，与、至少与或至多与SEQ ID NO:33 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，胞内区包含SEQID NO:33。

在一些实施方案中，本公开的嵌合多肽包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽是组织型纤溶酶原激活物(tPA)信号肽。在一些实施方案中，信号肽与、至多与或至少与SEQID NO:34 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:34。在一些实施方案中，信号肽是CD8α信号肽。在一些实施方案中，信号肽与、至多与或至少与SEQ ID NO:35 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，信号肽是GM-CSFRα信号肽。在一些实施方案中，信号肽与、至多与或至少与SEQ ID NO:36 60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间任何可衍化的范围)一致。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:36。

B.序列

表1提供了某些多肽，包括嵌合多肽及其部分、区域和结构域的氨基酸序列。

表1

C.变体多肽

以下是改变蛋白质的氨基酸亚基以产生等同的、甚至改进的第二代变体多肽或肽的论述。例如，某些氨基酸可以取代蛋白质或多肽序列中的其它氨基酸，而有或无与结构例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点的相互作用结合能力的明显丧失。由于蛋白质的相互作用能力和性质决定了该蛋白质的功能活性，因此可以在蛋白质序列及其相应的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，但仍能产生具有相似或所需性质的蛋白质。因此，本发明人设想了可以在编码蛋白质的基因的DNA序列中进行各种改变，而不会明显损失其生物效用或活性。

术语“功能等同密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，诸如精氨酸的六种不同密码子。还考虑了“中性取代”或“中性突变”,其是指编码生物学上等同的氨基酸的密码子或多种密码子的改变。

本公开的氨基酸序列变体可以是取代、插入或缺失变体。与野生型相比，本公开的多肽中的变异可以影响蛋白质或多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个非连续或连续氨基酸。变体可包含与本文提供或引用的任何序列至少50％、60％、70％、80％或90％(包括其间的所有值和范围)一致的氨基酸序列。变体可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个取代氨基酸。

还应理解，氨基酸和核酸序列可分别包含附加残基，诸如附加的N-或C-末端氨基酸，或5′或3′序列，但仍与本文公开的序列之一中所示的基本一致，只要该序列满足上述标准，包括在涉及蛋白质表达时保持生物蛋白质活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列，所述核酸序列可以例如包括位于编码区的5′或3′部分侧翼的各种非编码序列。

缺失变体通常缺少天然或野生型蛋白质的一个或多个残基。单个残基可被删除，或者许多相邻的氨基酸可被删除。可以将终止密码子引入(通过取代或插入)编码核酸序列中以产生截短的蛋白质。

插入突变体通常涉及在多肽的非末端点处添加氨基酸残基。这可包括插入一个或多个氨基酸残基。也可以产生末端添加，并且所述末端添加可包括融合蛋白，所述融合蛋白是本文描述或引用的一种或多种肽或多肽的多聚体或串联体。

取代变体通常在蛋白质或多肽内的一个或多个位点上包含一个氨基酸与另一个氨基酸的交换，并且可被设计成调节多肽的一种或多种特性，而有或无其它功能或特性的丧失。取代可以是保守的，即一个氨基酸被一个具有相似化学性质的氨基酸替代。“保守氨基酸取代”可包括一个氨基酸种类中的成员与同一类中的另一个成员的交换。保守取代在本领域是众所周知的，包括，例如，以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；甲硫氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；和缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。保守氨基酸取代可涵盖非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而非生物系统中的合成来掺入。这些包括肽模拟物或氨基酸部分的其它反向(reversed)或倒转(inverted)形式。

或者，取代可以是“非保守的”，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守性改变通常包括用化学上不相似的氨基酸残基取代氨基酸残基，诸如用极性或带电荷的氨基酸取代非极性或不带电荷的氨基酸，反之亦然。非保守取代可涉及氨基酸种类之一的成员与另一种类的成员的交换。

D.取代的考虑

本领域技术人员可使用众所周知的技术确定本文所示的多肽的合适变体。本领域技术人员可以通过靶向被认为对活性不重要的区域来鉴定分子的可被改变而不破坏活性的合适区域。本领域技术人员也将能够鉴定在相似的蛋白质或多肽之间保守的氨基酸残基和分子的部分。在另外的实施方案中，可将对生物活性或结构可能重要的区域进行保守氨基酸取代，而不会显著改变生物活性或对蛋白质或多肽结构没有不利影响。

在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。通过给每个氨基酸赋予数值(“亲水性指数”)，然后沿着肽链重复平均这些值，来计算蛋白质的亲水性特征。每种氨基酸都根据其疏水性和电荷特性而被赋予了值。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性是本领域普遍理解的(Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-131(1982))。人们普遍认为氨基酸的相对亲水性特征有助于所得蛋白质或多肽的二级结构，所述二级结构又定义了蛋白质或多肽与其它分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。还已知某些氨基酸可以替代具有相似亲水指数或评分的其它氨基酸，并且仍然保持相似的生物活性。在基于亲水性指数进行改变时，在某些实施方案中，包括其亲水性指数在±2以内的氨基酸的取代。在本公开的一些方面，包括在±1以内的那些取代，并且在本公开的其它方面，包括在±0.5以内的那些取代。

在本领域中还可理解，可以基于亲水性有效地进行相似氨基酸的取代。通过引用并入本文的美国专利4,554,101指出，蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性决定的)与蛋白质的生物学性质相关。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性决定的)与其免疫原性和抗原结合(即，作为蛋白质的生物学特性)相关。以下亲水性值被赋予这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，在某些实施方案中，包括其亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，在其它实施方案中，包括亲水性值在±1以内的那些氨基酸的取代，在其它实施方案中，包括亲水性值在±0.5以内的那些氨基酸的取代。在一些情况下，也可以基于亲水性从一级氨基酸序列中鉴定表位。这些区域也被称为“表位核心区”应当理解，氨基酸可被另一种具有相似亲水性值的氨基酸取代，并且仍然产生生物学上等同且免疫学上等同的蛋白质。

另外，本领域技术人员可以回顾结构-功能研究，鉴定相似多肽或蛋白质中对活性或结构重要的残基。鉴于这种比较，可以预测蛋白质中对应于相似蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择化学上相似的氨基酸取代此类预测的重要氨基酸残基。

本领域技术人员也可以分析类似蛋白质或多肽的三维结构和与该结构相关的氨基酸序列。鉴于这类信息，本领域技术人员可以预测抗体的氨基酸残基相对于其三维结构的比对。本领域技术人员可以选择不改变预计在蛋白质表面上的氨基酸残基，因为此类残基可能参与与其它分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生在每个所需氨基酸残基上含有单个氨基酸取代的测试变体。然后可使用结合和/或活性的标准测定法筛选这些变体，从而产生从此类常规实验中收集的信息，这可允许本领域技术人员确定其中应单独地或与其它突变组合地避免进一步取代的氨基酸位置。可用于确定二级结构的各种工具可以在万维网上找到，例如在expasy.org/proteomics/protein_structure上找到。

在本公开的一些实施方案中，进行了氨基酸取代，所述氨基酸取代：(1)降低对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或(5)赋予或修饰此类多肽上的其它物理化学或功能性质。例如，可在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中，保守氨基酸取代)。可在形成分子间接触的一个或多个结构域之外的抗体部分进行取代。在此类实施方案中，可使用基本上不改变蛋白质或多肽的结构特征的保守氨基酸取代(例如，不破坏表征天然抗体的二级结构的一个或多个替代氨基酸)。

E.B细胞成熟抗原(BCMA)

B细胞成熟抗原(BCMA)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员17或TNFRSF17，优先在浆细胞上表达，并在包括多发性骨髓瘤在内的多种恶性血液病中高度表达。BCMA由TNFRSF17基因编码。示例性mRNA由RefSeq登录号NM_001192来表征。示例性蛋白质由RefSeq登录号NP_001183来表征。人BCMA的完整多肽序列提供为SEQ ID NO:17。BCMA基因(TNFRSF17)的完整DNA序列提供为SEQ ID NO:18。

F.程序性细胞死亡1配体1(PDL1)

程序性细胞死亡1配体1(PDL1)，也称为CD274或B7-H1，是由造血细胞、免疫细胞和各种类型的肿瘤细胞表达的免疫抑制性受体配体。示例性mRNA由RefSeq登录号NM_001267706和NM_014143来表征。示例性蛋白由RefSeq登录号NP_001254635和NP_054862来表征。

G.CD30

CD30，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员8或TNFRSF8，由TNFRSF8基因编码。示例性mRNA由RefSeq登录号NM_001243来表征。示例性蛋白质由RefSeq登录号NP_001234来表征。

H.Her2

Her2(或“HER2”)，也称为受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2(erbB-2或ErbB2)、Neu或Her2/neu，是受体酪氨酸激酶的表皮生长因子(EGF)受体家族的成员，据报道Her2的扩增和/或过表达存在于许多癌症中，包括乳腺和卵巢肿瘤。HER2的胞外结构域包含四个结构域，结构域I(从约1至195的氨基酸残基)、结构域II(从约196至319的氨基酸残基)、结构域III(从约320至488的氨基酸残基)和结构域IV(从约489至630的氨基酸残基)(没有信号肽的残基编号)。参见Garrett等人Mol.Cell.11:495-505(2003),Cho等人Nature 421:756-760(2003),Franklin等人Cancer Cell 5:317-328(2004),Plowman等人Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)和美国专利8,652,474，每一篇通过引用并入本文。Her2由ERBB2基因编码。示例性mRNA由RefSeq登录号NM_001005862来表征。示例性蛋白质由RefSeq登录号NP_001005862来表征。

I.Trop2

Trop2(或“Trop-2”)，也称为肿瘤相关钙信号转导子2，是癌相关抗原。Trop2由TACSTD2基因编码。示例性mRNA由RefSeq登录号NM_002353来表征。示例性蛋白质由RefSeq登录号NP_002344来表征。人Trop2的完整多肽序列提供为SEQ ID NO:13。将Trop2基因(TACSTD2)的完整DNA序列作为SEQ ID NO:14提供。

J.EGFR

表皮生长因子受体(EGFR)，也称为erbB-1，优先在浆细胞上表达，并在包括多发性骨髓瘤在内的多种血液恶性肿瘤中高度表达。EGFR的胞外结构域由4个结构域(从N末端开始，分别称为结构域I、结构域II、结构域III和结构域IV，或者也分别称为L1、S1、L2和S2结构域)组成(参见Bajaj,M.等人Biochim.Biophys.Acta 916,220-226(1987)和美国专利7,514,240，每一篇通过引用并入本文)。EGFR由EGFR基因编码。示例性mRNA由RefSeq登录号NM_005228来表征。示例性蛋白质由RefSeq登录号NP_005219来表征。

II.核酸

在某些实施方案中，核酸序列可以存在于诸如以下的多种情况下：编码抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的一条或两条链的整合的序列或重组多核苷酸的分离片段和重组载体，足以用作杂交探针的多核苷酸，用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的PCR引物或测序引物，用于抑制多核苷酸表达的反义核酸，以及本文所述的前述互补序列。还提供了编码本文提供的某些抗体所针对的表位的核酸。还提供了编码包含这些肽的融合蛋白的核酸。核酸可以是单链或双链的，并且可包含RNA和/或DNA核苷酸及其人工变体(例如，肽核酸)。

术语“多核苷酸”是指重组的或已从总基因组核酸中分离的核酸分子。包括在术语“多核苷酸”内的是寡核苷酸(长度为100个残基或更少的核酸)、重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。在某些方面，多核苷酸包括基本上与其天然存在的基因或蛋白质编码序列分离开的调控序列。多核苷酸可以是单链的(编码链或反义链)或双链的，并且可以是RNA、DNA(基因组的、cDNA的或合成的)、其类似物或其组合。附加的编码或非编码序列可以但不必存在于多核苷酸中。

在这方面，术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”用于指编码蛋白质、多肽或肽(包括正确转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)的核酸。如本领域技术人员将理解的，该术语涵盖表达或可适合于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体的基因组序列、表达盒、cDNA序列和较小的工程化的核酸区段。编码全部或部分多肽的核酸可包含编码这种多肽的全部或部分的连续核酸序列。还设想了特定多肽可由含有变异的核酸编码，所述变异具有略微不同的核酸序列，但编码相同或基本相似的蛋白质。

在某些实施方案中，存在与本文公开的序列具有实质一致性的多核苷酸变体；使用本文所述方法(例如，使用标准参数的BLAST分析)与本文中提供的多核苷酸序列相比，包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性(包括其间的所有值和范围)的那些多核苷酸变体。在某些方面，分离的多核苷酸将包含编码多肽的核苷酸序列，所述多肽在序列的全长上与本文所述的氨基酸序列具有至少90％，优选95％和更高的同一性；或与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。

无论编码序列本身的长度如何，核酸区段都可以与其它核酸序列诸如启动子、多腺苷酸化信号、附加的限制性酶位点、多克隆位点、其它编码区段等组合，使得它们的总长度可在很大程度上变化。核酸可具有任何长度。它们的长度可以是例如5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,75,100,125,175,200,250,300,350,400,450,500,750,1000,1500,3000,5000个或更多个核苷酸，和/或可包含一个或多个附加序列，例如调控序列，和/或可为更大序列例如载体的一部分。因此，设想了可以使用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选受到在预期的重组核酸方案中制备和使用的容易性的限制。在一些情况下，核酸序列可以编码具有附加异源编码序列的多肽序列，例如以允许多肽的纯化、运输、分泌、翻译后修饰，或允许治疗益处诸如靶向或功效。如上所述，可将标签或其它异源多肽添加到经修饰的多肽编码序列中，其中“异源的”是指与经修饰的多肽不同的多肽。

A.杂交

在特定杂交条件下与其它核酸杂交的核酸。杂交核酸的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley和Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如本文所定义的，适度严格的杂交条件使用包含5×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、约50％甲酰胺的杂交缓冲液、6×SSC和55℃的杂交温度的预洗涤溶液(或其它类似的杂交溶液，诸如包含约50％甲酰胺的杂交溶液，杂交温度为42℃)，以及在0.5×SSC、0.1％SDS中60℃的洗涤条件。严格的杂交条件是在45℃的6×SSC中杂交，然后在68℃的0.1×SSC、0.2％SDS中洗涤一次或多次。此外，本领域技术人员可以操纵杂交和/或洗涤条件来增加或降低杂交的严格性，使得包含彼此至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致的核苷酸序列的核酸通常保持彼此杂效。

影响杂交条件的选择的参数和设计合适条件的指南由例如以下文献提出：Sambrook,Fritsch和Maniatis(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，第9和11章(1989)；CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等人，编辑，John Wiley和Sons,Inc.，第2.10和6.3-6.4节(1995)，其两者出于所有目的通过引用以其整体并入本文)，并且可由本领域普通技术人员根据例如DNA的长度和/或碱基组成容易地确定。

B.突变

可通过突变向核酸中引入变化，从而导致其编码的多肽(例如，抗体或抗体衍生物)的氨基酸序列发生变化。可使用本领域已知的任何技术引入突变在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案改变一个或多个特定的氨基酸残基。在另一个实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。无论如何制备，突变多肽都可被表达并被筛选出所需的特性。

突变可被被引入到核酸中，而不会显著改变其编码的多肽的生物活性。例如，可以进行核苷酸取代，导致非必需氨基酸残基的氨基酸取代。或者，可向核酸中引入一个或多个突变，所述突变选择性地改变其编码的多肽的生物活性。参见，例如，Romain Studer等人，Biochem.J.449:581-594(2013)。例如，突变可以定量或定性地改变生物活性。数量变化的实例包括增强、降低或消除活性。定性变化的实例包括改变抗体的抗原特异性。

III.无限免疫细胞

本公开的某些实施方案涉及被工程改造以表达一种或多种基因的免疫细胞。与缺乏一种或多种基因表达的细胞相比，一种或多种基因的表达直接或间接导致细胞寿命延长。在特定的实施方案中，操作细胞以表达所述一种或多种基因，包括一种或多种异源基因。在其它情况下，操纵细胞(诸如通过操纵一种或多种细胞内源基因的一种或多种调控元件)以上调一种或多种细胞内源基因的表达。

在特定的实施方案中，操纵免疫细胞以表达BCL6和一种或多种促存活基因或抗凋亡基因或细胞存活促进基因(并且在被分类为促存活或抗凋亡或细胞存活促进的基因中可以存在或可以不存在重叠)。如本文中所用，促存活基因是指可以通过任何机制发挥抗凋亡功能或促进存活的核酸聚合物。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以是Bcl2家族基因中的一种或多种，诸如BCL-xL、BCL-2、MCL-1、Bcl-w、Bfl-1、BCL-B等。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以是凋亡抑制剂(IAP)家族基因中的一种或多种，诸如XIAP、c-IAPl、C-IAP2、NAIP、生存素等。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以能够抑制或敲除在凋亡中起作用的一种或多种胱天蛋白酶诸如胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-10、胱天蛋白酶-11、胱天蛋白酶-12、胱天蛋白酶-13、胱天蛋白酶-14的表达。用于敲低或敲除的核酸聚合物可以是shRNA表达盒，或者这些胱天蛋白酶基因也可通过基因编辑方法(CRISPR、TALEN、锌指方法等)敲除。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可以能够抑制或敲除一种或多种促凋亡基因诸如BIM、Puma、Noxa、Bik、Bmf、Bad、Hrk、Bid、BAX、BAK、BOK等的表达。能够发挥抗凋亡功能的核酸聚合物可具有抗凋亡作用，诸如胰岛素样生长因子(IGF-1)、Hsp70、Hsp27、cFLIP、BNIP3、FADD、Akt和NF-κB、Raf-1和MEK1、p90Rsk、C-Jun、BNIP2、BAG1、HSPA9、HSP90B1、miRNA21、miR-106b-25、miR-206、miR-221/222、miR-17-92、miR-133、miR-143、miR-145、miR-155、miR-330等。

可用野生型或突变型BCL6产生无限T细胞。本发明人确定，无限T细胞可以用野生型BCL6或具有单个特定核苷酸差异的突变型BCL6产生无限T细胞-野生型BCL6中位置395处的氨基酸的密码子是CCT(编码脯氨酸/P)，而突变型BCL6中位置395处的氨基酸的密码子是CTT(编码亮氨酸/L)。两个BCL6基因的核苷酸和氨基酸序列如下所示(其中野生型序列中的突变点用下划线标出)。

野生型BCL6的氨基酸序列：

MASPADSCIQFTRHASDVLLNLNRLRSRDILTDVVIVVSREQFRAHKTVLMACSGLFYSIFTDQLKCNLSVINLDPEINPEGFCILLDFMYTSRLNLREGNIMAVMATAMYLQMEHVVDTCRKFIKASEAEMVSAIKPPREEFLNSRMLMPQDIMAYRGREVVENNLPLRSAPGCESRAFAPSLYSGLSTPPASYSMYSHLPVSSLLFSDEEFRDVRMPVANPFPKERALPCDSARPVPGEYSRPTLEVSPNVCHSNIYSPKETIPEEARSDMHYSVAEGLKPAAPSARNAPYFPCDKASKEEERPSSEDEIALHFEPPNAPLNRKGLVSPQSPQKSDCQPNSPTESCSSKNACILQASGSPPAKSPTDPKACNWKKYKFIVLNSLNQNAKPEGPEQAELGRLSPRAYTAPPACQPPMEPENLDLQSPTKLSASGEDSTIPQASRLNNIVNRSMTGSPRSSSESHSPLYMHPPKCTSCGSQSPQHAEMCLHTAGPTFPEEMGETQSEYSDSSCENGAFFCNECDCRFSEEASLKRHTLQTHSDKPYKCDRCQASFRYKGNLASHKTVHTGEKPYRCNICGAQFNRPANLKTHTRIHSGEKPYKCETCGARFVQVAHLRAHVLIHTGEKPYPCEICGTRFRHLQTLKSHLRIHTGEKPYHCEKCNLHFRHKSQLRLHLRQKHGAITNTKVQYRVSATDLPPELPKAC(SEQ ID NO:43)

野生型BCL6的核苷酸序列(其中野生型序列中突变点的密码子用下划线标出)：

ATGgcctcgccggctgacagctgtatccagttcacccgccatgccagtgatgttcttctcaaccttaatcgtctccggagtcgagacatcttgactgatgttgtcattgttgtgagccgtgagcagtttagagcccataaaacggtcctcatggcctgcagtggcctgttctatagcatctttacagaccagttgaaatgcaaccttagtgtgatcaatctagatcctgagatcaaccctgagggattctgcatcctcctggacttcatgtacacatctcggctcaatttgcgggagggcaacatcatggctgtgatggccacggctatgtacctgcagatggagcatgttgtggacacttgccggaagtttattaaggccagtgaagcagagatggtttctgccatcaagcctcctcgtgaagagttcctcaacagccggatgctgatgccccaagacatcatggcctatcggggtcgtgaggtggtggagaacaacctgccactgaggagcgcccctgggtgtgagagcagagcctttgcccccagcctgtacagtggcctgtccacaccgccagcctcttattccatgtacagccacctccctgtcagcagcctcctcttctccgatgaggagtttcgggatgtccggatgcctgtggccaaccccttccccaaggagcgggcactcccatgtgatagtgccaggccagtccctggtgagtacagccggccgactttggaggtgtcccccaatgtgtgccacagcaatatctattcacccaaggaaacaatcccagaagaggcacgaagtgatatgcactacagtgtggctgagggcctcaaacctgctgccccctcagcccgaaatgccccctacttcccttgtgacaaggccagcaaagaagaagagagaccctcctcggaagatgagattgccctgcatttcgagccccccaatgcacccctgaaccggaagggtctggttagtccacagagcccccagaaatctgactgccagcccaactcgcccacagagtcctgcagcagtaagaatgcctgcatcctccaggcttctggctcccctccagccaagagccccactgaccccaaagcctgcaactggaagaaatacaagttcatcgtgctcaacagcctcaaccagaatgccaaaccagaggggcCtgagcaggctgagctgggccgcctttccccacgagcctacacggccccacctgcctgccagccacccatggagcctgagaaccttgacctccagtccccaaccaagctgagtgccagcggggaggactccaccatcccacaagccagccggctcaataacatcgttaacaggtccatgacgggctctccccgcagcagcagcgagagccactcaccactctacatgcaccccccgaagtgcacgtcctgcggctctcagtccccacagcatgcagagatgtgcctccacaccgctggccccacgttccctgaggagatgggagagacccagtctgagtactcagattctagctgtgagaacggggccttcttctgcaatgagtgtgactgccgcttctctgaggaggcctcactcaagaggcacacgctgcagacccacagtgacaaaccctacaagtgtgaccgctgccaggcctccttccgctacaagggcaacctcgccagccacaagaccgtccataccggtgagaaaccctatcgttgcaacatctgtggggcccagttcaaccggccagccaacctgaaaacccacactcgaattcactctggagagaagccctacaaatgcgaaacctgcggagccagatttgtacaggtggcccacctccgtgcccatgtgcttatccacactggtgagaagccctatccctgtgaaatctgtggcacccgtttccggcaccttcagactctgaagagccacctgcgaatccacacaggagagaaaccttaccattgtgagaagtgtaacctgcatttccgtcacaaaagccagctgcgacttcacttgcgccagaagcatggcgccatcaccaacaccaaggtgcaataccgcgtgtcagccactgacctgcctccggagctccccaaagcctgc(SEQ ID NO:44)

突变体BCL6的氨基酸序列(亮氨酸突变用下划线标出)：

MASPADSCIQFTRHASDVLLNLNRLRSRDILTDVVIVVSREQFRAHKTVLMACSGLFYSIFTDQLKCNLSVINLDPEINPEGFCILLDFMYTSRLNLREGNIMAVMATAMYLQMEHVVDTCRKFIKASEAEMVSAIKPPREEFLNSRMLMPQDIMAYRGREVVENNLPLRSAPGCESRAFAPSLYSGLSTPPASYSMYSHLPVSSLLFSDEEFRDVRMPVANPFPKERALPCDSARPVPGEYSRPTLEVSPNVCHSNIYSPKETIPEEARSDMHYSVAEGLKPAAPSARNAPYFPCDKASKEEERPSSEDEIALHFEPPNAPLNRKGLVSPQSPQKSDCQPNSPTESCSSKNACILQASGSPPAKSPTDPKACNWKKYKFIVLNSLNQNAKPEGLEQAELGRLSPRAYTAPPACQPPMEPENLDLQSPTKLSASGEDSTIPQASRLNNIVNRSMTGSPRSSSESHSPLYMHPPKCTSCGSQSPQHAEMCLHTAGPTFPEEMGETQSEYSDSSCENGAFFCNECDCRFSEEASLKRHTLQTHSDKPYKCDRCQASFRYKGNLASHKTVHTGEKPYRCNICGAQFNRPANLKTHTRIHSGEKPYKCETCGARFVQVAHLRAHVLIHTGEKPYPCEICGTRFRHLQTLKSHLRIHTGEKPYHCEKCNLHFRHKSQLRLHLRQKHGAITNTKVQYRVSATDLPPELPKAC(SEQ ID NO:45)

突变型BCL6的核苷酸序列(亮氨酸的密码子用下划线标出)：

ATGgcctcgccggctgacagctgtatccagttcacccgccatgccagtgatgttcttctcaaccttaatcgtctccggagtcgagacatcttgactgatgttgtcattgttgtgagccgtgagcagtttagagcccataaaacggtcctcatggcctgcagtggcctgttctatagcatctttacagaccagttgaaatgcaaccttagtgtgatcaatctagatcctgagatcaaccctgagggattctgcatcctcctggacttcatgtacacatctcggctcaatttgcgggagggcaacatcatggctgtgatggccacggctatgtacctgcagatggagcatgttgtggacacttgccggaagtttattaaggccagtgaagcagagatggtttctgccatcaagcctcctcgtgaagagttcctcaacagccggatgctgatgccccaagacatcatggcctatcggggtcgtgaggtggtggagaacaacctgccactgaggagcgcccctgggtgtgagagcagagcctttgcccccagcctgtacagtggcctgtccacaccgccagcctcttattccatgtacagccacctccctgtcagcagcctcctcttctccgatgaggagtttcgggatgtccggatgcctgtggccaaccccttccccaaggagcgggcactcccatgtgatagtgccaggccagtccctggtgagtacagccggccgactttggaggtgtcccccaatgtgtgccacagcaatatctattcacccaaggaaacaatcccagaagaggcacgaagtgatatgcactacagtgtggctgagggcctcaaacctgctgccccctcagcccgaaatgccccctacttcccttgtgacaaggccagcaaagaagaagagagaccctcctcggaagatgagattgccctgcatttcgagccccccaatgcacccctgaaccggaagggtctggttagtccacagagcccccagaaatctgactgccagcccaactcgcccacagagtcctgcagcagtaagaatgcctgcatcctccaggcttctggctcccctccagccaagagccccactgaccccaaagcctgcaactggaagaaatacaagttcatcgtgctcaacagcctcaaccagaatgccaaaccagaggggcTtgagcaggctgagctgggccgcctttccccacgagcctacacggccccacctgcctgccagccacccatggagcctgagaaccttgacctccagtccccaaccaagctgagtgccagcggggaggactccaccatcccacaagccagccggctcaataacatcgttaacaggtccatgacgggctctccccgcagcagcagcgagagccactcaccactctacatgcaccccccgaagtgcacgtcctgcggctctcagtccccacagcatgcagagatgtgcctccacaccgctggccccacgttccctgaggagatgggagagacccagtctgagtactcagattctagctgtgagaacggggccttcttctgcaatgagtgtgactgccgcttctctgaggaggcctcactcaagaggcacacgctgcagacccacagtgacaaaccctacaagtgtgaccgctgccaggcctccttccgctacaagggcaacctcgccagccacaagaccgtccataccggtgagaaaccctatcgttgcaacatctgtggggcccagttcaaccggccagccaacctgaaaacccacactcgaattcactctggagagaagccctacaaatgcgaaacctgcggagccagatttgtacaggtggcccacctccgtgcccatgtgcttatccacactggtgagaagccctatccctgtgaaatctgtggcacccgtttccggcaccttcagactctgaagagccacctgcgaatccacacaggagagaaaccttaccattgtgagaagtgtaacctgcatttccgtcacaaaagccagctgcgacttcacttgcgccagaagcatggcgccatcaccaacaccaaggtgcaataccgcgtgtcagccactgacctgcctccggagctccccaaagcctgc(SEQ ID NO:46)

免疫细胞可以是任何种类的免疫细胞，包括T细胞(例如，调节性T细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、αβT细胞、γ-δT细胞或其混合物)、NK细胞、恒定NKT细胞、NKT细胞、先天淋巴细胞或其混合物。免疫细胞可以是病毒特异性的，表达CAR，和/或表达TCR。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如髓样细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞(DC)、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。本文还提供了生产和工程改造免疫细胞的方法，以及使用和施用用于过继细胞治疗的细胞的方法，在这种情况下，细胞可以是自体的或同种异体的。因此，免疫细胞可用作免疫疗法，诸如以靶向癌细胞。这些免疫细胞可以作为单一细胞类型或多种免疫细胞类型的组合用于治疗。在具体实施方案中，免疫细胞是CD3+、CD4+、CD8+、CD16+或其混合物。

免疫细胞可从受试者，特别是人受试者中分离。免疫细胞可获自目标受试者，诸如怀疑患有特定疾病或疾患的受试者、怀疑具有特定疾病或疾患倾向的受试者、或正在接受特定疾病或疾患的疗法的受试者。免疫细胞可以从它们在受试者中存在的任何位置收集，所述位置包括但不限于血液、脐带血、脾、胸腺、淋巴结和骨髓。分离的免疫细胞可以直接使用，或者可以诸如通过冷冻储存一段时间。

免疫细胞可从其所在的任何组织中富集/纯化，所述组织包括但不限于血液(包括由血库或脐带血库收集的血液)、脾、骨髓、手术过程中取出和/或暴露的组织以及通过活检过程获得的组织。从中富集、分离和/或纯化免疫细胞的组织/器官可以从活体和非活体受试者中分离，其中非活体受试者是器官供体。在特定的实施方案中，免疫细胞从血液诸如外周血或脐带血中分离。在一些方面，从脐带血分离的免疫细胞具有增强的免疫调节能力，诸如通过CD4-或CD8-阳性T细胞抑制所测量的。在具体方面，免疫细胞从合并的血液，特别是合并的脐带血中分离，用于增强的免疫调节能力。合并的血液可来自2个或更多个来源，例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个来源(例如，供体受试者)。

免疫细胞群可获自需要治疗或患有与免疫细胞活性降低相关的疾病的受试者。因此，这些细胞对于需要治疗的受试者来说是自体的。或者，免疫细胞群可获自供体，诸如部分或完全组织相容性匹配的供体或完全组织相容性错配的供体。可从外周血、脐带血、骨髓、脾或免疫细胞在其中存在于所述受试者或供体中的任何其它器官/组织中收获免疫细胞群。免疫细胞可从受试者和/或供体的集合中分离，例如从合并的脐带血中分离。

当从不同于受试者的供体获得免疫细胞群时，供体可以是同种异体的，只要获得的细胞是受试者相容的即可，因为它们可以被引入受试者。同种异体供体细胞可以与人白细胞抗原(HLA)相容，也可以不与人白细胞抗原相容。

PCT专利申请公开号WO/2021/034982(通过引用以其整体并入本文)中描述了与无限免疫细胞相关的其它方法和组合物。

A.T细胞

在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在过去的二十年中，已经描述了几种用于功能性抗肿瘤效应细胞的衍生、活化和扩增的基本方法。这些包括：自体细胞，诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；使用自体DC或PBMC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或包被有T细胞配体和活化抗体的珠粒或通过捕获靶细胞膜分离的细胞离体活化的T细胞；天然表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；和非肿瘤特异性自体或同种异体细胞，其被基因重新编程或“重定向”以表达展示抗体样肿瘤识别能力的肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子，被称为“T-体”。这些方法已经产生了许多用于T细胞制备和免疫的方案，所述方案可用于本文所述的方法中。

在一些实施方案中，T细胞来源于血液、骨髓、淋巴、脐带或淋巴器官。在某些方面，细胞是人细胞。细胞通常是原代细胞，诸如直接从受试者分离的细胞和/或从受试者分离并冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其它细胞类型的一个或多个亚群，诸如完整的T细胞群、CD4⁺细胞、CD8⁺细胞及其亚群，诸如由功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌谱和/或分化程度所定义的那些。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在一些方面，诸如对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，诸如干细胞，诸如诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者中分离细胞，如本文所述制备、加工、培养和/或工程改造它们，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一患者体内。

在T细胞(例如CD4⁺和/或CD8⁺ T细胞)的亚型和亚群中，有初始T(T_N)细胞、效应T细胞(T_EFF)、记忆T细胞及其亚型，诸如干细胞记忆T细胞(TSC_M)、中枢记忆T细胞(TC_M)、效应记忆T细胞(T_EM)或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在的和适应性调节性T细胞(Treg)细胞、辅助T细胞，诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞和γ/δT细胞。

在一些实施方案中，一种或多种T细胞群富集或耗竭对特定标志物诸如表面标志物呈阳性的细胞，或对特定标志物呈阴性的细胞。在一些情况下，此类标志物是在某些T细胞群(例如，非记忆细胞)中不存在或以相对低的水平表达，但在某些其它T细胞群(例如，记忆细胞)中存在或以相对高的水平表达的那些标志物。

在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(诸如B细胞、单核细胞或其它白细胞，诸如CD14)上表达的标志物，从PBMC样品中分离T细胞。在一些方面，CD4⁺或CD8⁺选择步骤用于分离CD4⁺辅助细胞T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞。可通过对在一种或多种初始、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或表达程度相对较高的标志物进行阳性或阴性选择来将此类CD4⁺和CD8⁺群进一步分类为亚群。

在一些实施方案中，诸如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择进一步富集CD8⁺ T细胞，或耗竭初始、中枢记忆、效应记忆和/或中枢记忆干细胞。在一些实施方案中，对中枢记忆T(T_CM)细胞或干细胞记忆细胞进行富集以增加功效，诸如改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在这样的亚群中特别稳健。

在一些实施方案中，T细胞是自体T细胞。在该方法中，从患者获得肿瘤样品，并获得单细胞悬浮液。单细胞悬浮液可以以任何合适的方式获得，例如，以机械方式(使用例如GENTLEMACS^TM解离仪(MiltenyiBiotec,Auburn,Calif.)解散肿瘤)或酶促方式(例如，胶原酶或DNA酶)获得。将肿瘤酶促消化物的单细胞悬浮液在白细胞介素-2(IL-2)或其它生长因子中培养。

可将培养的T细胞合并并快速扩增。在约10至约14天的时间内，快速扩增使抗原特异性T细胞的数量增加至少约50倍(例如，50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍或更多)。更优选地，快速扩增在约10至约14天的时间内提供至少约200倍(例如，200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍或更多)的增加。

扩增可以通过本领域已知的许多方法中的任一种来完成。例如，在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)(其中优选为IL-2)存在的情况下，使用非特异性T细胞受体刺激可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可包括约30ng/ml的OKT3，一种小鼠单克隆抗CD3抗体(可从Raritan,N.J.获得)。或者，可在T细胞生长因子诸如300IU/ml IL-2或IL-15(优选为IL-2)存在的情况下，通过用一种或多种癌症的抗原(包括其抗原部分，诸如一种或多种表位，或细胞)体外刺激外周血单核细胞(PBMC)来快速扩增T细胞，所述抗原可以任选地从载体中表达，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽或与其它I类或II类MHC分子结合的肽。通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞或表达其它HLA分子的抗原呈递细胞上的一种或多种相同的癌症抗原再次刺激来快速扩增体外诱导的T细胞。也可以在抗原呈递细胞不存在的情况下扩增体外诱导的T细胞。

自体T细胞可被修饰以表达促进自体T细胞的生长、分化和活化的T细胞生长或分化因子。合适的T细胞生长因子包括例如白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21和IL-12。合适的修饰方法是本领域已知的。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and John Wiley&Sons,NY,1994。在特定方面，经修饰的自体T细胞高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，诸如IL-12的编码序列，在本领域是容易获得的，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的有效连接促进了高水平表达。

B.NK细胞

在一些实施方案中，免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。NK细胞是对多种肿瘤细胞、病毒感染细胞以及骨髓和胸腺中的一些正常细胞具有自发的细胞毒性的淋巴细胞亚群。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化和成熟。NK细胞可通过人中的特定表面标志物诸如CD16、CD56和/或CD8来检测。NK细胞不表达T细胞抗原受体、泛T标志物CD3(pan Tmarker CD3)或表面免疫球蛋白B细胞受体。

在某些实施方案中，通过本领域熟知的方法，从人外周血单核细胞(PBMC)、未经刺激的白细胞单采术(leukapheresis)产物(PBSC)、人胚胎干细胞(hESC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、骨髓、组织或脐带血衍生出NK细胞。

C.NKT细胞

天然杀伤T(NKT)细胞是共有T细胞和天然杀伤细胞两者的特性的一组异质的T细胞。这些细胞中的许多细胞识别非多态性CD1d分子，这是一种结合自身和外来脂质和糖脂的抗原呈递分子。它们仅占所有外周血T细胞的大约0.1％。NKT细胞是共表达αβT细胞受体，而且还表达多种通常与NK细胞相关的分子标志物诸如NK1.1的T细胞亚群恒定天然杀伤T(iNKT)细胞表达高水平的转录调节剂早幼粒细胞白血病锌指并依赖其进行它们的发育。目前，有五个主要的不同iNKT细胞亚群。一旦被激活，这些亚群细胞产生一组不同的细胞因子。iNKT1、iNKT2和iNKT17亚型反映了细胞因子产生中的Th细胞亚群。另外，还有专门针对T滤泡辅助细胞样功能和IL-10依赖性调节功能的亚型。

D.先天淋巴细胞

先天淋巴细胞(Innate lymphoid cell)(ILC)是一组来源于共同淋巴样祖细胞(CLP)并属于淋巴样谱系(lymphoid lineage)的先天免疫细胞。这些细胞定义为由于缺乏重组激活基因(RAG)而缺乏抗原特异性B或T细胞受体。ILC不表达髓样细胞或树突细胞标志物。它们在保护性免疫以及体内稳态和炎症的调节中发挥作用，因此它们的失调可导致免疫病理，诸如过敏、支气管哮喘和自身免疫性疾病。ILC可以根据它们产生的细胞因子和调节其发育和功能的转录因子来划分。

IV.细胞的配制和培养

在特定的实施方案中，可以特别地配制本公开的细胞和/或可在特定的培养基中培养它们。可以以适于递送至接受者而无有害作用的方式配制细胞。

在某些方面，可使用用于培养动物细胞的培养基(诸如AIM V、X-VIVO-15、NeuroBasal、EGM2、TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、Improved MEM Zinc Option、IMDM、Medium 199、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI-1640和费歇尔培养基中的任一种，以及其任意组合)作为它们的基础培养基来制备培养基，但是只要培养基可用于动物细胞的培养基，其就可以不特别地限于此。特别地，培养基可以是无异种的或化学成分确定的。

培养基可以是含血清或无血清的培养基，或无异种的培养基。从防止异种动物来源组分污染的角度来看，血清可来源于与一种或多种干细胞的来源动物相同的动物。无血清培养基是指不含未加工或未纯化的血清的培养基，因此可以包括含有纯化的血液来源组分或动物组织来源组分(诸如生长因子)的培养基。

培养基可以包含或可以不包含血清的任何替代品。血清的替代品可包括适当地含有白蛋白(诸如富脂白蛋白、牛白蛋白、白蛋白替代品诸如重组白蛋白或人源化白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解产物)、转铁蛋白(或其它铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-巯基甘油或其等同物的材料。血清的替代品可以通过例如国际公开号98/30679(以其整体并入本文)中公开的方法来制备。或者，为了更方便起见，可以使用任何商购可得的材料。商购可得的材料包括KNOCKOUT^TM血清替代物(KSR)、化学成分明确的脂质浓缩物(GIBCO^TM)和GLUTAMAX^TM(GIBCO^TM)。

在某些实施方案中，培养基可包含以下的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种或更多种：维生素，诸如生物素；DLα生育酚醋酸酯；DLα-生育酚；维生素A(醋酸酯)；蛋白质，诸如BSA(牛血清白蛋白)或人白蛋白，不含脂肪酸的级分V；过氧化氢酶；人重组胰岛素；人转铁蛋白；超氧化物歧化酶；其它组分诸如皮质酮；D-半乳糖；乙醇胺盐酸盐；谷胱甘肽(还原型)；L-肉碱盐酸盐；亚油酸；亚麻酸；黄体酮；腐胺2HCl；亚硒酸钠；和/或T3(三碘甲腺原氨酸(triodo-I-thyronine))。在特定实施方案中，这些中的一种或多种可以被明确排除。

在一些实施方案中，培养基还包含维生素。在一些实施方案中，所述培养基包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13种以下物质(以及其间任何可衍化的范围)：生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇、维生素B12，或者所述培养基包含其组合或其盐。在一些实施方案中，培养基包含生物素、DLα生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A、氯化胆碱、泛酸钙、泛酸、叶酸烟酰胺、吡哆醇、核黄素、硫胺素、肌醇和维生素B12或基本由其组成。在一些实施方案中，维生素包括生物素、DLα-生育酚乙酸酯、DLα-生育酚、维生素A或其组合或盐，或基本由其组成。在一些实施方案中，培养基还包含蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质包括白蛋白或牛血清白蛋白、BSA的一部分、过氧化氢酶、胰岛素、转铁蛋白、超氧化物歧化酶或其组合。在一些实施方案中，培养基还包含以下物质的一种或多种：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘甲腺原氨酸或其组合。在一些实施方案中，培养基包含以下物质的一种或多种：补充剂、无异种B-27^TM补充剂、GS21^TM补充剂或其组合。在一些实施方案中，培养基包含或还包含氨基酸、单糖、无机离子。在一些实施方案中，氨基酸包括精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸或其组合。在一些实施方案中，无机离子包括钠、钾、钙、镁、氮或磷，或其组合或盐。在一些实施方案中，培养基还包含以下的一种或多种：钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰或其组合。在某些实施方案中，培养基包含本文所述的一种或多种维生素和/或本文所述的一种或多种蛋白质和/或以下物质的一种或多种：皮质酮、D-半乳糖、乙醇胺、谷胱甘肽、L-肉碱、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺、亚硒酸钠或三碘甲腺原氨酸、B-27^TM补充剂、无异种B-27^TM补充剂、GS21^TM补充剂、氨基酸(诸如精氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸或缬氨酸)、单糖、无机离子(诸如钠、钾、钙、镁、氮和/或磷)或其盐和/或钼、钒、铁、锌、硒、铜或锰，或基本上由其组成。在特定实施方案中，这些中的一种或多种可以被明确排除。

培养基还可包含一种或多种外部添加的脂肪酸或脂质、氨基酸(诸如非必需氨基酸)、一种或多种维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和/或无机盐。在特定实施方案中，这些中的一种或多种可以被明确排除。

可以以至少、最多或约0.1、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、180、200、250ng/L、ng/ml、μg/ml、mg/ml或其间任何可衍化的范围的浓度加入一种或多种培养基组分。

在具体实施方案中，特别地配制本公开的细胞。可将它们配制成细胞悬浮液或可以不将它们配制成细胞悬浮液。在特定情况下，它们被配制成单一剂型。它们可被配制用于全身或局部施用。在一些情况下，在使用前配制细胞用于储存，并且细胞制剂可包含一种或多种冷冻保存剂，诸如DMSO(例如，在5％DMSO中)。细胞制剂可包含白蛋白，包括人白蛋白，其中具体的制剂包含2.5％人白蛋白。细胞可被特别地配制用于静脉内施用；例如，它们被配制用于在不到一小时内进行静脉内施用。在特定的实施方案中，细胞处于配制的细胞悬浮液中，该悬浮液从解冻时起在室温下稳定1、2、3或4小时或更长时间。

在一些实施方案中，本公开的细胞还包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。例如，CAR可针对的肿瘤细胞抗原的实例至少包括5T4、8H9、αvβ6整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、EGFR家族(包括ErbB2(HER2)、EGFRvIII)、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、EPCAM、EphA2、EpCAM、叶酸受体-a、FAP、FBP、胎儿AchR、FR、GD2、G250/CAIX、Gd3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、Her2、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、KDR、MAGE、MCSP、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSC1、PSCA、PSMA、ROR1、SP17、生存素、TAG72、TEMs、癌胚抗原、HMW-MAA、AFP、CA-125、ETA、酪氨酸酶、MAGE、层粘连蛋白受体、HPV E6、E7、BING-4、钙激活氯离子通道2、细胞周期蛋白-B1、9D7、EphA3、端粒酶、SAP-1、BAGE家族、CAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族、XAGE家族、NY-ESO-1/LAGE-1、PAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、GP100/pmel17、TRP-1/-2、P.多肽、MC1R、前列腺特异性抗原、β-连环蛋白、BRCA1/2,CML66、纤连蛋白、MART-2、TGF-βRII或VEGF受体(例如，VEGFR2)。CAR可以是第一代、第二代、第三代或更多代CAR。CAR可以对任何两种不同抗原具有双特异性，或者其对超过两种不同的抗原具有特异性。

在一些实施方案中，本公开的细胞包含一种或多种嵌合多肽。细胞可包含本公开的嵌合多肽以及嵌合抗原受体、T细胞受体和/或其它工程化的受体或分子。在一些实施方案中，本公开的细胞包含1、2、3、4或5种嵌合多肽，或更多种嵌合多肽。

V.嵌合抗原受体

本公开的某些实施方案涉及嵌合抗原受体(CAR)、包含一种或多种CAR的细胞及其使用方法。

A.信号肽

本公开的多肽可以包含信号肽。“信号肽”是指指导蛋白质在细胞内转运和定位至例如某个细胞器(诸如内质网)和/或细胞表面的肽序列。在一些实施方案中，信号肽将新生蛋白质引导至内质网中。如果受体要被糖基化并锚定在细胞膜中，这是必不可少的。通常，使用天然附接于最氨基端组分的信号肽(例如，在具有取向轻链-接头-重链的scFv中，使用轻链的天然信号)。

在一些实施方案中，信号肽在通过内质网(ER)后被切割，即，是可切割的信号肽。在一些实施方案中，限制性位点位于信号肽的羧基末端，以便于切割。

B.抗原结合结构域

本公开的多肽可包含一个或多个抗原结合结构域。“抗原结合结构域”描述在适当条件下能够结合抗原的多肽的区域。在一些实施方案中，抗原结合结构域是基于一种或多种抗体的单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含可变重(VH)区和可变轻(VL)区，其中VH区和VL区在同一多肽上。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含VH与VL区之间的接头。接头可使抗原结合结构域能够形成抗原结合所需的结构。

可通过突变VH和/或VL CDR 1、CDR 2和/或CDR 3区内的氨基酸残基来修饰本公开的多肽的抗原结合结构域的可变区，以改善抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。术语“CDR”是指互补决定区，其基于分别由B细胞和T细胞产生的免疫球蛋白(抗体)和T细胞受体中可变链的一部分，其中这些分子与其特异性抗原结合。由于大多数与免疫球蛋白和T细胞受体相关的序列变异是在CDR中发现的，因此这些区域有时被称为高变区。可通过定点诱变或PCR介导的诱变来引入突变，并且可在适当的体外或体内测定中评估对抗体结合或其它目标功能特性的影响。优选引入保守修饰，并且通常改变CDR区内不超过1、2、3、4或5个残基。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。

可以例如通过将一个或多个框架残基“回复突变”到相应的种系序列来对抗体进行框架修饰以降低免疫原性。

还设想了，可通过用结合相同抗原(多价的)或不同抗原(多特异性的)的VH和VL区对将抗原结合结构域多聚化而使抗原结合结构域为多特异性的或多价的。

抗原结合区(诸如可变区(重链和/或轻链可变区))或CDR的结合亲和力可以至少为10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10^-13M。在一些实施方案中，抗原结合区(诸如可变区(重链和/或轻链可变区))或CDR的KD可以至少为10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或10^-13M(或其中任何可衍化的范围)。

结合亲和力KA或KD可通过本领域已知的方法，诸如通过基于表面等离子体共振(SRP)的生物传感器、通过动力学排阻分析(KinExA)、通过基于偏振调制的倾斜入射反射率差(OI-RD)的用于微阵列检测的光学扫描仪或通过ELISA来测定。

在一些实施方案中，与包含非人源化结合区诸如来自小鼠的结合区的多肽相比，包含人源化结合区的多肽具有等于、好于或至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、104％、106％、106％、108％、109％、110％、115％或120％的宿主细胞中的结合亲和力和/或表达水平。

在一些实施方案中，相对于小鼠框架区，人框架的框架区，诸如FR1、FR2、FR3和/或FR4可以各自或共同具有至少、至多或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个(或其间任何可衍化的范围)氨基酸取代、连续氨基酸添加或连续氨基酸缺失。

在一些实施方案中，相对于人框架，小鼠标框架的框架区诸如FR1、FR2、FR3和/或FR4可以各自或共同具有至少、至多或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个(或其间任何可衍化的范围)氨基酸取代、连续氨基酸添加或连续氨基酸缺失。

所述取代可在重链或轻链可变区的FR1、FR2、FR3或FR4的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100上。

C.肽间隔区

肽间隔区，诸如胞外间隔区，可以将抗原结合结构域与跨膜结构域连接。在一些实施方案中，肽间隔区具有足够的柔性，以允许抗原结合结构域在不同方向上定向，从而促进抗原结合。在一个实施方案中，间隔区包含来自IgG的铰链区。在一些实施方案中，间隔区包含或还包含免疫球蛋白的CH2CH3区和CD3的部分。在一些实施方案中，CH2CH3区可具有L235E/N297Q或L235D/N297Q修饰，或至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％的CH2CH3区的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，间隔区来自IgG4。胞外间隔区可包含铰链区。

如本文中所用，术语“铰链”是指为侧翼多肽区提供结构柔性和间隔的柔性多肽连接子区域(本文也称为“铰链区”)，并且可由天然或合成多肽组成。源自免疫球蛋白(例如，IgG1)的“铰链”通常被定义为从人IgG1的Glu216延伸至Pro230(Burton(1985)Molec.Immunol.,22:161-206)。通过将形成重链间二硫键(S-S)的第一个和最后一个半胱氨酸残基放置在相同的位置，可以将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对。铰链区可以是天然存在的或非天然存在的，包括但不限于美国专利第5,677,425号(通过引用并入本文)中描述的改变的铰链区。铰链区可包括源自与CH1结构域的类别或亚类不同的类别或亚类的抗体的完整铰链区。术语“铰链”也可包括源自CD8和其它受体的区域，所述受体在向侧翼区域提供柔性和间隔方面提供类似的功能。

胞外间隔区的长度可为至少、最多或正好4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、20、25、30、35、40、45、50、75、100、110、119、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、290、300、325、350个或400个氨基酸(或其间任何可衍化的范围)。在一些实施方案中，胞外间隔区由来自免疫球蛋白(例如，IgG)的铰链区组成或包含该铰链区。免疫球蛋白铰链区氨基酸序列是本领域已知的；参见，例如，Tan等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:162；和Huck等人(1986)Nucl.Acids Res.

胞外间隔区的长度可影响CAR的信号传导活性和/或CAR-T细胞响应于抗原刺激的CAR信号传导的扩增特性。在一些实施方案中，使用较短的间隔区(诸如少于50、45、40、30、35、30、25、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸)。在一些实施方案中，更长的间隔区，例如至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280或290个氨基酸的间隔区可具有增强的体内或体外扩增的有利方面。

当胞外间隔区包含多个部分时，在各个部分之间可以有0至50个氨基酸。例如，在铰链与CH2区或CH3区之间或CH2区与CH3区之间(当两者都存在时)可存在至少、至多或正好0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个氨基酸(或其间任何可衍化的范围)在一些实施方案中，胞外间隔区基本上由铰链区、CH2区和/或CH3区组成，这意味着铰链区、CH2区和/或CH3区是唯一存在的可鉴定的区域，所有其它结构域或区域都被排除在外，但可能存在不属于可鉴定的区域的其它氨基酸。

D.跨膜结构域

本公开的多肽可包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域是跨越膜的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域可导致不同的受体稳定性。

在一些实施方案中，跨膜结构域介于胞外间隔区与胞质区之间。在一些实施方案中，跨膜结构域介于胞外间隔区与一个或多个共刺激区之间。在一些实施方案中，接头位于跨膜结构域与一个或多个共刺激区域之间。

任何将多肽插入真核(例如，哺乳动物)细胞的细胞膜的跨膜结构域均可适于使用。在一些实施方案中，跨膜结构域源自CD28、CD8、CD4、CD3-ζ(CD3ζ)、CD134或CD7。

E.胞质区

在抗原识别后，本公开的受体可以聚集，并且信号通过胞质区传递到细胞。在一些实施方案中，本文所述的共刺激结构域是胞质区的一部分。在一些实施方案中，胞质区包含胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域可包含初级信号传导结构域和一个或多个共刺激结构域。

适用于本公开的多肽的胞质区和/或共刺激区包括任何所需的信号传导结构域，其通过抗原与抗原结合结构域结合的方式提供响应于活化的独特且可检测的信号(例如，细胞产生的一种或多种细胞因子的增加；靶基因转录的改变；蛋白活性的改变；细胞行为(例如，细胞死亡)的改变；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导反应的调节等)。在一些实施方案中，胞质区包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)如本文所述的ITAM基序。在一些实施方案中，胞质区包括DAP10/CD28型信号传导链。

适用于本公开的多肽的胞质区包括含免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-based activation motif)(ITAM)的胞内信号传导多肽。ITAM基序是YX1X2(L/I)，其中X1和X2独立地是任何氨基酸。在一些情况下，胞质区包含1、2、3、4或5个ITAM基序。在一些情况下，ITAM基序在内结构域(endodomain)中重复两次，其中ITAM基序的第一和第二实例彼此相隔6至8个氨基酸，例如(YX1X2(L/I))(X3)n(YX1X2(L/I))，其中n是6至8的整数，并且6-8个X3中的每一个可以是任意氨基酸。

合适的胞质区可以是含有ΓΓΑΜ基序的部分，其源自含有ITAM基序的多肽。例如，合适的胞质区可以是来自任何含ITAM基序的蛋白质的含ITAM基序的结构域。因此，合适的内结构域不需要包含其所源自的完整蛋白质的完整序列。合适的含ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12、DAP10、FCER1G(Fcε受体Iγ链)；CD3D(CD3δ)；CD3E(CD3ε)；CD3G(CD3γ)；CD3-ζ；和CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。

示例性的胞质区是本领域已知的。下面显示的胞质区也提供了可掺入本公开的CAR中的区域的实例：

在一些实施方案中，合适的胞质区可包含全长DAP12氨基酸序列的含ITAM基序的部分。在一些实施方案中，胞质区源自FCER1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRIγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚单位γ；免疫球蛋白E受体的高亲和力γ链；等)。在一些实施方案中，合适的胞质区可包含全长FCER1G氨基酸序列的含ITAM基序的部分。

在一些实施方案中，胞质区源自T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3D；CD3-δ；T3D；CD3抗原δ亚单位；CD3δ；CD3δ；CD3d抗原δ多肽(TiT3复合物)；OKT3δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链；等)。在一些实施方案中，合适的胞质区可包含全长CD3δ氨基酸序列的含ITAM基序的部分。在一些实施方案中，胞质区源自T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3e、CD3ε；T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3-ε、T3e等)。在一些实施方案中，合适的胞质区可包含全长CD3ε氨基酸序列的含ITAM基序的部分。在一些实施方案中，胞质区源自T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3G、CD3γ、T细胞受体T3γ链、CD3-γ、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。在一些实施方案中，合适的胞质区可包含全长CD3γ氨基酸序列的含ITAM基序的部分。在一些实施方案中，胞质区源自T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、CD3γ、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ζ、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一些实施方案中，合适的胞质区可包含全长CD3ζ氨基酸序列的含ITAM基序的部分。

在一些实施方案中，胞质区源自CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白等)。在一些实施方案中，合适的胞质区可包含全长CD79A氨基酸序列的含ITAM基序的部分。

F.共刺激区

合适的共刺激区域的非限制性实例，诸如包含在胞质区中的那些，包括但不限于来自4-lBB(CD137)、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR和HVEM的多肽。

共刺激区可具有至少、至多或正好20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或300个氨基酸或其间任何可衍化的范围的长度。在一些实施方案中，共刺激区源自跨膜蛋白4-1BB(也称为TNFRSF9、CD137、CDwl37、ILA等)的胞内部分。在一些实施方案中，共刺激区源自跨膜蛋白CD28(也称为Tp44)的细胞内部分。在一些实施方案中，共刺激区域源自跨膜蛋白ICOS(也称为AILIM、CD278和CVID1)的细胞内部分。在一些实施方案中，共刺激区源自跨膜蛋白OX-40(也称为TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX40、TXGP1L)的胞内部分。在一些实施方案中，共刺激区源自跨膜蛋白BTLA(也称为BTLA1和CD272)的胞内部分。在一些实施方案中，共刺激区源自跨膜蛋白CD27(也称为S152、T14、TNFRSF7和Tp55)的胞内部分。在一些实施方案中，共刺激区源自跨膜蛋白CD30(也称为TNFRSF8、D1S166E和Ki-1)的胞内部分。在一些实施方案中，共刺激区源自跨膜蛋白GITR(也称为TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357和GITR-D)的胞内部分。在一些实施方案中，共刺激区源自跨膜蛋白HVEM(也称为TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR和TR2)的胞内部分。

G.检测肽

在一些实施方案中，本文所述的多肽还可包含检测肽。各种合适的检测肽是本领域已知的，并在本文中有所考虑。

H.肽接头

在一些实施方案中，本公开的多肽包括肽接头(有时称为接头)。肽接头可用于分离本文所述的任何肽结构域/区域。例如，接头可以在信号肽与抗原结合结构域之间，在抗原结合结构域的VH与VL之间，在抗原结合结构域与肽间隔区之间，在肽间隔区与跨膜结构域之间，在共刺激区的侧翼或在共刺激区的N-或C-区上，和/或在跨膜结构域与内结构域之间。肽接头可具有多种氨基酸序列中的任一种。结构域和区域可通过通常具有柔性性质的肽接头连接，尽管不排除其它化学键联。接头可以是长度介于约6个与约40个氨基酸之间，或长度介于约6个与约25个氨基酸之间的肽。可通过使用编码合成接头的寡核苷酸偶联蛋白质来产生这些接头。

可使用具有一定柔性的肽接头。肽接头实际上可具有任何氨基酸序列，记住合适的肽接头将具有产生通常柔性的肽的序列。小氨基酸诸如甘氨酸和丙氨酸的使用可用于产生柔性肽。此类序列的产生对本领域技术人员来说是常规的。

合适的接头可被容易地选择，并且可具有任何合适的长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

合适的接头可以容易地选择，并且可具有任何合适的不同长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)到20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

VI.细胞

某些实施方案涉及包含本公开的多肽或核酸的细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞或T细胞。“T细胞”包括所有类型的表达CD3的免疫细胞，包括T辅助细胞、恒定天然杀伤T(iNKT)细胞、细胞毒性T细胞、调节性T细胞(Treg)γ-δT细胞、天然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞。T细胞可以指CD4+T细胞或CD8+T细胞。

合适的哺乳动物细胞包括原代细胞和永生化细胞系。合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类细胞系、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC编号CRL9618、CCL61、CRL9096)、人胚胎肾(HEK)293细胞(例如，ATCC编号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC编号CCL10)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RATI细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、HLHepG2细胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK细胞系(例如，NKL、NK92和YTS)等。

在一些情况下，细胞不是永生化细胞系，而是从个体获得的细胞(例如，原代细胞)。例如，在一些情况下，细胞是从个体获得的免疫细胞。例如，细胞是从个体获得的T淋巴细胞。作为另一个实例，细胞是从个体获得的细胞毒性细胞。作为另一个实例，细胞是从个体获得的干细胞(例如，外周血干细胞)或祖细胞。

VII.细胞因子

在一些实施方案中，本文涵盖的任何细胞可以表达一种或多种异源细胞因子。在具体实施方案中，细胞被工程改造成表达一种或多种异源细胞因子和/或被工程改造成上调一种或多种异源细胞因子的正常表达。可以在或可以不在与其它基因相同的载体上向细胞转导或转染一种或多种细胞因子。在一些情况下，除了一种或多种细胞因子之外，细胞还表达一种或多种异源蛋白质，包括任何种类的嵌合蛋白。作为一个实例，细胞可以表达嵌合抗原受体。

可将一种或多种细胞因子作为与其它蛋白质(包括嵌合多肽和/或CAR)分开的多肽从载体中共表达。例如，白细胞介素-15(IL-15)是组织限制性的，只有在病理条件下才能在血清中或全身观察到任何水平的白细胞介素-15。IL-15具有过继治疗所需的几个属性。IL-15是体内稳态细胞因子，其诱导天然杀伤细胞的发育和细胞增殖，通过减轻肿瘤驻留细胞的功能抑制来促进已形成的肿瘤的根除，并抑制激活诱导的细胞死亡(AICD)。除了IL-15以外，还设想了其它细胞因子。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子和其它有助于用于人应用的细胞的活化和增殖的分子。表达IL-15的NK细胞能够持续支持细胞因子信号传导，这对于它们的输注后存活是有用的。

在具体实施方案中，细胞表达一种或多种外源提供的细胞因子。作为一个实例，细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-23、GMCSF或其组合。另外，或可选地，可将一种或多种细胞因子外源地提供给细胞。在另一种情况下，细胞中的内源细胞因子在操纵内源细胞因子表达的调控(诸如在细胞因子的一个或多个启动子位点处基因重组)时被上调。在将细胞因子在表达构建体上提供给细胞的情况下，细胞因子可由与其它异源蛋白质相同的载体编码。

在一些实施方案中，细胞中使用的异源蛋白质是细胞因子与其受体的至少一部分(包括其受体的部分或全部胞外结构域)的融合物。在特定情况下，将IL-15的部分或全部与IL-15Ra受体的部分或全部(包括IL-15Ra受体的部分或全部胞外结构域，诸如sushi结构域)融合。

VIII.一般药物组合物

在一些实施方案中，向受试者施用药物组合物。不同的方面可涉及向受试者施用有效量的组合物。在一些实施方案中，向受试者施用细胞疗法(例如，CAR T细胞、CAR NK细胞、TCR T细胞等)以预防或治疗疾患(例如，癌症)。另外，可将此类组合物与另外的治疗剂(例如，化学治疗剂、免疫治疗剂、生物治疗剂等)组合施用。通常将此类组合物溶解或分散在药学上可接受的运载体或水性介质中。

短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当向动物或人施用时不会产生不利反应、过敏反应或其它不良反应的分子实体和组合物。如本文中所用，“药学上可接受的运载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除了在任何常规介质或剂与活性成分不相容的情况下之外，设想了其在免疫原性和治疗性组合物中的用途。补充活性成分，诸如其它抗感染剂和疫苗，也可被掺入到组合物中。

活性化合物可被配制成用于肠胃外施用，例如被配制成用于通过静脉内、肌内、皮下或腹膜内途径注射。通常，此类组合物可被制备成液体溶液或悬浮液；也可制备适于在注射前加入液体后用于制备溶液或悬浮液的固体形式；并且，还可以乳化制剂。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；制剂(包括，例如，含水丙二醇)；和用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该剂型必须是无菌的，且必须是达到其可被容易注射的程度的流体。其还应该在生产和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物诸如细菌和真菌的污染作用。

可将蛋白质性质的组合物配制成中性或盐的形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)，其由无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸诸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。

药物组合物可包含含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下保持所需的粒度以及使用表面活性剂来保持。可通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包含等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的剂例如单硬脂酸铝和明胶来实现。

通过以下方式制备无菌注射液：将活性化合物以所需量与上文列举的各种其它成分一起掺入适宜的溶剂中，然后根据需要进行过滤灭菌或等效操作。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散体，所述媒介物包含基本分散介质和上文列举的所需的其它成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分的粉末，加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何额外的所需成分。

通常通过任何常规途径施用组合物。这包括但不限于口服或静脉内施用。或者，施用可以是通过原位、皮内、皮下、肌内、腹膜内或鼻内施用。通常将此类组合物作为包含生理上可接受的运载体、缓冲剂或其它赋形剂的药学上可接受的组合物施用。

配制后，将溶液以与剂型相容的方式并以诸如治疗或预防有效的量施用。制剂易于以多种剂型，诸如上述注射液的类型施用。

IX.作为转导标志物和/或安全开关的嵌合多肽

本公开的实施方案包括可用作转导标志物和/或安全开关的嵌合多肽。例如，可将安全策略与细胞疗法一起使用，作为克服毒性的手段(如果毒性发生的话)。本领域中存在的实例包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/更昔洛韦、诱导型胱天蛋白酶9和截短的EGFR基因(tEGFR)。EGFR基因主要使用抗体依赖性细胞毒性(ADCC)机制来消除治疗性细胞，ADCC需要NK细胞和其它效应细胞的存在，所述效应细胞可能会限制这种安全开关在体内的功效。理想情况下，安全开关将利用ADCC或抗体-药物缀合物(ADC)机制来在体内消除治疗性细胞。ADC方法不需要效应细胞来在体内消除治疗性细胞，因此预计在体内会更有效。另外，例如，tEGRF安全开关在最近接受淋巴细胞清除化疗(lymphodepleting chemotherapy)的患者中可能疗效有限或无效。本公开提供了对细胞疗法安全性领域需求的解决方案。

本公开的实施方案包括与细胞疗法相关的方法和组合物，与非同样产生的细胞疗法相比，所述方法和组合物具有降低的有害作用的风险。在特定的实施方案中，本公开的治疗性细胞至少表达一种蛋白质标志物，其也可用作安全开关，例如在细胞疗法对接受者个体变得有毒的情况下。在一些情况下，蛋白质被用作标志物而不是安全开关，在一些情况下，蛋白质被用作安全开关而不是标志物，在其它情况下，蛋白质被用作标志物和安全开关。在任何毒性发作之前，可以使用或可以不使用标志物监测治疗性细胞。标志物/安全开关也可用于监测细胞的生产和/或细胞的使用。

在特定的实施方案中，嵌合多肽既用作特定细胞的标志物，而且如果如果需要也用作杀伤细胞的安全开关。在一些实施方案中，嵌合多肽存在于其在其中不正常表达的细胞中，和/或嵌合多肽作为任何种类的异源蛋白质(在一些情况下，包括作为融合蛋白)存在于细胞中。在具体的实施方案中，至少包含特定蛋白质的胞外结构域的嵌合多肽融合蛋白被用作表达其的细胞的标志物，并且如果需要，还被用作杀死表达其的细胞的靶标。在特定情况下，嵌合多肽作为融合蛋白存在，其中胞质结构域对于该蛋白的其余部分的任何部分都不是天然的(尽管融合蛋白的跨膜结构域可以是也可以不是与胞外结构域一起天然存在的跨膜结构域)，并且在一些方面，胞质结构域是细胞受体的胞质结构域，诸如内化胞质结构域。在特定情况下，嵌合多肽融合蛋白的胞质结构域来自CD30、B细胞成熟抗原(BCMA)、肿瘤相关钙信号转导子2(trop-2)、CD317、CD3γ、CD4、CD79b、CD19、CD22、CD25、CD33或其组合。

本公开的方法至少包括鉴定表达嵌合多肽(诸如包含特定胞外结构域的至少一部分达到使得结合该胞外结构域的剂(诸如抗体)能够结合其的程度的多肽)的细胞的方法。使用特定蛋白质鉴定细胞可以出于任何原因，诸如表达其的细胞的生产质量、监测细胞的位置和/或确定细胞的数量等。

在具体实施方案中，嵌合多肽包含部分或全部CD30胞外结构域。在特定情况下，通过靶向细胞上表达的CD30来控制细胞疗法的细胞。对CD30阳性细胞的控制使得它们被抑制(包括被杀死)，例如，如果细胞的接受者表现出细胞疗法已经以任何方式变得有害的任何迹象(诸如对个体表现出毒性)的话。在一些实施方案中，CD30阳性细胞属于任何种类，并且表达任何种类的异源CD30蛋白，包括嵌合融合蛋白。在其它实施方案中，细胞的天然机制导致细胞在非天然条件下表达CD30。例如，CD30可以在转染或转导一种或多种异源基因(包括异源基因的特定组合)后表达。在特定情况下，细胞中BCL6和BCL2L1的转染或转导导致CD30的表达(包括在在正常情况下不表达CD30的细胞中)，并且在此类情况下，CD30可以用作安全开关(或标志物)。在具体实施方案中，当接受者个体对CD30阳性细胞疗法表现出毒性时，向该个体提供有效量的一种或多种靶向CD30的剂，诸如抗体或抗体-药物缀合物，包括单克隆抗体；靶向CD30的表达嵌合抗原受体的免疫细胞(T细胞((包括αβ或γδ)、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、间充质干细胞(MSC)细胞、造血干细胞(HSC)、造血细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)或其衍生物、其混合物、其衍生物)；CD30/CD3双特异性抗体；或CD30/CD16双特异性抗体。

本公开的实施方案包括包含编码特定嵌合多肽的序列的表达构建体，其中嵌合多肽包含与包含内吞或内化活性的胞内结构域融合的特定胞外结构域的至少一部分。在特定情况下，嵌合多肽融合蛋白的胞质结构域来自CD30、B细胞成熟抗原(BCMA)、肿瘤相关钙信号转导子2(trop-2)、CD317、CD3γ、CD4、CD79b、CD19、CD22、CD25、CD33或其组合。在特定情况下，嵌合多肽可以包含也可以不包含特定跨膜结构域，诸如为T细胞受体的α或β链的跨膜结构域或来自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD30、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。在具体实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:47，编码融合蛋白的序列可包含SEQ ID NO:48。本文涵盖的任何表达构建体可在载体中，包括病毒载体或非病毒载体。

本公开的具体实施方案包括包含本文所涵盖的任何表达构建体的分离细胞，诸如免疫细胞。细胞可以是αβT细胞、γδT细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、间充质干细胞(MSC)细胞、造血干细胞(HSC)、造血细胞、iPSC或其混合物。在一些情况下，细胞表达除嵌合多肽外的一种或多种异源蛋白质。任何异源蛋白质可以是治疗性蛋白质、细胞因子、细胞因子与细胞因子受体的融合物、安全开关或其混合物。在特定情况下，治疗性蛋白质是工程化的抗原受体、抗体等。工程化的抗原受体可以靶向癌症抗原。工程化的抗原受体可以是嵌合抗原受体、T细胞受体或B细胞受体。在细胞的具体实施方案中，嵌合多肽和一种或多种异源蛋白质从同一载体中表达，尽管在其它情况下，嵌合多肽和一种或多种异源蛋白质从不同载体中表达。细胞可以表达异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因。本公开的实施方案包括包含在合适培养基中的本文所涵盖的任一种细胞的分离群体。可将群体保存在贮库中和/或冷冻保存。

本公开的具体实施方案包括鉴定用(1)异源CD30基因、(2)包含CD30胞外结构域的至少一部分的CD30融合蛋白或(3)异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因的组合转导或转染的CD30阳性细胞的方法，其包括以下步骤：用(1)异源CD30基因、(2)包含CD30胞外结构域的至少一部分的CD30融合蛋白或(3)异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因的组合转导或转染细胞；将细胞暴露于有效量的结合CD30的剂；以及直接或间接检测所述剂与细胞表面上的CD30的结合。暴露和检测步骤可以在细胞制造期间和/或之后发生。该方法还可包括制造细胞的步骤。在特定情况下，该方法被进一步定义为：用CD30融合蛋白转染或转导免疫细胞；将免疫细胞暴露于有效量的结合CD30的抗体或抗体-药物缀合物；以及直接或间接检测抗体或抗体-药物缀合物与细胞表面上的CD30的结合。该方法可被进一步定义为：用异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因转染或转导免疫细胞；将免疫细胞暴露于有效量的结合CD30的抗体或抗体-药物缀合物；以及直接或间接检测抗体或抗体-药物缀合物与细胞表面上的CD30的结合。在特定情况下，在体外进行该方法，尽管在一些情况下，在体内进行该方法的至少一部分。细胞可以表达除CD30融合蛋白外的一种或多种异源蛋白质，诸如治疗性蛋白质、细胞因子、细胞因子与细胞因子受体的融合物、安全开关或其混合物。治疗性蛋白质可以是工程化的抗原受体。在具体实施方案中，该方法还包括用除异源CD30或CD30融合蛋白外的异源蛋白质、或BCL6和一种或多种Bcl2家族基因转染或转化免疫细胞的步骤。在一些实施方案中，CD30融合蛋白和除CD30融合蛋白外的异源蛋白质或BCL6和一种或多种Bcl2家族基因从同一载体中表达。CD30融合蛋白和除CD30融合蛋白外的异源蛋白质或BCL6和一种或多种Bcl2家族基因可以从不同的载体中表达。

在一个实施方案中，存在生产用于过继细胞疗法的免疫细胞的方法，其包括以下步骤：(a)用(1)异源CD30蛋白；(2)CD30融合蛋白；或(3)异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因的组合转导或转染免疫细胞，其中免疫细胞分别表达(1)CD30；(2)CD30融合蛋白；或(3)CD30；以及(b)用一种或多种治疗性蛋白转导或转染免疫细胞。在具体实施方案中，步骤(a)在步骤(b)之前、与步骤(b)同时或在步骤(b)之后发生。步骤(a)中的转化或转染可以与步骤(b)中的转化或转染相同。在具体的实施方案中，(1)、(2)或(3)与治疗性蛋白质在同一载体上，尽管(1)、(2)或(3)可以与治疗性蛋白质在不同的载体上。在具体的实施方案中，在步骤(a)之后，诸如通过流式细胞术、聚合酶链式反应或其组合来分析来自所述方法的免疫细胞的在免疫细胞表面上表达的CD30的存在。在一些情况下，所述方法还包括向有需要的个体施用由所述方法产生的免疫细胞的步骤。在任何情况下，可以诸如使用结合CD30的剂(例如，抗体或抗体-药物缀合物)监测个体中的免疫细胞。在具体实施方案中，个体表现出一种或多种来自免疫细胞的有害作用，并且向个体施用有效量的结合CD30的剂。个体可表现出来自免疫细胞的毒性，并且可向个体施用有效量的结合CD30的剂。个体可表现出来自免疫细胞的移植物抗宿主病(GVHD),并且可向个体施用有效量的结合CD30的剂。个体可以不再需要免疫细胞，并且可向个体施用有效量的结合CD30的剂。

本公开的实施方案包括在个体中减轻或预防来自细胞疗法的一种或多种有害作用的方法，其包括靶向在细胞疗法的细胞表面上表达的嵌合多肽的胞外结构域的步骤。该方法可被进一步定义为向个体施用有效量的一种或多种结合细胞上表达的嵌合多肽的胞外结构域的剂，诸如抗体(诸如单克隆抗体)或抗体-药物缀合物。有害作用的实例包括GVHD、细胞因子释放综合征或免疫效应细胞相关的神经毒性综合征。在多肽包含CD30的胞外结构域的情况下，表达的CD30胞外结构域可以包括也可以不包括完整的CD30蛋白。在特定情况下，CD30是完整CD30蛋白的片段，其包含胞外结构域的至少一部分。CD30可以在免疫细胞上天然表达。在一些情况下，CD30在免疫细胞上天然地异源表达。由于细胞表达异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因，CD30可在细胞上表达。CD30可以是CD30融合蛋白，诸如包含与胞内结构域融合的CD30胞外结构域的至少一部分的CD30融合蛋白，所述胞内结构域包含内吞或内化活性。胞内结构域的实例包括来自B细胞成熟抗原(BCMA)、trop-2、CD317、CD3γ、CD4、CD79b或其组合的那些胞内结构域。CD30融合蛋白可包含CD30跨膜结构域。在特定情况下，融合蛋白包含SEQ ID NO:47。编码融合蛋白的序列可包含SEQ ID NO:48。

在特定情况下，在任何靶向步骤之前，可以诸如使用一种或多种靶向其嵌合多肽的剂体内监测个体的细胞。在特定实施方案中，靶向嵌合多肽的剂是抗体，其用量足够低，不会抑制治疗性细胞。细胞疗法对于个体而言可以是同种异体的或自体的。细胞疗法可包括表达一种或多种异源蛋白质的免疫细胞，所述异源蛋白质包括治疗性蛋白质、细胞因子、细胞因子与细胞因子受体的融合物、安全开关或其混合物。治疗性蛋白质可包含一种或多种工程化的抗原受体，包括嵌合抗原受体、T细胞受体或由细胞表达的两者。细胞可表达嵌合多肽和嵌合抗原受体。

本公开的实施方案包括抑制细胞活性的方法，其包括将用异源BCL6与一种或多种Bcl2家族基因的组合转导或转染的细胞暴露于有效量的结合CD30的剂的步骤。在具体实施方案中，活性的抑制被进一步定义为诱导细胞凋亡。该方法还可包括检测剂与细胞上表达的CD30的结合。在特定情况下，该方法还包括用异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因转导或转染本文所涵盖的任何种类的细胞。一种或多种Bcl2家族基因可以是BCL2L1。

本公开的实施方案包括抑制细胞活性的方法，其包括将用包含CD30胞外结构域的至少一部分的CD30融合蛋白转导或转染的细胞暴露于有效量的结合CD30的剂的步骤。在具体实施方案中，活性的抑制被进一步定义为诱导细胞凋亡。该方法还可包括检测剂与细胞上表达的CD30的结合。

X.CD30阳性细胞和相关组合物

CD30也被称为TNFRSF8、D1S166E、Ki-1、肿瘤坏死因子受体超家族成员8和TNF受体超家族成员8。本公开涉及包含CD30阳性细胞的组合物，所述组合物降低了细胞疗法对接受者个体有毒的风险和/或允许监测细胞的产生和/或监测细胞的位置。与未使用本公开的方法产生的细胞相比，使用本公开的方法产生的CD30阳性细胞具有降低的毒性风险。CD30蛋白的胞外结构域在细胞表面上的表达允许该蛋白被一种或多种剂靶向，所述剂识别表面上的结构域并直接或间接导致细胞的抑制，包括细胞的死亡。

在具体实施方案中，CD30阳性细胞被用作任何种类的标志物和安全开关，包括对接受者个体具有变得有毒的可能性的细胞。本公开的实施方案包括其中CD30作为转导标志物和安全开关之一或两者是有效的方法和组合物。细胞疗法包含CD30阳性细胞，在具体实施方案中，CD30阳性细胞本身是可以包含也可以不包含修饰以表达一种或多种异源基因的免疫细胞。

CD30阳性细胞包括在细胞表面上天然表达CD30的细胞。或者，可以通过人工修饰细胞以表达部分或全部CD30，在一些情况下，没有这种修饰的细胞不会表达CD30。CD30可以是也可以不是野生型的。在特定实施方案中，CD30蛋白的一部分但非全部在细胞中表达，并且当利用少于全部的CD30蛋白时，其包含CD30胞外结构域的至少一部分，如果不是全部胞外结构域的话。在具体的实施方案中，利用了CD30跨膜结构域，而在其它情况下则没有。在具体情况下，至少部分CD30用于融合蛋白，包括其中CD30融合蛋白在细胞表面表达的融合蛋白。在此类情况下，CD30融合蛋白包含至少部分(如果不是全部的话)CD30胞外结构域。在特定情况下，融合蛋白中包含足够的CD30胞外结构域，使得识别CD30胞外结构域的抗体能够在适当的表位上结合其。

在人工修饰后，诸如在转染或转导一种或多种非CD30的异源基因后，所述细胞还可具有表达作为细胞表面标志物的CD30的独特能力。对于某些细胞，至少包括T细胞(包括αβ或γδ)、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、间充质干细胞(MSC)细胞、造血干细胞(HSC)、造血细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)或其衍生物、混合物、其衍生物)，一种或多种异源基因的转染或转导导致CD30的表达，而CD30在正常情况下不会表达。一种或多种异源基因可以与也可以不与利用CD30的途径无关，在特定情况下，异源基因是BCL6和BCL2L1基因或其相关基因。在此类情况下，这允许CD30被用作一种或多种异源基因成功转染或转导细胞的转导标志物。

作为膜结合蛋白的CD30(或其衍生物)可用于多种治疗性免疫细胞产品。在一些情况下，免疫细胞至少包括T细胞(包括αβ或γδ)、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、间充质干细胞(MSC)细胞、造血干细胞(HSC)、造血细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)或它们的衍生物、其混合物、其衍生物等。

在特定情况下，膜结合蛋白包含CD30的部分或全部胞外结构域和/或CD30的胞内结构域。在一些情况下，膜结合蛋白是全长野生型CD30蛋白。细胞中的CD30可包含CD30胞外结构域和跨膜结构域，但不包含CD30胞内结构域。细胞中的CD30可包含CD30细胞外结构域和CD30细胞内结构域，但不包含CD30跨膜结构域。膜结合CD30蛋白可包含胞质尾(其至少具有内化基序，这意味着该尾可以与网格蛋白介导的细胞内运输复合物相互作用，以内化与CD30结合的抗CD30抗体)，所述胞质尾包含一种或多种其它膜结合受体的一种或多种内化胞质尾。与网格蛋白依赖性内吞分选信号相关的共有序列是本领域已知的(Traub,Molecular Cell Biology，第10卷，第583-596页，2009)。在一些情况下，胞质尾是表面结合的蛋白质的细胞质部分。在具体实施方案中，胞质尾是CD30、BCMA、trop-2、CD317、CD3γ、CD4、CD79b、CD19、CD22、CD25、CD33等的胞质尾。

在一个实施方案中，CD30与一种或多种异源蛋白质在细胞中共表达。异源蛋白质可以是也可以不是治疗性蛋白，包括本身具有治疗功效的蛋白和/或赋予表达该蛋白的CD30阳性细胞治疗功效的蛋白。可以同时或在不同时间制造细胞以表达CD30和异源蛋白质。在一些实施方案中，修饰可以是也可以不是CD30阳性的细胞以表达一种或多种异源蛋白质，然后将所述细胞储存在储库中，包括冷冻保存。根据需要，可以将细胞解冻并进一步修饰以表达CD30，表达CD30融合蛋白，或转化/转染以表达一种或多种异源基因，所述异源基因然后上调细胞中CD30的表达。在其它情况下，在将表达CD30的细胞、表达CD30融合蛋白的细胞、或被转化/转染以表达一种或多种异源基因(所述异源基因随后在细胞中上调CD30的表达)的细胞从储库中的低温保存条件下解冻后，修饰所述细胞以表达一种或多种异源蛋白质。

在特定实施方案中，对于任何CD30阳性细胞，一种或多种异源基因可以是一种或多种工程化的抗原受体，包括嵌合抗原受体或表达TCR的细胞。在此类情况下，任何工程化的抗原受体可以靶向一种或多种抗原，包括一种或多种癌症抗原。工程化的抗原受体可被定向为靶向单个或多个目标抗原，包括癌症抗原。

在特定情况下，CD30阳性细胞是自体或同种异体细胞(对于个体而言),其可以表达也可以不表达一种或多种异源蛋白质。

在一些实施方案中，CD30阳性细胞表达除CD30或CD30融合蛋白外的附加安全开关，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)/更昔洛韦、iCaspase9、tEGFR、synNotch、组合靶抗原识别、抑制性嵌合抗原受体等。

在一些实施方案中，使用CD30融合蛋白，其中融合是CD30胞外结构域与另一蛋白质片段(包括作为膜结合蛋白的胞质区的至少一部分的片段)的融合。作为一个实例，将CD30胞外结构域和跨膜结构域(PVLFWVILVLVVVVGSSAFLL；SEQ ID NO:51)与B细胞成熟抗原(BCMA)胞质尾(将其用下划线标出)融合。代表性CD30-BCMA融合蛋白的氨基酸序列如下：

MRVLLAALGLLFLGALRAFPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRKINSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEI ILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR(SEQ IDNO:47)

代表性CD30-BCMA融合蛋白的DNA序列如下：

ATGCGAGTCCTCCTGGCCGCGTTGGGGCTCTTGTTCCTTGGGGCACTTCGAGCCTTTCCACAGGATCGACCTTTTGAAGATACTTGTCACGGAAACCCTTCTCACTACTACGATAAAGCGGTCCGACGATGCTGCTACCGATGCCCTATGGGACTTTTCCCGACGCAGCAATGCCCACAGCGGCCTACGGACTGTAGAAAGCAATGCGAGCCGGACTACTATCTGGACGAAGCAGATCGGTGTACTGCCTGCGTAACATGCTCCCGGGATGACCTGGTGGAAAAGACCCCCTGCGCTTGGAACTCCAGTAGAGTATGCGAATGCCGACCAGGGATGTTCTGCAGCACGAGCGCAGTTAACTCATGTGCCAGGTGTTTTTTCCATTCTGTATGTCCTGCCGGGATGATTGTTAAGTTCCCAGGTACAGCTCAAAAGAACACGGTATGCGAACCCGCTAGTCCGGGAGTTTCCCCGGCCTGCGCCAGCCCAGAGAATTGCAAGGAGCCGTCTAGCGGTACAATCCCACAAGCTAAGCCGACGCCGGTCAGCCCGGCGACTTCATCCGCCTCAACAATGCCCGTCCGGGGTGGGACAAGACTCGCGCAGGAAGCGGCTAGCAAGTTGACACGAGCCCCCGATTCCCCTTCAAGTGTAGGCAGACCTAGTTCCGACCCTGGCCTTAGCCCAACGCAACCCTGCCCAGAGGGATCCGGAGACTGTCGGAAACAATGCGAGCCCGACTATTACTTGGATGAAGCCGGTCGCTGTACCGCATGTGTGTCCTGCAGCCGCGATGACCTGGTCGAGAAAACACCATGTGCATGGAATAGCAGTCGCACCTGCGAGTGCCGACCGGGAATGATCTGTGCCACCTCAGCAACCAACTCTTGTGCCAGGTGCGTACCATATCCCATCTGCGCGGCTGAGACCGTAACAAAACCTCAAGACATGGCCGAAAAAGACACCACTTTCGAAGCGCCGCCTCTGGGCACTCAACCAGACTGCAATCCTACGCCAGAAAACGGGGAAGCACCCGCGTCAACCTCCCCCACACAATCTTTGCTCGTAGACTCTCAGGCTTCCAAAACACTGCCAATACCAACTTCCGCTCCGGTGGCTCTGAGCTCTACCGGCAAACCCGTGCTTGACGCCGGGCCAGTCCTGTTCTGGGTTATATTGGTGCTCGTAGTCGTAGTAGGCTCCAGCGCCTTTCTGCTCTGTCACCGGAAGATCAATTCCGAACCTTTGAAAGACGAGTTTAAGAACACCGGGAGTGGCCTCCTCGGAATGGCTAATATCGACTTGGAGAAGAGCCGCACTGGGGACGAAATCATTTTGCCTCGCGGGCTTGAATACACAGTCGAAGAGTGCACGTGTGAAGACTGCATTAAATCAAAACCGAAGGTGGACAGCGATCATTGTTTCCCCTTGCCCGCTATGGAAGAAGGTGCAACTATCCTCGTAACAACCAAAACTAACGATTATTGTAAAAGCCTCCCGGCGGCTCTCTCTGCGACGGAAATAGAAAAATCAATCTCTGCAAGG(SEQ ID NO:48)，其中编码TM结构域的序列加以下划线标出。

在一些实施方案中，使用野生型CD30，因为其天然存在于细胞上，因为其是转导到细胞中的异源CD30，或者因为其由于一种或多种其它基因转导或转染到细胞中而在细胞上表达。野生型全长CD30如下：

氨基酸序列：

MRVLLAALGLLFLGALRAFPQDRPFEDTCHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQCEPDYYLDEADRCTACVTCSRDDLVEKTPCAWNSSRVCECRPGMFCSTSAVNSCARCFFHSVCPAGMIVKFPGTAQKNTVCEPASPGVSPACASPENCKEPSSGTIPQAKPTPVSPATSSASTMPVRGGTRLAQEAASKLTRAPDSPSSVGRPSSDPGLSPTQPCPEGSGDCRKQCEPDYYLDEAGRCTACVSCSRDDLVEKTPCAWNSSRTCECRPGMICATSATNSCARCVPYPICAAETVTKPQDMAEKDTTFEAPPLGTQPDCNPTPENGEAPASTSPTQSLLVDSQASKTLPIPTSAPVALSSTGKPVLDAGPVLFWVILVLVVVVGSSAFLLCHRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPTAASGK(SEQID NO:49)

DNA序列：

atgcgcgtcctcctcgccgcgctgggactgctgttcctgggggcgctacgagccttcccacaggatcgacccttcgaggacacctgtcatggaaaccccagccactactatgacaaggctgtcaggaggtgctgttaccgctgccccatggggctgttcccgacacagcagtgcccacagaggcctactgactgcaggaagcagtgtgagcctgactactacctggatgaggccgaccgctgtacagcctgcgtgacttgttctcgagacgacctcgtggagaagacgccgtgtgcatggaactcctcccgtgtctgcgaatgtcgacccggcatgttctgttccacgtctgccgtcaactcctgtgcccgctgcttcttccattctgtctgtccggcagggatgattgtcaagttcccaggcacggcgcagaagaacacggtctgtgagccggcttccccaggggtcagccctgcctgtgccagcccagagaactgcaaggaaccctccagtggcaccatcccccaggccaagcccaccccggtgtccccagcaacctccagtgccagcaccatgcctgtaagagggggcacccgcctcgcccaggaagctgcttctaaactgacgagggctcccgactctccctcctctgtgggaaggcctagttcagatccaggtctgtccccaacacagccatgcccagaggggtctggtgattgcagaaagcagtgtgagcccgactactacctggacgaggccggccgctgcacggcctgcgtgagctgttctcgagatgaccttgtggagaagacgccatgtgcatggaactcctcccgcacctgcgaatgtcgacctggcatgatctgtgccacatcagccaccaactcctgtgcccgctgtgtcccctacccaatctgtgcagcagagacggtcaccaagccccaggatatggctgagaaggacaccacctttgaggcgccacccctggggacccagccggactgcaaccccaccccagagaatggcgaggcgcctgccagcaccagccccactcagagcttgctggtggactcccaggccagtaagacgctgcccatcccaaccagcgctcccgtcgctctctcctccacggggaagcccgttctggatgcagggccagtgctcttctgggtgatcctggtgttggttgtggtggtcggctccagcgccttcctcctgtgccaccggagggcctgcaggaagcgaattcggcagaagctccacctgtgctacccggtccagacctcccagcccaagctagagcttgtggattccagacccaggaggagctcaacgcagctgaggagtggtgcgtcggtgacagaacccgtcgcggaagagcgagggttaatgagccagccactgatggagacctgccacagcgtgggggcagcctacctggagagcctgccgctgcaggatgccagcccggccgggggcccctcgtcccccagggaccttcctgagccccgggtgtccacggagcacaccaataacaagattgagaaaatctacatcatgaaggctgacaccgtgatcgtggggaccgtgaaggctgagctgccggagggccggggcctggcggggccagcagagcccgagttggaggaggagctggaggcggaccataccccccactaccccgagcaggagacagaaccgcctctgggcagctgcagcgatgtcatgctctcagtggaagaggaagggaaagaagaccccttgcccacagctgcctctggaaagtga(SEQ ID NO:50)

设想了其它特异性融合蛋白组合，包括(1)具有trop-2胞内结构域的CD30胞外抗原，其可以包含也可以不包含CD30跨膜结构域；(2)具有CD317胞内结构域的CD30胞外抗原，其可以包含也可以不包含CD30跨膜结构域；(3)具有CD3γ胞内结构域的CD30胞外抗原，其可以包含也可以不包含CD30跨膜结构域；(3)具有CD4胞内结构域的CD30胞外抗原，其可以包含也可以不包含CD30跨膜结构域；或(4)具有CD79b胞内结构域的CD30胞外抗原，其可以包含也可以不包含CD30跨膜结构域。在不使用CD30跨膜的实施方案中，可以使用下列之一的跨膜结构域：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、ICOS/CD278、GITR/CD357、NKG2D或DAP分子，诸如DAP10或DAP12。

XI.与CD30阳性细胞相关的方法

本公开涉及CD30阳性细胞及其用途，包括对于天然或重组CD30(包括可以与也可以不与一种或多种其它蛋白质片段嵌合的膜结合CD30蛋白)呈阳性的细胞及其用途。在具体实施方案中，如下使用CD30：(1)在制造过程中富集治疗性细胞产物的转导和选择标志物；(2)用于监测输注的细胞产物以体内评估扩增、表型、功能、运输和持久性的转导标志物；(3)使用单克隆抗体、抗体-药物缀合物或其它方法根据需要消除输注的治疗性细胞的安全开关。

在特定情况下，本公开涵盖使用CD30作为转导标志物的方法。例如，转染或转导可以表达也可以不表达CD30的细胞以表达至少具有CD30胞外结构域的蛋白质，并诸如使用一种或多种与胞外结构域的至少一部分结合的剂测定成功转染或转导的候选细胞的CD30胞外结构域的存在。在一些情况下，所述一种或多种剂被标记，使得可以检测(包括利用光、荧光、颜色、放射性等的检测)这种相互作用。在其它情况下，转染或转导可以表达也可以不表达CD30的细胞以表达一种或多种非CD30的蛋白质，但是在各自的转染或转导后，作为转染或转导的直接或间接结果，细胞表达CD30。

在一些实施方案中，CD30蛋白被用作选择标志物。也就是说，诸如使用在表面上包含CD30结合剂的基质，对至少具有被怀疑是CD30阳性的亚群的细胞群进行允许选择CD30阳性细胞的方法。可在足够的条件下暴露该群体，以允许群体中的那些CD30阳性细胞结合所述剂，从而排除非CD30阳性的那些细胞。然后可以从结合剂中释放细胞，诸如在适当的洗涤之后。在具体的实施方案中，用作选择标志物的CD30不是内源性CD30，而是由于人为原因而由细胞表达，诸如在用异源CD30、CD30融合蛋白或一种或多种非CD30但导致其上调的异源基因转染或转导后。

本公开的方法还利用CD30或CD30相关衍生蛋白(例如，融合蛋白)来监测细胞产物。监测可以是体外或体内的，并且监测可包括测定细胞的扩增、与细胞相关的特定功能等。在一些情况下，监测是体内的，并且是在将CD30阳性细胞施用(包括通过输注的施用)到接受者个体之后进行的。在特定情况下，CD30阳性的输注细胞产品允许在体内对输注细胞疗法的多个方面(包括扩增、表型、功能、运输和持久性)进行评估。在一些实施方案中，对CD30阳性细胞的监测提供了细胞疗法对个体变得有毒性的风险的信息。例如，CAR T细胞在输注后可能会过度增殖，并且能够导致毒性。

在特定实施方案中，细胞上的CD30或CD30相关衍生蛋白(例如，融合蛋白)被用作安全开关，以在不再需要细胞或个体表现出一种或多种细胞疗法对个体有毒或在任何持续时间的特定时期内对个体变得有毒的迹象的情况下，抑制细胞疗法的CD30阳性细胞的活性。本发明的方法和组合物可用于减少或预防一种或多种不良事件，诸如细胞因子释放综合征、神经毒性、免疫效应细胞相关的神经毒性综合征、过敏反应/变态反应、宿主排斥，至少包括GVHD、靶向肿瘤毒性(on-target on-tumor toxicity)和/或非肿瘤靶向毒性(正常细胞的耗竭),或被认为处于具有一种或多种症状的风险(包括即将发生的风险)中。自杀基因或安全开关的使用可以是计划的治疗方案的一部分，或者可以仅在认识到需要使用其时使用。在一些情况下，安全开关延迟毒性发作和/或降低毒性的严重性，而在其它情况下，其防止毒性或完全抑制毒性。

在输注给需要治疗性细胞的个体后，膜结合CD30蛋白可用于监测过继转移的T细胞的命运，包括通过流式细胞术、PCR或其它实验室方法，诸如下一代测序或使用临床试验诸如成像研究。在疗法导致不良事件诸如细胞因子释放综合征、GVHD、肿瘤发生等的情况下，抗体或抗体-药物缀合物或其它方法可用于在体内消除输注的细胞。

本公开提供了膜结合CD30蛋白或融合蛋白，其可以单独或组合用作转导和选择标志物和/或消除安全开关。在一些情况下，细胞表达CD30或CD30融合蛋白，所述CD30或CD30融合蛋白用作安全开关，但不用作转导或选择标志物，而在其它情况下，它们用作转导或选择标志物，但不用作安全开关。

本公开的方法还涵盖通过靶向细胞上的表面蛋白来抑制细胞活性的方法，所述表面蛋白包含CD30的部分或全部胞外结构域。被抑制的活性可以是任何类型的，但是在具体实施方案中，活性的抑制被定义为诱导细胞凋亡。当细胞暴露于有效量的一种或多种结合CD30的剂时，可导致细胞的增殖被抑制或延迟，或者细胞可被杀死。一种或多种结合CD30的剂可在本文公开的任何方法中控制细胞的存活。

XII.组疗法

在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及除包含治疗性细胞的组合物之外的癌症疗法。附加疗法可以是放射治疗、手术(例如乳房肿瘤切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因治疗、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法、激素疗法或前述疗法的组合。附加疗法可呈辅助疗法或新辅助疗法的形式。

在一些实施方案中，附加疗法是施用一种或多种小分子酶促抑制剂或一种或多种抗转移剂。在一些实施方案中，附加疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或严重性的剂，诸如抗恶心剂等)在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法。在一些实施方案中，附加疗法是手术。在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法与手术的组合。在一些实施方案中，附加疗法是γ辐照。在一些实施方案中，附加疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径的疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或一种或多种化学预防剂的疗法。附加疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。

免疫细胞疗法(除了本公开的细胞疗法之外)可以相对于附加癌症疗法(诸如免疫检查点疗法)在其之前、期间、之后施用或以各种组合施用。可以以从同时到数分钟到数天到数周的间隔施用。在将免疫细胞疗法与本公开的一种或多种组合物分开提供给患者的实施方案中，通常会确保每次递送之间的相当长的一段时间没有超过有效期，使得两种化合物仍能对患者产生有利的组合效果。在此类情况下，设想了可以在彼此约12至24或72h内，更特别地在彼此约6-12h内，为患者提供免疫疗法和所公开的组合物。在一些情况下，可能需要显著延长治疗时间，其中在各次施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8天)。

考虑到剂的毒性(如果有的话)，向患者施用本发明实施方案的任何化合物或细胞疗法将遵循施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合疗法的毒性的步骤。

A.化学疗法

可根据本发明实施方案使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于表示在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些剂或药物根据它们在细胞内的活动模式进行分类，例如，它们是否影响以及在哪个阶段影响细胞周期。或者，可以基于其直接交联DNA、嵌入DNA或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征剂。

化学治疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯类，诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替派、卡巴醌、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenins(尤其是布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γI和加利车霉素ωI1)；达米辛(dynemicin)，包括达米辛A；双膦酸盐，诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)，诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)和硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)和氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酮(testolactone)；抗肾上腺类，诸如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登素类化合物(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、黏液霉素(verracurinA)、杆孢菌素A和anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；铂配位复合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；伊利替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇，诸如视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、丙卡巴嗪、plicomycin、吉西他滨、那韦尔滨、法呢基蛋白转移酶抑制剂、跨铂(transplatinum)以及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

B.放射疗法

导致DNA损伤并被广泛使用的其它因素包括通常已知的γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。也设想了其它形式的DNA损伤因素，诸如微波、质子束辐照(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV辐照。最有可能的是所有这些因素都对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的装配和维持产生广泛的损害。X射线的剂量范围为从长期(3至4周)的50至200伦琴的日剂量到2000至6000伦琴的单剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。

C.免疫疗法

本领域技术人员将理解，可将附加的免疫疗法(在所公开的细胞疗法之外)与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗就是这样的实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物具有特异性的抗体。抗体本身可以充当疗法的效应物，或者其可以招募其它细胞来实际影响细胞杀伤。也可将抗体与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并作为靶向剂。或者，效应物可以是携带直接或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括除敲低或敲除了TGF-βR2的细胞外的细胞毒性T细胞和NK细胞。

抗体-药物缀合物已成为癌症治疗剂开发的突破性方法。抗体-药物缀合物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物相结合，产生了“经武装的”MAb，其将有效载荷(药物)递送至具有丰富抗原水平的肿瘤细胞。药物的靶向递送也使其在正常组织中的暴露最小化，从而降低毒性并改善了治疗指数。FDA于2011年批准了(维布妥昔单抗)以及于2013年批准了(恩美曲妥珠单抗或T-DM1)，这两种ADC药物的批准验证了所述方法。目前有超过30种ADC候选药物处于癌症治疗临床试验的不同阶段(Leal等人,2014)。随着抗体工程和接头-有效载荷优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合这种方法的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是肿瘤细胞中的上调/高水平的表达和强有力的内化。

在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须携带一些易于靶向，即不存在于大多数其它细胞上的标志物。存在许多肿瘤标志物，并且这些标志物中的任一种都可适合于在本实施方案的背景下靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的可选择的方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，诸如MIP-1、MCP-1、IL-8和生长因子，诸如FLT3配体。

目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如任何种类的干扰素、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人，1998)；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人，1998；ustin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。设想了一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。

在一些实施方案中，免疫疗法可为免疫检查点抑制剂。免疫检查点要么上调信号(例如，共刺激分子)，要么下调信号。可被免疫检查点阻断靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)以及T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

D.手术

大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性手术。治疗性手术包括切除(其中全部或部分癌组织被物理地移除、切除和/或破坏)，并且可以与其它疗法(诸如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除是指物理切除肿瘤的至少一部分。除了肿瘤切除以外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微控制手术(莫氏手术)。

在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。可通过使用附加的抗癌疗法对该区域进行灌注、直接注射或局部应用来完成治疗。例如，可以每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复这种治疗。这些治疗也可以具有不同的剂量。

E.其它剂

设想了可将其它剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些附加的剂包括影响细胞表面受体的上调和缝隙连接的剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖性细胞对凋亡诱导剂的敏感性的剂或其它生物剂。通过增加缝隙连接数量来增加细胞间信号传导将增强对邻近过度增殖性细胞群的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，可将细胞抑制剂或分化剂与本发明实施方案的某些方面组合使用，以提高治疗的抗过度增殖功效。设想了细胞粘附抑制剂可提高本发明实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。还设想了增加过度增殖性细胞对凋亡的敏感性的其它剂诸如抗体c225可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗效果。

XIII.载体

在特定实施方案中，本文所涵盖的细胞包含一种或多种载体，其可表达本文所涵盖的任何多肽。可以通过任何合适的载体，包括通过病毒载体或非病毒载体，将不同的蛋白质递送至受体细胞。病毒载体的实例至少包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。非病毒载体的实例至少包括质粒、转座子、脂质、纳米颗粒、脂质体及其组合等。

在例如用编码嵌合多肽的载体转导细胞，并且还需要将另外的一种或多种基因诸如异源蛋白质转导到细胞中的情况下，它们可以包含在也可以不包含在同一载体上。在一些情况下，嵌合多肽、一种或多种异源蛋白质等由同一载体分子诸如同一病毒载体分子表达。在此类情况下，多肽的表达可以由也可以不由相同的一种或多种调控元件调节。当多肽在同一载体上时，它们可以作为也可以不作为单独的多肽表达。例如，在它们被表达为单独的多肽的情况下，它们可以在载体上被2A元件或IRES元件隔开(或者两种元件可以在同一载体上使用一次或多次)。

本领域技术人员具有足够的能力通过标准重组技术(参见例如Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996，两者均通过引用并入本文)构建载体用于表达本公开的抗原受体。

A.调控元件

包含在可用于本公开的载体中的表达盒特别包含(在5’-至-3’方向)与蛋白质编码序列有效连接的真核转录启动子、包含插入序列的剪接信号和转录终止/多腺苷酸化序列。控制真核细胞中蛋白质编码基因转录的启动子和增强子可由多个遗传元件组成。细胞机制能够收集和整合每个元件传递的调控信息，允许不同的基因进化出不同的、通常复杂的转录调控模式。例如，本公开的说明书中使用的启动子包括组成型、诱导型和组织特异性启动子。在载体用于产生癌症疗法的情况下，启动子在缺氧条件下可以是有效的。

B.启动子/增强子

本文提供的表达构建体包含驱动任何一种或多种多肽表达的启动子。启动子通常包含用于定位RNA合成起始位点的序列。这方面最著名的实例是TATA盒，但是在一些缺乏TATA盒的启动子(例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子)中，覆盖在起始位点本身上的离散元件有助于固定起始的位置。附加的启动子元件调控转录起始的频率。通常，这些启动子位于起始位点的上游区域，尽管已显示许多启动子也在起始位点的下游含有功能元件。为了使编码序列处于启动子“的控制之下”，人们将转录阅读框的转录起始位点的5′末端置于所选启动子的“下游”(即3′)。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA表达。

启动子元件之间的间距通常是灵活的，因此当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。例如，在tk启动子中，在活性开始下降之前，可将启动子元件之间的间隔增加到50bp。根据启动子的不同，似乎单个元件可以协同或独立地激活转录。启动子可以与也可以不与“增强子”结合使用，增强子是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。

启动子可以是与核酸序列天然相关的启动子，可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列获得。这种启动子可被称为“内源性的”类似地，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于该序列的下游或上游。或者，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下将获得某些有利方面，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关联的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列相关联的增强子。此类启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，和从任何其它病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调控区的不同元件，和/或改变表达的突变。例如，重组DNA构建中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp-)启动子系统。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR)结合本文公开的组合物产生序列。此外，设想了也可以使用在非核细胞器诸如线粒体、叶绿体等内指导序列转录和/或表达的控制序列。

自然地，重要的是采用有效地指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域的技术人员通常知道启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达的用途(参见，例如Sambrook等人1989，通过引用并入本文)。采用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的，和/或在合适的条件下可用于指导引入的DNA片段的高水平表达，诸如有利于重组蛋白和/或肽的大规模生产。启动子可以是异源的或内源的。

另外，任何启动子/增强子组合(例如，根据真核启动子数据库EPDB，通过万维网在epd.isb-sib.ch/获得)也可用于驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶(作为递送复合物的一部分或作为附加的基因表达构建体)，真核细胞可以支持来自某些细菌启动子的细胞质转录。

启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，诸如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，诸如β肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；以及串联应答元件启动子，诸如环AMP反应元件启动子(cre)、血清反应元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和最小TATA盒附近的反应元件启动子(tre)。也可以使用人生长激素启动子序列(例如，在登录号X05244，核苷酸283-341中描述的人生长激素最小启动子)或小鼠乳腺肿瘤启动子(可从目录号ATCC 45007获得)。在某些实施方案中，启动子是CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌动蛋白、MHC I类或MHCII类启动子，然而，任何其它用于驱动治疗性基因表达的启动子均适用于本公开的实践。

在某些方面，本公开的方法还涉及增强子序列，即增强启动子的活性并且具有顺式地而无论其取向地起作用的潜力(即使在相对较长的距离上(距离目标启动子多达数千个碱基)也如此)的核酸序列。然而，增强子的功能不一定局限于如此长距离，因为它们也可以在非常接近给定启动子的地方发挥作用。

C.起始信号和连锁表达

特定的起始信号也可用于本公开提供的表达构建体中以用于编码序列的高效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员能够容易地确定这一点并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框“在读框内”,以确保整个插入序列的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含适当的转录增强子元件可以增强表达效率。

在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5′甲基化的帽依赖翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件以及来自哺乳动物信使的IRES。IRES元件可以连接到异源的开放阅读框。多个开放阅读框可以一起转录，每个阅读框由一个IRES分开，从而产生多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框对于核糖体是可接近的以用于有效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信息可以有效表达多个基因。

如本文其它地方所详述的，某些2A序列元件可用于在本公开中提供的构建体中产生基因的连锁或共表达。例如，切割序列可用于通过连接开放阅读框形成单个顺反子来共表达基因。示例性切割序列是马鼻炎A病毒(E2A)或F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，Thoseaasigna病毒2A；T2A)或猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1)(P2A)。在具体实施方案中，在单个载体中，多个2A序列是不相同的，尽管在替代实施方案中，同一载体利用相同的2A序列中的两个或更多个序列。在US2011/0065779(其通过引用以其整体并入本文)中提供了2A序列的实例。

D.复制起点

为了在宿主细胞中繁殖载体，其它可以含有一个或多个复制起点(通常称为“ori”)，例如，对应于如上所述的EBV的oriP的核酸序列或在编程中具有类似或提升的功能的遗传改造的oriP，复制起点是在其上启动复制的特定核酸序列。或者，可以使用如上所述的其它染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。

E.选择和可筛选标志物

在一些实施方案中，可通过在表达载体中包含标志物来体外或体内鉴定本公开的CD30阳性细胞。此类标志物将赋予细胞可鉴别的变化，从而允许容易地鉴别含有表达载体的细胞。通常，选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物是该标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的实例是抗药性标志物。

通常药物选择标志物的包含有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素(zeocin)和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标志物之外，还设想了其它类型的标志物，包括可筛选标志物，诸如以比色分析为基础的GFP。或者，可以利用可筛选的酶作为阴性选择标志物，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还知道如何使用免疫学标志物，可能结合FACS分析结合使用。所用的标志物被认为并不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标志物的其它实例是本领域技术人员从所周知的。

XIV.治疗方法

在各种实施方案中，本文设想的表达构建体、核酸序列、载体、宿主细胞等和/或包含它们的药物组合物用于预防、治疗或改善癌性疾病，诸如肿瘤性疾病。在特定的实施方案中，例如，本公开的药物组合物可以特别用于例如预防、改善和/或治疗癌症。例如，个体可以利用本公开的治疗方法作为初始治疗或在另一种治疗之后(或与另一种治疗一起)，诸如在HSCT之后利用本公开的治疗方法。基于癌症的类型和/或阶段，免疫疗法方法可以根据患有癌症的个体的需要进行定制，并且在至少一些情况下，可以在个体的治疗过程中修改免疫治疗。

在一些实施方案中，本公开提供了免疫治疗方法，其包括施用有效量的由本公开的方法产生的细胞。在一个实施方案中，通过转移由本文方法产生并引发免疫反应的细胞群来治疗医学疾病或病症。在本公开的某些实施方案中，通过转移由本公开的方法产生的细胞群来治疗癌症。本文提供了用于治疗个体的癌症或延缓其进展的方法，其包括向该个体施用有效量的细胞疗法。本发明方法可用于治疗实体癌或血液癌。

本发明治疗方法适用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中发现的那些。示例性实体瘤可包括但不限于选自由以下组成的组的器官肿瘤：急性髓细胞样白血病、淋巴瘤、肺癌、肾癌、膀胱癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤和胰腺癌。

在本公开的某些实施方案中，将本文所涵盖的免疫细胞递送至有需要的个体，诸如患有癌症的个体。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的免疫细胞。在为个体提供两个或多个剂量的免疫细胞的情况下，施用之间的持续时间应足够以允许在个体中繁殖的时间，并且在具体实施方案中，剂量之间的持续时间为1、2、3、4、5、6、7天或更多天。

在具体实施方案中，向个体提供治疗有效量(在1个细胞至10¹⁰个细胞的范围内)的细胞，所述治疗有效量改善个体中至少一种与癌症相关的症状。治疗有效量可以是1至10¹⁰个、10至10¹⁰个、10²-10¹⁰个、10³至10¹⁰个、10³至10⁹个、10³至10⁸个、10³至10⁷个、10³至10⁶个、10³至10⁵个、10³至10⁴个、10⁴至10¹⁰个、10⁴至10⁹个、10⁴至10⁸个、10⁴至10⁷个、10⁴至10⁶个、10⁴至10⁵个、10⁵至10¹⁰个、10⁵至10⁹个、10⁵至10⁸个、10⁵至10⁷个、10⁵至10⁶个、10⁶至10¹⁰个、10⁶至10⁹个、10⁶至10⁸个、10⁶至10⁷个、10⁷至10¹⁰个、10⁷至10⁹个、10⁷至10⁸个、10⁸至10¹⁰个、10⁸至10⁹个或10⁹至10¹⁰个细胞。在具体实施方案中，向患有癌症的个体提供一次或多次治疗有效量的特定治疗性细胞。在一些实施方案中，当个体处于这些细胞作为治疗的有害作用的风险中时，可以调整浓度和/或可以施用一种或多种靶向细胞上抗原的嵌合多肽试剂。在具体的实施方案中，向患有癌症的个体提供一次或多次治疗有效量的特定免疫细胞，然后当个体处于细胞作为治疗的有害作用的风险中时，可以调整浓度和/或可以施用一种或多种靶向细胞上抗原的嵌合多肽试剂。

在某些实施方案中，施用后，载体可被稳定整合到受试者的基因组中。在具体实施方案中，例如，可以使用对某些细胞或组织特异并在细胞中持续存在的病毒载体。合适的药物运载体和赋形剂是本领域众所周知的。根据本公开制备的组合物可用于预防或治疗或延缓上文鉴定的疾病。

此外，本公开还涉及用于预防、治疗或改善肿瘤性疾病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的本文所涵盖的CD30阳性细胞、核酸序列、载体的步骤，如本文所设想的和/或通过本文设想的方法产生的。

对于其施用示例性细胞的一种或多种组合物的可能适应症是癌性疾病，包括任何种类的肿瘤性疾病。对于其施用CD30阳性细胞的一种或多种组合物的示例性适应症是癌性疾病，包括表达特定抗原的任何恶性肿瘤，包括CAR所针对的肿瘤。本公开的一种或多种组合物的施用可用于所有阶段和类型的癌症，包括例如最小残留疾病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难治性癌症。

产生的细胞的治疗有效量可通过多种途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内、瘤内、鞘内、心室内、通过贮库、关节内注射或输注。

用于过继细胞疗法的所产生的细胞的治疗有效量是在接受治疗的受试者中达到所需效果的量。例如，这可以是抑制进展或导致癌症消退所必需的免疫细胞的量。

可以在与疾病一致的治疗方案中施用产生的细胞群，例如在一至几天内的单次或几次剂量以改善疾病状态，或者在延长的时间内的定期剂量以抑制疾病进展并预防疾病复发。制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径以及疾病或病症的严重性，并且应该根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。细胞的治疗有效量将取决于所治疗的受试者、疾病的严重程度和类型以及施用方式。在一些实施方案中，可用于治疗人受试者的剂量范围为至少1x10³个、至少1x10⁴个、3.8×10⁴个、至少3.8×10⁵个、至少3.8×10⁶个、至少3.8×10⁷个、至少3.8×10⁸个、至少3.8×10⁹个或至少3.8×10¹⁰个T细胞/m²。在某个实施方案中，用于治疗人受试者的剂量范围为约3.8×10⁹至约3.8×10¹⁰个T细胞/m²。在另外的实施方案中，T细胞的治疗有效量可以从约5×10⁶个细胞/kg体重变化至约7.5×10⁸个细胞/kg体重，诸如从约2×10⁷个细胞/kg体重变化至约5×10⁸个细胞/kg体重，或从约5×10⁷个细胞/kg体重变化至约2×10⁸个细胞/kg体重。T细胞的确切量可由本领域技术人员根据受试者的年龄、体重、性别和生理状况来容易地确定。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统得出的剂量-反应曲线中推断出来。

本公开还包括与其它通过免疫细胞起作用的化合物(例如双特异性抗体构建体、靶向毒素或其它化合物)的共施用方案。用于一种或多种本发明化合物的共施用的临床方案可包括在施用另外的组分的同时、之前或之后共施用。特定的组合疗法包括化学疗法、放射疗法、手术、激素疗法或其它类型的免疫疗法。

实施方案涉及包含本文定义的细胞、本文定义的构建体、本文定义的核酸序列、本文定义的载体和/或本文定义的宿主的药盒。还设想了本公开的药盒包含单独的或与待向需要医学治疗或干预的个体施用的其它药物组合的上文所述的药物组合物。

XV.本公开的药盒

本文所述的任何组合物都可以包含在药盒中。在非限制性实例中，药盒包含CD30分子、包含CD30分子的细胞、编码特定CD30蛋白或CD30融合蛋白的载体、编码一种或多种异源蛋白质的载体和/或产生所述异源蛋白质的试剂，并且这些中的任一种都可以包含在本公开的药盒的合适容器装置中。药盒可包含免疫细胞、载体(无论是否为病毒)、用于插入载体的表达构建体多核苷酸等。可以包含用于扩增任何多核苷酸的引物。在一些情况下，药盒包含冷冻保存的细胞，包括CD30阳性细胞。可以包括用于细胞转染或转导的任何试剂。

药盒的组合物可被包装在水性介质中或以冻干形式包装。药盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，其中可以放入一种或多种组分，并且优选适当地等分所述组分。当药盒中有超过一种组分时，药盒通常还可包含第二个、第三个或其它额外的容器，附加的组分可以单独放入其中。然而，可将组分的各种组合包含在小瓶中。本公开的药盒通常还包括用于容纳分子、包含所述分子的细胞和/或试剂以在封闭的环境中产生所述分子、细胞和试剂以供商业销售的装置。此类容器可包括注射容器或吹塑塑料容器，所需的小瓶保留在其中。

当药盒的组分以一种和/或多种液体溶液的形式提供时，液体溶液是水溶液，其中特别地设想了无菌水溶液。组合物也可被配制成可注射的组合物。在这种情况下，容器装置本身可以是注射器、移液管和/或其它类似的装置，由此可以将制剂施用到身体的感染区域，注射到动物体内，和/或甚至施用到药盒的另外组分上和/或与之混合。

然而，药盒的组分可以以一种或多种干粉的形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可以通过添加合适的溶剂来复原粉末。设想了溶剂也可以在另一个容器装置中提供。

不考虑容器的数量和/或类型，本公开的药盒也可以包括用于帮助最终组合物在动物体内的注射/施用和/或放置的器械和/或包装有所述器械。这种器械可以是注射器、移液管、镊子和/或任何这种医学上认可的递送媒介物。在一些实施方案中，药盒中包含用于离体使用的试剂或装置或容器。

XVI.实施例

包括以下实施例来说明本发明的某些实施方案。本领域技术人员应该理解，在下面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术，因此可被认为构成了用于其实践的某些模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应该理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得类似或相似的结果。

实施例1-BCMA胞外结构域在293T细胞上的表达

用含有以下三种不同膜结合受体之一的质粒转染293T细胞：与PD-L1铰链和跨膜结构域融合的BCMA胞外结构域、与CD8α铰链和跨膜结构域融合的BCMA胞外结构域，以及全长野生型BCMA。下表2中描述了所述多肽。每个受体都通过P2A肽与增强型GFP连接。转染一天后，将细胞用缀合有APC的抗BCMA单克隆抗体染色(图1)。

表2

实施例2-有或无内化基序的BCMA胞外结构域在治疗性T细胞中的表达

用共表达CD19 CAR和以下两种不同BCMA融合构建体之一的慢病毒载体转导用BCL6和BCL2L1转导的原代T细胞：具有PD-L1铰链和跨膜结构域但无功能性胞内结构域的BCMA胞外结构域，(示于图2的左图上)或与PD-L1铰链和跨膜结构域融合的BCMA胞外结构域和来自Trop-2的胞质结构域(tBCMA；示于图2的中图上)。下表3中描述了所述多肽。

将细胞用缀合有APC的抗BCMA抗体和重组FITC标记的CD19-Fc蛋白染色(图2)。结果显示嵌合BCMA蛋白表达与CD19 CAR表达一致，表明嵌合BCMA蛋白可用作治疗性T细胞的转导标志物。

表3

实施例3-转导到治疗性T细胞中的BCMA融合蛋白可用于使用抗BCMA珠富集T细胞

如实施2中所述，转导用BCL6和BCL2L1转导的原代T细胞，用缀合有APC的抗BCMA抗体染色，然后用抗APC磁珠富集。扩增2周后，用缀合有APC的抗BCMA抗体和重组FITC标记的CD19-Fc蛋白对细胞进行染色，以检查转导细胞的纯度(图3)。结果表明，通过磁珠分离显著富集了BCMA和抗CD19 CAR双阳性群体。

实施例4-作为消除T细胞的安全开关的包含Trop2胞质结构域的融合蛋白

用BCMA融合蛋白转导并如实施例3所述富集用BCL6和BCL2L1转导的原代T细胞，在浓度为0μg/mL、5μg/mL或20μg/mL的贝兰妥单抗莫福汀(靶向BCMA的抗体-药物缀合物)不存在或存在的情况下进行培养。在第2天，使用计数珠通过流式细胞术对活细胞进行计数，并计算与无药物相比，使用贝兰妥单抗莫福汀的活细胞的百分比变化(图4)。结果表明，表达具有Trop-2胞内结构域的BCMA(tBCMA)的治疗性T细胞对贝兰妥单抗莫福汀的细胞毒性活性高度敏感。

实施例5-有或无胞质尾的BCMA胞外结构域在Jurkat细胞上的表达

用慢病毒载体转导Jurkat细胞，所述慢病毒载体仅表达BCMA胞外结构域、表达与来自CD317的胞质结构域融合的BCMA胞外结构域或与来自CD3γ的胞质结构域融合的BCMA胞外结构域。下表4中描述了所述多肽。

在浓度为25μg/mL或12.5μg/mL的贝兰妥单抗莫福汀不存在或存在的情况下培养细胞。4天后，用不含贝兰妥单抗的新培养基更换培养基。再培养7天后，通过流式细胞术测定BCMA阳性细胞的百分比(图5)。结果表明，BCMA阳性细胞的百分比以剂量依赖性方式降低，这表明了贝兰妥单抗对BCMA阳性细胞的特异性杀伤。

表4

实施例6-作为安全开关的CD30

通过BCL6和BCL2L1基因的过表达在T细胞上可诱导或维持T细胞上CD30的表达。将BCL6和BCL2L1基因转染到原代T细胞中。通过流式细胞术测量CD30和CD69的表达(图6)。CD30在αβ和γδT细胞(>99％的细胞)上组成性表达。相反，体外培养4周后，约15％的原代T细胞表达CD30。因此，CD30可用作生产过程中的选择标志物，用作输注后监测患者的转导标志物，以及用作在严重不良事件的情况下消除治疗细胞的安全开关。

实施例7-在表达CD30的治疗性T细胞中使用CD30作为安全开关

在递增浓度的维布妥昔单抗不存在或存在的情况下培养用表达CD30的BCL6和BCL2L1转导的原代T细胞。不表达CD30的Raji Burkitt淋巴瘤肿瘤细胞用作对照。收获细胞，用活/死染色剂染色，并在第1、2、3和4天使用计数珠通过流式细胞术测定活细胞的绝对数量。测定与本妥昔单抗不存在的情况下培养的细胞相比的活细胞数量的百分比变化，并显示在图7的图中。数据表明，与对照Raji细胞相比，表达CD30的T细胞被高效杀死(高达95％)。在更高的浓度和更长的孵育时间下观察到非特异性细胞毒性。

实施例8-与BCMA胞质尾融合的CD30胞外域可以在293T细胞上表达

用慢病毒载体转导293T细胞，所述慢病毒载体表达CD19 CAR以及Her2结构域4和与BCMA胞质尾融合的CD30胞外结构域(图8中所示的示意图)。下表5中描述了所述多肽。用抗CD30和缀合有AF647的曲妥珠单抗对转导的293T进行染色(图9)。将转导的293T细胞在不同浓度的本妥昔单抗存在的情况下培养4天，在第4天使用流式计数珠对Her2阳性(也预期为CD30阳性)和Her2阴性(也预期为CD30阴性)293T细胞的细胞数量变化进行计数(图9，右图)。结果表明，CD30阳性(Her2阳性)293T细胞的活细胞计数与对照相比显著减少。

表5

实施例9-表达Her2结构域4的Jurkat细胞可被CAR-T细胞杀死

用表达CD19 CAR以及Her2和截短的EGFR的慢病毒载体(图10中显示的示意图)转导Jurkat T细胞。下表6中描述了所述多肽。转导的细胞在曲妥珠单抗和表达CD16的CAR-T细胞存在的情况下被杀死(图11A-图11B)。图11A显示了通过分别用CD19-Fc融合蛋白和缀合有AF647的曲妥珠单抗染色检测的CD19 CAR和Her2结构域4的表达。图11B显示了在曲妥珠单抗存在的情况下与表达CD16的CAR-T共培养时活Jurkat细胞的百分比变化。

表6

实施例10-作为安全开关的Trop 2

使用LIPOFECTAMINE^TM3000，用含有抗CD19 CAR、Her2结构域IV和Trop2基因的慢病毒质粒(图12中所示的示意图)转染293T细胞。下表7描述了所述多肽。转染后24小时进行流式细胞术分析(图13)。数据显示抗CD19 CAR和Trop2在转染细胞中的共表达。

表7

实施例11-作为安全开关的EGFR的结构域3和部分结构域4

用含有CD19 CAR以及Her2和截短的EGFR的慢病毒质粒(EGFR结构域3-部分结构域4和CD8铰链和TM；图14中显示的构建体示意图)转染293T细胞。下表8中提供了截短的EGFR(EGFR结构域3-部分结构域4和CD8铰链和TM)的序列。数据显示通过CD19-Fc融合蛋白和缀合有AF647的西妥昔单抗检测的抗CD19 CAR和截短的EGFR在转染的细胞中的共表达(图15，右图)。图15，左图显示未转导的293T细胞。

表8

实施例12-tBCMA安全开关具有体外和体内功效

在递增浓度的贝兰妥单抗莫福汀(一种抗BCMA抗体药物-缀合物)不存在或存在的情况下培养用BCL6和BCL2L1+/-CD19 CAR转导并表达截短的BCMA(tBCMA)的原代T细胞。不表达BCMA的Raji Burkitt淋巴瘤肿瘤细胞用作对照。收获细胞，用活/死染色剂染色，并在第2天使用计数珠通过流式细胞术测定活细胞的绝对数量。与本妥昔单抗不存在时培养的细胞相比，测定活细胞数量的百分比变化，并显示在图中。数据表明，与对照Raji细胞相比，表达BCMA的T细胞被高效杀死(高达80％)。在较高浓度下观察到非特异性细胞毒性。

将用BCL6、BCL2L1、CD19 CAR、tBCMA、荧光素酶和IL-15转导的原代T细胞在第0天通过尾静脉IV注射入NSG小鼠IV(2x10⁶个细胞/小鼠)。在第3天于小鼠3和4中以及在第11天于小鼠1和2中，通过尾静脉以2.5mg/kg体重的剂量IV注射贝兰妥单抗莫福汀。在指定的时间点通过生物发光成像监测T细胞的扩增和持续。数据表明，当在体内强劲扩增之前(小鼠3和4)或之后(小鼠1和2)注射时，T细胞可用贝兰妥单抗莫福汀非常高效地根除。

***

鉴于本公开内容，可以在不进行过度实验的情况下进行和执行本文公开和要求保护的所有方法。尽管已经根据优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员而言明显的是，可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下对所述方法以及本文所描述的方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，将明显的是，化学和生理相关的某些剂可以替代本文所述的剂，而将获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似的替代和修改都被认为在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

Claims

1.一种嵌合多肽，其包含：

(a)来自B细胞成熟抗原(BCMA)的胞外结构域；

(b)来自程序性细胞死亡1配体1(PDL1)的铰链区；

(c)跨膜结构域；和

(d)胞内区。

2.权利要求1的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:19至少95％一致的氨基酸序列。

3.权利要求2的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含SEQ ID NO:19。

4.权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述胞外结构域由SEQ ID NO:19组成。

5.权利要求1-4中任一项的嵌合多肽，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:23。

6.权利要求5的嵌合多肽，其中所述铰链区由SEQ ID NO:23组成。

7.权利要求1-6中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是T细胞受体的α链或β链或来自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。

8.权利要求1-7中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。

9.权利要求1-8中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26至少95％一致的氨基酸序列。

10.权利要求9的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:26。

11.权利要求10的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO:26组成。

12.权利要求1-6中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是来自PDL1的跨膜结构域。

13.权利要求12的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:25至少95％一致的氨基酸序列。

14.权利要求13的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:25。

15.权利要求14的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO:25组成。

16.权利要求1-15中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含序列RLR(SEQ ID NO:29)。

17.权利要求16的嵌合多肽，其中所述胞内区由序列RLR(SEQ ID NO:29)组成。

18.权利要求1-11中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含SEQ ID NO:31。

19.权利要求18的嵌合多肽，其中所述胞内区由SEQ ID NO:31组成。

20.权利要求1-11中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含SEQ ID NO:32。

21.权利要求20的嵌合多肽，其中所述胞内区由SEQ ID NO:32组成。

22.权利要求1-11中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含与SEQ ID NO:40至少95％一致的氨基酸序列。

23.权利要求22的嵌合多肽，其中所述胞内区包含SEQ ID NO:40。

24.权利要求23的嵌合多肽，其中所述胞内区由SEQ ID NO:40组成。

25.权利要求1-24中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含至多25个氨基酸。

26.权利要求1-25中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含至多20个氨基酸。

27.权利要求1-26中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含至多10个氨基酸。

28.权利要求1-27中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含至多6个氨基酸。

29.权利要求1-28中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含至多3个氨基酸。

30.权利要求1-29中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽的长度小于或等于100个氨基酸。

31.权利要求1-30中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含信号传导结构域。

32.权利要求1-31中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含来自BCMA的胞内区。

33.权利要求1-32中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:1至少95％一致的氨基酸序列。

34.权利要求33的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:1至少99％一致的氨基酸序列。

35.权利要求34的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:1。

36.一种包含与SEQ ID NO:1至少95％一致的氨基酸序列的嵌合多肽。

37.一种包含SEQ ID NO:1的嵌合多肽。

38.一种由SEQ ID NO:1组成的嵌合多肽。

39.权利要求1-32中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:38至少95％一致的氨基酸序列。

40.权利要求39的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:38至少99％一致的氨基酸序列。

41.权利要求40的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:38。

42.一种包含与SEQ ID NO:38至少95％一致的氨基酸序列的嵌合多肽。

43.一种包含SEQ ID NO:38的嵌合多肽。

44.一种由SEQ ID NO:38组成的嵌合多肽。

45.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-44中任一项的嵌合多肽的核苷酸序列。

46.权利要求45所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:2至少95％一致的核酸序列。

47.权利要求46的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:2。

48.权利要求45所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:39至少95％一致的核酸序列。

49.权利要求48的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:39。

50.一种载体，其包含权利要求45-49中任一项的核酸分子。

51.一种产生工程化的细胞的方法，其包括将权利要求1-44中任一项的嵌合多肽、权利要求45-49中任一项的核酸分子或权利要求50的载体引入细胞。

52.一种工程化的细胞，其包含权利要求1-44中任一项的嵌合多肽、权利要求45-49中任一项的核酸分子或权利要求50的载体。

53.权利要求52的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是T细胞。

54.权利要求53的工程化的细胞，其中所述T细胞是CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞或调节性T细胞。

55.权利要求52的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是天然杀伤细胞。

56.权利要求52的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。

57.权利要求52的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是iPSC衍生细胞。

58.权利要求52-57中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)。

59.权利要求58的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述CAR有效连接。

60.权利要求52-59中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含T细胞受体(TCR)。

61.权利要求60的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述TCR有效连接。

62.一种工程化的细胞群，其包含权利要求52-61中任一项的工程化的细胞。

63.一种用于检测、分离、耗竭或纯化权利要求52-61中任一项的工程化的细胞的方法，所述方法包括将所述工程化的细胞与BCMA结合蛋白接触。

64.权利要求63的方法，其中所述BCMA结合蛋白是抗BCMA抗体或其抗原结合片段。

65.权利要求63或64的方法，所述方法还包括使用所述BCMA结合蛋白从细胞群体中分离所述细胞。

66.权利要求63-65中任一项的方法，所述方法还包括用显像剂检测所述细胞，其中所述BCMA结合蛋白与所述显像剂连接。

67.权利要求63或64的方法，其中所述BCMA结合蛋白与细胞毒性剂连接。

68.权利要求67的方法，其中与细胞毒性剂连接的所述BCMA结合蛋白是贝兰妥单抗莫福汀。

69.权利要求63-68中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述BCMA结合蛋白接触是在体外进行的。

70.权利要求63-68中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述BCMA结合蛋白接触是离体进行的。

71.权利要求63-68中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述BCMA结合蛋白接触是在体内进行的。

72.一种嵌合多肽，其包含：

(a)组织型纤溶酶原激活物(tPA)信号肽；

(b)来自BCMA的胞外结构域；

(c)铰链区；

(d)跨膜结构域；和

(e)胞内区。

73.权利要求72的嵌合多肽，其中所述tPA信号肽包含与SEQ ID NO:34至少95％序列一致的序列。

74.权利要求73的嵌合多肽，其中所述tPA信号肽包含SEQ ID NO:34。

75.权利要求74的嵌合多肽，其中所述tPA信号肽由SEQ ID NO:34组成。

76.权利要求72-75中任一项的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:19至少95％一致的氨基酸序列。

77.权利要求76的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含SEQ ID NO:19。

78.权利要求77所述的嵌合多肽，其中所述胞外结构域由SEQ ID NO:19组成。

79.权利要求72-78中任一项的嵌合多肽，其中所述铰链区包含CD8α铰链、PDL1铰链、IgG4铰链、IgG1铰链或CD34铰链。

80.权利要求79的嵌合多肽，其中所述铰链区是来自PDL1的铰链区。

81.权利要求80的嵌合多肽，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:23。

82.权利要求81的嵌合多肽，其中所述铰链区由SEQ ID NO:23组成。

83.权利要求79的嵌合多肽，其中所述铰链区是来自CD8α的铰链区。

84.权利要求83的嵌合多肽，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:24。

85.权利要求84的嵌合多肽，其中所述铰链区由SEQ ID NO:24组成。

86.权利要求72-85中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是T细胞受体的α链或β链或来自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137或CD154的跨膜结构域。

87.权利要求72-86中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域是来自CD8α的跨膜结构域。

88.权利要求72-87中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26至少95％一致的氨基酸序列。

89.权利要求88的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:26。

90.权利要求89的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO:26组成。

91.权利要求72-90中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区是来自CD8α的胞内区的一部分。

92.权利要求72-91中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含至多10个氨基酸。

93.权利要求72-92中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含至多6个氨基酸。

94.权利要求72-93中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含SEQ ID NO:30。

95.权利要求94的嵌合多肽，其中所述胞内区由SEQ ID NO:30组成。

96.权利要求72-87中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽的长度小于或等于150个氨基酸。

97.权利要求72-96中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含信号传导结构域。

98.权利要求72-97中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含来自BCMA的胞内区。

99.权利要求72-98中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:3至少95％一致的氨基酸序列。

100.权利要求99的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:3。

101.一种包含与SEQ ID NO:3至少95％一致的氨基酸序列的嵌合多肽。

102.一种包含SEQ ID NO:3的嵌合多肽。

103.一种由SEQ ID NO:3组成的嵌合多肽。

104.一种核酸分子，其包含编码权利要求72-103中任一项的嵌合多肽的核苷酸序列。

105.权利要求104所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:4至少95％一致的核酸序列。

106.权利要求105的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:4。

107.一种载体，其包含权利要求104-106中任一项的核酸分子。

108.一种产生工程化的细胞的方法，其包括将权利要求72-103中任一项的嵌合多肽、权利要求104-106中任一项的核酸分子或权利要求107的载体引入细胞。

109.一种工程化的细胞，其包含权利要求72-103中任一项的嵌合多肽、权利要求104-106中任一项的核酸分子或权利要求107的载体。

110.权利要求109的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是T细胞。

111.权利要求110的工程化的细胞，其中所述T细胞是CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞或调节性T细胞。

112.权利要求109的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是天然杀伤细胞。

113.权利要求109的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是iPSC。

114.权利要求109的工程化的细胞，其中所述细胞是iPSC衍生细胞。

115.权利要求109-114中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含CAR。

116.权利要求115的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述CAR有效连接。

117.权利要求109-116中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含TCR。

118.权利要求117的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述TCR有效连接。

119.一种用于检测、分离、耗竭或纯化权利要求109-118中任一项的工程化的细胞的方法，所述方法包括将所述工程化的细胞与BCMA结合蛋白接触。

120.权利要求119的方法，其中所述BCMA结合蛋白是抗BCMA抗体或其抗原结合片段。

121.权利要求119或120的方法，所述方法还包括使用所述BCMA结合蛋白从细胞群体中分离所述细胞。

122.权利要求119或120的方法，所述方法还包括用显像剂检测所述细胞，其中所述BCMA结合蛋白与所述显像剂连接。

123.权利要求119的方法，其中所述BCMA结合蛋白与细胞毒性剂连接。

124.权利要求123的方法，其中与细胞毒性剂连接的所述BCMA结合蛋白是贝兰妥单抗莫福汀。

125.权利要求119-124中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述BCMA结合蛋白接触是在体外进行的。

126.权利要求119-124中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述BCMA结合蛋白接触是离体进行的。

127.权利要求119-124中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述BCMA结合蛋白接触是在体内进行的。

128.一种嵌合多肽，其包含：

(a)来自CD30的胞外结构域；

(b)来自CD30的跨膜结构域；和

(c)来自BCMA的胞内区。

129.权利要求128的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:20至少95％一致的氨基酸序列。

130.权利要求129的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含SEQ ID NO:20。

131.权利要求130所述的嵌合多肽，其中所述胞外结构域由SEQ ID NO:20组成。

132.权利要求128-131中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:27至少95％一致的氨基酸序列。

133.权利要求132的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:27。

134.权利要求132或133的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO:27组成。

135.权利要求128-134中任一项的嵌合多肽，其中所述胞内区包含与SEQ ID NO:33至少95％一致的氨基酸序列。

136.权利要求135的嵌合多肽，其中所述胞内区包含SEQ ID NO:33。

137.权利要求135或136的嵌合多肽，其中所述胞内区由SEQ ID NO:33组成。

138.权利要求128-137中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含信号传导结构域。

139.权利要求128-138中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含来自CD30的胞内区。

140.权利要求128-139中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:9至少95％一致的氨基酸序列。

141.权利要求128-140中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:9至少99％一致的氨基酸序列。

142.权利要求128-141中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:9。

143.一种包含与SEQ ID NO:9至少95％一致的氨基酸序列的嵌合多肽。

144.一种包含SEQ ID NO:9的嵌合多肽。

145.一种由SEQ ID NO:9组成的嵌合多肽。

146.一种核酸分子，其包含编码权利要求128-145中任一项的嵌合多肽的核苷酸序列。

147.权利要求146所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:10至少95％一致的核酸序列。

148.权利要求146或147的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:10。

149.一种载体，其包含权利要求146-148中任一项的核酸分子。

150.一种产生工程化的细胞的方法，其包括将权利要求128-145中任一项的嵌合多肽、权利要求146-148中任一项的核酸分子或权利要求149的载体引入细胞。

151.一种工程化的细胞，其包含权利要求128-145中任一项的嵌合多肽、权利要求146-148中任一项的核酸分子或权利要求149的载体。

152.权利要求151的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是T细胞。

153.权利要求152的工程化的细胞，其中所述T细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞或调节性T细胞。

154.权利要求151的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是天然杀伤细胞。

155.权利要求151的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是iPSC。

156.权利要求151的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是iPSC衍生细胞。

157.权利要求151-156中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含CAR。

158.权利要求157的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述CAR有效连接。

159.权利要求151-156中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含TCR。

160.权利要求159的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述TCR有效连接。

161.一种工程化的细胞群，其包含权利要求151-160中任一项的工程化的细胞。

162.一种用于检测、分离、耗竭或纯化权利要求151-160中任一项的工程化的细胞的方法，所述方法包括将所述工程化的细胞与CD30结合蛋白接触。

163.权利要求162的方法，其中所述CD30结合蛋白是抗CD30抗体或其抗原结合片段。

164.权利要求162或163的方法，所述方法还包括使用所述CD30结合蛋白从细胞群中分离所述细胞。

165.权利要求162或163的方法，所述方法还包括用显像剂检测所述细胞，其中所述CD30结合蛋白与所述显像剂连接。

166.权利要求162或163的方法，其中所述CD30结合蛋白与细胞毒性剂连接。

167.权利要求162-166中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述CD30结合蛋白接触是在体外进行的。

168.权利要求162-166中任一项的方法，其中将所述工程化细胞与所述CD30结合蛋白接触是在离体进行的。

169.权利要求162-166中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述CD30结合蛋白接触是在体内进行的。

170.一种嵌合多肽，其包含：

(a)不是Her2信号肽的信号肽；

(b)来自Her2的胞外结构域；和

(c)来自Her2的跨膜结构域。

171.权利要求170的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含胞内区。

172.权利要求170或171的嵌合多肽，其中所述信号肽是来自CD8α的信号肽。

173.权利要求172的嵌合多肽，其中所述信号肽包含与SEQ ID NO:35至少95％一致的氨基酸序列。

174.权利要求173的嵌合多肽，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:35。

175.权利要求174的嵌合多肽，其中所述信号肽由SEQ ID NO:35组成。

176.权利要求170-175中任一项的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含与SEQ ID NO:21至少95％一致的氨基酸序列。

177.权利要求176的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含SEQ ID NO:21。

178.权利要求177所述的嵌合多肽，其中所述胞外结构域由SEQ ID NO:21组成。

179.权利要求170-178中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:28至少95％一致的氨基酸序列。

180.权利要求179的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:28。

181.权利要求180的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO:28组成。

182.权利要求170-181中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:11至少95％一致的氨基酸序列。

183.权利要求170-182中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:11至少99％一致的氨基酸序列。

184.权利要求170-183中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:11。

185.一种包含与SEQ ID NO:11至少95％一致的氨基酸序列的嵌合多肽。

186.一种包含SEQ ID NO:11的嵌合多肽。

187.一种由SEQ ID NO:11组成的嵌合多肽。

188.一种核酸分子，其包含编码权利要求170-187中任一项的嵌合多肽的核苷酸序列。

189.权利要求188的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:12至少95％一致的核酸序列。

190.权利要求189的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:12。

191.一种载体，其包含权利要求188-190中任一项的核酸分子。

192.一种产生工程化的细胞的方法，其包括将权利要求170-187中任一项的嵌合多肽、权利要求188-190中任一项的核酸分子或权利要求191的载体引入细胞。

193.一种工程化的细胞，其包含权利要求170-187中任一项的嵌合多肽、权利要求188-190中任一项的核酸分子或权利要求191的载体。

194.权利要求193的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是T细胞。

195.权利要求194的工程化的细胞，其中所述T细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞或调节性T细胞。

196.权利要求193的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是天然杀伤细胞。

197.权利要求193的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是iPSC。

198.权利要求193的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是iPSC衍生细胞。

199.权利要求193-198中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含CAR。

200.权利要求199的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述CAR有效连接。

201.权利要求193-198中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含TCR。

202.权利要求201的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述TCR有效连接。

203.一种工程化的细胞群，其包含权利要求193-202中任一项的工程化的细胞。

204.一种用于检测、分离、耗竭或纯化权利要求193-202中任一项的工程化的细胞的方法，所述方法包括将所述工程化的细胞与Her2结合蛋白接触。

205.权利要求204的方法，其中所述Her2结合蛋白是抗Her2抗体或其抗原结合片段。

206.权利要求204或205的方法，所述方法还包括使用所述Her2结合蛋白从细胞群中分离所述细胞。

207.权利要求204或205的方法，所述方法还包括用显像剂检测所述细胞，其中所述Her2结合蛋白与所述显像剂连接。

208.权利要求204或205的方法，其中所述Her2结合蛋白与细胞毒性剂连接。

209.权利要求208的方法，其中与所述细胞毒性剂连接的所述Her2结合蛋白是恩美曲妥珠单抗。

210.权利要求204-209中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述Her2结合蛋白接触是在体外进行的。

211.权利要求204-209中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述Her2结合蛋白接触是离体进行的。

212.权利要求204-209中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述Her2结合蛋白接触是在体内进行的。

213.一种包含编码Trop2多肽的核酸的工程化的免疫细胞。

214.权利要求213的工程化免疫细胞，其中所述Trop2多肽包含SEQ ID NO:15。

215.权利要求213或214的工程化免疫细胞，其中所述核酸包含与SEQ ID NO:16至少95％一致的核酸序列。

216.权利要求215的工程化免疫细胞，其中所述核酸包含SEQ ID NO:16。

217.权利要求213-216中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞是T细胞。

218.权利要求217的工程化的免疫细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞或调节性T细胞。

219.权利要求213-216中任一项的工程化的免疫细胞，其中所述工程化的免疫细胞是天然杀伤细胞。

220.权利要求213-219中任一项的工程化的免疫细胞，所述细胞还包含CAR。

221.权利要求220的工程化的免疫细胞，其中所述嵌合多肽与所述CAR有效连接。

222.权利要求213-216中任一项的工程化的免疫细胞，所述细胞还包含TCR。

223.权利要求222的工程化的免疫细胞，其中所述嵌合多肽与所述TCR有效连接。

224.一种工程化的细胞群，其包含权利要求213-223中任一项的工程化的免疫细胞。

225.一种用于检测、分离、耗竭或纯化权利要求213-223中任一项的工程化的细胞的方法，所述方法包括将所述工程化的细胞与Trop2结合蛋白接触。

226.权利要求225的方法，其中所述Trop2结合蛋白是抗Trop2抗体或其抗原结合片段。

227.权利要求225或226的方法，所述方法还包括使用所述Trop2结合蛋白从细胞群中分离所述细胞。

228.权利要求225或226的方法，所述方法还包括用显像剂检测所述细胞，其中所述Trop2结合蛋白与所述显像剂连接。

229.权利要求225或226的方法，其中所述Trop2结合蛋白与细胞毒性剂连接。

230.权利要求229的方法，其中与细胞毒性剂连接的所述Trop2结合蛋白是戈沙妥珠单抗。

231.权利要求225-230中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述Trop2结合蛋白接触是在体外进行的。

232.权利要求225-230中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述Trop2结合蛋白接触是离体进行的。

233.权利要求225-230中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述Trop2结合蛋白接触是在体内进行的。

234.一种嵌合多肽，其包含：

(a)信号肽；

(b)胞外区，其包含(i)EGFR结构域III和(ii)长度小于100个氨基酸的EGFR结构域IV的一部分；

(c)铰链区域；和

(d)跨膜结构域。

235.权利要求234的嵌合多肽，其中EGFR结构域IV的所述部分具有少于50个氨基酸的长度。

236.权利要求235的嵌合多肽，其中EGFR结构域IV的所述部分具有33个氨基酸的长度。

237.权利要求234-236中任一项的嵌合多肽，其中所述信号肽是来自GM-CSFRα的信号肽。

238.权利要求237的嵌合多肽，其中所述信号肽包含与SEQ ID NO:36至少95％一致的氨基酸序列。

239.权利要求238的嵌合多肽，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:36。

240.权利要求239的嵌合多肽，其中所述信号肽由SEQ ID NO:36组成。

241.权利要求234-240中任一项的嵌合多肽，其中所述胞外区包含与SEQ ID NO:22至少95％一致的氨基酸序列。

242.权利要求241的嵌合多肽，其中所述胞外区包含SEQ ID NO:22。

243.权利要求242的嵌合多肽，其中所述胞外区由SEQ ID NO:22组成。

244.权利要求234-243中任一项的嵌合多肽，其中所述铰链区是来自CD8的铰链区。

245.权利要求244的嵌合多肽，其中所述铰链区包含与SEQ ID NO:37至少95％一致的氨基酸序列。

246.权利要求245的嵌合多肽，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:37。

247.权利要求246的嵌合多肽，其中所述铰链区由SEQ ID NO:37组成。

248.权利要求234-247中任一项的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:26至少95％一致的氨基酸序列。

249.权利要求248的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:26。

250.权利要求249的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域由SEQ ID NO:26组成。

251.权利要求234-250中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含信号传导结构域。

252.权利要求234-251中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽不包含来自EGFR的胞内区。

253.权利要求234-252中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:15至少95％一致的氨基酸序列。

254.权利要求234-253中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含与SEQ ID NO:15至少99％一致的氨基酸序列。

255.权利要求234-254中任一项的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽包含SEQ ID NO:15。

256.一种包含与SEQ ID NO:15至少95％一致的氨基酸序列的嵌合多肽。

257.一种包含SEQ ID NO:15的嵌合多肽。

258.一种由SEQ ID NO:15组成的嵌合多肽。

259.一种核酸分子，其包含编码权利要求234-258中任一项的嵌合多肽的核苷酸序列。

260.权利要求259所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含与SEQ ID NO:16至少95％一致的核酸序列。

261.权利要求260的核酸分子，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:16。

262.一种载体，其包含权利要求259-261中任一项的核酸分子。

263.一种产生工程化的细胞的方法，其包括将权利要求234-258中任一项的嵌合多肽、权利要求259-261中任一项的核酸分子或权利要求262的载体引入细胞。

264.一种工程化的细胞，其包含权利要求234-258中任一项的嵌合多肽、权利要求259-261中任一项的核酸分子或权利要求262的载体。

265.权利要求264的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是T细胞。

266.权利要求265的工程化的细胞，其中所述T细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、iNKT细胞、NKT细胞、γδT细胞或调节性T细胞。

267.权利要求264的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是天然杀伤细胞。

268.权利要求264的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是iPSC。

269.权利要求264的工程化的细胞，其中所述工程化的细胞是iPSC衍生细胞。

270.权利要求264-269中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含CAR。

271.权利要求270的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述CAR有效连接。

272.权利要求264-271中任一项的工程化的细胞，所述细胞还包含T细胞受体(TCR)。

273.权利要求264的工程化的细胞，其中所述嵌合多肽与所述TCR有效连接。

274.一种工程化的细胞群，其包含权利要求264-273中任一项的工程化的细胞。

275.一种用于检测、分离、耗竭或纯化权利要求264-273中任一项的工程化的细胞的方法，所述方法包括将所述工程化的细胞与EGFR结合蛋白接触。

276.权利要求275的方法，其中所述EGFR结合蛋白是抗EGFR抗体或其抗原结合片段。

277.权利要求275或276的方法，所述方法还包括使用所述EGFR结合蛋白从细胞群体中分离所述细胞。

278.权利要求275或276的方法，所述方法还包括用显像剂检测所述细胞，其中所述EGFR结合蛋白与所述显像剂连接。

279.权利要求275或276的方法，其中所述EGFR结合蛋白与细胞毒性剂连接。

280.权利要求275-279中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述EGFR结合蛋白接触是在体外进行的。

281.权利要求275-279中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述EGFR结合蛋白接触是离体进行的。

282.权利要求275-279中任一项的方法，其中将所述工程化的细胞与所述EGFR结合蛋白接触是在体内进行的。

283.一种用于检测、分离、耗竭或纯化细胞的方法，所述细胞包含：

(a)来自B细胞成熟抗原(BCMA)的胞外结构域；

(b)来自程序性细胞死亡1配体1(PDL1)的铰链区；

(c)跨膜结构域；和

(d)胞内区，

所述方法包括将所述细胞与BCMA结合蛋白接触。

284.一种用于检测、分离、耗竭或纯化细胞的方法，所述细胞包含：

(a)组织型纤溶酶原激活物(tPA)信号肽；

(b)来自BCMA的胞外结构域；

(c)铰链区；

(d)跨膜结构域；和

(e)胞内区，

所述方法包括将所述细胞与BCMA结合蛋白接触。

285.一种用于检测、分离、耗竭或纯化细胞的方法，所述细胞包含：

(a)来自CD30的胞外结构域；

(b)来自CD30的跨膜结构域；

(c)来自BCMA的胞内区，

所述方法包括将所述细胞与CD30结合蛋白接触。

286.一种用于检测、分离、耗竭或纯化细胞的方法，所述细胞包含：

(a)不是Her2信号肽的信号肽；

(b)来自Her2的胞外结构域；

(c)来自Her2的跨膜结构域，

所述方法包括将所述细胞与Her2结合蛋白接触。

287.一种用于检测、分离、耗竭或纯化工程化的免疫细胞的方法，所述工程化的免疫细胞包含Trop2多肽，所述方法包括将所述细胞与Trop2结合蛋白接触。

288.一种用于检测、分离、耗竭或纯化细胞的方法，所述细胞包含：

(a)信号肽；

(c)铰链区域；和

(d)跨膜结构域，

所述方法包括将所述细胞与EGFR结合蛋白接触。

289.一种表达构建体，其包含编码CD30融合蛋白的序列，其中所述融合蛋白包含与胞内结构域融合的所述CD30胞外结构域的至少一部分，所述胞内结构域包含胞吞或内化活性。

290.权利要求289的表达构建体，其中所述胞内结构域来自B细胞成熟抗原(BCMA)、trop-2、CD317、CD3γ、CD4、CD79b、低密度脂蛋白受体、CD19、CD22、CD25、CD33或其组合。

291.权利要求289或290的表达构建体，其中所述CD30融合蛋白包含所述CD30跨膜结构域。

292.权利要求289-291中任一项的表达构建体，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:47。

293.权利要求289-292中任一项的表达构建体，其中编码所述融合蛋白的所述序列包含SEQ ID NO:48。

294.一种分离的细胞，所述细胞包含权利要求289-293中任一项的表达构建体。

295.权利要求294的细胞，其中所述细胞是免疫细胞。

296.权利要求294或295的细胞，其中所述细胞是abT细胞、gdT细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、间充质干细胞(MSC)细胞、造血干细胞(HSC)、造血细胞、iPSC或其混合物。

297.权利要求294-296中任一项的细胞，其中所述细胞表达除所述CD30融合蛋白外的一种或多种异源蛋白质。

298.权利要求297的细胞，其中所述异源蛋白质是治疗性蛋白质、细胞因子、细胞因子与细胞因子受体的融合物、安全开关或其混合物。

299.权利要求298的细胞，其中所述治疗性蛋白质是工程化的抗原受体或抗体。

300.权利要求299的细胞，其中所述工程化的抗原受体靶向癌症抗原。

301.权利要求299或300的细胞，其中所述工程化的抗原受体是嵌合抗原受体、T细胞受体或B细胞受体。

302.权利要求8-21中任一项的细胞，其中所述细胞表达异源BCL6和BCL2L1基因。

303.权利要求294-302中任一项的细胞的分离群体，所述群体包含在合适的培养基中。

304.权利要求303的群体，所述群体被安置在贮藏库中。

305.权利要求303或304的群体，其中冷冻保存所述群体。

306.一种鉴定用(1)异源CD30基因、(2)包含至少部分CD30胞外结构域的CD30融合蛋白或(3)异源BCL6与一种或多种Bcl2家族基因的组合转导或转染的CD30阳性细胞的方法，其包括以下步骤：

用(1)异源CD30基因、(2)包含至少部分CD30胞外结构域的CD30融合蛋白或(3)异源BCL6与一种或多种Bcl2家族基因的组合转导或转染细胞；

将所述细胞暴露于有效量的结合CD30的剂；以及

直接或间接检测剂与所述细胞表面上的CD30的结合。

307.权利要求306的方法，其中所述暴露和检测步骤在所述细胞的制造期间和/或之后进行。

308.权利要求306或307的方法，所述方法还包括制造所述细胞的步骤。

309.权利要求306-308中任一项的方法，所述方法被进一步定义为：

用所述CD30融合蛋白转染或转导免疫细胞；

将所述免疫细胞暴露于有效量的结合CD30的抗体或抗体-药物缀合物；以及

直接或间接检测所述抗体或抗体-药物缀合物与所述细胞表面上CD30的结合。

310.权利要求306-309中任一项的方法，所述方法被进一步定义为：

用所述异源BCL6和一种或多种Bc l2家族基因转染或转导免疫细胞；

311.权利要求306-310中任一项的方法，其中在体外进行所述方法。

312.权利要求306-310中任一项的方法，其中在体内进行所述方法的至少一部分。

313.权利要求306-312中任一项的方法，其中所述细胞表达除所述CD30融合蛋白外的一种或多种异源蛋白质。

314.权利要求313的方法，其中所述异源蛋白质是治疗性蛋白质、细胞因子、细胞因子与细胞因子受体的融合物、安全开关或其混合物。

315.权利要求314的方法，其中所述治疗性蛋白质是工程化的抗原受体。

316.权利要求306-315中任一项的方法，所述方法还包括用除所述异源CD30或所述CD30融合蛋白外的异源蛋白质、或BCL6和一种或多种Bc l2家族基因转染或转化所述免疫细胞的步骤。

317.权利要求316的方法，其中从同一载体表达所述CD30融合蛋白和除所述CD30融合蛋白外的异源蛋白质或所述BCL6和一种或多种Bc l2家族基因。

318.权利要求316的方法，其中从不同载体表达所述CD30融合蛋白和除所述CD30融合蛋白外的异源蛋白质或所述BCL6和一种或多种Bc l2家族基因。

319.一种制造用于过继细胞疗法的免疫细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)用(1)异源CD30蛋白、(2)CD30融合蛋白或(3)异源BCL6与一种或多种Bc l2家族基因的组合转导或转染免疫细胞，其中所述免疫细胞分别表达(1)CD30、(2)CD30融合蛋白或(3)CD30；以及

(b)用一种或多种治疗性蛋白质转导或转染免疫细胞。

320.权利要求319的方法，其中所述步骤(a)在步骤(b)之前、与步骤(b)同时或在步骤(b)之后发生。

321.权利要求319的方法，其中步骤(a)中的所述转化或转染与步骤(b)中的转化或转染相同。

322.权利要求319-321中任一项的方法，其中(1)、(2)或(3)与所述治疗性蛋白质位于同一载体上。

323.权利要求319-321中任一项的方法，其中(1)、(2)或(3)在与所述治疗性蛋白质不同的载体上。

324.权利要求50-54中任一项的方法，其中在步骤(a)之后，分析来自所述方法的免疫细胞的在所述免疫细胞表面上表达的CD30的存在。

325.权利要求324的方法，其中所述分析包括流式细胞术、聚合酶链式反应或其组合。

326.权利要求319-325中任一项的方法，所述方法还包括向有需要的个体施用由所述方法产生的免疫细胞的步骤。

327.权利要求326的方法，其中监测所述个体中的免疫细胞。

328.权利要求326的方法，其中使用结合CD30的剂监测个体中的免疫细胞。

329.权利要求328的方法，其中所述剂是抗体或抗体-药物缀合物。

330.权利要求319-329中任一项的方法，其中所述个体表现出一种或多种来自所述免疫细胞的有害效应，并且向所述个体施用有效量的结合CD30的剂。

331.权利要求330的方法，其中所述个体表现出来自所述免疫细胞的毒性，并且向所述个体施用有效量的结合CD30的剂。

332.权利要求330的方法，其中所述个体表现出来自所述免疫细胞的移植物抗宿主病(GVHD),并且向所述个体施用有效量的结合CD30的剂。

333.权利要求329-332中任一项的方法，其中所述个体不再需要所述免疫细胞，并且向所述个体施用有效量的结合CD30的剂。

334.一种减少或预防个体中来自细胞疗法的一种或多种有害作用的方法，所述方法包括靶向所述细胞疗法的细胞表面上表达的CD30的步骤。

335.权利要求334的方法，所述方法被进一步定义为向所述个体施用有效量的一种或多种结合细胞上表达的CD30的剂。

336.权利要求335的方法，其中所述剂是抗体或抗体-药物缀合物。

337.权利要求336的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。

338.权利要求334-337中任一项的方法，其中所述有害作用包括GVHD、细胞因子释放综合征或免疫效应细胞相关神经毒性综合征。

339.权利要求334-338中任一项所述的方法，其中所述CD30是完整的CD30蛋白。

340.权利要求334-338中任一项的方法，其中所述CD30是包含至少部分胞外结构域的完整CD30蛋白的片段。

341.权利要求334-339中任一项的方法，其中所述CD30在所述免疫细胞上天然表达或在所述免疫细胞上天然异源表达。

342.权利要求334-339中任一项的方法，其中所述CD30在所述细胞上的表达是所述细胞表达异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因的结果。

343.权利要求334-340中任一项的方法，其中所述CD30是CD30融合蛋白。

344.权利要求343的方法，其中所述融合蛋白包含与胞内结构域融合的CD30胞外域的至少一部分，所述胞内结构域包含胞吞或内化活性。

345.权利要求344的方法，其中所述胞内结构域来自B细胞成熟抗原(BCMA)、trop-2、CD317、CD3γ、CD4、CD79b或其组合。

346.权利要求344或345的方法，其中所述CD30融合蛋白包含所述CD30跨膜结构域。

347.权利要求334-346中任一项的方法，其中在所述靶向步骤之前，在体内监测所述个体的细胞。

348.权利要求347的方法，其中使用一种或多种靶向CD30的剂来监测所述细胞。

349.权利要求348的方法，其中所述靶向CD30的剂是以足够低的量使用而不会抑制所述治疗性细胞的抗体。

350.权利要求334-349中任一项的方法，其中所述细胞疗法对于所述个体而言是自体的或同种异体的。

351.一种抑制细胞活性的方法，所述方法包括将用异源BCL6和一种或多种Bcl2家族基因的组合转导或转染的细胞暴露于有效量的结合CD30的剂的步骤。

352.权利要求351的方法，其中所述活性的抑制被进一步定义为诱导细胞凋亡。

353.权利要求351或352的方法，其中所述方法还包括检测所述剂与所述细胞上表达的CD30的结合。

354.权利要求351-353中任一项的方法，其中所述方法还包括用所述异源BCL6和用一种或多种Bc l2家族基因转导或转染细胞。

355.权利要求351-354中任一项的方法，其中所述细胞是T细胞。

356.权利要求351-355中任一项的方法，其中所述一种或多种Bc l2家族基因是BCL2L1。

357.一种抑制细胞活性的方法，所述方法包括将用包含CD30胞外结构域的至少一部分的CD30融合蛋白转导或转染的细胞暴露于有效量的结合CD30的剂的步骤。

358.权利要求357的方法，其中所述活性的抑制被进一步定义为诱导细胞凋亡。