CN114980907A - 增强细胞癌症治疗的t细胞死亡相关基因8(tdag8)调节 - Google Patents

Abstract

本公开的实施方案涵盖通过允许细胞更有效地用于癌症治疗(包括在实体瘤微环境中)来改善细胞疗法。在特定情况下，例如通过CRISPR基因编辑，修饰细胞以具有降低或抑制的T细胞死亡相关基因8(TDAG8)表达水平。在特定情况下，进一步修饰细胞以表达例如一种或多种工程化改造的受体、一种或多种细胞因子和任选的自杀基因。

Description

增强细胞癌症治疗的T细胞死亡相关基因8(TDAG8)调节

本申请要求于2020年1月19日提交的序列号为62/963,121的美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开的实施方案至少包括细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学领域，包括癌症医学。

背景技术

紧随着2017年美国食品药物管理局(FDA)核准用于治疗淋巴瘤和白血病患者的CAR-T细胞疗法，过继性细胞疗法已经迅速成为癌症免疫疗法领域的利益相关者的焦点。虽然这种治疗方式已经表现出前所未有的患者反应并且为某些血液学恶性病提供了显著的治愈潜力，但是在实体瘤中的成功仍然是难以捉摸的，部分是由于以低氧、酸性pH、营养消耗和免疫抑制为特征的实体瘤微环境的独特特征(Renner等人，2017)。酸度是实体瘤微环境的通用特征，其主要是因为酸性代谢物，例如，在低氧条件下由活跃糖酵解引起的乳酸(Huber等人，2017)。酸度介导免疫抑制、肿瘤进展和不良预后。具体地，组织酸中毒导致对免疫细胞介导的应答的抑制，例如天然杀伤(NK)细胞和T细胞的细胞毒性、细胞因子产生和肿瘤监督的降低。T细胞死亡相关基因8(TDAG8)，也称为G蛋白偶联受体65(GPR65)，是在免疫细胞(包括T细胞和NK细胞)以及癌细胞上表达的跨膜蛋白受体或pH传感器，其被细胞外酸度活化(Ludwig等人，2003；Ishii等人，2005；Onozawa等人，2012；Maghazachi等人，2004)。在遇到质子时，TDAG8通过经由负反馈回路调节细胞因子产生并诱导细胞凋亡来减少NK细胞和T细胞活化，因此充当免疫代谢检查点。TDAG8通过Gs/cAMP/蛋白激酶A(PKA)途径起作用，导致cAMP累积，其进而磷酸化cAMP应答元素结合蛋白(CREB，一种促进抗炎应答的转录因子)(Wang等人，2004；Robert和Mackay，2018；Wen等人，2010)。

本公开通过经由抑制TDAG8而操纵PKA途径以便促进实体瘤微环境中的活性来提供对癌症治疗领域中的长期需要的解决方案。

发明内容

本公开的实施方案包括与细胞疗法相关的方法和组合物，包括过继细胞疗法。本公开的特定实施方案涵盖用于癌症免疫疗法、抗病原体免疫疗法或两者的方法和组合物。病原体至少包括病毒、细菌、真菌和寄生虫。本公开涵盖免疫效应细胞疗法，所述免疫效应细胞疗法已出于将一种或多种特性赋予细胞以改善其功效的明确目的而得到改善。在具体实施方案中，修饰免疫效应细胞以允许它们更好地杀死靶细胞，例如癌细胞。在具体实施方案中，与不存在工程化改造相比，免疫效应细胞被工程化改造以具有一种或多种基因产物的减少的表达，所述基因产物允许工程化的细胞在实体瘤微环境中有效，尽管所述细胞对于缺乏实体瘤的癌症例如血液学癌症也是有效的。在特定实施方案中，工程化改造的细胞被更好地配备以有效杀死低氧的、具有酸性pH、具有营养消耗和/或经历免疫抑制的环境中的癌细胞。

在特定实施方案中，免疫效应细胞包含在组合物中并用于本文涵盖的方法中，所述免疫效应细胞已经工程化改造以具有减少的TDAG8(也称为GPR65)表达水平或具有对TDAG8表达的完全抑制，例如缺少通过本领域常规方法可检测的TDAG8表达。在特定实施方案中，内源TDAG8基因已经通过对TDAG8的基因组基因座的基因操作而被修饰。具有减少的或完全抑制的TDAG8表达的免疫效应细胞可以或可以不以另外的方式被人为修饰，例如表达一种或多种外源性提供的基因产物。在具体实施方案中，基因产物是受体、细胞因子、趋化因子、自杀基因或其组合。在特定情况下，受体是抗原受体，其中抗原可以是或可以不是癌症抗原，包括实体瘤细胞上的抗原。在具体的情况下，抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或非天然T细胞受体。

本公开从各种细胞疗法中使用的免疫效应细胞敲除或敲低编码TDAG8的基因(TDAG8或GPR65)，以使其对酸度的免疫抑制作用不敏感，并因此增加其存活、增殖和免疫功能，至少包括在酸性实体瘤微环境中。使用基因编辑CRISPR/Cas9技术，作为一个示例，利用预先加载化学合成的靶向TDAG8的crFNA:tracrRNA双链体的Cas9来确认敲除TDAG8的可行性。数据表明，从NK细胞敲除TDAG8导致其细胞毒性作用的改善以及针对癌症细胞系的抗肿瘤活性，所述癌症细胞系的特征为其微环境的活跃糖酵解和显著的酸中毒。靶向TDAG8的这种基因工程策略可以与不同形式的细胞疗法组合，包括CAR-T细胞、CAR-NK细胞、T细胞受体(TCR)-T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或其组合，以增强它们对抗各种类型的癌症，包括实体瘤。

经工程化改造的免疫效应细胞可为任何种类，但在具体实施方案中，免疫效应细胞为T细胞、天然杀伤(NK)细胞、NK T细胞、巨噬细胞、B细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、树突细胞、间充质干细胞(MSC)、其组合等。在特定情况下，免疫效应细胞是NK细胞，包括脐带血衍生的NK细胞。

可通过施用治疗有效量的本公开的工程化改造的免疫效应细胞来治疗任何医学病症。在特定实施方案中，细胞用在用于治疗任何种类的癌症的组合物中。

本公开涉及利用先进的基因编辑技术(CRISPR/Cas9)从免疫细胞敲除TDAG8基因的新策略，以赋予并增强它们的抗肿瘤活性，作为针对任何种类的癌症(至少包括实体瘤)的细胞疗法。这种治疗细胞的基因工程方法是独特的，并且是一种新的方法，其针对例如其中细胞疗法尚未显示出很大成功的肿瘤类型的各种形式的细胞疗法。

本公开的实施方案包括关于工程化改造的免疫效应细胞的组合物及其用途，其中细胞中的内源TDAG8基因在表达方面被完全减少或抑制。在具体实施方案中，所述细胞是T细胞、NK细胞、NK T细胞、巨噬细胞、B细胞、不变NKT细胞、γδT细胞、MSC、肿瘤浸润淋巴细胞、树突细胞或其混合物。在一个具体实施方案中，NK细胞衍生自脐带血。在一些情况下，细胞包含一种或多种工程化改造的受体，包括工程化改造的抗原受体，如CAR、趋化因子受体、归巢受体和/或非天然T细胞受体。抗原可以是癌症抗原，包括实体瘤抗原。抗原的具体实例包括选自以下的抗原：5T4、8H9、αvβ6整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CA9、CD5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、CS1、CLL1、CD99、DLL3、EGFR、EGFR家族(包括ErbB2(HER2))、EGFRvIII、EGP2、EGP40、ERBB3、ERBB4、ErbB3/4、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、FBP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、L1CAM、Kappa、KDR、MCSP、间皮蛋白、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSC1、PSCA、PSMA、ROR1、SP17、存活蛋白、TAG72、TEM、HMW-MAA、VEGFR2或它们的组合(所述受体可以具有两个或更多个结合不同抗原的抗原结合结构域)。

在某些实施方案中，细胞包含一种或多种外源趋化因子或一种或多种细胞因子的表达。细胞因子的实例包括IL-15、IL-12、IL-21、IL-2、IL-18、IL-7或其组合。另外或备选地，细胞包含自杀基因。

通过同源重组或非同源重组可以减少或抑制内源TDAG8基因的表达。在某些情况下，通过CRISPR-Cas9敲除内源TDAG8。本公开的任何细胞包括相对于接受体个体为自体、同种异体或异种的细胞。

在具体的实施方案中，细胞进一步减少或抑制以下中的一种或多种的表达：NKG2A，SIGLEC-7，LAG3，TIM3，CISH，FOXO1，TGFBR2，TIGIT，CD96，ADORA2，NR3C1，PD1，PDL-1，PDL-2，CD47，SIRPA，SHIP1，ADAM17，RPS6，4EBP1，CD25，CD40，IL21R，ICAM1，CD95，CD80，CD86，IL10R，CD5和CD7。

本公开的实施方案包括本文涵盖的任何一种细胞的群体。在具体实施方案中，所述群体包含在药学上可接受的赋形剂中。

本公开的具体实施方案包括工程化改造NK细胞的方法，使得它们的功能以任何方式改善，包括以非瞬时方式，并且相对于未被这样工程化改造的NK细胞得到改善。在具体实施方案中，与未被这样工程化改造的NK细胞相比，NK细胞中的基因修饰导致细胞具有增强的针对癌细胞的细胞毒性和/或具有增强的扩增、持续性和/或增殖。本公开的方法包括在接受任何种类的过继细胞疗法的个体体内抑制免疫细胞介导的应答的方法，所述过继细胞疗法包括T细胞和/或NK细胞(仅作为示例)，并且在这种情况下，细胞被工程化改造以具有减少的或完全抑制的TDAG8表达。

本公开的实施方案包括与未被这样工程化改造的细胞相比，通过利用如本文所涵盖的工程化改造细胞在肿瘤微环境方面改善任何种类的过继细胞疗法。在具体实施方案中，本公开包括免疫效应细胞的产生和使用，与没有工程化改造以导致内源TDAG8在细胞中的表达减少或完全抑制的细胞相比，所述免疫效应细胞具有增强的细胞毒性、持久性和扩增，因为工程化改造(与天然细胞相反)减少或完全抑制内源TDAG8在细胞中的表达。

任何种类的免疫效应细胞，例如NK细胞，可以从许多非限制性来源获得，包括从外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、肿瘤或市售的。可以使用本领域技术人员可用和已知的任何数量的免疫细胞系。

除了免疫效应细胞被工程化改造以具有内源TDAG8的减少或完全抑制的表达之外，在至少一些情况下，工程化改造的免疫效应细胞也在一个或多个其他方面被工程化改造。在具体的实施方案中，细胞还被工程化改造以表达一种或多种工程化改造的受体(与细胞内源的受体相反)、一种或多种细胞因子和/或一种或多种自杀基因。工程化改造的受体可以是任何种类，包括至少一种或多种CAR、一种或多种T细胞受体、一种或多种趋化因子受体、其组合等。免疫效应细胞的任何工程化改造可以或可以不在TDAG8表达的敲除(或敲低)之后发生。在其中具有减少或完全抑制的TDAG8表达的工程化改造的免疫效应细胞还被工程化改造以表达两种或更多种其他基因的情况下，用于表达两种或更多种其他基因的工程化改造可以或可以不彼此同时发生。例如，在TDAG8敲除(KO)(或敲低)的细胞被工程化改造以表达CAR和细胞因子的情况下，表达CAR和细胞因子的工程化改造可以或可以不基本上同时发生。细胞的任何其它转基因可以或可以不从相同载体表达。在示例性情况下，CAR和细胞因子(仅作为代表)可以或可以不在免疫效应细胞转染或转化后从相同载体表达。

本公开的实施方案包括治疗个体中的癌症的方法，其包括将治疗有效量的本公开的细胞群体施用于个体的步骤。在一些情况下，癌症是实体瘤或不是实体瘤。癌症可以是肺癌、脑癌、乳腺癌、血液癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、脾癌、胆囊癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫内膜癌、前列腺癌、直肠癌、肛门癌或宫颈癌。个体可以是哺乳动物，例如人、狗、猫、马、牛、绵羊、猪或啮齿动物。个体可以或可以不施用另外的癌症疗法，例如手术、放射、化学疗法、激素疗法、免疫疗法或其组合。在具体的实施方案中，所述方法还包括诊断个体的癌症的步骤。在一些情况下，所述方法还包括产生细胞群体的步骤。细胞相对于个体可以是自体的或同种异体的。

在具体实施方案中，细胞是NK细胞，例如脐带血NK细胞，包括表达一种或多种工程化改造的抗原受体的细胞。细胞可以是表达CAR的NK细胞或表达TCR的NK细胞。

特别预期关于本发明的一个实施方案所讨论的任何限制可适用于本发明的任何其它实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于生产或利用本发明的任何组合物。实施例中阐述的实施方案的各方面也是可以在不同实施例中的其他地方或本申请中的其他地方(诸如在发明内容、具体实施方式、权利要求书和附图说明中)讨论的实施方案的情形中实现的实施方案。

前面已经相当广泛地概述了本公开的特征和技术优点，以便可以更好地理解下面的详细描述。下文将描述形成本申请权利要求书的主题的额外特征和优点。本领域的技术人员应理解，所公开的概念和具体实施方案可容易地用作修改或设计用于执行本发明设计的相同目的的其它结构的基础。本领域的技术人员还应认识到，此类等效构造不脱离所附权利要求书中所述的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述将更好地理解被认为是本文公开的设计的特性的新颖特征(关于组织和操作方法两者)以及进一步的目的和优点。然而，应当明确地理解，每个附图仅出于说明和描述的目的而提供，并且不旨在作为本公开的限制的定义。

附图说明

为了更完全地理解本公开，现在参考结合附图进行的以下描述。

图1.TDAG8(GPR65)在免疫细胞上的基因表达水平。使用免疫细胞表达数据库(Database of Immune Cell Expression，DICE)生成该图。

图2.通过PCR确认TDAG8敲除(KO)。用以下针对TDAG8的特异性引物：5’-ACTTTCTCTCCTGCCTTGTG-3’(SEQ ID NO:1)和5’-CGCACAGCTTGGTAGACTTT-3’(SEQ ID NO:2)，对来自2个脐带血(CB)来源的野生型(WT)相对KO NK细胞的DNA进行PCR扩增。

图3.用于在核转染之前和之后在脐带血衍生的NK细胞中TDAG8表达的流式细胞术，核转染使用预先加载化学合成的靶向TDAG8的crRNA:tracrRNA双链体的Cas9进行(敲除前(Pre-KO)峰是向右迁移的峰)。

图4.在遇到TDAG8KO-NK细胞(每对柱的右柱)和预加载Cas9的NK细胞(对照；每对柱的左柱)后，Raji细胞的膜联蛋白V的表达百分比，所述TDAG8KO-NK细胞和预加载Cas9的NK细胞在不存在或存在不同浓度(5、10和20mM)的乳酸盐的情况下孵育48小时。

图5A-5B.在10mM乳酸存在下孵育48小时后，TDAG8敲除(KO)-NK细胞与来自2种不同脐带血(CB)来源(即CB1(图5A)和CB2(图5B))的对照(预先加载了单独Cas9的NK细胞)相比的细胞毒性指数。使用肿瘤细胞生长的活细胞成像和NK细胞的杀死，针对

装置中的786-O肾细胞癌细胞系进行测定。*<0.05，**p<0.01，***p<0.001，ns：不显著，TDAG8KO相对于Cas9-NK的配对T检验。

图6.一些糖酵解途径基因在原发透明细胞肾细胞癌和正常肾之间的差异表达。这些基因在原发肿瘤和正常(左侧的列)之间具有FDR q值<0.05和倍数变化>1.5。

图7A和图7B.与WT NK细胞相比，TDAG8KO NK细胞针对来自786-O(7A)和A498(7B)细胞系的3-D肿瘤球状体(如本文中所述)中生长的肾细胞癌的细胞毒性增强。总绿色物体积分强度(total green object integrated intensity)反映NK细胞引起的肿瘤细胞死亡。*<p0.05，**p<0.01，***p<0.001，WT-NK相对于KO-NK的配对T检验。

虽然本文已经示出和描述了本公开的各种实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这样的实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的本公开的实施方案的各种替代方案。

具体实施方式

I.定义的示例

与长期存在的专利法惯例一致，词语“一种”和“一个”在本说明书中(包括权利要求书)与词语“包含”一起使用时表示“一种或多种/一个或多个”。本公开的一些实施方案可以由本公开的一个或多个元件、方法步骤和/或方法组成或基本由本公开的一个或多个元件、方法步骤和/或方法组成。预期本文所述的任何方法或组合物可相对于本文所述的任何其他方法或组合物实施，并且可组合不同的实施方案。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素组。“由……组成”意指包括且限于在短语“由……组成”中间的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素为所必需或必选的，且不可以存在其他要素。“基本上由……组成”意指包括该短语中间所列的任何要素，且限于不干扰或有助于所列要素在本发明中所指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列举的要素为所必需或必选的，但没有其他要素是可选的且视其是否影响所列举要素的活性或作用而言可以存在或可以不存在。

本说明书通篇中，提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某一实施方案”、“额外实施方案”或“另一实施方案”或其组合意指结合实施方案描述的特定的特点、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇各处出现上述短语不必均指代相同实施方案。另外，可以在一个或多个实施方案中以任何适合的方式组合特定的特点、结构或特征。

如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述组合或彼此排斥的多个组件。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。尤其考虑x、y或z可特定地从实施方案中排除。

在整个本申请中，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的普遍和普通含义使用，以指示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。

如本文所用，术语“工程化改造”是指由人工产生的实体，包括细胞、核酸、多肽、载体等。在至少一些情况下，工程化改造的实体是合成的并且包括不天然存在或以其在本公开中使用的方式配置的元素。

如本文所用，术语“外源”是指在哺乳动物细胞(如免疫细胞)中不内源性存在或在哺乳动物细胞外合成产生(如通过重组技术)的多核苷酸(如编码基因产物或基因产物的一部分的多核苷酸)。

如本文所用，术语“表达”是指将多核苷酸转录成mRNA的过程和/或随后将转录的mRNA翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。因此，如本文所用，“基因产物”是指转录的mRNA、预剪接转录的RNA(例如，仍然包含非编码区的RNA)、翻译的多肽(例如，具有或不具有信号肽或成熟蛋白质中不存在的其它区的那些)和蛋白质。基因的表达水平可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定。在一个方面，来自一个样品的基因的表达水平可以与来自对照或参考样品的基因的表达水平直接比较。在另一个方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平与施用化合物后来自同一样品的基因的表达水平直接比较。

如本文所用，术语“分离的”是指分子或生物制剂或细胞材料基本上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指核酸(例如DNA或RNA)，或蛋白质或多肽，或细胞或细胞器，或组织或器官，其分别与其他DNA或RNA、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离，所述其他DNA或RNA、或蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官例如存在于天然来源中的那些。术语“分离的”也是指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基、或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”是指包括作为片段不天然存在并且在天然状态下不被发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指从其它细胞蛋白中分离的多肽，并且旨在涵盖纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中也用于指与其他细胞或组织分离的细胞或组织，并且旨在涵盖培养和工程化改造的细胞或组织。

如本文所用，“预防”和类似词语诸如“被预防”、“防止”等表示用于预防、抑制或减少疾病或病况(例如癌症)发生或复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病况的发作或复发，或延迟疾病或病况的症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病况发作或复发之前减少疾病或病况的强度、影响、症状和/或负担。

如本文所用，术语“样品”通常是指生物样品。样品可以取自来自个体的组织或细胞。在一些示例中，样品可包括或源自组织活检、血液(例如，全血)、血浆、细胞外液、干血点、培养的细胞、废弃的组织。在收集之前，样品可能已经从来源中分离。非限制性示例包括血液、脑脊液、胸膜液、羊水、淋巴液、唾液、尿液、粪便、泪液、汗液或粘膜分泌物，以及在收集之前从原始来源中分离的其他体液。在一些示例中，在样品制备过程中，样品从其原始来源(细胞、组织、体液诸如血液、环境样品等)分离。样品可以或可以不从其原始来源纯化或以其他方式富集。在一些情况下，原始来源在进一步处理之前被均质化。可以过滤或离心样品以去除白膜层、脂质或颗粒物质。样品还可以被纯化或富集核酸，或者可以用RNA酶处理。样品可含有完整的、碎片化或部分降解的组织或细胞。

如本文所用，术语“受试者”通常是指具有正在进行处理或分析的生物样品的个体，并且在特定情况下患有或怀疑患有癌症。受试者可以是作为方法或材料的对象的任何生物体或动物受试者，包括哺乳动物，例如人类、实验室动物(例如，灵长类动物、大鼠、小鼠、兔)、牲畜(例如，牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)、家养宠物(例如，狗、猫和啮齿动物)、马和转基因非人类动物。受试者可以是患者，例如患有或怀疑患有疾病(可以称为医学病况)，例如良性或恶性肿瘤、或癌症。受试者可能正在经历或已经经历治疗。受试者可以是无症状的。受试者可以是健康个体，但希望预防癌症。在至少一些情况下，术语“个体”可以互换使用。如本文所用，“受试者”或“个体”可以或可以不安置在医疗机构中，并且可以作为医疗机构的门诊患者进行治疗。个体可以通过互联网正接受一种或多种医药组合物。个体可以包括任何年龄的人类或非人类动物，因此包括成人和青少年(即儿童)以及婴儿，并且包括子宫内个体。该术语并不意味着需要医学治疗，因此，无论临床还是支持基础科学研究，个体都可以自愿或非自愿成为实验的一部分。

如本文所用，“治疗”包括对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益或期望的效果，并且甚至可包括所治疗的疾病或病况(例如癌症)的一种或多种可测量标志物的最小减少。治疗可涉及任选地减轻或改善疾病或病况的症状，或延迟疾病或病况的进展。“治疗”不一定指示疾病或病况或其相关症状的完全根除或治愈。

本公开包括操纵免疫效应细胞中的内源TDAG8基因以供随后用于细胞疗法。从免疫效应细胞敲除编码TDAG8的基因(TDAG8或GPR65)在本文中用于各种细胞疗法中，以使所述细胞对酸度的免疫抑制作用不敏感，并因此增加其在酸性实体瘤微环境中的存活、增殖和免疫功能。使用基因编辑CRISPR/Cas9技术，作为示例，利用预先加载化学合成的靶向TDAG8的crRNA:tracrRNA双链体的Cas9确认敲除TDAG8的可行性。数据显示，从NK细胞敲除TDAG8导致其细胞毒性作用以及针对癌症细胞系的抗肿瘤活性的改善，所述癌症细胞系的特征为其微环境的活跃糖酵解和显著的酸中毒。在特定实施方案中，靶向TDAG8的这种基因工程策略与不同形式的细胞疗法(包括例如CAR-T细胞、CAR-NK细胞、TCR-T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))组合，以增强它们对抗各种类型的癌症，包括实体瘤。

II.具有减少或抑制的TDAG8表达水平的细胞的基因编辑

在本公开的细胞的扩增和基因修饰之前，可以通过各种非限制性方法从受试者获得细胞来源。任何种类的免疫细胞，例如NK细胞，可以从许多非限制性来源获得，包括从外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、肿瘤或市售获得。可以使用本领域技术人员已知的任何数量的可用的免疫细胞系。

在特定实施方案中，任何种类的免疫效应细胞经基因编辑以修饰细胞中内源TDAG8的表达。在特定情况下，修饰细胞以具有减少的TDAG8表达水平，包括完全抑制TDAG8的表达(可称为敲除)。这样的细胞可以在生产之前和/或使用之前扩增或不扩增。

在特定情况下，TDAG8基因在表达中被破坏，其中表达部分或全部减少。在特定情况下，使用本公开的方法将TDAG8基因敲低或敲除。

本领域技术人员知晓如何工程化改造任何细胞，包括任何免疫细胞，以减少或完全抑制TDAG8基因的表达。特定实施方案利用涵盖靶向需要减少或完全抑制表达的特定基因的核苷酸序列的方式。TDAG8核苷酸序列的一个例子是在美国国家生物技术信息中心

数据库的登录号NM_003608中，其全部内容通过引用并入本文。下面提供了TDAG8核苷酸序列的一个示例：

>NC_000014.9:88005135-88014811智人(Homo sapiens)14号染色体，GRCh38.p13主要组装体-GPR65

AGCAGTGTTGGTTTCTCTTCTTGACTTGATGCAGGCACAGATTTATCAAGCTCCTCAGTCAACAAACACATCACCGGAAGAAATATGGGTAAGTATAAGATTAAAAAATAAAATAATATTTTAAAGTAGATAACATGCTTTGGCATAATTGTCAGTGATGTTCGCAACATTCTTCCTGGTTTAGGCTGTATAAATGTGGTAATGCAAAGCATGATAAGAGAGAAAGAAATGAGGAAGACACATGGTTTCCTCTACTTTGAGCAGTGGTAAAGGGCCAAACTTTAAATTTAGAACTAATTAGGCAAAACCATAGATATAGAAAAAGGGGGTTGTTCATACTTTATTTTCTTTTCAGGAAACAGTGCTTTGGCAAACTTCATTCAGTATTAGGAAGAAGCCTACCAGCCCCTGGCTTTAGAGCTATCTGGCACCAATCCCTCATCTGTACAATGGTCCAGTAAATACTTTTTATATCCATCAGAAAAAAATGTGATATTAGGAAAGAATATTTCCAGTATTAATAAATGTCAAGTAATAATTATTAGTTAATAAGTGACTACCACAGTGCCTGAAATATATAGTAGAGTCTTAATAAGTAACTATTAAACTGATAGATGAAAGCAAGCATTTTCTATAACACTGTAGGAAAATATTGTACTTTTGGTCATCGTCATCAATGATTTGTACTATTTTTAGATCTGTTCAAGAATAGATATACTTTAATATACTGTAGATTGTCTTTTTTGACATCTGGTAAAAATTAAAAAATTAAAAACTCACCAAAATTTCTCAGTGCTTGTTCTAAAAACAATTTTCTCAAAATTTGATTAAAGGAGGCAAAATAATATCTGAAAAGATATGTGAATACTGTAATAGGAATTATATACAGTATTCCACTAAAATCTCAGATCCACCCAAATTAAATGAACAACTATTATCTGCAGAGCCTAGTATTATACGTGAAGTGTTACCATATAAATTACACTCTGAGCACCTCCAGCTTTTCTGCTATGCTGTGGCTAGATGACTAAAGATGATTTCTTTTCAGAAAATGTAGGGGACAGCACAAAGATTGGTGCAGACTACCAATGTCATTAAAACAATATTACCAGCTAACGTACAGTGAATGCCTCCCATGTGCTAGGAACTTTGCTTCATATGTCGTTTCATTTAACCCTCACAACAATCTTAGAAACTGGGTACTAACTTACACATGTGAAAACTGGAACTTAGAGAGGTGAAGAAACACCAATGGGCCCAGAGTGCTGTTGAGAGGCATTCGAATTGTCTCCAGAGCCCACGCTCTTAACCACAAGCCTGTACTGCCTCTGCGTCACTACAAAGAAGAGGGCCTCTGCTTCATCAACCCATCCTGTCTTGTGGTTAAGTCAAGGCAGGAAATGCTTTTACAGCTAGAGAAATGTATTCCATTGAAAACTTTATAAACCTTTCTAAAAATCATTTTTTCATTTAATCTGTCATACCATTTTTAAAGAAAATGATGACTATCTATTGAGTAACACGGACAAAGGAGGAAGAGGCACATGCTGCCCATTACCCGACTTTCTCGGTCCTGGTCTTAAGGGGAGGATGTTTTCATGGTTCAGGTGTTCTTCCCAAGACACATGAGCCTGGTGTTGGACGTGTTGTGTGTGCATCAGAGTCCCATCCGCGGGGGCTGATTCAATCTTCCTGCATCGCAGACATTACCCTAGTGTCCTTTTCCTACTTCAGTTATATCCTTTAGAAGTTTCTTTAGTGGGGATTTTGGATGTAAATGTTCTGAGTGGTAGTTTACCTGAAAATGTCCTAATTCTTGCTCTGGTCCTTGAAATTTAGTTCTGTTGAGTATATAATTATAGGATGACATATATTTTCTTAGCAATTTGGAACTTTTAATCTTCTGCTGTCTGTTATCGCTGTTGAGAAGTCTTTTGTCCGTCTAAATTCCATCCTTCATAGGTAGTCCATCTTTCCTCTCTGGCTCTTTTTTCCTTAGTCTTTGGTGAACTGCAATTTTATTGCAATGTGTCTAAGTATAGGTTTCCATTTTTGTGTTTTTAATCCTATTTGGGATTTTCTAAGCTTCATAAATCTGCAGATTTCATGAGGATTGAAGATGCATGAGGATTCTTCATCCATCCTCAAGATTCCTTCATCAGTTCTAGAAAGCTCATCATCTTTGTGAATATTGCCTTTTCAACATTCTCTCTTTTCGATCTTTATGGAATTCCAATTATGTATATGCCACCCTTTTCACCTTTTCTCCATATCTCTTATATTTTCCCATGTCCTTAACATGCTGATAATTTTGTGTTATTTCTTTATCTCTATCTTGCAATATACAAATTTTCTCTTCAGCTGGATCTAATCAGTTGGTTACTCCCTGTGTTTATTTTTAAATTTAAATTATTATTATTTTTATTTTTAGAAAGTCTTTTTCAATCTTTCTAAAAATATGGCTTGTCATTTTTTAATCTCTTCCTCCTTACTCATGTGTTTAAATCCCTTCTTTTGTTTCTTTAAACATATTAAACATATTTTGTGTTTTTTATATATATATATATAAATTTTATCTCTAAAGTTTTGTGGATCTGGTTTACTTTGTTGTTTCTGCTCAATCTGACACGTAGTTGCTTATTATTCTCTCTGTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAATAAGGTCATATTTGTTAGAACTCTATCTGTAGGATTCTTTGAGGCCTGAGTTAAAGAGGACTTGTTCAAGGGGGGATCTGTGTCAACTTCTTCCAGGAGCCTAGAATTTATTTTTTCATATATAGTTAACCTTTATTTTTGGTGAAGTTATTTTCATAATTAGGTAAATTATTTATTTATTGTTTTCTCTCAATTACATTTTATGTATGAGGATAGAAATAAGATCAGATTTCTTAAAAAGGCATATATGTTCCATCTGTGGGTAAAACAGATGTTTGTTTGTCAAGATGCTCTACATGCCATCTCACACAGCCTTTTGATTCCACTTTTTAATGTTTCCATTGCAATACAATACACATGCAGCAAAATGCACATATCCTAAGTGTACAGCTTGATGCATTTCTACAAACTGAGCATGCTCATGGAACCAGCCACCCCTACCAAGAGATAGAACATTGCCAAATCTCAGAAGTCCTCCTCATGCCCTCTTCCAACAGTACTCAGCCTTTCCCCAGAGGTAGCCACTACCCAGACTCCTAACATCATAGATTAACTTTGCCTGGTTTGTATCAGATAATACATACTCTTTTGTGTCTTTTTTTTTATCACTCAGAATTACATTTGTGATCTTCAACCATGCGATTGCATGTAGCAATAATTTATTCATCTTCATTGAGGTGTAGATTTCAGTGGTGTTACTATATCCCAATTTACTCATCTATTATACTGCTAGTGGGCATTCTAGTTAAGGGATATTACAAGTAGTGTTACTGTGAATATTCTAATTCTAGTACCTGTCTTTTGGTTAACATATGTATGCGTTTATGTTGAACAAATACCTAGAGGTGGAATTGCTGGATCATATGGCATGCATAAGTGCCTAGTGTTTTTTTACTCAACAGCATATGAGTCAAGATGTTCTATTTCCTTCCTAACACTTGATATTTTGTCTTATTTTCATTTCATTTGTTGTGTTGGGTGTGTAGTGGTATATCATTTTAATTTTAGCTTGAATTCCTCTGATGACTAATGAAGTTGAGCATGTAGGTTGGCCTGAAGTTTGCAGGATCAAACTAATAATGTAGACCCAGACCTAGTTTCCAAGTGAGGACCCCACAGGCCACAACTACTTAGGGTAGAATTTTTTATTGTAACTCCTCACAGAAACCAAGCAGAGGCAGGGAAATTGCCATCTTTTCTCTACTGTCTGCAAATGTCTGTGGAATTTATTTTATTTTGTTTATTTTCTAGTTCACCCTTTCCCTGACAGCAGAGGTTCTGGATCCCATGTGTTTGGGATGGTCAAGGACCCCTTCTTACCTGCATAGGCCCAAGTTTTGTCTCTAGTTTCTCTGATCCCTAGTGAGTTCCTCCAGATCTACATATGTCTTCAGGCCATCCAGAGCTCCGGCGCTCACTCACCTCCCTGATAACAGCTCCCACCTCCTTTCTTCCATCACAAATTTTCCCCCCCTTTGGAAGCTTCCCTATTTATTTAAAAGGCTGTTTTTCACATTTTATTCCTGTTTTTTAGGTTGATAAAGCTAAAAGTTTTCAGGAGTTTTAGTTACCTGTTTAAGAGTGAAATATGATATATTTTCCCATATGATTTACTCTGCTAGTAGAATTCTTGTGACTTGTGATGGCAGGTCTTTTTGTGCTCAGGATTCATCAACAGTTGGGAGGGAGTGATTCTGGTGCCCTGAATAGTGTTTCTAGAAAGCTTTCTGTGAAGGTATTCACCATGTAAATGATCTCAGCCACCAGTAGGCCTCAGCAGCAAAGGGATATAGACAAAGTATTTCTCTACTCCAGTATGGAGAGAAGGATGGAACCTTTACTCTTATGTGAATCTATGACATCATAGCTTTAAAAAGACACTAACCTCTTAAACCATCAGATATAAAGGTGGAAATTAATGATTCCAAGATTTTACCCAGAATAAGAACATTCTGTCCTCTCATTTATAAAAGTATAAGAAAAATAAAGTGAGTTAGTCGACAAAGGAAATAAAAAGATAAACAGAAGTAGGATTGTCTAATTATATGCTAAGGCTTAACAAACTGCTACATTTTAAAATTCTAAAACTTTATTGTATTTCTATTATAGTATTTCTTTGGATAATAAGGTGATTTTTGAAAGTGCCGTACACCTAGATTGAATATGAAATTAGAAATTTGAAATCACATAACCATACAGTTGATCACACATGCAAAAGTATTTACCAATCACAGACAAATAACAGAATTTTTTATCTTTAGCTGCTGAAATGACTTTTTAAATTGAGTTTTGTGTTCTTGGGTTATATCCATTGAGAAATATAATTCGCTCTAATCTAACATGCCTCAGGTAGTTCTTATTTGATATAAGTAAAATGTCTTGACTTGATTTTATTTACTGAAGTCAATAAGATAATTTTCCCATTTTAAACACCTTCACTGTAACTTAATGCATTTTCAATATCTTCAATACATGAAACAAAAAGGGATTATTTCAAAATCCTGATTGTAATGAAGTCATGCATCTTAAACATCTAAACAATTTTAATTCATCTTTCATTACAGAAGGAAAGGAATTTTAAAAGGAAATACCAATCTCTGTGCAAACAAAGCCTTGTATATTCATGTTTGCACCAATCTACTGTGAGATTTATGAAGAAAAACAAATTGCGGACAACTCTCTATGTACACTTACAAATGCCTCAGTTGATGCTTGTGGGCTGTTTGTCAGCGTTCTGTGATAATGAACACATGGACTTCTGTTTATTAAATTCAGTTGACCCCTTTAGCCAATTGCCAGGAGCCTGGATTTTTACTTCCAACTGCTGATATCTGTGTAAAAATTGATCTACATCCACCCTTTAAAAGCATTGATGAATTAATTAGAACTTTAGACAACAAAGAAAAATTGAAAAAGAATTCTCAGTAAAAGCGAATTCGATGTTCAAAACAAACTACAAAGAGACAAGACTTCTCTGTTTACTTTCTAAGAACTAATATAATTGCTACCTTAAAAAGGAAAAAATGAACAGCACATGTATTGAAGAACAGCATGACCTGGATCACTATTTGTTTCCCATTGTTTACATCTTTGTGATTATAGTCAGCATTCCAGCCAATATTGGATCTCTGTGTGTGTCTTTCCTGCAAGCAAAGAAGGAAAGTGAACTAGGAATTTACCTCTTCAGTTTGTCACTATCAGATTTACTCTATGCATTAACTCTCCCTTTATGGATTGATTATACCTGGAATAAAGACAACTGGACTTTCTCTCCTGCCTTGTGCAAAGGGAGTGCTTTTCTCATGTACATGAATTTTTACAGCAGCACAGCATTCCTCACCTGCATTGCCGTTGATCGGTATTTGGCTGTTGTCTACCCTTTGAAGTTTTTTTTCCTAAGGACAAGAAGATTTGCACTCATGGTCAGCCTGTCCATCTGGATATTGGAAACCATCTTCAATGCTGTCATGTTGTGGGAAGATGAAACAGTTGTTGAATATTGCGATGCCGAAAAGTCTAATTTTACTTTATGCTATGACAAATACCCTTTAGAGAAATGGCAAATCAACCTCAACTTGTTCAGGACGTGTACAGGCTATGCAATACCTTTGGTCACCATCCTGATCTGCAACCGGAAAGTCTACCAAGCTGTGCGGCACAATAAAGCCACGGAAAACAAGGAAAAGAAGAGAATCATAAAACTACTTGTCAGCATCACAGTTACTTTTGTCTTATGCTTTACTCCCTTTCATGTGATGTTGCTGATTCGCTGCATTTTAGAGCATGCTGTGAACTTCGAAGACCACAGCAATTCTGGGAAGCGAACTTACACAATGTATAGAATCACGGTTGCATTAACAAGTTTAAATTGTGTTGCTGATCCAATTCTGTACTGTTTTGTAACCGAAACAGGAAGATATGATATGTGGAATATATTAAAATTCTGCACTGGGAGGTGTAATACATCACAAAGACAAAGAAAACGCATACTTTCTGTGTCTACAAAAGATACTATGGAATTAGAGGTCCTTGAGTAGAACCAAGGATGTTTTGAAGGGAAGGGAAGTTTAAGTTATGCATTATTATATCATCAAGATTACATTTTGAAAAGGAAATCTAGCATGTGAGGGGACTAAGTGTTCTCAGAGTGATGTTTTAATCCAGTCCAATAAAAATATCTTAAAACTGCATTGTACAGCTCCCTCCCTGCGTTTTATTAAATGATGTATATTAAACAAAGATCAATATTTTCTTAATGACTCAGGGTCTTTATTGTTAATGCCAATTGTTTTTGTATCTGTGCTATAATCCCTTAGAGTCAGTAAAGTATGTAGGGGACTGTTTCTTCCTTTGTGTCTGGGTTTATGATTTTTCTCACTCTTTCTTTGGACTCCAGGGTGTCAGCCATCAGGTCTCCTAATTTTGTGTACCGGTCTCCAACAACCCCAGCTACTGAATACTGCTTCTAATCTCCTCATTCATTAACAAATCTTTATTTTTTTATCTTGTATAAAATAACTGCTTTATTGACACAAAATTTACATAACTTAAAATTCAACTTTGTATTGTGTACAATTCAGTGATTTTTTGTATATTCACAGAGCTGTGCAACCATCACCACACTCAAAAAATTTTCATCACCCACCAAAGAAATCTTATACTCTTAGCAGTCGCTCCCTGCTCTCCCGTCCATGCCAGTTATTAATTTACTTTCTGTCTCTAAGGATTTTCATTACTCTGAACATTTCATATAAATAGAATTATACAATATGTGGCCTACTGTGACGTATTTCACTTAGTATAATGGTTTCAAGTTTTATCCATGTGTAGAATGTATCAGCACTTCATTTCTTTTTATGGCCTGATAGTATTCTGTTGCATGGTTATACTCCATTTTGTTTATCTAATCACTTGGCTTCATTAACAAATATTTATTGAATCCATTCCATAAACTAGGTTTTGAGTTAAGTACTGGGGCTATGAAAGAAATGGTCTCATGAAGCCTCACGAAGTTTACATTAGTTCAAAAGCCTAGTCACCGAGCTTGAAAGATTTCTATATAAAGGAAAAGGAAATAGGCTCTGAGTTTTATTTTGATCTCTTTTTAATTTATAACTGGGTATAACATAGCTGAAATTACCAGAAGTTTAATGCATAGACAAATAAATAGTTCTATTATATCTTTCTTTTTGGACTTAGAATGTTAGAATATTTTGAGAGTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGTCAGAGTCTTGCTCTGTAATCCAGGCTAGAGTGTAGTGGTGCGATCTCCACTCACTGCAGCCTCCACCTCCCAGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGATTACAGGCACCCACCACCATGCCCAGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCATGTTGCACAGGCTGGTCTCAATCGAACTCCTGACCTCAAGTGATCATCCCACCTAGGTCTCCCAAAGTGCTGAGATGACAGGCGTGAGCCACCATGCCTGGCAAAGAGAGTCTTGATACAACATATTCTTTTGAATCCTCATTGTGTAAATTGCCTCGTTGTAAATAGACACTCAGTAAACATTTTCCTCACCAAAATATTTTTAAGGATTTTTCTACCCTTCTCCTTTTCTCTTTGCTTTCCTTTTCTTGCCTGTTCTTTCCACTCCCCCCAAAATGATCAGATAGCAAATGTCTTGATAACATGAGGTGCCCTCACATTAAAAAACAAAATATTGAGCCGGGCGCGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGCAGATCGCCTTAGGTCAGGAGTTGGAGACCAGGCTGACCAATATGATGAAACTCTGTCTCTACTAAAAATTCAAAAATGTGCCAGACCTGGCCTGGTGGCATGTGCCTGTAATCCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGTCATAAGCCTGCAATGGGAAAATGGATCGAATCTGGGGTGAGGGGGAAGTGATGTGGGGGTTATGGTACCTCTTTTCTCTTCCAAAGATGCTGTTCTTACTGCATCACTTGTGGCTGGCCAGGAAAAGCCATGCAGGAGTTTTGTTTGTGGCCACTAGGTGACGATCGTGTTCTGTACGGGACCTCTTATTAATAGTTCACCACTAGCCGCCACTCCAGAAGAGCGGAGGAACCCAGGATAATATTTTGTCAACCAAGAAACAAGAAGTCCCTCCCAGGAACTGGAAATGAATGGGGAAAATGCTGAAATCTCATTTGCACTATTCATTTCTCTTCTCTCTGGAAAGCTCGGCAATCATCAGGTCATTTCATTTGGCTTAAATTCCATGTGTCTTTCCAAACTTTTAAAAGCTGGTGAAAATTGTTCCACCCATATGTAAAAGAACATAGGTTAAGTTGTCTAATTCTTGCAGGAATGTGGATATAGCATTAAAAATATGTCTTTGTATACTTATCTTACCCATGTAAGAAAAGAGTGGCCAACTTTCATATAAATAGAAAGAGAACATTTAAGCTATATGCAGTTTGCATTTTTGTCTACTATTATGAAATTATTATCTATGAAATTCAAGCTGTAACTCAACATATGTATAATTTTAATTTCTAATTTATTGTTAGATCTCAGCACTTAAAAAATTACATCTTGTATTTGAATTGTTAAATCTGTTCCCTGCAAAGAACAGTAATACAATCATGTTCTAATTTACTAGCATTTGCATATTTTAGAAATATAATGGCCTGTAATTTACTTTTCTTTTGCCTATAATTTTCTGAAGCTCTTTATGATGCACCGGTGCATTTTTATTTAAAAAATAGATTGTGACTCCTCAAATAATGTTACAATTCGATGTTCAAAAAGCAATCCAGGTACATAGCCATAAAGGGATGAGCTAGAGAGGTCTCCATATTATCATTCAATGTGAGAATAAAAATTCTATATTTTATTCTAGAATAAAATTATAAATTTCTTTATCTA(SEQ ID NO:28)

SEQ ID NO:28内的特定序列示例如下：

TDAG8编码序列如下所示：

ATGAACAGCACATGTATTGAAGAACAGCATGACCTGGATCACTATTTGTTTCCCATTGTTTACATCTTTGTGATTATAGTCAGCATTCCAGCCAATATTGGATCTCTGTGTGTGTCTTTCCTGCAAGCAAAGAAGGAAAGTGAACTAGGAATTTACCTCTTCAGTTTGTCACTATCAGATTTACTCTATGCATTAACTCTCCCTTTATGGATTGATTATACCTGGAATAAAGACAACTGGACTTTCTCTCCTGCCTTGTGCAAAGGGAGTGCTTTTCTCATGTACATGAATTTTTACAGCAGCACAGCATTCCTCACCTGCATTGCCGTTGATCGGTATTTGGCTGTTGTCTACCCTTTGAAGTTTTTTTTCCTAAGGACAAGAAGATTTGCACTCATGGTCAGCCTGTCCATCTGGATATTGGAAACCATCTTCAATGCTGTCATGTTGTGGGAAGATGAAACAGTTGTTGAATATTGCGATGCCGAAAAGTCTAATTTTACTTTATGCTATGACAAATACCCTTTAGAGAAATGGCAAATCAACCTCAACTTGTTCAGGACGTGTACAGGCTATGCAATACCTTTGGTCACCATCCTGATCTGCAACCGGAAAGTCTACCAAGCTGTGCGGCACAATAAAGCCACGGAAAACAAGGAAAAGAAGAGAATCATAAAACTACTTGTCAGCATCACAGTTACTTTTGTCTTATGCTTTACTCCCTTTCATGTGATGTTGCTGATTCGCTGCATTTTAGAGCATGCTGTGAACTTCGAAGACCACAGCAATTCTGGGAAGCGAACTTACACAATGTATAGAATCACGGTTGCATTAACAAGTTTAAATTGTGTTGCTGATCCAATTCTGTACTGTTTTGTAACCGAAACAGGAAGATATGATATGTGGAATATATTAAAATTCTGCACTGGGAGGTGTAATACATCACAAAGACAAAGAAAACGCATACTTTCTGTGTCTACAAAAGATACTATGGAATTAGAGGTCCT(SEQ ID NO:29)

下述DNA序列是来自SEQ ID NO:28的5’-3’序列的示例，所述序列被示例性的向导RNA靶向，从而通过CRISPR/Cas9技术敲除TDAG8。CRISPR/Cas9技术利用向导RNA(与被靶向的基因上短靶DNA序列互补)从而进行双链DNA切割。向导RNA可以是正链或负链，但是由于使用CRISPR/Cas9技术进行的切割影响靶DNA的两条链，此处显示的是所述序列的DNA正链上的靶序列。

SEQ ID NO:28中示例性AA向导RNA靶标的序列是

GCATTGCCGTTGATCGGTAT(SEQ ID NO:30)。

SEQ ID NO:28中示例性AB向导RNA靶标的序列是

AACTTGTTCAGGACGTGTAC(SEQ ID NO:4)。

SEQ ID NO:28中示例性AC向导RNA靶标的序列是

TGTGCGGCACAATAAAGCCA(SEQ ID NO:5)。

SEQ ID NO:28中示例性AD向导RNA靶标的序列是

GCCTTGTGCAAAGGGAGTGC(SEQ ID NO:31)。

SEQ ID NO:28中示例性AE向导RNA靶标的序列是

GCCAATATTGGATCTCTGTG(SEQ ID NO:32)。

SEQ ID NO:28中示例性AF向导RNA靶标的序列是

GTCCATCTGGATATTGGAAA(SEQ ID NO:33)。

SEQ ID NO:28中示例性AG向导RNA靶标的序列是

TTATGGATTGATTATACCTG(SEQ ID NO:34)。

SEQ ID NO:28中示例性AH向导RNA靶标的序列是

TATTGAAGAACAGCATGACC(SEQ ID NO:35)。

SEQ ID NO:28中示例性AI向导RNA靶标的序列是

GTCTTTCCTGCAAGCAAAGA(SEQ ID N:36)

SEQ ID NO:28中示例性AK向导RNA靶标的序列是

CAACTTGTTCAGGACGTGTA(SEQ ID NO:37)。

SEQ ID NO:28中示例性AL向导RNA靶标的序列是

TACAGGCTATGCAATACCTT(SEQ ID NO:38)。

SEQ ID NO:28中示例性AM向导RNA靶标的序列是

CACCTGCATTGCCGTTGATC(SEQ ID NO:39)。

SEQ ID NO:28中示例性AN向导RNA靶标的序列是

GGAAAGTCTACCAAGCTGTG(SEQ ID NO:21)。

SEQ ID NO:28中示例性AO向导RNA靶标的序列是

CTTTATGGATTGATTATACC(SEQ ID NO:40)。

SEQ ID NO:28中示例性AP向导RNA靶标的序列是

TCACCATCCTGATCTGCAAC(SEQ ID NO:41)。

SEQ ID NO:28中示例性AQ向导RNA靶标的序列是

CAGCCTGTCCATCTGGATAT(SEQ ID NO:42)。

SEQ ID NO:28中示例性AR向导RNA靶标的序列是

AAGGACAAGAAGATTTGCAC(SEQ ID NO:43)。

SEQ ID NO:28中示例性AS向导RNA靶标的序列是

GACAAGAAGATTTGCACTCA(SEQ ID NO:44)。

SEQ ID NO:28中示例性AT向导RNA靶标的序列是

TTGGTCACCATCCTGATCTG(SEQ ID NO:45)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B1向导RNA靶标的序列是CAGTCAACAAACACATCACC(SEQ ID NO:46)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B2向导RNA靶标的序列是TCAGTCAACAAACACATCAC(SEQ ID NO:10)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B3向导RNA靶标的序列是CAGTTGATGCTTGTGGGCTG(SEQ ID NO:47)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B4向导RNA靶标的序列是GTTCTGTGATAATGAACACA(SEQ ID NO:12)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B5向导RNA靶标的序列是GCAAAGAAGGAAAGTGAACT(SEQ ID NO:13)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B6向导RNA靶标的序列是CTTCAGTTTGTCACTATCAG(SEQ ID NO:48)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B7向导RNA靶标的序列是TGTGCAAAGGGAGTGCTTTT(SEQ ID NO:49)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B8向导RNA靶标的序列是TCTGGATATTGGAAACCATC(SEQ ID NO:50)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B9向导RNA靶标的序列是TCCTGATCTGCAACCGGAAA(SEQ ID NO:51)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B10向导RNA靶标的序列是TTACACAATGTATAGAATCA(SEQ ID NO:22)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B11向导RNA靶标的序列是AAACAGGAAGATATGATATG(SEQ ID NO:23)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B12向导RNA靶标的序列是TATTAAAATTCTGCACTGGG(SEQ ID NO:24)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B13向导RNA靶标的序列是GAGGTCCTTGAGTAGAACCA(SEQ ID NO:25)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B14向导RNA靶标的序列是CAAGGATGTTTTGAAGGGAA(SEQ ID NO:26)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B15向导RNA靶标的序列是CTAGGTGACGATCGTGTTCT(SEQ ID NO:52)。

SEQ ID NO:28中示例性Guide-GPR65-B16向导RNA靶标的序列是CTCAGCAGTGTTGGTTTCTC(SEQ ID NO:53)。

下表提供了用于TDAG8基因编辑的CRISPR的向导RNA的实例。这些向导RNA可以与上文所示的DNA正链互补，或者它们可以与DNA相对(负)链互补。

在用CRISPR/Cas9敲除后，我们使用PCR检查敲除效率。对于PCR反应，我们使用涵盖编辑区的引物。此处是一些可以使用的引物的示例。也可以使用多种其他引物组合。

本公开的实施方案包括敲除或敲低细胞中的内源TDAG8表达的方法，其包括使细胞至少与Cas9或功能等效的替代物以及靶向TDAG8的适当向导RNA接触。Cas9和/或向导RNA可以通过来自一个或多个编码其的表达载体的表达提供给细胞。载体可以是病毒(逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)载体或非病毒载体(裸质粒DNA或化学修饰的mRNA)。

在特定情况下，除TDAG8之外的一种或多种其他基因被敲低或敲除，并且这可以或可以不在与TDAG8敲低或敲除相同的步骤中发生。表达的减少或完全抑制可以利用或可以不利用与用于TDAG8的基因编辑机制相同的基因编辑机制，并且一种或多种其他基因的表达的减少或完全抑制可以在TDAG8的基因编辑之前、期间或之后发生。在细胞中编辑的基因可以是任何种类，但是在具体实施方案中，所述基因是其基因产物抑制TDAG8KO细胞的活性和/或增殖的基因。在特定情况下，除TDAG8之外被编辑的基因允许细胞在肿瘤微环境中更有效地工作。在特定情况下，所述基因是以下中的一种或多种：NKG2A，SIGLEC-7，LAG3，TIM3，CISH，FOXO1，TGFBR2，TIGIT，CD96，ADORA2，NR3C1，PD1，PDL-1，PDL-2，CD47，SIRPA，SHIP1，ADAM17，RPS6，4EBP1，CD25，CD40，IL21R，ICAM1，CD95，CD80，CD86，IL10R，CD5和CD7。在具体实施方案中，TGFBR2基因在细胞中被敲除或敲低。

在一些实施方案中，使用一种或多种DNA结合核酸进行细胞中的任何基因编辑，例如经由RNA引导的核酸内切酶(RGEN)的改变。例如，可以使用规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白进行改变；在一些实施方案中，使用CpF1代替Cas9。通常，“CRISPR系统”笼统指参与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达或指导CRISPR相关基因的活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-mate序列(在内源CRISPR系统的情形中包括“直接重复”和tracrRNA处理的部分直接重复)、向导序列(在内源CRISPR系统的情形中也称为“间隔子”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。

CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括以序列特异性结合DNA的非编码RNA分子(向导)RNA，以及具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如，Cas9)。CRISPR系统的一个或多个元件可以衍生自I型、II型或III型CRISPR系统，例如衍生自包含内源CRISPR系统的特定生物体，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

在一些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括靶序列特异性crRNA和固定的tracrRNA的融合物)引入细胞中。通常，gRNA 5’端的靶位点利用互补碱基配对将Cas核酸酶靶向靶位点，例如基因。靶位点可以基于其紧邻原间隔子邻近基序(PAM)序列(例如通常为NGG或NAG)的5'的位置来选择。在这方面，通过修饰向导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸以对应于靶DNA序列，将gRNA靶向所需序列。通常，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列的位点处形成CRISPR复合物的元件。通常，“靶序列”通常是指这样的序列：向导序列被设计成具有对该序列的互补性，其中靶序列和向导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补性，条件是存在充分的互补性足以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。

CRISPR系统可以在靶位点诱导双链断裂(DSB)，然后是如本文所讨论的破坏或改变。在其他实施方案中，Cas9变体(被认为是“切口酶”)用于在靶位点处在单链上切口。可以使用成对的切口酶，例如以改善特异性，每个切口酶由一对不同的gRNA靶向序列引导，使得在同时引入切口时，引入5’突出端。在其他实施方案中，无催化活性的Cas9与异源效应物结构域如转录阻遏物或活化剂融合，以影响基因表达。

靶序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可以位于细胞的细胞核或细胞质中，例如在细胞的细胞器内。通常，可用于重组到包含靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源模板多核苷酸可称为编辑模板。在一些方面，重组是同源重组。

通常，在内源CRISPR系统的情况下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的向导序列)的形成导致靶序列中或附近(例如，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。可以包含野生型tracr序列的全部或一部分(例如，野生型tracr序列的约或超过约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸)或由野生型tracr序列的全部或一部分组成的tracr序列也可以形成CRISPR复合物的一部分，例如通过沿着tracr序列的至少一部分与可操作地连接到向导序列的tracr配对序列的全部或一部分杂交。tracr序列与tracr配对序列具有充分的互补性足以杂交并参与CRISPR复合物的形成，例如当最佳比对时沿着tracr配对序列的长度至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。

可以将驱动CRISPR系统的一种或多种元件的表达的一种或多种载体引入细胞中，使得CRISPR系统的元件的表达指导在一个或多个靶位点的CRISPR复合物形成。组分也可作为蛋白质和/或RNA递送至细胞。例如，Cas酶、连接至tracr配对序列的向导序列、和tracr序列可各自可操作地连接至单独载体上的单独调节元件。备选地，从相同或不同的调节元件表达的元件中的两个或更多个可以组合在单个载体中，其中一个或多个附加载体提供未包括在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。载体可以包含一个或多个插入位点，例如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的向导序列时，可以使用单个表达构建体将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同的对应靶序列。

载体可以包含可操作地连接到编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、其同源物或其修饰形式。这些酶是已知的；例如，酿脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到。

CRISPR酶可以是Cas9(例如，来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(S.pneumonia))。在一些情况下，CpF1可以用作内切核酸酶替代Cas9。CRISPR酶可以在靶序列的位置(例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内)直接切割一条或两条链。载体可以编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化为切口酶(切割单条链)。在一些实施方案中，Cas9切口酶可以与一个或多个向导序列(例如两个向导序列，其分别靶向DNA靶的有义链和反义链)组合使用。这种组合允许两条链都被切开并用于诱导NHEJ或HDR。

在一些实施方案中，编码CRISPR酶的酶编码序列经密码子优化以用于在特定细胞(例如真核细胞)中表达。真核细胞可以是特定生物体(例如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类动物)的真核细胞或源自特定生物体的真核细胞。通常，密码子优化是指通过用在宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子同时保持天然氨基酸序列来修饰核酸序列以在感兴趣的宿主细胞中增强表达的过程。各种物种表现出对于特定氨基酸的某些密码子的特定偏好。密码子偏好(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率又被认为取决于被翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性等。细胞中所选tRNA的优势通常是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。因此，可以基于密码子优化来定制基因以用于给定生物体中的最佳基因表达。

通常，向导序列是与靶多核苷酸序列具有充分的互补性足以与靶序列杂交并引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，向导序列与其对应的靶序列之间的互补程度为约或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多。

可以使用用于比对序列的任何合适的算法来确定最佳比对，其非限制性示例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换(例如，BurrowsWheeler Aligner)、Clustal W、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies)、ELAND(Illumina，San Diego，Calif.)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)的算法。

CRISPR酶可以是包含一个或多个异源蛋白结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何另外的蛋白序列，和任选地在任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白质结构域的实例包括但不限于表位标签、报告基因序列和具有以下活性中的一种或多种的蛋白质结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。CRISPR酶可以融合到编码蛋白或蛋白片段的基因序列，所述蛋白或蛋白片段结合DNA分子或结合其它细胞分子，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S-标签、Lex A DNA结合结构域(DBD)融合体、GAL4A DNA结合结构域融合体和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合体。可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外的结构域描述于US 20110059502中，其通过引用并入本文。

III.免疫效应细胞

本公开涉及基因工程改造免疫效应细胞以包含TDAG8表达的部分减少或完全抑制。TDAG8表达的部分减少或完全抑制可以通过任何机制发生，包括至少通过CRISPR/Cas9技术，以进行用于治疗任何类型的癌症(包括实体瘤)的创新且有效的细胞治疗。

本公开涵盖经修饰以具有减少或完全抑制的TDAG8表达的任何种类的免疫效应细胞。在具体实施方案中，减少或完全抑制细胞中TDAG8的表达是人为故意操纵细胞的直接或间接结果。操纵免疫效应细胞以减少或完全抑制TDAG8的表达可以通过任何机制进行，包括通过同源或非同源重组。在具体实施方案中，例如，由于CRISPR技术，操纵细胞以具有减少的或完全抑制的TDAG8表达。

免疫效应细胞具有减少或抑制的TDAG8表达，特别是通过基因工程实现，这与具有导致内源TDAG8表达减少的一个或多个突变的天然细胞相反。因此，在具体实施方案中，免疫效应细胞经基因工程改造以减少或抑制内源TDAG8在免疫效应细胞的基因组中的表达。在具体实施方案中，免疫效应细胞被敲除内源TDAG8的表达。

本公开涵盖任何种类的免疫效应细胞，包括常规T细胞、γ-δT细胞、NK细胞、NK T细胞、不变NK T细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、MSC或其混合物。相对于个体，包括需要所述细胞的个体，例如患有癌症的个体，细胞可以是同种异体的、自体的或异种的。

在特定实施方案中，除细胞被修饰以具有减少或完全抑制的TDAG8表达之外，还用人工修饰免疫效应细胞以表达或以其它方式产生一种或多种基因产物。这种对细胞的额外修饰不是天然存在于细胞中，或者相对于细胞具有外源来源。额外修饰可以是任何种类，例如表达受体、细胞因子、自杀基因或趋化因子或其组合的免疫效应细胞。

当具有减少或完全抑制的TDAG8表达的免疫效应细胞也被另外修饰以产生或表达不天然存在于细胞中或具有外源来源的基因产物时，修饰免疫效应细胞的顺序可以是任何类型。例如，可以修饰具有减少或完全抑制的TDAG8表达的免疫效应细胞以具有一种或多种额外修饰，其中在其他情况下，在修饰免疫效应细胞以产生或表达不天然存在于细胞中或具有外源来源的基因产物之后，修饰所述免疫效应细胞以具有减少或完全抑制的TDAG8表达。

在特定实施方案中，缺乏TDAG8的完全或部分表达的免疫效应细胞是经修饰以表达受体(例如抗原受体)的相同细胞。本公开所涵盖的任何免疫效应细胞表达可以是任何种类的抗原受体，包括针对作为癌症抗原(也可以是肿瘤抗原)的抗原的受体。在具体实施方案中，受体是例如嵌合抗原受体或T细胞受体。免疫效应细胞可专门设计成具有TDAG8表达的完全或部分抑制，并且专门设计成具有靶向个体中癌细胞上的抗原的抗原受体。也就是说，可以定制细胞以包括靶向已知存在于个体的癌细胞上的抗原的一种或多种抗原受体。

在特定实施方案中，产生本公开的细胞，以用作现成的细胞。例如，对TDAG8的表达具有完全或部分抑制的细胞存在于例如保藏库中，并且它们从保藏库中获得并被工程化改造以具有除对TDAG8的表达具有完全或部分抑制之外的进一步修饰。在其他情况下，具有除完全或部分抑制TDAG8表达之外的修饰的细胞从保藏库获得，并且被工程化改造以具有对TDAG8表达的完全或部分抑制。在从保藏库获得细胞之后对细胞进行这种修饰之后，可以存储细胞，或者向有需要的个体提供有效量的所述细胞。TDAG8KO或敲低细胞的进一步工程化改造可以是对它们进行工程化改造以表达工程化改造的受体，例如靶向肿瘤抗原的工程化改造的抗原受体，其适合用于治疗患有表达该抗原的特定癌症的个体。

在特定实施方案中，免疫效应细胞具有TDAG8表达的完全或部分抑制，并且还表达一种或多种工程化改造的抗原靶向受体和/或表达至少一种转染的(与细胞内源性相反)细胞因子和/或表达至少一种自杀基因。在具有TDAG8表达的完全或部分抑制的细胞的一些情况下，不同的载体编码一种或多种抗原靶向受体，相对于编码一种或多种自杀基因和/或一种或多种转染的细胞因子。免疫细胞，包括NK细胞，可衍生自脐带血、外周血、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)、骨髓或其混合物。例如，NK细胞可以来源于细胞系，例如但不限于NK-92细胞。NK细胞可以是脐带血单核细胞，例如CD56+NK细胞。

本实例显示使用CRISPR/Cas9从衍生自储存在脐带血库中的脐带血的天然杀伤(NK)细胞成功敲除(KO)了TDAG8基因。TDAG8KO NK细胞在酸性条件下或在文献中显示为酸性的类体内条件下具有比TDAG8WT NK细胞增强的抗肿瘤活性。表明这种增强的抗肿瘤活性是针对已知具有活跃糖酵解和突出的酸性肿瘤微环境的实体瘤细胞系。

在一些情况下，具有对TDAG8表达的完全或部分抑制的免疫效应细胞已经在有效量的通用抗原呈递细胞(UAPC)的存在下扩增，包括以任何合适的比率扩增。细胞可以与UAPC以10:1至1:10；9:1至1:9；8:1至1:8；7:1至1:7；6:1至1:6；5:1至1:5；4:1至1:4；3:1至1:3；2:1至1:2；或1:1的比率培养，包括例如以1:2的比率培养。在一些情况下，NK细胞在IL-2存在下扩增，如IL-2的浓度为10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、100-500、100-400、100-300、100-200、200-500、200-400、200-300、300-500、300-400或400-500U/mL。

在用任何载体进行基因修饰之后，具有TDAG8表达的部分或完全减少的免疫效应细胞可以立即递送到个体或可以被储存(或一些细胞被递送到个体并且其余细胞被储存)。在某些方面，在基因修饰之后，细胞可以在基因转移到细胞中之后约1、2、3、4、5天或更长时间内作为大量群体离体繁殖数天、数周或数月。在另一个方面，克隆转染物，并且将证明存在单个整合的或附加体维持的表达盒或质粒的克隆离体扩增。选择用于扩增的克隆表明减少或不存在TDAG8的表达。重组免疫细胞可以通过用IL-2或结合共同γ链的其他细胞因子(例如，IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激来扩增。重组免疫细胞可通过用人工抗原呈递细胞刺激而扩增。在另一方面，基因修饰的细胞可以冷冻保存。

本公开的实施方案涵盖具有对TDAG8表达的完全或部分抑制和一种或多种工程化改造的受体(包括一种或多种抗原受体)的免疫效应细胞。一种或多种工程化改造的抗原受体由人工例如使用重组技术产生，并且对于免疫效应细胞不是天然的。尽管工程化改造的受体可以是任何种类，但在具体实施方案中，所述受体是嵌合抗原受体、T细胞受体、归巢受体、CRISPR/Cas9-介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。

本公开的实施方案涵盖具有对TDAG8表达的完全或部分抑制和一种或多种自杀基因的细胞。免疫效应细胞可以具有对TDAG8表达的完全或部分抑制，并且可以包含编码任何种类的自杀基因的重组核酸。自杀基因的实例包括工程化改造的不可分泌的(包括膜结合的)肿瘤坏死因子(TNF)-α突变体多肽(参见PCT/US2019/062009，其通过引用整体并入本文)，并且它们可能受到结合TNF-α突变体的抗体的递送的影响。可以使用的自杀基因/前药组合的实例是单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦、阿昔洛韦或FIAU；氧化还原酶和环己胺；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸(thymidilate)激酶(Tdk::Tmk)和AZT；以及脱氧胞苷激酶和胞嘧啶阿拉伯糖苷。可使用大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶，其为一种将前药6-甲基嘌呤脱氧核糖苷转化为毒性嘌呤6-甲基嘌呤的所谓自杀基因。其他自杀基因包括例如CD20、CD52、诱导性胱天蛋白酶9、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫氨酸-α,γ-裂解酶(MET)和胸苷磷酸化酶(TP)。

细胞可以直接从个体获得，或者可以从保藏库或其他存储机构获得。作为疗法的细胞相对于对其提供所述细胞作为疗法的个体可以是自体或同种异体的。

细胞可以来自需要治疗医学病况的个体，并且在操纵它们以具有减少或抑制的TDAG8表达、任选的自杀基因、任选的细胞因子和任选的受体(例如，使用用于过继细胞治疗的转导和扩增的标准技术)之后，可以将它们提供回它们最初来源的个体。在一些情况下，存储细胞以供个体或另一个体以后使用。

免疫细胞可以包含在细胞群体中，并且该群体中大部分可以具有减少或抑制的TDAG8表达和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子。细胞群体可包含51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的免疫细胞，所述免疫细胞具有减少或抑制的TDAG8表达和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子和/或一种或多种工程化改造的受体；这些基因产物中的每一种可以或可以不作为单独多肽产生。

可以产生免疫细胞以具有减少或抑制的TDAG8表达和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子，目的是相对于特定目的模块化。例如，可以产生细胞，包括用于商业分销，具有减少或抑制的TDAG8表达和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子(或与编码用于后续转导的自杀基因的核酸一起分销)，并且用户可以根据其预期目的修饰它们以表达一种或多种其他感兴趣的基因(包括治疗性基因)。例如，对治疗癌细胞感兴趣的个体可以获得或产生自杀基因表达细胞(或异源细胞因子表达细胞)并将其修饰为具有减少或抑制的TDAG8表达，反之亦然。

在特定实施方案中，利用NK细胞，并且可以修饰具有减少或抑制的TDAG8表达和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子的NK细胞的基因组。基因组可以以任何方式修饰，但是在具体实施方案中，基因组例如通过CRISPR基因编辑来修饰。可以修饰细胞的基因组以增强细胞的有效性以用于任何目的。

IV.治疗方法

本公开的实施方案包括与癌症免疫疗法或抗病原体免疫疗法相关的治疗方法，例如，其中癌症免疫疗法和抗病原体免疫疗法至少包含含有具有减少或抑制的TDAG8表达水平的免疫效应细胞的组合物。所述方法包括向患有癌症和/或具有病原体的个体提供有效量的具有减少或抑制的TDAG8表达水平的免疫效应细胞。

在特定情况下，向个体提供有效量的具有减少或抑制的TDAG8表达水平的细胞。在特定的情况下，使用CRISPR/Cas9的TDAG8敲除用于基因工程改造在各种细胞疗法中使用的免疫细胞以增加它们对实体瘤的有效性，并且将这些细胞疗法提供给个体。

作为一个实例，嵌合抗原受体(CAR)-T细胞(例如经FDA批准用于治疗白血病和淋巴瘤的那些细胞)经基因工程改造以缺失TDAG8基因，目的是增加它们在实体瘤的酸性TME中的有效性，这在特定实施方案中导致这种治疗扩展到实体瘤。此外，该基因工程策略用于各种其他形式的细胞疗法，例如CAR-NK细胞、工程化改造的TCR-T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，以增强它们对抗各种类型的实体瘤。

在某些实施方案中，将本公开的细胞提供给个体以用于改善医学病况的目的，所述医学病况例如任何种类的癌症和/或任何种类的病原体感染。本文考虑的细胞(包括包含其的药物组合物)的用途用于预防、治疗或改善癌性疾病，例如肿瘤疾病，或病原体感染。在特定实施方案中，本公开的药物组合物可特别用于预防、改善和/或治疗癌症，包括例如可能是或可能不是实体瘤的癌症。

在特定实施方案中，本公开部分地预期本文涵盖的细胞的用途，所述细胞可以单独或与一种或多种其他疗法任意组合施用，并且在至少一些方面，与药学上可接受的承载体或赋形剂一起施用。在某些实施方案中，在将细胞递送到受试者之前，任何核酸分子或载体可以稳定地整合到细胞的基因组中。

此外，本公开涉及用于预防、治疗或改善肿瘤疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的具有减少或抑制的TDAG8表达水平的任何细胞的步骤，如本文所考虑的。

在一个实施方案中，如本文所涵盖的通过任何合适的方法或从细胞系获得并进行工程改造的分离细胞可用作药物。所述药物可用于治疗有需要的个体中的癌症或感染。在一个实施方案中，根据本公开的分离细胞可用于制备用于治疗有需要的个体的癌症或感染的药物。

在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗有需要的个体的方法，所述方法包括以下步骤中的至少一个：

(a)提供免疫效应细胞；

(b)工程化改造免疫效应细胞以具有至少TDAG8的减少或抑制的表达；

(c)工程化改造免疫效应细胞以表达一种或多种工程化改造的受体(并且步骤(c)可与步骤(b)同时或在步骤(b)之前进行)；

(d)工程化改造免疫效应细胞以表达一种或多种细胞因子(并且步骤(d)可与步骤(b)或(c)同时或在步骤(b)或(c)之前进行)；

(e)将工程化改造的细胞施用给有需要的个体，所述个体包括已经被确定为患有癌症或处于患有癌症的风险中(诸如大于人群中的普通人)的个体。在特定实施方案中，与任何种类的非工程化改造的细胞相比，为了产生增强的扩增、持久性和/或细胞毒性的目的，工程化改造的细胞被特异性工程化改造。

本公开的任何治疗方法对于个体可以是改善性的、治愈性的或预防性的。它可以是自体免疫疗法的一部分或是同种异体免疫疗法治疗的一部分。在特定情况下，该方法用于同种异体免疫疗法，只要它能够将通常从供体获得的NK细胞转化为非同种异体反应性细胞。这可以在标准流程下完成并且根据需要再现多次。所得工程化改造的免疫细胞可被汇集并施用给一个或多个患者，作为“现成的”治疗产品可用。可以存储细胞，例如冷冻保存。

在一些实施方案中，细胞组合物的施用用于任何类型的癌性疾病，包括肿瘤疾病，例如包括B细胞恶性病、多发性骨髓瘤、肺癌、脑癌、乳腺癌、血液癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、脾癌、胆囊癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫内膜癌、前列腺癌、直肠癌、肛门癌或宫颈癌。施用细胞组合物的示例性适应症是癌性疾病，包括表达与个体癌症相关的一种或多种特定抗原的任何恶性病。本公开的组合物的施用可用于所有阶段(I、II、III和/或IV)和类型的癌症，包括例如最小残留疾病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难治性癌症。

本公开还包括与经由免疫细胞起作用的其他化合物(例如双特异性抗体构建体、靶向性毒素或其他化合物)的共同施用方案。用于共同施用本发明化合物的临床方案可以包括在施用其它组分的同时、之前或之后共同施用。特定组合疗法包括化学疗法、辐射、手术、激素疗法或其它类型的免疫疗法。

实施方案涉及试剂盒，其包含产生细胞的构建体、如本文定义的核酸序列、如本文定义的载体和/或如本文定义的宿主细胞(例如免疫效应细胞)。还预期本公开的试剂盒包含如上文所述的药物组合物，所述药物组合物单独或与另外的药物组合以施用给需要医学治疗或干预的个体。

V.基因工程改造的受体

可以进一步修饰具有减少或抑制的TDAG8表达的本公开的免疫细胞以表达一种或多种非内源基因产物。基因产物可以是或可以不是基因工程改造的受体。受体可以是任何种类，包括例如针对抗原、趋化因子或细胞因子的受体。在其中受体针对抗原的情况下，抗原可以是癌症抗原，包括实体瘤抗原。

具有减少或抑制的TDAG8表达的免疫效应细胞可以被基因工程改造以表达靶向特异性抗原的抗原受体，并且这样的细胞可以被特异性设计以靶向存在于个体的癌细胞上的一种或多种抗原。

在具体实施方案中，包含TDAG8的减少或抑制的表达的免疫效应细胞可以包含工程化改造的抗原受体，例如工程化改造的TCR或CAR。例如，免疫细胞可以是被修饰以表达对一种或多种特定抗原具有抗原特异性的一种或多种CAR和/或TCR的NK细胞。在一些方面，通过例如使用CRISPR敲入CAR或TCR来工程化改造免疫细胞，以表达抗原特异性CAR或抗原特异性TCR。

合适的修饰方法是本领域已知的。参见例如Sambrook和Ausubel，出处同上。例如，可以使用Hemskerk等人，2008和Johnson等人，2009中描述的转导技术转导细胞，以表达对癌症抗原具有抗原特异性的TCR。

在一些实施方案中，细胞包含通过基因工程引入的一种或多种核酸，其编码一种或多种抗原受体和这些核酸的基因工程改造的产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即，通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，例如从另一种生物体或细胞获得的细胞或样品，例如，通常不存在于被工程化改造的细胞和/或衍生这种细胞的生物体中。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，例如天然中不存在的核酸(例如，嵌合)。

示例性的抗原受体，包括CAR和重组TCR，以及用于将受体工程化改造并引入细胞的方法，包括例如在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP2537416中描述的那些，和/或Sadelain等人，2013；Davila等人，2013；Turtle等人，2012；Wu等人，2012中所述的那些。在一些方面，基因工程改造的抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。

A.嵌合抗原受体

在一些实施方案中，抗原特异性CAR包含：a)一个或多个细胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)细胞外结构域，其包含靶向(包括特异性结合)所需抗原的抗原结合区。

在一些实施方案中，工程化改造的抗原受体包括CAR，包括活化或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人，2013)。CAR通常包括连接至(在一些方面中经由接头和/或跨膜结构域)一种或多种细胞内信号传导组分的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这些分子通常模拟或近似通过天然抗原受体的信号、通过此类受体与共刺激性受体组合的信号、和/或通过单独的共刺激性受体的信号。

本公开的某些实施方案涉及核酸的使用，包括编码抗原特异性CAR多肽的核酸，包括已经被人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含至少一个细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含一个或多个信号传导基序的细胞外结构域。在某些实施方案中，所述抗原特异性CAR可以识别包含一种或多种抗原之间的共享空间的表位。在某些实施方案中，结合区可以包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性源自结合受体的肽(例如细胞因子)。

预期人类抗原CAR核酸可以是用于增强用于人类患者的细胞免疫疗法的人类基因。在一个具体实施方案中，本公开包括全长抗原特异性CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可包含衍生自特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的V_H和V_L链的片段，例如美国专利7,109,304(通过引用并入本文)中所述的那些。片段也可以是人抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。在一个更具体的实施方案中，所述片段是由序列编码的抗原特异性scFv，所述序列针对用于在人类细胞中表达的人类密码子应用而优化。

排列可为多聚体，诸如双抗体或多聚体。多聚体最可能通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双抗体而形成。构建体的铰链部分可以具有多种替代物，从完全缺失、至保留第一半胱氨酸、至脯氨酸而不是丝氨酸取代、到截短至第一半胱氨酸。Fc部分可以缺失。任何稳定和/或二聚化的蛋白质可用于此目的。可以仅使用Fc结构域之一，例如，来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可以使用已经修饰的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区以改善二聚化。还可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。还可以使用CD8α的部分。

在一些实施方案中，CAR核酸包含编码其它共刺激性受体的序列，如跨膜结构域和修饰的CD28细胞内信号传导结构域。其他共刺激性受体包括但不限于CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、DAP12和4-1BB(CD137)中的一个或多个。除了由CD3ζ引发的初级信号之外，由插入人CAR中的人共刺激性受体提供的额外信号对于NK细胞的完全活化是重要的，并且可以帮助改善过继免疫疗法的体内持续性和治疗成功性。

在一些实施方案中，抗原特异性CAR经构建以具有针对抗原的特异性，抗原例如在正常或非患病细胞类型或患病细胞类型上表达的抗原。因此，CAR通常在其细胞外部分中包括一种或多种抗原结合分子，例如一种或多种抗原结合片段、结构域或部分，或一种或多种抗体可变结构域，和/或抗体分子。在一些实施方案中，抗原特异性CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如源自单克隆抗体(mAb)的可变重(VH)链和可变轻(VL)链的单链抗体片段(scFv)。

在某些实施方案中，当存在少量的肿瘤相关抗原时，抗原特异性CAR可以与细胞因子共同表达以改善持久性。例如，CAR可以与一种或多种细胞因子共同表达，所述细胞因子例如IL-7、IL-2、IL-15、IL-12、IL-18、IL-21或其组合。

编码嵌合受体的开放阅读框的序列可从基因组DNA源、cDNA源获得，或可合成(例如，通过PCR)，或其组合。取决于基因组DNA的大小和内含子的数量，可能期望使用cDNA或其组合，因为发现内含子稳定mRNA。此外，使用内源或外源非编码区来稳定mRNA可能是进一步有利的。

预期嵌合构建体可以作为裸DNA或在合适的载体中引入免疫细胞中。使用裸DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法是本领域已知的。参见例如美国专利号6,410,319。裸DNA通常是指编码嵌合受体的DNA，所述嵌合受体以对于表达适当的定向包含在质粒表达载体中。

备选地，病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)可用于将嵌合构建体引入免疫细胞中。根据本公开的方法使用的合适的载体是在免疫细胞中不复制的。已知大量基于病毒的载体，其中细胞中维持的病毒的拷贝数足够低以维持细胞的活力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。

在一些方面，抗原特异性结合或识别组分与一个或多个跨膜和细胞内信号传导域连接。在一些实施方案中，CAR包括融合到CAR的细胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。

在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或合成来源。在来源是天然的情况下，在一些方面，结构域衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自以下(即，至少包含以下的一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α链、β链或ζ链，CD28，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，CD3δ，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，ICOS/CD278，GITR/CD357，NKG2D，和DAP分子。备选地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每一末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

在某些实施方案中，本文公开的用于基因修饰免疫细胞(如NK细胞)的平台技术包括：(i)使用电穿孔装置(例如，核转染仪)的非病毒基因转移，(ii)通过胞内结构域(例如，CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他组合)信号传导的CAR，(iii)具有可变长度的细胞外结构域的CAR，所述细胞外结构域将CD70-识别结构域连接至细胞表面，以及在一些情况下，(iv)能够稳健地且在数值上扩增CAR⁺免疫细胞的源自K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)(Singh等人，2008；Singh等人，2011)。

B.T细胞受体(TCR)

在一些实施方案中，基因工程改造的抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)并且能够特异性结合与主要组织相容性复合物(MHC)受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。

通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但表达它们的T细胞可具有不同的解剖位置或功能。TCR可存在于细胞表面上或呈可溶性形式。通常，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，其中它通常负责识别与MHC分子结合的抗原。在一些实施方案中，TCR还可以包含恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾部(参见例如Janeway等人，1997)。例如，在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和在C末端的短细胞质尾部。在一些实施方案中，TCR与参与调控信号转导的CD3复合物的不变蛋白缔合。除非另有说明，术语“TCR”应理解为包括其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。

因此，出于本文的目的，提及TCR包括任何TCR或功能片段，诸如与结合在MHC分子中的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。可互换使用的TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指包含TCR的一部分结构域但结合完整TCR所结合的抗原(例如MHC-肽复合物)的分子。在一些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，足以形成用于结合特异性MHC-肽复合物的结合位点，例如通常其中每条链包含三个互补决定区。

在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合以形成与免疫球蛋白类似的环或互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点来赋予抗原识别且决定肽特异性，并且决定肽特异性。通常，像免疫球蛋白一样，CDR由框架区(FR)分开(参见例如Jores等人，1990；Chothia等人，1988；Lefranc等人，2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别加工的抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也显示与抗原肽的N末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C末端部分相互作用。CDR2被认为识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区可含有另一高变(HV4)区。

在一些实施方案中，TCR链包含恒定结构域。例如，类似于免疫球蛋白，TCR链的细胞外部分(例如，a链、β链)可以包含两个免疫球蛋白结构域、一个在N末端的可变结构域(例如，V_a或Vp；通常是基于Kabat编号(Kabat等人，"Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Dept.Health and Human Services，Public HealthService National Institutes of Health，1991，第5版)的氨基酸1至116)和一个与细胞膜相邻的恒定结构域(例如，a链恒定结构域或Ca，通常是基于Kabat的氨基酸117至259；β链恒定结构域或Cp，通常是基于Kabat的氨基酸117至295)。例如，在一些情况下，由两个链形成的TCR的细胞外部分含有两个近膜端恒定结构域和两个含有CDR的远膜端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两个链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。

在一些实施方案中，TCR链可包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有细胞质尾。在一些情况下，该结构允许TCR与其他分子如CD3缔合。例如，含有具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导器或复合物的不变亚基缔合。

通常，CD3是可以具有三条不同链(γ、δ和ε)(在哺乳动物中)和ζ链的多蛋白复合物。例如，在哺乳动物中，复合物可以包含一个CD3γ链、一个CD3δ链、两个CD3ε链以及CD3ζ链的同源二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的胞内尾区各自含有单个保守基序(称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM)，而每个CD3ζ链具有三个保守基序。通常，ITAM参与TCR复合物的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区，并在将信号从TCR传送到细胞中发挥作用。CD3链和ζ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。

在一些实施方案中，所述TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异源二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，所述TCR是含有例如通过一个或多个二硫键连接的两条独立链(α和β链或γ和δ链)的异源二聚体。在一些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如癌症抗原)的TCR并将其引入细胞中。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可从多种来源获得，例如通过公众可得到的TCR DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR获自生物来源，例如获自细胞，例如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可获自体内分离的细胞。在一些实施方案中，可以从患者分离高亲和力T细胞克隆，并分离TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或HLA)工程化改造的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的TCR克隆。参见例如肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人，2009和Cohen等人，2005)。在一些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人，2008和Li，2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可根据TCR序列的知识合成地产生。

VI.细胞因子

一种或多种细胞因子可用在具有减少或抑制的TDAG8表达水平的免疫效应细胞中。在一些情况下，一种或多种细胞因子存在于与工程化改造的受体相同的载体分子上，但是在其他情况下，它们在单独的分子上。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子由与工程化改造的受体相同的载体共表达。一种或多种细胞因子可作为与抗原特异性受体分开的多肽产生。作为一个示例，利用白介素-15(IL-15)。可以采用IL-15的原因在于，例如它是组织限制性的，并且仅在病理条件下在血清中的任何水平或全身观察到。IL-15具有合乎过继疗法需要的若干属性。IL-15是一种稳态细胞因子，其诱导天然杀伤细胞的发育和细胞增殖，通过减轻肿瘤驻留细胞的功能抑制而促进已建立的肿瘤的根除，并抑制活化诱导的细胞死亡。除了IL-15之外，还考虑了其他细胞因子。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子和有助于用于人应用的细胞的活化和增殖的其它分子。例如，细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。可以利用具有减少或抑制的TDAG8表达水平并且可以表达一种或多种细胞因子的细胞，并且所述细胞能够持续支持细胞因子信号传导，这可用于其输注后存活。

在具体实施方案中，具有减少或抑制的TDAG8表达水平的NK细胞表达一种或多种外源提供的细胞因子。细胞因子可以外源性地提供给细胞，因为它是从细胞内的表达载体表达的。在备选情况下，细胞中的内源细胞因子在操纵内源细胞因子的表达调节后上调，例如在细胞因子的启动子位点处的基因重组。在将细胞因子以在表达构建体上的方式提供给细胞的情况下，细胞因子可以从与表达另一基因产物(例如自杀基因)的载体相同的载体编码。细胞因子可表达为与自杀基因分开的多肽分子和与细胞的工程化改造受体分开的多肽。在一些实施方案中，本公开涉及CAR和/或TCR载体与IL-15的共同利用，特别是在具有减少的或抑制的TDAG8表达水平的NK细胞中的共同利用。

VII.自杀基因

在特定实施方案中，自杀基因与任何类型的细胞疗法结合使用以控制其使用并允许在期望的事件和/或时间终止细胞疗法。自杀基因用于转导细胞中，用于在需要时引发转导细胞死亡的目的。已经被修饰以携带本公开所涵盖的载体的本公开的免疫效应细胞可包含一种或多种自杀基因。在一些实施方案中，本文使用的术语“自杀基因”被定义为在施用前药或其他药剂时实现基因产物向杀死其宿主细胞的化合物的转变的基因。在其他实施方案中，自杀基因编码基因产物，当需要时，该基因产物被靶向自杀基因产物的药剂(例如抗体)靶向。

可以使用的自杀基因/前药组合的实例是单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦、阿昔洛韦或FIAU；氧化还原酶和环己胺；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk::Tmk)和AZT；以及脱氧胞苷激酶和胞嘧啶阿拉伯糖苷。可使用大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶，一种将前药6-甲基嘌呤脱氧核糖苷转化为毒性嘌呤6-甲基嘌呤的所谓自杀基因。与前药疗法一起使用的自杀基因的其他实例是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因和HSV胸苷激酶基因。

示例性自杀基因还包括CD20、CD52、EGFRv3或诱导性胱天蛋白酶9。在一个实施方案中，EGFR变体III(EGFRv3)的截短形式可用作可由西妥昔单抗消融的自杀抗原。可用于本发明的本领域已知的其它自杀基因包括：嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫氨酸-α,γ-裂解酶(MET)和胸苷磷酸化酶(TP)。

在特定的实施方案中，编码抗原靶向CAR的载体或本文所涵盖的NK细胞中的任何载体包括一种或多种自杀基因。自杀基因可以在或可以不在与抗原靶向CAR相同的载体上。在自杀基因存在于与抗原靶向CAR相同的载体上的情况下，自杀基因和CAR可以通过例如内部核糖体进入位点(IRES)元件或2A元件分开。

在具体的实施方案中，自杀基因是肿瘤坏死因子(TNF)-α突变体，其不能被天然切割TNF的标准酶(例如TNF-α转化酶(也称为TACE))切割。因此，在特定实施方案中，TNF-α突变体是膜结合且不可分泌的。本公开中使用的TNF-α突变体可通过结合突变体的一种或多种药剂靶向，包括至少一种抗体，使得在所述药剂结合到细胞表面上的TNF-α突变体之后，细胞死亡。本公开的实施方案允许TNF-α突变体用作表达其的细胞的标志物。

表达不可切割的TNF-α突变体的细胞可被靶向以进行选择性缺失，包括例如使用目前临床所用的经FDA批准的TNF-α抗体，例如依那西普、英夫利昔单抗或阿达木单抗。突变的TNF-α多肽可与细胞中的一种或多种治疗性转基因共表达，诸如编码TCR或CAR的基因，包括CD70-靶向TCR和/或CAR。此外，表达TNF-α突变体的细胞对肿瘤靶标具有优异的活性，其由与膜结合的TNF-α蛋白的生物活性介导。

关于野生型，TNF-α具有26kD跨膜形式和17kD分泌组分。Perez等人(1990)中描述的一些突变体可用于本公开中。在具体的实施方案中，本公开的TNF-α突变体的实例至少包括关于17kD TNF的以下各项：(1)缺失Val1和缺失Prol12；(2)缺失Val13；(3)缺失Val1和缺失Val13；(4)缺失Val1至且包括Prol12和缺失Val13(缺失13aa)；(5)缺失Ala-3至且包括Val 13(缺失14aa)。在具体实施方案中，TNF-α突变体包含在位置-3、-2、-1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或其组合处缺失相应氨基酸。特定组合包括在以下位置处的缺失：-3至且包括13；-3至且包括12；-3至且包括11；-3至且包括10；-3至且包括9；-3至且包括8；-3至且包括7；-3至且包括6；-3至且包括5；-3至且包括4；-3至且包括3；-3至且包括2；-3至且包括1；-3至且包括-1；-3至且包括-2；-2至且包括13；-2至且包括12；-2至且包括11；-2至且包括10；-2至且包括9；-2至且包括8；-2至且包括7；-2至且包括6；-2至且包括5；-2至且包括4；-2至且包括3；-2至且包括2；-2至且包括1；-2至且包括-1；-1至且包括13；-1至且包括12；-1至且包括11；-1至且包括10；-1至且包括9；-1至且包括8；-1至且包括7；-1至且包括6；-1至且包括5；-1至且包括4；-1至且包括3；-1至且包括2；-1至且包括1；1至且包括13；1至且包括12；1至且包括11；1至且包括10；1至且包括9；1至且包括8；1至且包括7；1至且包括6；1至且包括5；1至且包括4；1至且包括3；1至且包括2；等等。

TNF-α突变体可通过任何合适的方法产生，但在具体实施方案中，其通过定点诱变产生。在一些情况下，TNF-α突变体可具有除使蛋白质不可切割的突变之外的突变。在特定情况下，除在Val1、Pro12和/或Val13或其间区域的缺失之外，TNF-α突变体可具有1个、2个、3个或更多个突变。除了使突变体不可分泌的那些之外的突变可以是氨基酸取代、缺失、添加、倒置等中的一种或多种。在额外突变是氨基酸取代的情况下，例如，取代可以是或可以不是保守氨基酸。在一些情况下，1、2、3、4、5或更多个额外氨基酸可以存在于蛋白质的N末端和/或C末端上。在一些情况下，TNF-α突变体具有：(1)使突变体不可分泌的一个或多个突变；(2)防止针对突变体的外向内信号传导的一个或多个突变；和/或(3)干扰突变体与TNF受体1和/或TNF受体2结合的一个或多个突变。

在特定的实施方案中，在递送有效量的一种或多种药剂以结合表达TNF-α突变体的抗原CAR靶向细胞时，大部分表达TNF-α突变体的细胞被消除。在具体实施方案中，在个体中消除了大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的表达TNF-α突变体的细胞。在认识到需要消除细胞之后，可以继续将一种或多种药剂递送到个体，直到不再存在一个或多个症状或直到已经消除足够数量的细胞。可以使用TNF-α突变体作为标志物监测个体中的细胞数量。

本公开的方法的实施方案可包括向有需要的个体提供有效量的细胞疗法的第一步骤，其中所述细胞包含一种或多种不可分泌的TNF-α突变体；和使用TNF-α突变体作为自杀基因(直接通过细胞死亡或间接通过任何机制引起的细胞死亡)消除所述细胞的第二步骤。第二步骤可以在个体的至少一个不良事件开始时发起，并且该不良事件可以通过任何手段识别，包括在从细胞治疗开始可以连续或可以不连续的例行监测时。可以在检查和/或测试时检测不良事件。在个体具有细胞因子释放综合征(其也可称为细胞因子风暴)的情况下，个体可具有升高的炎性细胞因子(仅作为示例：干扰素-γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-10、IL-6和TNF-α)；发烧；疲劳；低血压；缺氧，心动过速；恶心；毛细血管渗漏；心脏/肾/肝功能障碍；或其组合。在个体具有神经毒性的情况下，个体可能具有混乱、谵妄、发育不全和/或癫痫发作。在一些情况下，测试个体的与细胞因子释放综合征的发作和/或严重性相关的标志物，如C-反应性蛋白、IL-6、TNF-α和/或铁蛋白。

在另外的实施方案中，在细胞因子释放综合征或神经毒性期间施用结合不可分泌的TNF-α的一种或多种药剂例如具有中和导致治疗毒性的高水平可溶性TNF-α的额外益处。可溶性TNF-α在细胞因子释放综合征期间以高水平释放，并且是CAR T细胞疗法的毒性介质。在这种情况下，本文所涵盖的TNF-α抗体的施用具有双重有益效果：即选择性去除TNF-α突变体表达细胞以及中和引起毒性的可溶性TNF-α。因此，本公开的实施方案涵盖在接受或已接受其中细胞表达不可分泌的TNF-α突变体的过继细胞疗法的个体中消除或降低细胞因子释放综合征的严重性的方法，其包括提供有效量的结合不可分泌的TNF-α突变体的药剂的步骤，所述药剂引起个体(a)消除细胞疗法的至少一些细胞；和(b)降低可溶性TNF-α的水平。

本公开的实施方案包括减少个体中细胞因子释放综合征的影响的方法，所述个体已经接受或正在接受用表达不可分泌的TNF-α突变体的细胞进行的细胞疗法，所述方法包括提供有效量的一种或多种结合所述突变体的药剂以引起个体(a)消除细胞疗法的至少一些细胞；和(b)降低可溶性TNF-α水平的步骤。

当需要使用TNF-α自杀基因时，向个体提供有效量的一种或多种能够抑制(例如通过直接结合)细胞表面上的TNF-α突变体的抑制剂。在一些实施方案中，可以将抑制剂系统地和/或局部地提供给个体。抑制剂可以是多肽(例如抗体)、核酸、小分子(例如黄嘌呤衍生物)、肽或其组合。在具体实施方案中，抗体经FDA批准。当抑制剂是抗体时，抑制剂在至少一些情况下可以是单克隆抗体。当采用抗体的混合物时，混合物中的一种或多种抗体可以是单克隆抗体。小分子TNF-α抑制剂的实例包括如美国专利号5,118,500中所述的小分子，其全部内容通过引用并入本文。多肽TNF-α抑制剂的实例包括多肽，如美国专利号6,143,866中所述的那些，其全部内容通过引用并入本文。

在特定实施方案中，利用至少一种抗体靶向TNF-α突变体以触发其作为自杀基因的活性。抗体的实例至少包括例如阿达木单抗(Adalimumab)、Adalimumab-atto、Certolizumab pegol、依那西普(Etanercept)、Etanercept-szzs、戈利木单抗(Golimumab)、英夫利昔单抗(Infliximab)、Infliximab-dyyb或其混合物。

本公开的实施方案包括通过修饰细胞疗法的细胞以表达不可分泌的TNF-α突变体来降低个体的细胞疗法的毒性风险的方法。在具体实施方案中，细胞疗法用于癌症，并且其可以包含靶向抗原(包括癌症抗原)的工程化改造的受体。

在特定实施方案中，除了本公开的发明性细胞疗法之外，个体还可以已经被提供、可以被提供和/或可以将要被提供针对医学病况的额外疗法。在医学病况是癌症的情况下，可以向个体提供手术、辐射、免疫疗法(除了本公开的细胞疗法之外)、激素疗法、基因疗法、化学疗法等中的一种或多种。

具有减少或抑制的TDAG8表达水平的细胞群体以有效水平提供给有需要的个体。细胞可以通过注射、静脉内、动脉内、腹膜内、气管内、肿瘤内、肌肉内、经由内窥镜、病灶内、颅内、经皮、皮下、区域内、通过灌注、在肿瘤微环境中或其组合施用于个体。

在所述方法的具体实施方案中，细胞可以一次或多于一次施用于个体。向个体施用细胞之间的持续时间可以是1-24小时、1-7天、1-4周、1-12个月或1年或更长。

VIII.载体

在其中具有减少的或抑制的TDAG8表达水平的免疫效应细胞包含非内源工程化改造的基因产物或外源提供的基因产物的情况下，基因产物可通过任何合适的载体递送至接受者免疫效应细胞，包括通过病毒载体或非病毒载体递送。病毒载体的实例至少包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。非病毒载体的实例至少包括质粒、转座子、脂质、纳米颗粒等。

在免疫细胞用编码抗原靶向受体的载体转导并且还需要将另一个或多个基因(例如自杀基因和/或细胞因子和/或任选的治疗性基因产物)转导到细胞中的情况下，抗原靶向受体、自杀基因、细胞因子和任选的治疗性基因可以包含在相同载体上或不包含在相同载体上或者可以或可以不使用相同载体。在一些情况下，抗原靶向CAR、自杀基因、细胞因子和任选的治疗性基因从相同的载体分子(如相同的病毒载体分子)表达。在这种情况下，抗原靶向CAR、自杀基因、细胞因子和任选的治疗性基因的表达可以或可以不由相同的调节元件调节。当抗原靶向CAR、自杀基因、细胞因子和任选的治疗性基因在相同载体上时，它们可以或可以不表达为单独的多肽。在它们表达为单独多肽的情况下，它们可在载体上通过例如2A元件或IRES元件分开(或两种可在相同载体上使用一次或多于一次)。

A.通用实施方案

本领域技术人员有能力通过标准重组技术(参见，例如，Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996)构建载体用于表达本公开的抗原受体。

1.调节元件

包括在适用于本公开的载体中的表达盒尤其含有(在5’-至-3’方向上)可操作地连接于蛋白质编码序列的真核转录启动子、包括间隔序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。控制真核细胞中的蛋白质编码基因的转录的启动子和增强子由多个基因元件构成。细胞机构能够聚集和整合由各元件输送的调节信息，从而允许不同基因进化不同的、通常为复杂的转录调节模式。例如，在本发明的上下文中所使用的启动子包括组成型、诱导型和组织特异型启动子。在其中载体用于产生癌症疗法的情形中，启动子可以在缺氧条件下是有效的。

2.启动子/增强子

本文所提供的表达构建体包含驱动抗原受体和其他顺反子基因产物表达的启动子。启动子一般包含起定位RNA合成的起始位点的作用的序列。该序列最佳已知的实例为TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子，诸如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中，叠加起始位点的离散元件本身有助于固定起始的位置。额外启动子元件调节转录起始频率。通常，这些元件位于起始位点上游区中，但许多启动子已显示也含有起始位点下游的功能元件。为使编码序列“处在启动子控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5’端置于所选择的启动子的“下游”(即3’端)。“上游”启动子刺激DNA的转录且促进所编码RNA的表达。

启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对彼此倒置或移动时保留启动子功能。在tk启动子中，启动子元件之间的间距可在活性开始下降前增加至相隔50bp。取决于启动子，个别元件似乎可以合作地或独立地起活化转录的作用。启动子可以或可以不与“增强子”结合使用，增强子指参与核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列。

启动子可为天然与核酸序列缔合的一种启动子，如可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。此类启动子可称为“内源的”。类似地，增强子可为天然与核酸序列缔合、位于该序列下游或上游的一种增强子。备选地，某些优势将通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子控制下来获得，重组或异源启动子指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子也指在其天然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及自任何其他病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，和非“天然存在的”启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变。例如，最常用于重组DNA构建的启动子包括β内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖及色氨酸(trp-)启动子系统。除合成地产生启动子和增强子的核酸序列以外，可结合本文所公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)产生序列。此外，预期也可以采用引导非核细胞器(诸如粒线体、叶绿体等)内的序列的转录和/或表达的控制序列。

自然地，使用有效引导在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的DNA区段的表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员一般知晓使用启动子、增强子和细胞型组合进行蛋白质表达(参见例如Sambrook等人，1989，其通过引用并入本文中)。所用启动子可以是组成型的、组织特异型的、诱导型的和/或适用于在适当条件下引导所引入的DNA区段的高水平表达，诸如在重组蛋白质和/或肽的大规模产生方面有利。启动子可以是异源的或内源的。

另外，任何启动子/增强子组合(根据例如真核启动子数据库(EukaryoticPromoter Data Base，EPDB)，通过万维网epd.isb-sib.ch/访问)也可用于驱动表达。使用T3、T7或SP6细胞质表达系统是另一个可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶(作为递送复合物的一部分或作为额外的基因表达构建体)，则真核细胞可以支持从某些细菌启动子的细胞质转录。

启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，诸如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，诸如β肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；和串联的反应元件启动子，诸如环状AMP反应元件启动子(cre)、血清反应元件启动子(sre)、佛波醇酯启动子(TPA)和靠近最小TATA盒的反应元件启动子(tre)。也有可能使用人类生长激素启动子序列(例如

登录号X05244，核苷酸283-341所描述的人类生长激素最小启动子)或小鼠乳房肿瘤启动子(可获自ATCC，目录号ATCC 45007)。在某些实施方案中，启动子为CMV IE、dectin-1、dectin-2、人类CD11c、F4/80、SM22、RSV、SV40、Ad MLP、β-肌动蛋白、MHC I类或MHC II类启动子，然而适用于驱动治疗性基因表达的任何其他启动子可以适用于实施本发明。

在某些方面中，本发明的方法亦还涉及增强子序列，即增加启动子活性且具有以顺式方式起作用的潜能的核酸序列，且不考虑核酸序列的方向，甚至跨越相对较长距离(与靶启动子相距多达几千个碱基)。然而，增强子功能不一定受限于这样长的距离，因为其也可非常接近所给定的启动子起作用。

3.起始信号和连锁表达

特定起始信号也可用于本发明中所提供的表达构建体中用以编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供包括ATG起始密码子的外源性翻译控制信号。本领域普通技术人员将容易地能够判定此情形且提供必需的信号。熟知起始密码子必须在所要编码序列的阅读框的“框内”，以确保整个插入物的翻译。外源性翻译控制信号和起始密码子可为天然或合成的。表达效率可通过包括适当的转录增强子元件来增强。

在某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)元件的用途产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5’甲基化封端依赖性翻译的核糖体扫描模型且在内部位点开始翻译。已描述来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件以及来自哺乳动物信息的IRES。IRES元件可连接至异源开放阅读框。多个开放阅读框可转录在一起，各自通过IRES分隔，产生多顺反子信息。借助于IRES元件，各开放阅读框可接近核糖体以便有效翻译。可以使用单一启动子/增强子转录单一信息来有效表达多个基因。

如本文其他地方所详细描述的，某些2A序列元件可用于在本发明中所提供的构建体中产生基因的连锁表达或共表达。例如，裂解序列可用于通过连接开放阅读框以形成单一顺反子来共表达基因。示例性裂解序列为马鼻炎A病毒(E2A)或F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，Thosea asigna病毒2A；T2A)或猪捷申病毒-1(P2A)。在具体实施方案中，在单个载体中，多个2A序列是不同的，尽管在备选实施方案中，同一载体使用两个或更多个相同的2A序列。2A序列的实例提供在US 2011/0065779中，其通过引用整体并入本文中。

4.复制起点

为了在宿主细胞中繁殖载体，其可含有一个或多个复制位点起点(常常称为“ori”)，例如，对应于如上文所描述的EBV的oriP，或在程序化中具有类似或提高功能的经基因工程改造的oriP的核酸序列，其为复制起始的特定核酸序列。备选地，可以采用如上文所述的其他染色体外复制病毒或自主复制序列(ARS)的复制起点。

5.选择和可筛选标志物

在一些实施方案中，含有本发明的CD70靶向受体构建体的NK细胞可通过在表达载体中包括标志物进行体外或体内鉴别。此类标志物将赋予细胞可鉴别的变化，允许容易地鉴别含有所述表达载体的细胞。一般而言，选择标志物是赋予允许选择的特性的一种标志物。阳性选择标志物是该标志物的存在允许其选择的一种标志物，而阴性选择标志物是其存在阻止其选择的一种标志物。阳性选择标志物的实例为抗药性标志物。

通常包含药物选择标志物有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施区分转化体的表型的标志物之外，还预期了其他类型的标志物，包括可筛选标志物，例如以比色分析为基础的GFP。备选地，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还知晓如何使用免疫标志物，可能与FACS分析结合使用。所使用的标志物被认为并不重要，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择和可筛选标志物的其他例子是本领域技术人员公知的。

B.多顺反子载体

在具体实施方案中，抗原靶向受体、任选的自杀基因、任选的细胞因子和/或任选的治疗性基因由多顺反子载体表达(如本文所用的术语“顺反子”是指可由其产生基因产物的核酸序列)。在具体实施方案中，多顺反子载体编码抗原靶向受体、自杀基因和至少一种细胞因子和/或工程化改造的受体，例如T细胞受体和/或额外的非抗原靶向CAR。在一些情况下，多顺反子载体编码至少一种抗原靶向CAR、至少一种TNF-α突变体和至少一种细胞因子。细胞因子可以是特定类型的细胞因子，例如人或小鼠或任何物种的细胞因子。在特定情况下，细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18和/或IL-21。

在某些实施例中，本公开提供了一种灵活的模块化系统(如本文所使用的术语“模块化”是指允许其可互换性的顺反子或顺反子的组件，例如分别通过移除和替换整个顺反子或顺反子的组件，例如通过使用标准重组技术)，其利用具有以基本相同的水平表达多个顺反子的能力的多顺反子载体。该系统可以用于允许多个基因的组合表达(包括过表达)的细胞工程化改造。在具体实施方案中，载体表达的一种或多种基因包括一种、两种或更多种抗原受体。多个基因可包含但不限于CAR、TCR、细胞因子、趋化因子、归巢受体、CRISPR/Cas9-介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。载体可以进一步包含：(1)一种或多种报告物，例如荧光或酶报告物，例如用于细胞测定和动物成像；(2)一种或多种细胞因子或其它信号传导分子；和/或(3)自杀基因。

在特定情况下，载体可包含由任何种类的切割位点(例如2A切割位点)分隔的至少4个顺反子。载体可以是或可以不是基于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV或MMLV)的，包括在pUC19骨架中具有psi包装序列的3’和5’LTR。载体可包含4个或更多个顺反子，其中具有用于基因交换的三个或更多个2A切割位点和多个ORF。在一些实施方式中，该系统允许侧接限制位点(以通过亚克隆快速整合)的多个基因(7个或更多个)的组合过表达，并且该系统还包括至少三个2A自切割位点。因此，该系统允许表达多种CAR、TCR、信号传导分子、细胞因子、细胞因子受体和/或归巢受体。该系统还可应用于其它病毒和非病毒载体，包括但不限于慢病毒、腺病毒AAV以及非病毒质粒。

所述系统的模块化性质还使得能够将基因有效亚克隆到所述多顺反子表达载体中的4个顺反子中的每一个中，并且能够进行基因交换，例如用于快速测试。策略性地位于多顺反子表达载体中的限制位点允许有效率的基因交换。

本公开的实施方案涵盖利用多顺反子载体的系统，其中所述载体的至少一部分是模块化的，例如通过允许移除和替换一个或多个顺反子(或一个或多个顺反子的一个或多个组件)，例如通过利用一个或多个限制性酶切位点，所述位点的同一性和位置被特异性选择以促进所述载体的模块化使用。载体还具有这样的实施方案，其中多个顺反子被翻译成单个多肽并被加工成多个单独的多肽，从而赋予载体以基本上等摩尔浓度表达分开的基因产物的优点。

本公开的载体经配置用于模块化，以能够改变载体的一个或多个顺反子和/或改变一或多个特定顺反子的一个或多个组件。载体可被设计成利用侧接一个或多个顺反子的末端和/或侧接特定顺反子的一个或多个组件的末端的独特限制性酶切位点。

本公开的实施方案包括包含至少两个、至少三个或至少四个顺反子的多顺反子载体，每个顺反子侧接一个或多个限制性酶切位点，其中至少一个顺反子编码至少一种抗原受体。在一些情况下，将两个、三个、四个或更多个顺反子翻译成单个多肽并切割成多个单独的多肽，而在其他情况下，将多个顺反子翻译成单个多肽并切割成多个单独的多肽。载体上的相邻的顺反子可以通过自切割位点(例如2A自切割位点)分隔。在一些情况下，每个顺反子从载体表达单独的多肽。在特定情况下，载体上的相邻的顺反子由IRES元件分隔。

在某些实施方案中，本公开提供了用于细胞工程化改造的系统，其允许多个顺反子的组合表达(包括过度表达)，例如，所述多个顺反子可以包括一种、两种或更多种抗原受体。在特定实施方案中，使用如本文所述的多顺反子载体允许载体从相同mRNA产生等摩尔水平的多个基因产物。多个基因可包含但不限于CAR、TCR、细胞因子、趋化因子、归巢受体、CRISPR/Cas9-介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。载体还可包含一种或多种荧光或酶报告物，例如用于细胞测定和动物成像。载体还可包含自杀基因产物，用于当携带载体的细胞不再需要或变得对其已提供到的宿主有害时终止所述细胞。

在本公开的特定实施方案中，载体上的至少一个顺反子包括两个或更多个模块化组件，其中顺反子内的每个模块化组件侧接一个或多个限制性酶切位点。例如，顺反子可包含三个、四个或五个模块化组件。在至少一些情况下，顺反子编码具有由相应的模块化组件编码的受体的不同部分的抗原受体。顺反子的第一模块化组件可以编码受体的抗原结合结构域。另外，顺反子的第二模块化组件可以编码受体的铰链区。此外，顺反子的第三模块化组件可以编码受体的跨膜结构域。另外，顺反子的第四模块化组件可以编码第一共刺激结构域。另外，顺反子的第五模块化组件可以编码第二共刺激结构域。另外，顺反子的第六模块化组件可以编码信号传导结构域。

在本公开的特定方面中，载体上的两种不同的顺反子各自编码不相同的抗原受体。两种抗原受体均可由包含两个或更多个模块化组件的顺反子编码，包括包含两个或更多个模块化组件的单独顺反子。例如，抗原受体可以是嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。

在具体实施方案中，载体是病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)或非病毒载体。载体可包含莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)5’LTR、3’LTR和/或psi包装元件。在特定情况下，将psi包装掺入5’LTR和抗原受体编码序列之间。载体可以包含或不包含pUC19序列。在载体的一些方面，至少一个顺反子编码细胞因子(例如白介素15(IL-15)、IL-7、IL-21或IL-2)、趋化因子、细胞因子受体和/或归巢受体。

当在载体中利用2A切割位点时，2A切割位点可包含P2A、T2A、E2A和/或F2A位点。

除了编码CD70-靶向CAR的一个顺反子之外，载体的任何顺反子可包含自杀基因。载体的任何顺反子可以编码报告基因。在具体的实施方案中，第一顺反子编码自杀基因，第二顺反子编码CD70-靶向CAR，第三顺反子编码报告基因，以及第四顺反子编码细胞因子。在某些实施方案中，第一顺反子编码自杀基因，第二顺反子编码CD70-靶向CAR，第三顺反子编码第二CAR或另一种抗原受体，以及第四顺反子编码细胞因子。在具体实施方案中，CD70-靶向CAR和/或另一受体的不同部分由相应的模块化组件编码，并且第二顺反子的第一组件编码抗原结合结构域，第二组件编码铰链和/或跨膜结构域，第三组件编码共刺激结构域，并且第四组件编码信号传导结构域。

在具体的实施方案中，至少一个顺反子编码自杀基因。在一些实施方案中，至少一个顺反子编码细胞因子。在某些实施方案中，至少一个顺反子编码抗原靶向CAR。顺反子可以编码或可以不编码报告基因。在某些实施方案中，至少两个顺反子编码两种不同的抗原受体(例如，CAR和/或TCR)。顺反子可以编码或可以不编码报告基因。

在感兴趣的基因货物的特定构型中，单个载体可以包含编码抗原靶向CAR的顺反子和编码与抗原靶向受体不相同的第二抗原受体的顺反子。在具体实施方案中，第一抗原受体编码抗原靶向CAR，第二抗原受体编码TCR，反之亦然。在特定的实施方案中，包含分别编码抗原靶向CAR和第二抗原受体的单独的顺反子的载体还包含编码细胞因子或趋化因子的第三顺反子和编码自杀基因的第四顺反子。然而，自杀基因和/或细胞因子(或趋化因子)可能不存在于载体上。

在特定实施方案中，至少一个顺反子包含模块化的多个组件本身。例如，一个顺反子可以编码多组件基因产物，例如具有多个部分的抗原受体；在特定情况下，抗原受体由单个顺反子编码，从而最终产生单个多肽。编码多种组件的顺反子可具有由1、2、3、4、5或更多个限制性酶消化位点分开的多种组件，包括1、2、3、4、5或更多个限制性酶消化位点，其对于包含顺反子的载体是独特的。在具体实施方案中，具有多个组件的顺反子编码具有多个相应部分的抗原受体，每个相应部分赋予受体独特的功能。在一个具体的实施方案中，多组件顺反子的每个或大部分组件由载体特有的一个或多个限制性酶消化位点分隔，从而在需要时允许单独组件的可互换性。

在具体实施方案中，多组件顺反子的每个组件对应于所编码的抗原受体(例如抗原靶向CAR)的不同部分。在说明性实施方案中，组件1可编码受体的抗原结合结构域；组件2可编码受体的铰链结构域；组件3可编码受体的跨膜结构域；组件4可编码受体的共刺激结构域，且组件5可编码受体的信号传导结构域。在具体实施方案中，抗原靶向CAR可以包含一个或多个共刺激结构域，每个共刺激结构域由独特的限制性酶消化位点分隔，用于受体内的共刺激结构域的可互换性。

在具体的实施方案中，存在具有四个单独的顺反子的多顺反子载体，其中相邻的顺反子被2A切割位点分开，尽管在具体的实施方案中，代替2A切割位点，存在直接或间接引起单独的多肽由顺反子产生的元件(例如IRES序列)。例如，四个单独的顺反子可以被三个2A肽切割位点分镉，并且每个顺反子具有限制性位点(X₁、X₂等)，所述限制性位点侧接顺反子的每个末端以允许特定顺反子的可互换性，例如与另一顺反子或其它类型的序列，且在使用标准重组技术后互换。在具体的实施方式中，侧接每个顺反子的限制性酶切位点对于载体是独特的以允许容易重组，尽管在备选的实施方案中限制性酶切位点对于载体不是独特的。

在特定实施方案中，该载体通过允许在特定顺反子内(包括在特定顺反子的多个组件内)的可互换性来提供独特的第二级模块性。特定顺反子的多个组件可由一个或多个限制性酶切位点(包括载体特有的那些)分开，以允许顺反子内的一个或多个组件的可互换性。作为示例，顺反子2可以包含五个单独的组件，但是每个顺反子可以有2、3、4、5、6或更多个组件。例如，载体可以包括具有五个组件的顺反子2，每个组件由独特的酶限制性位点X₉、X₁₀、X₁₁、X₁₂、X₁₃和X₁₄分开，以允许标准重组以交换不同的组件1、2、3、4和/或5。在一些情况下，在不同组件之间可存在多个限制性酶切位点(其是独特的，但备选地一个或多个不是独特的)，并且在多个限制性酶切位点之间可存在序列(但备选地可不存在)。在某些实施方案中，由一个顺反子编码的所有组件被设计用于可互换的目的。在特定情况下，一个顺反子的一个或多个组件被设计成可互换的，而该顺反子的一个或多个其他组件可能不被设计成可互换的。

在具体实施方案中，顺反子编码具有多个组件的抗原靶向CAR分子。例如，顺反子2可以由编码抗原靶向CAR分子的序列组成，该抗原靶向CAR分子具有由组件1、组件2、组件3等表示的其单独组件。CAR分子可以包含2、3、4、5、6、7、8或更多个可互换组件。在特定实例中，组件1编码scFv；组件2编码铰链；组件3编码跨膜结构域；组件4编码共刺激结构域(但还可存在编码侧接用于交换的限制位点的第二或更多个共刺激结构域的组件4′)；且组件5编码信号传导结构域。在特定实例中，组件1编码scFv；组件2编码IgG1铰链和/或跨膜结构域；组件3编码CD28；且组件4编码CD3ζ。

本领域的技术人员在载体的设计中认识到，各顺反子和组件必须经配置使得其在必要时保持在阅读框中。

在一个具体的实例中，顺反子1编码自杀基因；顺反子2编码抗原靶向CAR；顺反子3编码报告基因；顺反子4编码细胞因子；顺反子2的组件1编码scFv；顺反子2的组件2编码IgG1铰链；顺反子2的组件3编码CD28；以及组件4编码CD3ζ。

限制性酶切位点可以是任何种类，并且可以在其识别位点中包括任何数量的碱基，例如4至8个碱基；识别位点中的碱基数量可以是至少4、5、6、7、8或更多。切割时的部位可产生平切口或粘末端。限制性酶可以是例如I型、II型、III型或IV型。限制性酶切位点可从可用数据库获得，诸如整合关系酶数据库(Integrated relational Enzyme database，IntEnz)或BRENDA(综合酶信息系统(The Comprehensive Enzyme Information System))。

示例性的载体可以是环形的，并且按照惯例，其中位置1(在环形顶部处的12点时钟位置，其中序列的其余部分在顺时针方向上)被设置在5’LTR的开始处。

在利用自切割2A肽的实施方案中，2A肽可以是在真核细胞中翻译期间介导多肽“切割”的18-22个氨基酸(aa)长的病毒寡肽。名称“2A”是指病毒基因组的特定区域，并且不同的病毒2A通常根据其衍生的病毒命名。首先发现的2A是F2A(口蹄疫病毒)，之后还鉴定了E2A(马鼻炎A病毒)、P2A(猪捷申病毒-1 2A)和T2A(thosea asigna病毒2A)。发现2A-介导“自切割”的机制是核糖体跳过在2A的C末端形成的甘氨酰-脯氨酰肽键。

在特定情况下，载体可以是γ-逆转录病毒转移载体。逆转录病毒转移载体可包含基于质粒的主链，例如pUC19质粒(在HindIII和EcoRI限制性酶切位点之间的大片段(2.63kb))。主链可携带来自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)的病毒组件，包括5’LTR、psi包装序列和3’LTR。LTR是在逆转录病毒前病毒的每一侧存在的长末端重复序列，并且在转移载体的情况下，在之间包括感兴趣的基因货物，例如抗原靶向CAR和相关组件。psi包装序列(其是用于通过核衣壳包装的靶位点)也以顺式掺入，夹在5’LTR和CAR编码序列之间。因此，转移载体的示例的基本结构可以如此配置：pUC19序列-5’LTR-psi包装序列-感兴趣的基因货物-3’LTR-pUC19序列。该系统还可应用于其它病毒和非病毒载体，包括但不限于慢病毒、腺病毒AAV以及非病毒质粒。

A.药物组合物

本文还提供包含转导的NK细胞和药学上可接受的承载体的药物组合物和制剂。所述转导的细胞可以包含在适于转移到个体中的培养基和/或适于保存的培养基中，所述保存例如冷冻保存，包括在转移到个体中之前。

本文所述的药物组合物和制剂可通过将具有所需纯度的活性成分(例如细胞)与一种或多种任选的药学上可接受的承载体(Remington's Pharmaceutical Sciences第22版，2012)混合来制备，其呈冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的承载体通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯(alkylparaben)，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；盐形成抗衡离子(counter-ion)，例如钠；金属配合物(例如Zn-蛋白配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的承载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(

Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rHuPH20)和使用方法描述于美国专利公开号2005/0260186和2006/0104968中。一方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。

B.组合疗法

在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的免疫细胞群体(包括NK细胞群体)。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，肿块切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法、激素疗法或前述的组合。另外的疗法可以是辅助治疗或新辅助疗法的形式。

在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是副作用限制剂(例如，旨在减少治疗的副作用的发生和/或严重性的药剂，例如抗恶心剂等)的施用。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是γ辐照。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR路径疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。

可以相对于另外的癌症疗法(例如免疫检查点疗法)在之前、期间、之后或以各种组合施用免疫细胞疗法。施用间隔可以从同时至数分钟至数天至数周。在其中免疫细胞疗法与另外的治疗剂分开地提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间不会度过相当长的一段时间，使得两种化合物将仍然能够发挥对患者有利的联合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此约12至24或72小时内，更具体地在彼此约6-12小时内为患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在某些情况下，可能期望将治疗时间显著延长，其中在各自施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7天)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。

可以采用各种组合。对于下面的实例，免疫细胞疗法为“A”，抗癌疗法为“B”：

考虑到药剂的毒性(如果有的话)，本实施方案的任何化合物或细胞疗法向患者的施用将遵循用于施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测归因于组合疗法的毒性的步骤。

1.化学疗法

根据本发明的实施方案可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在细胞内的活性模式分类，例如其是否并且在哪一阶段影响细胞周期。备选地，药剂可基于其直接交联DNA、插入DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂失常的能力来表征。

化学治疗剂的实例包括：烷化剂，诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；杜卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷和睾内酪；抗肾上腺类，诸如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦辛类，诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂，和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

2.放射疗法

造成DNA损伤并已广泛使用的其他因素包括通常被称为γ射线、X射线的那些和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV照射。最可能的是，所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成宽范围的损害。X射线的剂量范围为从以50-200伦琴的日剂量持续长时间段(3至4周)至2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围宽泛地变化，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。

3.免疫疗法

熟练的技术人员会理解，另外的免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的情形下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子以靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗

是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物特异性的抗体。所述抗体单独地可以充当治疗的效应物，或者它可以募集其他细胞以实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且充当靶向剂。备选地，效应物可以是携带直接地或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

已经出现抗体-药物缀合物作为癌症治疗剂开发的突破性方案。癌症是世界上死亡的主要原因之一。抗体-药物缀合物(ADC)包含与杀死细胞的药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。该方案将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物组合，从而产生将货物(药物)递送至具有富集水平抗原的肿瘤细胞的“武装”MAb。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，从而导致降低的毒性和提高的治疗指数。FDA对两种ADC药物的批准(2011年

(本妥昔单抗(Brentuximab vedotin))和2013年

(曲妥珠单抗美坦新或T-DM1))验证了该方案。目前存在超过30种ADC药物候选物处于癌症治疗的临床试验的各个阶段(Leal等人，2014)。随着抗体工程和接头-货物优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合于该方案的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中上调的/高水平的表达和稳健内化。

在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须带有一些适合靶向的标志物，即，所述标志物不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任一种可能适合用于在本发明实施方案的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸基路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激性分子，包括：细胞因子，诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，诸如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子，诸如FLT3配体。

目前在研究或在使用中的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法，例如，干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因疗法，例如，TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如，抗-CD20、抗-神经节苷脂GM2和抗-p185(Hollander，2012；Hanibuchi等人，1998；美国专利5,824,311)。考虑一种或更多种抗癌疗法可以与本文所述的抗体疗法一起使用。

在一些实施方案中，所述免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如共刺激性分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断而靶向的抑制性免疫检查点包括：腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也被称作CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、细胞毒性T-淋巴细胞相关的蛋白4(CTLA-4，也被称作CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)。具体地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll，Nat Rev Cancer，12(4):252-64，2012；二者通过引用并入本文)。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可以用于在本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如已知的是，帕姆单抗(lambrolizumab)也以替代和等同名称MK-3475和帕博丽珠单抗(pembrolizumab)为人所知。

在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，所述PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号US8735553、US8354509和US8008449中，它们都通过引用并入本文。用于用在本文提供的方法中的其他PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，例如描述于美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369中，它们都通过引用并入本文。

在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是抗-PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，所述抗-PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、帕博丽珠单抗(pembrolizumab)和CT-011。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，含有与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也被称作MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

)是在WO2006/121168中描述的抗-PD-1抗体。帕博丽珠单抗(也被称作MK-3475、Merck 3475、帕姆单抗、

和SCH-900475)是在WO2009/114335中描述的抗-PD-1抗体。CT-011(也被称作hBAT或hBAT-1)是在WO2009/101611中描述的抗-PD-1抗体。AMP-224(也被称作B7-DCIg)是在WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。

可以在本文提供的方法中被靶向的另一种免疫检查点是细胞毒性T-淋巴细胞-相关的蛋白4(CTLA-4)，也被称作CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的一个成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激性蛋白CD28类似，并且这两种分子都结合抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中并且可能对其功能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化会导致增加的CTLA-4(B7分子的抑制性受体)表达。

在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。

使用本领域众所周知的方法，可以产生适用于本发明方法的抗-人-CTLA-4抗体(或由此衍生出的VH和/或VL结构域)。备选地，可以使用本领域公认的抗-CTLA-4抗体。例如，在以下文献中公开的抗-CTLA-4抗体可以用在本文公开的方法中：US 8,119,129，WO01/14424，WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也被称作曲美木单抗；以前的替西木单抗)，美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145):摘要号2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304。每篇上述公开物的教导通过引用并入本文。也可以使用与这些本领域公知的抗体中的任一种竞争结合CTLA-4的抗体。例如，在国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号8,017,114(都通过引用并入本文)中描述了人源化的CTLA-4抗体。

一种示例性的抗-CTLA-4抗体是伊匹木单抗(也被称作10D1、MDX-010、MDX-101和

)或其抗原结合片段和变体(参见，例如，WO 01/14424)。在其他实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹木单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体竞争结合CTLA-4上的相同表位和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体具有至少约90％可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹木单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。

用于调节CTLA-4的其他分子包括例如在美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752(都通过引用并入本文)中描述的CTLA-4配体和受体，以及例如在美国专利号US8329867(通过引用并入本文)中描述的免疫粘附素。

4.手术

大约60％的患有癌症的人将经历某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括其中将全部或一部分癌性组织物理去除、切除和/或破坏的切除术，并且可以与其他疗法(例如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术表示至少一部分肿瘤的物理去除。除肿瘤切除术之外，通过手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电手术和用显微镜控制的手术(莫氏手术)。

在切除一部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可能在体内形成腔。通过灌注、直接注射或向该区域局部施用另外的抗癌疗法，可以实现治疗。可以重复这样的治疗，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有不同剂量。

5.其他药剂

考虑可以将其他药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效果。这些额外药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其他生物药剂。通过提高GAP连接数目实现的细胞间信号传导的增加，会增加对相邻过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞粘附抑制剂以提高本发明实施方案的效力。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂(例如抗体c225)可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗效力。

IX.本公开的试剂盒

本文所述的任何组合物可包含在试剂盒中。在非限制性实例中，具有减少或抑制的TDAG8表达水平的细胞、产生细胞的试剂、载体和产生载体的试剂和/或其组分可包含在试剂盒中。在某些实施方案中，NK细胞可以包含在试剂盒中，并且它们可以或可以不以任何方式修饰。这样的试剂盒可以具有或可以不具有用于操纵细胞的一种或多种试剂。这样的试剂包括例如小分子、蛋白质、核酸、抗体、缓冲液、引物、核苷酸、盐和/或其组合。编码敲除(KO)TDAG8的CRISPR试剂、自杀基因产物、受体和/或细胞因子的核苷酸可包括在试剂盒中。诸如细胞因子或抗体(包括单克隆抗体)的蛋白质可以包括在试剂盒中。编码工程化改造的CAR受体或TCR受体的组分的核苷酸可包括在试剂盒中，包括产生其的试剂。

在特定方面，试剂盒包含本公开的NK细胞疗法以及另一种癌症疗法。在一些情况下，除了细胞疗法实施方案之外，试剂盒还包括第二癌症疗法，例如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。试剂盒可以针对个体的特定癌症定制，并且包含用于个体的相应第二癌症疗法。

试剂盒可包含本公开的合适的等分组合物。试剂盒的组分可以水性介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器装置，其中可以放置组分，并且优选地，组分适当地等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还可包含第二、第三或其他附加容器，附加组分可单独放置在这些容器中。然而，在小瓶中可以包括组分的各种组合。本发明的试剂盒还将典型地包括用于包含组合物的装置和任何其它试剂容器，其紧密密封以用于商业销售。此类容器可包括注塑或吹塑塑料容器，期望的小瓶保持在该注塑或吹塑塑料容器中。

X.实施例

包括以下实施例以证明本公开的某些非限制性方面。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明方法的实践中发挥良好作用的技术。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，可以在不背离所公开的主题的精神和范围的情况下在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍可获得类似或相似的结果。

实施例1

免疫性细胞上的TDAG8表达

通过挖掘免疫细胞表达数据库(Database of Immune Cell Expression，DICE)，发现TDAG8在NK细胞和某些T细胞亚组上高度表达(图1)。TDAG8之前在文献中显示在免疫细胞(包括T细胞、NK细胞和巨噬细胞)上表达^5,6。该数据证实TDAG8在脐带血衍生的NK细胞上的表达，如后来在基因敲除数据中所示的。

通过CRISPR/Cas9敲除TDAG8

设计向导RNA(gRNA)，其在TDAG8的外显子区诱导双链断裂，同时具有高的中靶(on-target)和脱靶(off-target)活性得分。设计下述sgRNA作为实例：

5’-AUACCGAUCAACGGCAAUGC-3’(SEQ ID NO:54)

5’-AACUUGUUCAGGACGUGUAC-3’(SEQ ID NO:55)

5’-UGUGCGGCACAAUAAAGCCA-3’(SEQ ID NO:56)

5’-GCACUCCCUUUGCACAAGGC-3’(SEQ ID NO:57)

5’-CACAGAGAUCCAAUAUUGGC-3’(SEQ ID NO:58)

5’-UUUCCAAUAUCCAGAUGGAC-3’(SEQ ID NO:59)

5’-CAGGUAUAAUCAAUCCAUAA-3’(SEQ ID NO:60)

5’-UAUUGAAGAACAGCAUGACC-3’(SEQ ID NO:61)

5’-GUCUUUCCUGCAAGCAAAGA-3’(SEQ ID NO:62)

5’-UACACGUCCUGAACAAGUUG-3’(SEQ ID NO:63)

5’-UACAGGCUAUGCAAUACCUU-3’(SEQ ID NO:64)

5’-GAUCAACGGCAAUGCAGGUG-3’(SEQ ID NO:65)

5’-GGAAAGUCUACCAAGCUGUG-3’(SEQ ID NO:66)

5’-CUUUAUGGAUUGAUUAUACC-3’(SEQ ID NO:67)

5’-UCACCAUCCUGAUCUGCAAC-3’(SEQ ID NO:68)

5’-CAGCCUGUCCAUCUGGAUAU-3’(SEQ ID NO:69)

5’-GUGCAAAUCUUCUUGUCCUU-3’(SEQ ID NO:70)

5’-GACAAGAAGAUUUGCACUCA-3’(SEQ ID NO:71)

5’-CAGAUCAGGAUGGUGACCAA-3’(SEQ ID NO:72)

5’-GGUGAUGUGUUUGUUGACUG-3’(SEQ ID NO:73)

5’-UCAGUCAACAAACACAUCAC-3’(SEQ ID NO:74)

5’-CAGCCCACAAGCAUCAACUG-3’(SEQ ID NO:75)

5’-GUUCUGUGAUAAUGAACACA-3’(SEQ ID NO:76)

5’-GCAAAGAAGGAAAGUGAACU-3’(SEQ ID NO:77)

5’-CUGAUAGUGACAAACUGAAG-3’(SEQ ID NO:78)

5’-AAAAGCACUCCCUUUGCACA-3’(SEQ ID NO:79)

5’-GAUGGUUUCCAAUAUCCAGA-3’(SEQ ID NO:80)

5’-UUUCCGGUUGCAGAUCAGGA-3’(SEQ ID NO:81)

5’-UUACACAAUGUAUAGAAUCA-3’(SEQ ID NO:82)

5’-AAACAGGAAGAUAUGAUAUG-3’(SEQ ID NO:83)

5’-UAUUAAAAUUCUGCACUGGG-3’(SEQ ID NO:84)

5’-GAGGUCCUUGAGUAGAACCA-3’(SEQ ID NO:85)

5’-CAAGGAUGUUUUGAAGGGAA-3’(SEQ ID NO:86)

5’-AGAACACGAUCGUCACCUAG-3’(SEQ ID NO:87)

5’-GAGAAACCAACACUGCUGAG-3’(SEQ ID NO:88)

对于以下实验，组合使用以下gRNA：5’-AUACCGAUCAACGGCAAUGC-3’(SEQ ID NO:54)和5’-AACUUGUUCAGGACGUGUAC-3’(SEQ ID NO:55)。从脐带血中分离NK细胞并培养。一周后，将细胞用单独的Cas9(作为对照)或预先加载化学合成的靶向TDAG8的crRNA:tracrRNA双链体的Cas9进行核转染。然后将它们再扩增一周。在第二天通过PCR确认基因编辑效率(图2)，并在第7天通过流式细胞术确认蛋白质表达减少(图3)。

在体外酸性条件下TDAG8敲除对NK细胞功能的影响：

为了测试TDAG8敲除对酸性环境中的NK细胞的影响，将NK细胞在不存在或存在不同浓度的乳酸盐(5mM、10mM和20mM)下孵育48小时，之后在存在Raji细胞的情况下进行膜联蛋白V测定。在不同NK细胞条件下表达膜联蛋白V的Raji细胞的百分比示于图4。该实验显示，当野生型(WT)NK细胞在增加浓度的乳酸盐中孵育时，Raji细胞的膜联蛋白V(其是细胞凋亡的标志物)表达减少。然而，即使在酸性环境存在下，NK细胞的TDAG8敲除(KO)也部分地恢复其在Raji细胞中诱导细胞凋亡的能力。

为了测试野生型(WT)细胞相对于TDAG8敲除(KO)-NK细胞的杀死潜力，使用在10mM乳酸存在下孵育48小时后的这些NK细胞和786-O肾细胞癌细胞系，进行杀死测定。在具有肿瘤细胞生长的活细胞成像和NK细胞杀死的

装置中进行杀死测定(图5A-5B)。与单独用Cas9核转染的对照NK细胞相比，在TDAG8KO-NK细胞中，在10mM乳酸存在下NK细胞的活性增强。在NK细胞的2个脐带血来源中进行相同的实验并获得类似的结果。

为了研究TDAG8KO在模拟体内实体瘤条件的条件下对NK细胞的抗肿瘤功能的影响，本发明人进行NK细胞针对786-O和A498肾细胞癌细胞系的3-D肿瘤球状体培养模型的杀死测定。肿瘤球状体模拟实体瘤团块且先前已在文献中显示为具有酸性pH(Nunes等人，2019)。肾细胞癌的特征在于突出的“Warburg效应”(Courtney等人，2018)，由此糖酵解途径基因被上调(图6)。这导致在肿瘤微环境中产生乳酸并增加酸度(Courtney等人，2018)。为了进行这些测定，用活体细胞染色标记786-O细胞和A498细胞并接种在超低附着板中。使3D肿瘤球状体培养物模型在IncuCyte中形成48小时，之后添加胱天蛋白酶-3/7绿色试剂(细胞凋亡信号传导试剂)和NK细胞。在

活细胞分析系统中实时监测肿瘤生长和细胞死亡。数据显示，与WT NK细胞相比，TDAG8KO-NK细胞具有增强的针对3-D肿瘤球状体的细胞毒性(图7)。

总之，数据表明，通过CRISPR/Cas9敲除编码充当免疫代谢检查点的质子传感器的TDAG8基因导致在酸性条件下以及在模拟体内酸性实体瘤条件的3-D肿瘤球状体的类体内条件下NK细胞的改善的抗肿瘤活性。

参考文献

本说明书中提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。所有专利和出版物通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物被具体和单独地指出通过引用并入。

专利和专利申请

美国专利号4,870,287

美国专利号5,760,395

美国专利号5,844,905

美国专利号5,885,796

美国专利号6,143,866

美国专利号6,207,156

美国专利号6,410,319

美国专利号6,451,995

美国专利号7,070,995

美国专利号7,265,209

美国专利号7,354,762

美国专利号7,446,191

美国专利号7,446,190

美国专利号7,446,179

美国专利号8,017,114

美国专利号8,119,129

美国专利号8,252,592

美国专利号8,324,353

美国专利号8,329,867

美国专利号8,339,645

美国专利号8,398,282

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WO 2013/123061

WO 2014/055668

WO 2014/031687

出版物

Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates and John Wiley&Sons,NY,1994.

Camacho等人，(2004)J Clin Oncology 22(145):Abstract No.2505.

Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988.

Courtney KD,Bezwada D,Mashimo T,等人,Cell Metabolism 28:793-800.e2,2018.

Davila等人，PLoS ONE 8(4):e61338,2013.

Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215),2013.

Huber V,Camisaschi C,Berzi A,等人Semin Cancer Biol 43:74-89,2017.

Hurwitz等人，(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071.

Ishii S,Kihara Y and Shimizu T.,J Biol Chem 280:9083-7,2005.

Janeway et al,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,3^rd Ed.,Current Biology Publications,p.433,1997.

Jores等人,PNAS U.S.A.87:9138,1990.

Kabat等人,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes ofHealth,1991,5^th ed.

Leal,M.,Ann N Y Acad Sci 1321,41-54,2014.

Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003.

Ludwig M-G,Vanek M,Guerini D,等人,Nature 425:93-98,2003.

Maghazachi AA,Knudsen E,Jin Y,等人,Biochem Biophys Res Commun320:810-5,2004.

Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304.

Nunes AS,Barros AS,Costa EC,等人,Biotechnol Bioeng 116:206-226,2019.

Onozawa Y,Fujita Y,Kuwabara H,等人,Eur J Pharmacol 683:325-31,2012.

Perez等人,Cell.1990Oct 19；63(2):251-8.

Robert R and Mackay CR,Immunol Cell Biol 96:341-343,2018.

Renner K,Singer K,Koehl GE,等人Frontiers in Immunology 8:248-248,2017.

Sadelain等人,Cancer Discov.3(4):388-398,2013.

Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd ed.,Cold SpringHarbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001.

Singh等人,Cancer Research,68:2961-2971,2008.

Singh等人,Cancer Research,71:3516-3527,2011.

Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,24(5):633-39,2012.

Wang JQ,Kon J,Mogi C,等人,J Biol Chem 279:45626-33,2004.

Wen AY,Sakamoto KM,Miller LS.J Immunol 185:6413-9,2010.

Wu等人,Cancer,18(2):160-75,2012.

尽管已经详细地描述了本发明及其优势，但应该理解，在不背离由所附权利要求书限定的本发明主旨和范围的情况下，可以进行各种改变、替换和更改。而且，本申请的范围并不旨在限于本说明书中描述的工艺、机器、制造、物质组合物、装置、方法和步骤的特定实施方案。本领域的普通技术人员通过本公开应该理解，根据本公开，可以使用现有的或今后开发的用于执行与所述相应实施方案基本相同的功能或获得基本相同结果的工艺、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤。因此，所附权利要求书旨在包括在这样的工艺、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤的范围内。

Claims (35)

1.工程化改造的免疫效应细胞，其中所述细胞中的内源T细胞死亡相关基因8(TDAG8)(GPR65)被工程化改造以减少或抑制其表达。

2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、天然杀伤(NK)细胞、NK T细胞、巨噬细胞、B细胞、不变NKT细胞、γδT细胞、MSC、肿瘤浸润淋巴细胞或树突细胞。

3.根据权利要求2所述的细胞，其中所述NK细胞衍生自脐带血。

4.根据权利要求1-3中任一项的细胞，其中所述细胞包含一种或多种工程化改造的受体。

5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述工程化改造的受体是工程化改造的抗原受体。

6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述工程化改造的抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。

7.根据权利要求5或6所述的细胞，其中所述抗原是癌症抗原。

8.根据权利要求5-7中任一项所述的细胞，其中所述抗原为实体瘤抗原。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的细胞，其中所述抗原选自：5T4，8H9，α_vβ₆整联蛋白，BCMA，B7-H3，B7-H6，CAIX，CA9，CD5，CD19，CD20，CD22，CD30，CD33，CD38，CD44，CD44v6，CD44v7/8，CD70，CD123，CD138，CD171，CEA，CSPG4，CS1，CLL1，CD99，DLL3，EGFR，EGFR家族，包括ErbB2(HER2)，EGFRvIII，EGP2，EGP40，ERBB3，ERBB4，ErbB3/4，EPCAM，EphA2，EpCAM，FAP，FBP，胎儿AchR，FRα，GD2，GD3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)，HLA-A1+MAGE1，HLA-A1+NY-ESO-1，IL-11Rα，IL-13Rα2，Lambda，Lewis-Y，L1CAM，Kappa，KDR，MCSP，间皮蛋白，Muc1，Muc16，NCAM，NKG2D配体，NY-ESO-1，PRAME，PSC1，PSCA，PSMA，ROR1，SP17，存活蛋白，TAG72，TEMs，HMW-MAA，VEGFR2，及其组合。

10.根据权利要求4-9中任一项所述的细胞，其中所述工程化改造的受体是细胞因子受体、趋化因子受体、归巢受体或其组合。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含一种或多种外源趋化因子和/或一种或多种细胞因子的表达。

12.根据权利要求11所述的细胞，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-21、IL-2、IL-18、IL-7或其组合。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含自杀基因。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的细胞，其中通过同源重组或非同源重组减少或抑制所述内源TDAG8基因的表达。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的细胞，其中通过CRISPR-Cas9敲除内源TDAG8。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞，其中所述细胞相对于个体是自体、同种异体或异种的。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的细胞，其中所述细胞进一步减少或抑制以下一种或多种的表达：NKG2A，SIGLEC-7，LAG3，TIM3，CISH，FOXO1，TGFBR2，TIGIT，CD96，ADORA2，NR3C1，PD1，PDL-1，PDL-2，CD47，SIRPA，SHIP1，ADAM17，RPS6，4EBP1，CD25，CD40，IL21R，ICAM1，CD95，CD80，CD86，IL10R，CD5和CD7。

18.权利要求1-17所述的细胞中任一种的群体。

19.根据权利要求18所述的群体，其中所述群体包含在药学上可接受的赋形剂中。

20.治疗个体中的癌症的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的权利要求18或19所述的细胞的群体的步骤。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述癌症是实体瘤或不是实体瘤。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述癌症是肺癌、脑癌、乳腺癌、血液癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、甲状腺癌、胃癌、脾癌、胆囊癌、骨癌、卵巢癌、睾丸癌、子宫内膜癌、前列腺癌、直肠癌、肛门癌或宫颈癌。

23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述个体是哺乳动物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述个体是人、狗、猫、马、牛、绵羊、猪或啮齿动物。

25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述个体被施用另外的癌症疗法。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述另外的癌症疗法是手术、放射、化学疗法、激素疗法、免疫疗法或其组合。

27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其还包括诊断所述个体的癌症的步骤。

28.根据权利要求20-27中任一项所述的方法，其还包括产生细胞群体的步骤。

29.根据权利要求20-28中任一项所述的方法，其中所述细胞相对于个体是自体的。

30.根据权利要求20-29中任一项所述的方法，其中所述细胞相对于个体是同种异体的。

31.根据权利要求20-30中任一项所述的方法，其中所述细胞是NK细胞。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述NK细胞是脐带血NK细胞。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述NK细胞表达一种或多种工程化改造的抗原受体。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞是表达CAR的NK细胞或表达TCR的NK细胞。

35.根据权利要求20-34中任一项所述的方法，其中所述细胞是表达CAR的NK细胞。

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