CN117603828A

CN117603828A - 一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66及其应用

Info

Publication number: CN117603828A
Application number: CN202310481728.XA
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 顾佳悦; 陈婷; 张俊莉; 董瑶
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2023-04-28
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2024-02-27
Anticipated expiration: 2043-04-28
Also published as: CN117603828B

Abstract

本发明涉及一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66及其应用，所述具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus LRa66菌株，保藏编号为CGMCC No.24282。该菌株具有良好的耐胃酸能力、耐肠液能力和耐胆盐能力，可以显著改善代谢综合征反应尤其是高血糖和高血脂，具体表现血清中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇降低，改善了血清IL‑10水平，并抑制了TNF‑α和IL‑1β的生成。

Description

一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66及其应用

技术领域

本发明属于益生菌剂技术领域，涉及一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66及其应用，具体涉及一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66、培养物、益生菌剂及其应用。

背景技术

肥胖、高血压、血脂紊乱及糖尿病、高尿酸、高脂肪肝发生率和高胰岛素血症并存的病理状态被称之为代谢综合征(MS)。MS是心血管病的多种代谢危险因素在个体内集结的状态。MS的主要组成成分是肥胖病尤其是内脏型肥胖、糖尿病或糖调节受损，以高甘油三酯(TG)血症及低高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血症为特点的血脂紊乱以及高血压。此外，MS亦涉及持续低度炎症反应及血液凝溶异常。

肥胖属于慢性、易复发、进行性疾病状态，另外，肥胖与多种代谢紊乱有关，包括心血管疾病、高脂血症、非酒精性脂肪肝、2型糖尿病等。研究表明，肥胖本质上是脂质的过度积累和能量代谢的抑制。肠道菌群是饮食诱导肥胖和相关代谢功能障碍发生的主要促成因素。

肥胖及其相关病症如2型糖尿病，心脑血管疾病等的发病率呈逐年上升趋势。除了宿主基因，饮食及其他环境因素除了能够直接调节体重及胰岛素抵抗外，还对肠道菌群的构成产生影响。菌群失调现象出现在肥胖及2型糖尿病患者中，减少的微生物多为丁酸盐产生菌及具有代谢硫酸盐和抗氧化作用的细菌。最近的研究表明，肠道菌群失调造成内毒素入血所致的慢性炎症，是肥胖、糖尿病等代谢性疾病发展的重要因素之一。菌群紊乱失衡可引发全身慢性反应炎症，从而导致胰岛β细胞损伤和胰岛素抵抗下降，同时影响体内其他细胞对糖分的吸收用以转化能量，造成人体机能难以正常运转，最后引发一系列并发症。

益生菌为活性微生物，适量给予有益于宿主健康。目前的临床及实验证据均表明，肠道菌群为MS潜在的致病因素，其表现出的所有疾病指征是许多因素相互作用的结果。如以短链脂肪酸为代表的肠道菌群代谢产物是肥胖的重要致病因素，能够调节宿主多项代谢功能、能量摄入甚至食欲。多糖、短链脂肪酸既是能量来源同时可与G蛋白耦联受体41或GPR43结合调节激素或调控炎症反应。同时肠道菌群与宿主的复杂相互作用中，菌群可产生促炎因子，如脂多糖，诱导宿主产生免疫应答相关蛋白进而不仅影响菌群的稳态及组成，导致肠道菌群失调，菌群易位，同时也加剧了肥胖及胰岛素抵抗的进程。食物中的胆碱、胆固醇及多糖可经肠道菌群直接代谢或进一步由宿主及菌群联合代谢产生生物活性物质，如胆碱可导致心血管疾病，胆固醇可激活G蛋白耦联胆酸受体5增加能量消耗及GLP-1的分泌从而保护心血管。肠道菌群通过产生乙醇，改变胆碱及胆酸代谢，刺激肝细胞脂肪生成以及增加肠道通透性等途径加剧脂肪肝及NALFD的进展。近些年的研究证明获得性免疫参与对抗菌群失调，因此越来越多的证据表明肠道菌群可以作为治疗MS的靶点。

因此，筛选出可以有效降低高血糖和高血脂为主要指标代谢综合征的益生菌至关重要。与此同时，这对于开发更高保健价值的益生菌有重要的意义，对于利用膳食策略缓解代谢综合征开辟新的路径和解决方案。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66及其应用，具体提供一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66、培养物、益生菌剂及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳杆菌LRa66，所述具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳杆菌LRa66的分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏编号为CGMCC No.24282，保藏日期为2022年1月10日。

本发明从人母乳样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善或降低高血糖和血脂的鼠李糖乳酪杆菌，将其命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus LRa66菌株，该菌株具有良好的耐胃酸能力、耐肠液能力和耐胆盐能力，可以显著改善代谢综合征反应尤其是高血糖和高血脂，具体表现血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低，有效改善了血清IL-10水平，并抑制了TNF-α和IL-1β的生成。LRa66显著降低了T2DM小鼠中较高的FINS水平。与现有技术中已公开的相比，本发明提供的鼠李糖乳酪杆菌LRa66的降血糖和血脂的效果更好，优势明显。使用该菌种进行改善或治疗时，不会产生耐药性，改善或治疗过程中也不会引起患者的不良反应，可用于制备改善或降低高血糖和血脂的产品，如药物和保健品等。

本发明所涉及的LRa66菌株的筛选步骤如下：

(1)选取人母乳样本，使用质量浓度为0.9％的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基(培养基含抗生素莫匹罗星锂盐，其可抑制大部分除双歧杆菌外的其他菌种，药品购于海博生物)上，在37℃培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30％的甘油进行保藏。

(2)针对保藏的30株人乳来源的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株胃肠液耐受能力(人工模拟)、Caco-2细胞粘附能力、抑菌能力和功能性低聚糖利用能力最好的单菌株，对其进行鉴定。

第二方面，本发明提供一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66的培养物，所述培养物的制备方法包括：将第一方面所述的鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus LRa66菌株接种于培养基中在30-37℃(例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、37℃等)下培养18-24h(例如18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h等)。

上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

本发明优选上述培养条件，鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌株能够达到生长稳定期，并且具有更加优异的碳源利用能力。

所述培养基的配方组成包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K₂PO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄、半胱氨酸盐酸盐。

第三方面，本发明提供一种具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂，所述具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂包含第一方面所述的鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillusrhamnosus LRa66菌株。

优选地，在所述益生菌剂中，所述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillusrhamnosus LRa66菌株的活菌数不低于1×10⁸CFU/mL或1×10⁸CFU/g，例如1×10⁸CFU/mL、2×10⁸CFU/mL、5×10⁸CFU/mL、8×10⁸CFU/mL、1×10⁹CFU/mL、5×10⁹CFU/mL、1×10¹⁰CFU/mL等。该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

所述益生菌剂的剂型包括冻干粉剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂。

优选地，所述具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂还包含保护剂和/或益生元。

所述保护剂包括脱脂奶粉。

所述益生元包括低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、菊粉、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

本发明所涉及的鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌株可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中。

优选地，所述具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂还包含干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株，保藏编号为CGMCC No.15409，保藏日期为2018年3月5日。

优选地，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株与鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus LRa66菌株的活菌数之比为3:1-1:3，例如3:1、2:1、1:1、1:2、1:3等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂还包含植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株，保藏编号为CGMCC No.10453，保藏日期为2015年1月27日。

优选地，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株与鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus LRa66菌株的活菌数之比为3:1-1:3，例如3:1、2:1、1:1、1:2、1:3等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

本发明还创造性地发现上述鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌株能够与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株以及植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp 90进行复配得到的复合益生菌剂使用用于降低血糖和血脂，同样具有优异的效果，且与单一LRa66菌株相比，复合菌剂具有更显著的改善或治疗高血糖和高血脂的效果，说明LRa66菌株与LC89菌株以及Lp90菌株在上述功效上具有协同增效作用。

在上述复合益生菌剂中，三种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。

第四方面，本发明提供第一方面所述的鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillusrhamnosus LRa66菌株或第二方面所述的培养物或第三方面所述的益生菌剂在制备具有降血糖和降血脂功能的药物或保健品中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明从人母乳样本中分离获得并保藏了一株新的能够改善或降低高血糖和血脂的鼠李糖乳酪杆菌，将其命名为鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌株，该菌株具有良好的耐胃酸能力、耐肠液能力和耐胆盐能力，Caco-2细胞粘附能力、抑菌能力和对利用功能性低聚糖能力较强，可以显著改善代谢综合征反应尤其是高血糖和高血脂，具体表现与LRa66组相比，HFD组血清TG、TC、LDL-C显著升高，补充LRa66可减轻HFD诱导的血脂异常。非酒精性脂肪肝实施例血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低，T2DM实施例有效改善了血清IL-10水平，并抑制了TNF-α和IL-1β的生成。LRa66降低了T2DM小鼠中较高的FINS水平。为改善或降低高血糖和血脂提供备选方案。使用该菌种进行改善或治疗时，不会产生耐药性，改善或治疗过程中也不会引起患者的不良反应，可用于制备改善或降低高血糖和血脂的产品，如药物和保健品等。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

下述使用的鼠李糖乳杆菌LRa66来自微康益生菌(苏州)股份有限公司菌种库，该菌株的分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，于2022年1月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.24282；

下述使用的干酪乳杆菌来自微康益生菌(苏州)股份有限公司菌种库，该菌株命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株，于2018年3月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.15409；

下述使用的植物乳杆菌来自微康益生菌(苏州)股份有限公司菌种库，该菌株命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株，于2015年1月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.10453；

RPMI 1640培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；

胎牛血清、PBS和胰蛋白酶购自Thermo公司；

MRS固体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂PO₄·3H₂O 2.6g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、MnSO₄0.05g、琼脂20g和半胱氨酸盐酸盐0.5g，使用去离子水溶解，再加入1mL吐温80，定容至1L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用；

MRS液体培养基：称取蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乙酸钠2g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂PO₄·3H₂O 2.6g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、MnSO₄0.05g和半胱氨酸盐酸盐0.5g，使用去离子水溶解，再加入1mL吐温80，定容至1L，灭菌冷却后备用。

实施例1

本实施例筛选一株能够改善或降低高血糖和血脂的鼠李糖乳酪杆菌，步骤如下：

(2)针对保藏的人乳来源的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株胃肠液耐受能力(人工模拟)、Caco-2细胞粘附能力、抑菌能力和功能性低聚糖利用能力最好的单菌株，具体为如下：

A.胃肠液耐受能力测试：

人工模拟胃液：配制0.5％NaCl溶液，加入0.3％胃蛋白酶，用1mol/L HCl调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

人工模拟肠液：配制0.5％NaCl溶液，加入0.1％胰蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。

待选菌株在人工胃液和肠液中厌氧培养3h，取0h和3h的消化液进行活菌数检测，计算其存活率。菌株存活率(％)＝B/A×100％，式中A表示该菌0h的活菌数(CFU/mL)，B表示该菌3h的活菌数(CFU/mL)。

B.Caco-2细胞粘附能力测试：

菌种活化：待选菌株按2％接种量接种于含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃培养14h，取发酵液离心、收集菌体，用PBS洗涤3次后，将菌体重悬于不含双抗的DMEM培养液中，调节菌悬液的浓度为10⁸CFU/mL。

Caco-2细胞培养：在细胞培养瓶中，加入5mL DMEM完全培养液(含20％胎牛血清，1％青霉素和链霉素溶液)，于5％CO₂恒温培养箱中37℃孵育，每天换1次培养液，待细胞状态良好后(70％～80％融合)，用0.2％消化液(胰酶-EDTA)进行消化传代。

黏附性试验：将消化的Caco-2细胞调整浓度到1×10⁵cell/mL，接种到12孔细胞培养板中，每孔1mL，于5％CO₂浓度的培养箱中孵育至细胞长至单层，用无菌PBS洗涤两次，其中一个孔用胰酶消化，用血球计数板进行细胞计数；其他孔中分别加入待选菌株悬液1mL，于5％CO₂培养箱中37℃孵育2h后，用无菌PBS洗涤细胞5次，除去未黏附的菌悬液，每孔加入0.2mL胰酶EDTA缓冲液消化细胞5min，消化完后加入0.8mL PBS吹打均匀，取菌液进行稀释活菌计数。

C.抑菌能力测试：

采用牛津杯法测试对致病菌的抑制能力：取拮抗菌株按2％(V/V)接种至含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃恒温静置培养12h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、转速250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液。将MRS固体培养基冷却至55℃左右，与病原菌悬液按一定比例混匀，使体系病原菌活菌数在10⁶CFU/mL数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，每孔注入200μL拮抗菌株菌液，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养适宜时间后观察，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。

D.功能性低聚糖利用能力测试：

无糖培养基：蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母浸膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、K₂HPO₄0.2％、MgSO₄ 0.058％、MnSO₄ 0.019％、吐温-80 0.1％、L-半胱氨酸盐酸盐0.1％。

菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖购于量子高科(中国)生物股份有限公司，低聚木糖(XOS)购自山东龙力生物科技有限公司。

将低聚木糖(XOS)、菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖按2％加入到上述无糖培养基中，获得含低聚糖为碳源的培养基。将待选菌株接种到含低聚糖的培养基中，37℃恒温静置培养12h，测定OD600吸光度判断菌株对功能性菌株的利用能力。

综合以上胃肠液耐受能力(人工模拟)、Caco-2细胞粘附能力、抑菌能力和对利用功能性低聚糖能力实验，LRa66是最好的菌株。

实施例2

本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：

(1)形态鉴定：

将菌株接种在MRS固体培养基中，于37℃培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可知，菌落为乳白色，呈半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。

(2)16S rRNA分子生物学鉴定：

将-80℃保藏的菌株取出，接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养18h。吸取1mL菌液于离心管中，8000rpm下离心10min，去上清液，收集菌体。

提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16SrDNA序列如SEQ ID No:1所示。

SEQ ID No:1：

CGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATCCATTGTAGCACGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGCTTCAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGTCAGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCATCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCCTCGGTTAACCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGATCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGGATCATTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTGACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCAAAATTAAATCAAGATGCAAGCACCTTTCAATAATCAGAA。

将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为鼠李糖乳酪杆菌。

实施例3

本实施例验证鼠李糖乳酪杆菌LRa66的耐胃酸能力，步骤如下：

(1)制备人工胃液：

以质量分数计，人工胃液中含有0.20％的NaCl以及0.30％的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。

(2)耐胃酸能力测试：

取1.0mL鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌悬液(浓度为1×10⁹CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度)，分别与9.0mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始(0h)和处理3h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：

存活率(％)＝N1/N0×100％，

其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表1。

表1

人工胃液pH	活菌数N0(0h)	活菌数N1(3h)	存活率(％)
				2.0	6.81×10⁸	5.47×10⁸	80.0
2.5	6.69×10⁸	6.31×10⁸	90.4
				3.0	6.72×10⁸	6.43×10⁸	95.6

由表1可以看出，本发明所述的鼠李糖乳酪杆菌LRa66具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达80.0％以上；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达90.4％以上；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达95.6％以上。良好的耐酸能力为其制备改善或降低高血糖和血脂的产品创造了条件。

实施例4

本实施例验证鼠李糖乳酪杆菌LRa66的耐肠液能力，步骤如下：

(1)制备人工肠液：

将胰蛋白酶溶于pH 8.0的PBS中使其终浓度为0.8g/L，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟肠液。

(2)耐肠液能力测试：

取1.0mL鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌悬液(浓度为1×10⁹CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度)加入至9mL模拟肠液(pH 8.0)中，混匀后于37℃培养8h后检测活菌数。用MRS固体培养基37℃培养48h，候选益生菌的存活率用以下公式计算：

存活率(％)＝[log CFU N1/log CFU N0]×100％；

其中，N1＝经过模拟肠液处理之后的候选益生菌活菌数，N0＝未处理前候选益生菌的活菌数。测试结果如表2所示：

表2

	活菌数N0(0h)	活菌数N1(3h)	存活率(％)
				人工肠液	5.68×10⁸	4.22×10⁸	74.3

由表2可以看出，本发明所述的鼠李糖乳酪杆菌LRa66具有良好的耐肠液能力，在人工肠液中孵育3h，存活率可达74.3％以上。良好的耐肠液能力为其制备改善或降低高血糖和血脂的产品创造了条件。

实施例5

本实施例验证鼠李糖乳酪杆菌LRa66的耐胆盐能力，步骤如下：

将1mL浓度调节为1×10⁹CFU/mL的鼠李糖乳酪杆菌LRa66接种于100mL含有0.3％胆盐的MRS-THIO(MRS含有0.2％的巯基乙酸钠)培养基中，37℃培养4h，在600nm处测吸光值。本次实验使用鼠李糖乳酪杆菌LGG作为对照菌，LGG菌的培养方法与LRa66相同。OD₆₀₀值越大说明乳酸菌耐受胆盐的能力越强。测试结果如表3所示：

表3

	OD₆₀₀(4h)
		鼠李糖乳酪杆菌LGG	0.22
鼠李糖乳酪杆菌LRa66	0.38

由表3可以看出，经过4小时培养后鼠李糖乳酪杆菌LRa66的OD600为0.38，高于鼠李糖乳酪杆菌LGG，这说明鼠李糖乳酪杆菌LRa66耐胆盐的能力高于鼠李糖乳酪杆菌LGG。

实施例6

本实施例提供一种鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌粉，所述鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌粉通过以下方法进行制备：

将鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌种接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10min，得到鼠李糖乳酪杆菌菌体；

将菌体用质量浓度为10％的脱脂奶粉水溶液重悬至浓度为1×10¹⁰CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在37℃下预培养1h后冻干，得到所述鼠李糖乳酪杆菌LRa66菌粉，测的菌粉的活菌数为300亿CFU/g。

采用上述相同方法制备副干酪乳杆菌LC89菌粉，测的菌粉的活菌数为300亿CFU/g。

采用上述相同方法制备副干酪乳杆菌Lp90菌粉，测的菌粉的活菌数为300亿CFU/g。

实施例7

本实施例提供降低肥胖小鼠血糖和血脂的方法：

(1)造模方法：雌性C57BL/6J小鼠(6周龄)购自上海斯莱克实验动物中心。50只小鼠控制光照和温度的屏障维持条件下饲养(光照/黑暗周期，12h/12h；温度，22℃±1℃；相对湿度，55％±5％)。驯化2周后，将所有小鼠随机分为5组，每组由10只小鼠组成，分别为：正常对照组(CTL)，模型组(HFD)喂食HFD(60％脂肪)；益生菌干预组(LRa66)喂食HFD(60％脂肪)，按3×10⁹CFU/天；益生菌干预组(LC89+Lp90)喂食HFD(60％脂肪)，按3×10⁹CFU/天(活菌数1:1)；益生菌干预组(LRa66+LC89+Lp90)喂食HFD(60％脂肪)，按3×10⁹CFU/天(活菌数1:1:1)。通过血糖仪(On Call Plus，Hangzhou，China)测定其尾静脉空腹血糖(FBG)水平。CTL组和HFD组均通过灌胃给予等体积的溶剂-即每只小鼠200μL生理盐水。所有小鼠均通过灌胃给予各自的饲料8周。在整个研究期间，所有小鼠均可自由进食和饮水。每2周测量其体重。

(2)血清采集：实验结束后，所有老鼠禁食12h后，经10％水合氯醛麻醉处死，心脏穿刺新鲜采血，3000r/min离心10min后，-80℃保存血清。

(3)血清生化分析：使用商品化试剂盒(南京建成生物工程研究所，南京，中国)按照试剂盒规定的说明书测定血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平。

各组小鼠体重(g)变化见表4。

表4

	CTL	HFD	LRa66	LC89+Lp90	LRa66+LC89+Lp90
						week0	16.36	16.26	16.24	16.25	16.26
week2	17.87	20.12	19.23	20.08	17.95
						week4	19.35	22.66	21.41	21.94	20.73
week6	20.86	24.42	23.72	24.17	21.51
						week8	22.45	27.65	25.01	25.86	23.04

由表4结果可知：小鼠的体重的变化在第2周表现出相同的趋势。值得注意的是，第2周之后益生菌干预组组的体重增长趋势较HFD组增长有所抑制，其中LRa66+LC89+Lp90组的抑制效果更好。提示补充LRa66或复合菌剂可减轻HFD诱导的体重异常。

各组的血脂结果如表5所示。

表5

由表5结果可知：与HFD组相比，益生菌干预组小鼠血清TG、TC和LDL-C相对降低；同时与CTL组相比，益生菌干预组小鼠血清的HDL-C有一定程度的升高，提示补充LRa66或复合菌剂可减轻HFD诱导的血脂异常。

实施例8

本实施例探究益生菌对非酒精性脂肪肝小鼠的治疗作用：

(1)动物模型：将50只6周龄、体重170-190g的无特定病原体(Specific PathogenFree，SPF)雄性Sprague Dawley大鼠饲养在严格控制的温度22±2℃下，每笼5只，12h光照/黑暗周期，自由进食和饮水。适应养殖2周后，将大鼠随机分配至正常对照(Control，CTL)组(n＝10)和HFD(high-fat diet)组(n＝40)。CTL组动物定期饲喂常规大鼠普通饲料，HFD组饲喂高脂肪饲料。喂食10周后，将HFD组40只大鼠进一步平均随机分配至HFD组、益生菌LRa66干预组(LRa66按3×10⁹CFU/天)、益生菌LC89+Lp90干预组(LC89+Lp90按3×10⁹CFU/天，活菌数1:1)、益生菌LRa66+LC89+Lp90干预组(LRa66+LC89+Lp90按3×10⁹CFU/天，活菌数1:1:1)。为消除生物节律影响，均于每日上午9:00灌胃，连续灌胃干预4周。

(2)血清生化分析：采用商品化试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定肝脏丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平、肝脏天冬氨酸转移酶(AST)水平和总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。

(3)炎症因子测定：采用商品化(南京建成生物工程研究所，南京，中国)ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)水平。如表6所示。

表6

	CTL	HFD	LRa66	LC89+Lp90	LRa66+LC89+Lp90
						ALT(U/L)	29.8	80.93	35.6	36.8	32.7
AST(U/L)	27.8	154.41	36.8	38.7	30.2
						TC(mmol/L)	1.38	6.60	1.57	2.36	1.35
TG(mmol/L)	1.20	6.96	4.87	5.12	4.89
						TNF-α(pg/ml)	55.54	79.18	56.02	62.48	55.70
IL-1β(pg/ml)	2.44	4.16	2.61	2.89	2.48
						IL-10(pg/ml)	42.11	29.53	46.21	42.76	48.42

由表6结果可知：与CTL组比较，HFD组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平较高。与HFD组比较，益生菌干预组大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平均降低。与HFD组相比，经益生菌干预后大鼠血清TNF-α和IL-1β含量均降低，IL-10的含量有所提高，说明益生菌干预可以一定程度抑制炎症反应。

实施例9

本实施例探究益生菌对2型糖尿病(T2DM)小鼠的治疗作用：

(1)动物模型：6周龄SPF雄性昆明小鼠购自上海斯莱克试验动物中心，并在气候受控环境(22±1℃和55±5％湿度，12h光照/黑暗周期)中驯化1周。正常组食用标准饲料(NC，n＝8)，糖尿病组(n＝32)食用高脂饲料。4周后，所有小鼠禁食12h。糖尿病组腹腔注射链脲佐菌素(100mg/kg·BW)，CTL组注射等体积缓冲液。通过血糖仪(On Call Plus，Hangzhou，China)测定空腹血糖(FBG)。1周后，将FBG≥7.1mmol/L的小鼠视为T2DM。将T2DM小鼠随机分为4组(每组8只)：(1)T2DM组，口服0.2mL无菌生理盐水灌胃；(2)LRa66组，将LRa66溶于无菌生理盐水中，口服0.2mL，3×10⁹CFU/天LRa66灌胃；(3)LC89+Lp90组，3×10⁹CFU/天灌胃，活菌数1:1；(4)LRa66+LC89+Lp90组，3×10⁹CFU/天灌胃，活菌数1:1:1。CTL组仅给予0.2mL无菌生理盐水。每周测定FBG。LRa66治疗6周后，禁食12h后眼眶后放血采血，离心分离血清(1150×g，10min，4℃)。胰腺、肝脏和结肠内容物保存至-80℃进一步分析。

(2)口服葡萄糖耐量试验：治疗6周后，如前所述禁食12h后进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。

(3)生化参数测量：采用ELISA试剂盒(中国天津)测定空腹血清胰岛素(FINS)水平。肝脏丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平、肝脏天冬氨酸转移酶(AST)水平测定方法同实施例8。

(4)炎症因子测定：血清脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素10(IL-10)水平检测同实施例8。结果如表7所示。

表7

	CTL	T2DM	LRa66	LC89+Lp90	LRa66+LC89+Lp90
						OGTT(mg/dl)	7.27	17.85	8.22	9.89	7.57
FINS(mIU/L)	5.16	9.49	7.29	7.98	6.24
						ALT(U/L)	29.6	95.57	30.06	38.88	30.29
AST(U/L)	27.6	100.43	41.65	51.65	32.65
						LPS(ng/ml)	0.20	0.61	0.31	0.41	0.25
IL-1β(pg/ml)	18.41	34.07	22.61	24.87	20.45
						TNF-a(pg/ml)	124.13	186.76	129.64	134.5	125.3
IL-10(pg/ml)	48.10	45.20	76.48	65.08	82.32

由表7结果可知：在OGTT试验中，T2DM组观察到重度葡萄糖不耐受。此外，与CTL组相比，益生菌干预组有效降低了T2DM小鼠中较高的FINS水平。细菌产物LPS是炎症的原因之一，益生菌干预减轻了T2DM小鼠的炎症，益生菌干预组能很好地降低了T2DM小鼠的血清LPS水平。同样，与T2DM小鼠相比，益生菌干预组小鼠中IL-1β和TNF-a浓度有效降低，IL-10浓度有所提高。LRa66有效改善了血清IL-10水平，并抑制了TNF-a和IL-1β的生成。与CTL组相比，T2DM组的肝脏ALT和AST水平较高，LRa66有效减轻了肝脏AST水平，说明LRa66增加了T2DM小鼠的肝脏保护作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims

1.一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳杆菌LRa66，其特征在于，所述具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳杆菌LRa66的分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus，保藏编号为CGMCC No.24282，保藏日期为2022年1月10日。

2.一种具有降血糖和降血脂功能的鼠李糖乳酪杆菌LRa66的培养物，其特征在于，所述培养物的制备方法包括：将权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillusrhamnosus LRa66菌株接种于培养基中在30-37℃下培养18-24h；所述培养基的配方组成包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠、酵母粉、柠檬酸氢二铵、K₂PO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄、半胱氨酸盐酸盐。

3.一种具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂，其特征在于，所述具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂包含权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosusLRa66菌株。

4.根据权利要求3所述的具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂，其特征在于，在所述益生菌剂中，所述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus LRa66菌株的活菌数不低于1×10⁸CFU/mL或1×10⁸CFU/g；

5.根据权利要求3所述的具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂，其特征在于，所述具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂还包含保护剂和/或益生元；

所述保护剂包括脱脂奶粉；

6.根据权利要求3所述的具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂，其特征在于，所述具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂还包含干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株，保藏编号为CGMCC No.15409，保藏日期为2018年3月5日。

7.根据权利要求6所述的具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂，其特征在于，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC89菌株与鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillusrhamnosus LRa66菌株的活菌数之比为3:1-1:3。

8.根据权利要求3所述的具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂，其特征在于，所述具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂还包含植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株，保藏编号为CGMCC No.10453，保藏日期为2015年1月27日。

9.根据权利要求8所述的具有降血糖和降血脂功能的益生菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Lp90菌株与鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillusrhamnosus LRa66菌株的活菌数之比为3:1-1:3。

10.根据权利要求1所述的鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus LRa66菌株或权利要求2所述的培养物或权利要求3-9中任一项所述的益生菌剂在制备具有降血糖和降血脂功能的药物或保健品中的应用。