CN114634901B

CN114634901B - 一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌lc16及其培养方法与应用

Info

Publication number: CN114634901B
Application number: CN202210537666.5A
Authority: CN
Inventors: 方曙光; 董瑶; 盖忠辉; 陈婷; 朱建国; 陈珂可
Original assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Current assignee: WeCare Probiotics Co Ltd
Priority date: 2022-05-18
Filing date: 2022-05-18
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-05-18
Also published as: CN114634901A

Abstract

本发明涉及一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌LC16及其培养方法与应用，所述促进骨骼健康的干酪乳杆菌LC16命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株，保藏编号为CGMCC No.24110。该菌株能够促进骨骼健康，降低骨质疏松发生风险，具体体现在：能够显著增加骨密度、促进钙吸收；能够促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞，调节骨代谢进程。

Description

一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌LC16及其培养方法与应用

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌LC16及其培养方法与应用，具有涉及一种促进骨骼健康，降低骨质疏松发生风险的干酪乳杆菌LC16及其培养方法与应用。

背景技术

骨骼健康是人体健康的重要基石之一，也是人体长寿的特征，人体的所有行为动作都离不开骨骼的支撑。随着我国人口老龄化速度加快，骨骼健康问题，如骨质疏松不仅威胁老年人特别是绝经后妇女的健康，而且已经成为严重的社会问题。这是以低骨量及骨组织微结构退变为特征、伴有骨脆性增加、易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病，属于中老年常见疾病，严重损害身体健康和生活质量。

随着越来越多的研究对骨骼健康的关注，人们发现肠道微生物与骨代谢关系密切。研究显示，肠道微生物中的有益菌在肠道内的增殖不仅可以抑制肠道病原菌的生长，预防和治疗各种肠道疾病，而且在远离肠道的器官和组织，如皮肤、动脉和骨骼的健康也都与益生菌密切相关。具体来说，骨骼健康的守护可以通过肠道有益菌，如乳杆菌等发酵食物中的纤维产生短链脂肪酸，降低肠道局部pH值，减少肠道钙离子与磷形成复合物，从而促进钙吸收；有益菌可以改变全身及骨髓的免疫状态调节破骨细胞生成进而影响骨代谢；有益菌群可刺激肠道细胞分泌肠促胰素，包括葡萄糖依赖促胰肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，促进骨形成，抑制骨吸收，从而促进骨骼健康，降低骨质疏松发生风险。因此，肠道有益菌，如干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌等乳杆菌或许可以成为治疗骨质疏松和预防骨折新治疗靶点。

因此，如何提供一种可以有效改善/治疗骨质疏松等骨骼健康问题的微生物制剂，使用者可尝试使用含有特定益生菌的保健品或药品，解决因骨质疏松或其他骨骼健康问题给患者带来的不良生活体验，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌LC16及其培养方法与应用，具有提供一种促进骨骼健康，降低骨质疏松发生风险的干酪乳杆菌LC16及其培养方法与应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌LC16，所述促进骨骼健康的干酪乳杆菌LC16命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株，保藏编号为CGMCCNo.24110，保藏日期为2021年12月15日。

本发明从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗上都镇乃日音希热区奶豆腐样本中分离获得并保藏了一株新的能够促进骨骼健康的干酪乳杆菌，将其命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株，该菌株能够促进骨骼健康，降低骨质疏松发生风险，具体体现在：（1）能够显著增加骨密度、促进钙吸收；（2）能够促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞，调节骨代谢进程。因此，此干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株在制备改善或治疗骨质疏松的产品（如药品、保健品等）中。

另外，干酪乳杆菌是一种益生菌，因此，本发明筛选得到的干酪乳杆菌LC16用于改善或治疗骨质疏松的产品（如药品、保健品等）中时，安全性高；且其不会产生抗药性，可长期用于改善或治疗骨质疏松的产品中。

本发明所涉及的干酪乳杆菌的筛选步骤如下：

（1）选取分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗上都镇乃日音希热区奶豆腐样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在38℃培养48h后，挑取出不同形态的3株菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为40%的甘油进行保藏。

（2）针对保藏的3株奶豆腐来源的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株生长能力、耐酸和胆盐能力（人工模拟）、产SCFA（短链脂肪酸）量最多的单菌株，对其进行鉴定。

优选地，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株的培养方法包括：将干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株接种于培养基中在35-38℃（例如35℃、36℃、37℃、38℃等）下培养18-22 h（例如18 h、19 h、20 h、21 h、22 h等）；该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

所述培养基的配方组成包括：蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乳糖、酵母浸膏、柠檬酸氢二铵、K₂PO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄、L-半胱氨酸。

具体地，所述培养基（液体）的配方组成包括：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、乳糖10g、酵母浸膏5g、柠檬酸氢二铵2g、K₂PO₄·3H₂O 2g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、MnSO₄0.01g、L-半胱氨酸1g。

本发明优选上述培养条件，干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株能够达到生长稳定期，并且具有更加优异的碳源（葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、松三糖、蔗糖等）利用能力。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的促进骨骼健康的干酪乳杆菌在制备改善或治疗骨质疏松的产品中的应用；所述产品包括保健品或药品。

本发明所涉及的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌株联合应用于相关产品中。

第三方面，本发明提供一种具有改善或治疗骨质疏松功效的益生菌剂，所述具有改善或治疗骨质疏松功效的益生菌剂包括第一方面所述的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株。

优选地，在所述益生菌剂中，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株的活菌数不低于1×10⁸ CFU/mL或1×10⁸ CFU/g，例如1×10⁸ CFU/mL、2×10⁸ CFU/mL、5×10⁸CFU/mL、8×10⁸ CFU/mL、1×10⁹ CFU/mL、5×10⁹ CFU/mL、1×10¹⁰ CFU/mL等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述益生菌剂的剂型可以为冻干粉剂，所述冻干粉剂还可以被进一步地制备成胶囊剂、片剂等剂型。

优选地，所述具有改善或治疗骨质疏松功效的益生菌剂还包括保护剂和/或益生元；

所述保护剂包括脱渣豆粉；

所述益生元包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、海藻糖、大豆低聚糖、抗性糊精、螺旋藻、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供一种具有改善或治疗骨质疏松功效的复合益生菌剂，所述具有改善或治疗骨质疏松功效的复合益生菌剂包括第一方面所述的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株；所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的保藏编号为CGMCC No. 1.12731，保藏日期为2020年7月20日。

本发明还创造性地发现上述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株能够与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株进行复配使用用于促进骨骼健康，同样具有优异的效果，且与单一菌剂相比，复合菌剂具有更显著的促进骨骼健康，降低骨质疏松风险的效果，说明LC16菌株与LC86菌株在促进骨骼健康，降低骨质疏松风险方面具有协同增效作用。

优选地，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的质量比为(1-4):(1-4)，例如1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

在本发明所涉及的复合益生菌剂中，两种菌株在满足上述特定的质量比例关系时具有更优的协同增效效果。

优选地，所述具有改善或治疗骨质疏松功效的复合益生菌剂还包括保护剂和/或益生元；

所述保护剂包括脱渣豆粉；

进一步优选地，所述具有改善或治疗骨质疏松功效的复合益生菌剂还包括罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株；所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteriLR08菌株的保藏编号为CGMCC No. 1.12733，保藏日期为2020年7月20日。

本发明还创造性地发现在上述复合益生菌剂中添加罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株得到的复合益生菌剂具有进一步优化的效果，且与单一菌剂或两者复配方式相比，三种菌株的复合菌剂具有更显著的促进骨骼健康，降低骨质疏松风险的效果，说明LC16菌株、LC86菌株与LR08菌株在促进骨骼健康，降低骨质疏松风险方面具有协同增效作用。

所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株与干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的质量比为(1-4):(1-4):(1-4)，例如1:4:1、1:3:1、1:2:1、1:1:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1、1:4:2、1:3:2、1:2:2、1:1:2、2:1:2、3:1:2、4:1:2、1:4:4、1:3:4、1:2:4、1:1:4、2:1:4、3:1:4、4:1:4等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明还创造性地发现上述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株能够与副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株进行复配使用用于促进骨骼健康，同样具有优异的效果，且与单一菌剂相比，复合菌剂具有更显著的促进骨骼健康，降低骨质疏松风险的效果，说明LC16菌株与LC86菌株在促进骨骼健康，降低骨质疏松风险方面具有协同增效作用。而在上述复合益生菌剂中添加罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株得到的复合益生菌剂具有进一步优化的效果，且与单一菌剂或两者复配方式相比，三种菌株的复合菌剂具有更显著的促进骨骼健康，降低骨质疏松风险的效果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

下述涉及的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24110，保藏日期为2021年12月15日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述涉及的副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.12731，保藏日期为2020年7月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述涉及的罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1.12733，保藏日期为2020年7月20日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述涉及的MRS固体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乳糖10g、酵母浸膏5 g、柠檬酸氢二铵2 g、K₂PO₄·3H₂O 2 g、MgSO₄·7H₂O 0.6 g、MnSO₄ 0.01 g、琼脂20 g和L-半胱氨酸1 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。

下述涉及的MRS液体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乳糖10g、酵母浸膏5 g、柠檬酸氢二铵2 g、K₂PO₄·3H₂O 2 g、MgSO₄·7H₂O 0.6 g、MnSO₄ 0.01 g和L-半胱氨酸1 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。

下述涉及的干酪乳杆菌LC16菌悬液：将干酪乳杆菌接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10 min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到干酪乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。

下述涉及的副干酪乳杆菌LC86菌悬液：将副干酪乳杆菌LC86接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，38℃下培养18h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10 min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到副干酪乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。

下述涉及的罗伊氏乳杆菌LR08菌悬液：将罗伊氏乳杆菌LR08接种于MRS液体培养基中，38℃下培养20h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，38℃下培养20h，得到菌液；将菌液在8000g下离心10 min，取上清液过0.22μm无菌滤膜，得到罗伊氏乳杆菌上清液；使用PBS重悬菌体，即得。

实施例1

本实施例筛选一株促进骨骼健康的干酪乳杆菌，步骤如下：

（1）选取分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗上都镇乃日音希热区奶豆腐样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在固体培养基上，在38℃培养48h后，挑取出不同形态的菌落后在改良MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为40%的甘油进行保藏。

（2）针对保藏的奶豆腐来源的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株生长能力、耐酸和胆盐能力（人工模拟）、产SCFA（短链脂肪酸）量最多的单菌株，具体为如下：

A. 耐酸和胆盐能力测试：

使用MRS液体培养基、MRS固体培养基和分离培养基（在固体CMRS重加0.5%CaCO₃），主要试剂有胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆酸钠和CaCO₃等。把MRS培养基的pH调到3.0，121℃下15min灭菌后按2%的接种量接入已活化两代的液体培养扩培物，37℃培养24h，测定其在24h过程中的吸光度的变化∆OD₆₀₀值；在MRS培养基中添加0.3%的牛胆盐，121℃下15min灭菌后按2%的接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养24h后测定其在24h过程中吸光度的变化∆OD₆₀₀值，最后选取两个∆OD₆₀₀值相对大的大约10个菌株做下一步实验。

耐酸性实验：以pH7.0的PBS缓冲液为基础，再用37%的盐酸将其调至3.0，121℃下15min灭菌后按10%接种量接入已活化两代的液体培养物，37℃培养，分别于0min、30min、60min、90min、120min取样测定活菌数。

耐胆盐实验：菌种活化两代后的液体培养物以2%接种量接入含有不同胆盐浓度的MRS培养基中（培养基中分别含0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、2%胆盐），同时以不含胆盐的MRS培养基为对照，在37℃恒温培养24h后取样测定活菌数，结合上一个实验结果筛选出耐酸耐胆盐的优良菌株。

B. 产酸能力测试：采用滴定法测定菌株的产酸能力。取甘油管保藏的菌株活化后按2%接种量接种于MRS液体培养基，37℃恒温培养24h，取各菌株的发酵液10mL于50mL无菌水中，滴加2-3滴1g/L的酚酞作为指示剂，用0.1mol/L的NaOH标准溶液进行滴定，以溶液出现粉红色且30s后不褪色为滴定终点，每个样品3次平行。以未接种的MRS液体培养基作空白对照，其计算公式为：总酸度/(g·L^-1) = [(V1-V2)·c·100]/V0（V1为样品消耗NaOH溶液的体积，mL；V2为空白对照消耗NaOH溶液的体积，mL；V0为稀释液的总体积，mL；c为标准NaOH的浓度，mol/L）。益生菌在代谢培养基中营养物质快速生长的同时会产生短链脂肪酸，如丁酸、丙酸、乙酸等。对比单菌产酸速度情况，结合耐受性实验，筛选出具有优良性能的干酪乳杆菌LC16。

实施例2

本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：

（1）形态鉴定：

将菌株接种在MRS固体培养基中，于38℃培养48h后，在显微镜下进行观察。观察可得，菌落为乳白色，圆润透亮的圆点。挑选对数生长期的该菌株，进行光学显微镜检测，经涂片和革兰染色后镜检观察到：革兰氏染色为阳性，菌株形态为杆状，无芽孢无鞭毛。

（2）16S rRNA分子生物学鉴定：

将-80℃保藏的菌株取出，按2%比例接种于装有20mL MRS液体培养基的离心管中，在38℃下培养18h后进行离心分离，8000 rpm下离心10min，去上清液，收集菌体。提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No:1所示。将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株确实为干酪乳杆菌。

SEQ ID No:1：

GAGCATCGTTCGTCACCTTAGACGGCTCGCTCCCTAAAAGGGTTACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTACTAGAGTGCCCAACTCAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCGCTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTGCGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTTTAAGTCGAATCTCAGTGCAAGCACCGTTCATCGACCAAAACTCGTTCGACTGCATGTATAGGCACCCCGCCCCCCG。

基于实施例2的16S rRNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株。

实施例3

本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行生理生化特征表征，结果如表1所示：

表1

实施例4

本实施例对干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株的培养条件进行优化，步骤如下：

将干酪乳杆菌LC16接种于MRS液体培养基中，分别于10-50℃的不同温度下培养48h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD₆₀₀数值。结果如表2所示：

表2

结果显示，干酪乳杆菌LC16在35-38℃，pH在6.86左右生长最佳，培养18-22h即可达到生长稳定期。

根据API细菌鉴定标准利用API 50CHL培养基（基础培养基，由48种可发酵碳水化合物的API 50CH试验条组成）和API 50CH试验条对检测菌株干酪乳杆菌LC16进行糖发酵反应判读检测其碳源利用能力。该方法原理是利用需测定的菌株制成悬液接种在每个试验条小管里，经过培养，能够被利用的碳源管会因其发酵产酸，pH下降，从而使指示剂变色。

最后结果得到，菌株LC16可利用碳源葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、松三糖、蔗糖等多种糖源。

实施例5

本实施例验证干酪乳杆菌LC16的耐胃酸能力，步骤如下：

（1）制备人工胃液：

以质量分数计，人工胃液中含有0.20%的NaCl以及0.30%的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。

（2）耐胃酸能力测试：

取1.0 mL干酪乳杆菌LC16菌悬液（浓度为1×10⁹ CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度），分别与9.0 mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0 h）和处理3 h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：

存活率（%）=N1/N0×100%，

其中，N1：人工胃液处理3h后的活菌数；N0：0h的活菌数。测试结果见表3。

表3

由表3可以看出，本发明所述的干酪乳杆菌LC16具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达75.0%以上；在pH为2.5的人工胃液中孵育3h，存活率可达93.4%以上；在pH为3.0的人工胃液中孵育3h，存活率可达95.1%以上。良好的耐酸能力为其制备改善或治疗骨质疏松等骨骼健康问题的产品创造了条件。

实施例6

本实施例探究干酪乳杆菌LC16对大鼠骨密度的影响，步骤如下：

（1）试验大鼠模型的构建：

清洁级SD雌性大鼠72只，体重230 g±20 g，由上海市实验动物研究中心提供，已获得上海实验动物研究中心动物伦理委员会（伦理号：2021082003）的伦理批准。根据现有技术常用方法，使用腹腔注射法给药30mg/kg·bw戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，无菌操作切除双侧卵巢（对照组和干预组），一组按同样操作但不切除大鼠双侧卵巢（假手术组）。大鼠卵巢切除后5天，进行阴道涂片检查，剔除卵巢切除不完全的大鼠，完成实验大鼠建模。

（2）分组和给药：

试验共分为9组，每组大鼠8只，分别为假手术组、模型对照组（MC组，给予纯化水）、阳性对照组（PC组，1.0mg/(kg·bw·d)的雌二醇，给予纯化水）、碳酸钙对照组（75mg/kg·bw·d）、益生菌LC16干预组（菌悬液10⁸CFU/天）、益生菌LC86干预组（菌悬液10⁸CFU/天）、益生菌LR08干预组（菌悬液10⁸CFU/天）、益生菌LC16+LC86联合干预组（菌悬液（5×10⁷）CFU/天+菌悬液（5×10⁷）CFU/天）、益生菌LC16+LC86+LR08联合干预组（菌悬液（4×10⁷）CFU/天+菌悬液（4×10⁷）CFU/天+菌悬液（2×10⁷）CFU/天）。灌胃给药10mL/kg量，每天灌胃一次，共进行12周，每周记录体重，对比各组大鼠体重变化差异，结果如表4所示：

表4

由表4数据可知：MC组对比假手术组大鼠体重变化较为显著，MC组12周体重增长了约(134±6.1)g，假手术对照组12周增长了(94±5.5)g，可能与MC组大鼠手术后出现雌性减少导致的激素水平紊乱，因此体重上涨异常，即可证明建模成功。

（3）股骨骨密度测定：

解剖大鼠，剥离左侧股骨，将股骨烤干至恒重。使用discovery-wi型骨密度仪测量大鼠股骨中点和股骨远心端骨密度，同时利用原子吸收法测定骨钙含量，结果如表5所示。

表5

由表5可以得到，与MC组相比，PC组和假手术组中远心端骨密度、骨钙含量和中心点骨密度均显著高于MC组。LC16干预组、LC86干预组、LR08干预组和碳酸钙对照组的远心端骨密度和骨钙含量均明显增高，且LC16+LC86联合干预组和LC16+LC86+LR08联合干预组的效果更显著。

实施例7

本实施例探究干酪乳杆菌LC16对大鼠钙吸收能力的影响，步骤如下：

（1）试验大鼠：

出生4周左右的断乳大鼠56只，体重75 g±5 g，由上海市实验动物研究中心提供，已获得上海实验动物研究中心动物伦理委员会（伦理号：2021082003）的伦理批准。

（2）分组和给药：

制备冻干菌粉：将菌悬液在38℃下预培养2h后冻干，得到冻干菌粉，与乳矿物盐（阿尔拉食品原料贸易（北京）有限公司，0525BG 乳钙，乳白色粉状）混合搅拌均匀即可。

试验共分为7组，每组大鼠8只，分别为：

（2.1）低钙对照组（给予500mg/(kg·bw·d)）；

（2.2）碳酸钙对照组（给予碳酸钙3000mg/(kg·bw·d)）；

（2.3）益生菌LC16干预组（冻干菌粉含LC16菌株10⁸CFU/天、钙含量1000mg/(kg·bw·d)）；

（2.4）益生菌LC86干预组（冻干菌粉含LC86菌株10⁸CFU/天、钙含量1000mg/(kg·bw·d)）；

（2.5）益生菌LR08干预组（冻干菌粉含LR08菌株10⁸CFU/天、钙含量1000mg/(kg·bw·d)）；

（2.6）益生菌LC16+LC86联合干预组（冻干菌粉含LC16菌株（5×10⁷）CFU/天+含LC86菌株（5×10⁷）CFU/天+钙含量1000mg/(kg·bw·d)）；

（2.7）益生菌LC16+LC86+LR08联合干预组（冻干菌粉含LC16（4×10⁷）CFU/天+含LC86菌株（4×10⁷）CFU/天+含LR08菌株（2×10⁷）CFU/天+钙含量1000mg/(kg·bw·d)）。

（3）骨钙含量和钙的表观吸收率的测定：

灌胃给药10mL/kg量，每天灌胃一次，共进行4周，每周记录大鼠的身长和体重，重复3周后，进行3天钙代谢实验，并记录摄食量，收集72h粪便并测定粪便中钙含量。将大鼠粪便置于75℃烘箱中烘干，冷却后研磨细腻（全过程于无菌室中进行）。

骨钙含量的测定：采用原子吸收法测定。

钙的表观吸收率：

摄入钙(mg)=饲料钙含量(mg/g)×3天饲料消费量+样品摄入钙含量

粪钙(mg)=粪便中钙含量(mg/g)×3天粪便排出量

钙的表观吸收率(%)=(摄入钙-粪钙)/摄入钙×100%

结果如表6所示：

表6

由表6数据可知：与低钙对照组相比，各组的断乳大鼠体重、身长均无显著差异，但干预组的钙表观的吸收率显著高于低钙对照组，即使用各益生菌剂在不影响基本生理的情况下即可达到促进机体钙吸收的功能。

实施例8

本实施例探究干酪乳杆菌LC16对小鼠成骨细胞增殖的影响，步骤如下：

（1）首先将制备的各组菌悬液或复合菌悬液（LC16+LC86（1:1）、LC16+LR08（2:1）、LC86+LR08（2:1）、LC16+LC86+LR08（2:2:1））以及市售菌（副干酪乳杆菌LP-33，购于景岳生物科技有限公司）（各组总菌浓度为10⁹CFU/mL）分别与成骨细胞（小鼠成骨细胞前体细胞MC3T3-E1，取自上海市实验动物研究中心）诱导培养基以1:50或1:100的体积比例混合，配成带菌培养液：将装有小鼠成骨细胞的冻存管取出，于37℃恒温无菌条件（该步骤在无菌室内完成）下迅速解冻，使用移液器吸取细胞悬液至高温灭过菌的离心管中，并向离心管内缓慢滴加

-MEM完全培养液（购于武汉普诺赛生命科技有限公司），混匀后于5000g下离心5min，去除上清，并使用备好的不同浓度益生菌培养液重悬沉淀部分，混匀后使用移液器转移至100mm细胞培养皿中，并将其放置于CO₂恒温培养箱中37℃，5%CO₂条件下培养，并定时更换细菌上清液培养液（约48h/次）。

（2）完成干预后，使用MTT的方法（又称MTT四唑盐比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，可以将活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原城蓝紫色的结晶）测定成骨细胞的生长率：将处于对数生长期的第3代成骨细胞，在无菌操作台中提取至

-MEM完全培养基中，稀释后以2.5×10⁴/mL的浓度将成骨细胞接种于96孔板中，测量时，向每孔加入20μL浓度为5 mg/ mL的MTT溶液，放置于CO₂恒温培养箱中37℃，5%CO₂条件下孵育4h。结束后吸出培养液，并向其中加入二甲基亚砜(DMSO) 100μL，混匀10min，待结晶完全溶解后，测定吸光度值（OD_490nm）。另外，将灭菌后的丁酸钠（购于默克Sigma-Aldrich品牌），在无菌操作室中用将丁酸钠加入诱导培养基，使其浓度为0.5mmol/L（丁酸作为一种短链脂肪酸，已在不同的细胞培养中被证明可以产生诱导细胞形态和细胞分化的作用），并按同上操作。

结果如表7所示：

表7

由表7数据可知：与对照组相比，各菌悬液组可以极显著地刺激成骨细胞的增殖、分化和成熟。同时结合0.5mmol/L丁酸组的结果，从一定程度上可以说明，在LC16、LC86、LR08的代谢产物中，有可以对成骨细胞产生直接作用的SCFA，并且作用效果随着浓度的增加和作用时间的延长（从24h到48h）而突出。在市售菌干预的培养基没有发现明显的效果，说明其代谢产物中没有可以对成骨细胞产生直接作用的SCFA。

实施例9

本实施例探究干酪乳杆菌LC16对小鼠破骨细胞抑制的影响，步骤如下：

（1）首先将制备的各组菌悬液或复合菌悬液（LC16+LC86（1:1）、LC16+LR08（2:1）、LC86+LR08（2:1）、LC16+LC86+LR08（2:2:1））以及市售菌（副干酪乳杆菌LP-33，购于景岳生物科技有限公司）（各组总菌浓度为10⁹CFU/mL）分别与破骨细胞（小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，取自上海市实验动物研究中心）诱导培养基以1:50或1:100的体积比例混合，配成带菌培养液：将装有RAW 264.7细胞的冻存管取出，于37℃恒温无菌条件（该步骤在无菌室内完成）下迅速解冻，使用移液器吸取细胞悬液至高温灭过菌的离心管中，并向离心管内缓慢滴加

（2）完成干预后，使用MTT的方法测定破骨细胞的生长抑制情况，方法同实施例7，结果如表8所示：

表8

由表8数据可知：随着时间的延长，对照组中破骨细胞的增殖、分化明显。与对照组相比，各组菌悬液可以极显著地抑制破骨细胞的增殖、分化和成熟。而在市售菌上清液各组中均无差异性，其结果与对照组相似。同时结合0.5mmol/L丁酸组的结果可以证明，含有丁酸的培养基能在一定程度上抑制破骨细胞的增殖分化。也就是说，LC16、LC86、LR08可以利用其代谢产物，如丁酸、乳酸等SCFA直接抑制破骨细胞的增殖分化。

结合实施例7和8，成骨细胞和破骨细胞共同参与骨代谢，完成骨骼的更新换代，而干酪乳杆菌可以通过其产生的锻炼脂肪酸等物质直接作用于两种细胞，调节二者的平衡从而改善骨质。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌及其培养方法与应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

序列表

<110> 微康益生菌(苏州)股份有限公司

<120> 一种促进骨骼健康的干酪乳杆菌LC16及其培养方法与应用

<130> 2022

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1480

<212> DNA

<213> 干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株

<400> 1

gagcatcgtt cgtcacctta gacggctcgc tccctaaaag ggttacgcca ccggcttcgg 60

gtgttacaaa ctctcatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc 120

gcggcgtgct gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg tgtaggcgag ttgcagccta 180

cagtccgaac tgagaatggc tttaagagat tagcttgacc tcgcggtctc gcaactcgtt 240

gtaccatcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc 300

atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcttacta gagtgcccaa ctcaatgctg 360

gcaactagtc ataagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag 420

ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcattt tgcccccgaa ggggaaacct gatctctcag 480

gtgatcaaaa gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat 540

gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact 600

ccccaggcgg aatgcttaat gcgttagctg cggcactgaa gggcggaaac cctccaacac 660

ctagcattca tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc gctacccatg 720

ctttcgagcc tcagcgtcag ttacagacca gacagccgcc ttcgccactg gtgttcttcc 780

atatatctac gcatttcacc gctacacatg gagttccact gtcctcttct gcactcaagt 840

ttcccagttt ccgatgcgct tcctcggtta agccgagggc tttcacatca gacttaaaaa 900

accgcctgcg ctcgctttac gcccaataaa tccggataac gcttgccacc tacgtattac 960

cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggttg gataccgtca cgccgacaac 1020

agttactctg ccgaccattc ttctccaaca acagagtttt acgacccgaa agccttcttc 1080

actcacgcgg cgttgctcca tcagacttgc gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc 1140

tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc cgatcaacct ctcagttcgg 1200

ctacgtatca tcgccttggt gagccgttac ctcaccaact agctaatacg ccgcgggtcc 1260

atccaaaagc gatagcttgc gccatctttc agccaagaac catgcggttc ttggatttat 1320

gcggtattag catctgtttc caaatgttat cccccactta agggcaggtt acccacgtgt 1380

tactcacccg tccgccactc gttttaagtc gaatctcagt gcaagcaccg ttcatcgacc 1440

aaaactcgtt cgactgcatg tataggcacc ccgccccccg 1480

Claims

1.一种具有改善或治疗骨质疏松功效的复合益生菌剂，其特征在于，所述具有改善或治疗骨质疏松功效的复合益生菌剂中的菌株由质量比为(1-4):(1-4)的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株组成；所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的保藏编号为CGMCC No.1.12731，保藏日期为2020年7月20日；所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株的保藏编号为CGMCC No.24110，保藏日期为2021年12月15日。

2.一种具有改善或治疗骨质疏松功效的复合益生菌剂，其特征在于，所述具有改善或治疗骨质疏松功效的复合益生菌剂中的菌株由质量比为(1-4):(1-4):(1-4)的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株、副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株和罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株组成；所述副干酪乳杆菌Lactobacillus paracasei LC86菌株的保藏编号为CGMCC No. 1.12731，保藏日期为2020年7月20日；所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株的保藏编号为CGMCC No.24110，保藏日期为2021年12月15日；所述罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri LR08菌株的保藏编号为CGMCC No. 1.12733，保藏日期为2020年7月20日。